đánh giá chỉ tiêu vi sinh và hàn the trong chả lụa tại một số cơ sở sản xuất ở cần thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

--- ---

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

ĐÁNH GIÁ CHỈ TIÊU VI SINH VÀ HÀN THE
TRONG CHẢ LỤA TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ SẢN XUẤT Ở
CẦN THƠ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ths. HUỲNH XUÂN PHONG

SINH VIÊN THỰC HIỆN
TRỊNH THỊ NGỌC DIỆP
MSSV: 3108482
LỚP: VSV K36

Cần Thơ – Tháng 11/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

ĐÁNH GIÁ CHỈ TIÊU VI SINH VÀ HÀN THE
TRONG CHẢ LỤA TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ SẢN XUẤT Ở
CẦN THƠ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ths. HUỲNH XUÂN PHONG

SINH VIÊN THỰC HIỆN
TRỊNH THỊ NGỌC DIỆP
MSSV: 3108482
LỚP: VSV K36

Cần Thơ - Tháng 11/2013


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ths. Huỳnh Xuân Phong

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Trịnh Thị Ngọc Diệp

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG


LỜI CẢM TẠ
---------------------Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ,
Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng Quý Thầy Cô
đã tận tình giảng dạy em trong thời gian học tập vừa qua.
Xin được bày tỏ lòng biết ơn sự hướng dẫn tận tình của Cán bộ hướng dẫn - ThS.
Huỳnh Xuân Phong.
Xin gửi lời biết ơn chân thành đến các thầy cô cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học
khóa 36, ThS Võ Văn Song Toàn và ThS Nguyễn Thị Pha. Sự hỗ trợ nhiệt tình của các
thầy cô đã giúp cho chúng em hoàn thành tốt quá trình học tập của mình.
Xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, cán bộ quản lý phòng thí
nghiệm CNSH Thực phẩm và quý Thầy Cô, Anh Chị quản lý phòng thí nghiệm của
Viện NC&PT CNSH đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài
nghiên cứu này. Xin được gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên của phòng thí nghiệm
CNSH Thực phẩm đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu.
Kính chúc quý Thầy Cô, các Anh Chị và các bạn được dồi dào sức khỏe, hạnh
phúc và thành đạt.
Xin trân trọng cảm ơn!
Cần Thơ, ngày 20 tháng 11 năm 2013
Sinh viên thực hiện

Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013

Trường ĐHCT

TÓM TẮT
---------Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề hết sức quan trọng và cần thiết,
được tiếp cận với những thực phẩm an toàn là nhu cầu cơ bản đối với mỗi con người.
Với mục đích khảo sát và đánh giá mức độ an toàn của chả lụa được sản xuất tại một
số cơ sở trên địa bàn thành phố Cần Thơ, đề tài: “Đánh giá chỉ tiêu vi sinh và hàn the
trong chả lụa tại một số cơ sở sản xuất ở Cần Thơ” đã được thực hiện. Trong nghiên
cứu này, chỉ tiêu hàn the và các chỉ tiêu vi sinh theo quy định của Bộ Y tế đã được tiến
hành khảo sát. Tổng cộng có 5 mẫu được tiến hành kiểm tra. Kết quả cho thấy, chỉ có
1 mẫu đạt yêu cầu về các chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí, men mốc, Coliforms, E.coli. Cả
5 mẫu đều cho kết quả âm tính với E.coli. Có 4 mẫu có chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí,
men mốc, Coliforms vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế. Đối với chỉ tiêu hàn the
thì có một mẫu cho kết quả dương tính.
Từ khoá: chả lụa, hàn the, IMViC, vi sinh vật gây bệnh.

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
i


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
---------Trang

PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM TẮT .................................................................................................................. i
MỤC LỤC ................................................................................................................. ii
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... iv
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. v
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ vi
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ...................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................... 2
CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................. 3
2.1. Giới thiệu về chả lụa ................................................................................. 3
2.2. Tổng quan về hàn the ................................................................................ 5
2.3. Các con đường vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm ....................................... 6
2.4. Giới thiệu các vi sinh vật thường gây ô nhiễm trong thịt và các sản phẩm từ
thịt .............................................................................................................. 6
2.4.1. Coliforms tổng số ................................................................................ 6
2.4.2. Escherichia coli ................................................................................... 7
2.4.3. Vi khuẩn hiếu khí ................................................................................ 9
2.4.4. Nấm men và nấm mốc ......................................................................... 9
2.5. Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt ....... 10
3.1. Phương tiện thí nghiệm ........................................................................... 11
3.1.1. Mẫu thí nghiệm ................................................................................. 11
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 11
3.1.3. Thời gian thực hiện ............................................................................ 11
3.1.4. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 11
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
ii

Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013

Trường ĐHCT

3.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 14
3.2.1. Phương pháp thu mẫu ........................................................................ 14
3.2.2. Định tính hàn the ................................................................................ 14
3.2.2.1. Nguyên tắc.............................................................................. 14
3.2.3. Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh .............................................................. 16
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 26
4.1. Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 1 ................................... 26
4.2. Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 2 ................................... 31
4.3. Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 3 ................................... 33
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 36
5.1. Kết luận................................................................................................... 36
5.2. Đề nghị ................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 37
PHỤ LỤC .....................................................................................................................
Phụ lục 1. Các hình ảnh về thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm
Phụ lục 2. Các tiêu chuẩn sử dụng

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
iii


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG
---------Bảng 1. Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt ............. 10
Bảng 2. Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 1 ....................................... 26
Bảng 3. Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 1 .................................. 26
Bảng 4. Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 1 ......................... 28
Bảng 5. Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 2 ....................................... 31
Bảng 6. Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 2 .................................. 31
Bảng 7. Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 2 ......................... 32
Bảng 8. Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 3 ....................................... 33
Bảng 9. Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 3 .................................. 33
Bảng 10. Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 3 ....................... 34

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
iv


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH

---------Hình 1. Quy trình chế biến chả lụa tổng quát ............................................................... 3
Hình 2. Hình dạng Coliforms dưới kính hiển vi điện tử ............................................... 7
Hình 3. Hình dạng vi khuẩn E. coli ............................................................................. 7

Hình 4. Sự đổi màu của giấy nghệ với hàn the đối chứng........................................... 16
Hình 5. Các bước pha loãng mẫu ............................................................................... 17
Hình 6. Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường Endo ................................................... 19
Hình 7. Thử nghiệm indole ........................................................................................ 20
Hình 8. Thử nghiệm citrate ........................................................................................ 20
Hình 9. Thử nghiệm Methyl Red ............................................................................... 21
Hình 10. Thử nghiệm VP ........................................................................................... 21
Hình 11. Khuẩn lạc của vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA ............................. 24
Hình 12. Khuẩn lạc men, mốc trên môi trường YDC ................................................. 24
Hình 13. Mẫu chả lụa có hàn the làm đổi màu giấy nghệ ........................................... 27
Hình 14. Thử nghiệm IMViC .................................................................................... 27
Hình 15. Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí .................................................................... 29
Hình 16. Khuẩn lạc men mốc .................................................................................... 29
Hình 17. Khuẩn lạc Coliforms ................................................................................... 29

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
v


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

---------VSATTP

Vệ sinh an toàn thực phẩm

SCA

Simmons citrate agar

MR-VP

Methyl Red – Voges Proskauer

MR

Methyl Red

VP

Voges Proskauer

PCA

Plate Count Agar

YDC

Yeast extract Dextrose – Chloramphenicol

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TSVSVHK

Tổng số vi sinh vật hiếu khí

CFU

Colony forming unit

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
vi


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Xã hội càng phát triển, nhu cầu vật chất và tinh thần sẽ cao và đa dạng hơn, trong
đó, các yêu cầu về giá trị dinh dưỡng, vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) được đặc
biệt chú trọng. Bởi thực phẩm không chỉ là nguồn cung cấp năng lượng và chất dinh
dưỡng cho con người phát triển, duy trì sự sống và lao động, mà cũng chính từ thực
phẩm con người có thể bị ngộ độc nếu như không tuân thủ nghiêm nhặt những biện
pháp đảm bảo VSATTP hữu hiệu trong sản xuất, chế biến và bảo quản.
Gần đây, qua thanh, kiểm tra, các cơ quan chức năng đã phát hiện trong mứt có
dòi; chân gà có vi khuẩn mủ xanh hay hàng ngàn tấn thịt (từ trâu, bò, heo, gà, dê,
cừu...) đông lạnh đã hết hạn sử dụng, hôi thối nhưng vẫn được tái chế bằng hóa chất
rồi bán ra thị trường, điều đó cho thấy chất lượng và VSATTP rất đáng quan ngại. Như
đã được phản ánh trên các phương tiện thông tin đại chúng, có rất nhiều thực phẩm

chứa hàm lượng chất gây độc hại đang lưu hành trên thị trường như nước mắm, hải sản
tươi có urea, nước tương có chất 3-MCPD, da heo có thuốc tẩy, trứng gà và sữa chứa
melamine; trái cây khô từ Trung Quốc bị nhiễm độc chì; hạt dưa, bột ớt, bột điều
nhuộm phẩm màu công nghiệp có chứa Rhodamin B, xúc xích có chứa chất
Polychlorobifenyls gây ung thư; bánh phở chứa formol, rau củ quả có dư lượng hóa
chất bảo vệ thực vật, các loại chả, giò, nem chứa hàn the v.v…
Hiện nay tình trạng ngộ độc thực phẩm xảy ra thường xuyên hơn, nhất là tại các
bếp ăn tập thể. Theo số liệu báo cáo của Cục An toàn thực phẩm (Bộ Y tế), trong năm
2009, cả nước có tổng cộng 152 vụ ngộ độc thực phẩm, với 5212 ca ngộ độc và 35
trường hợp tử vong. Đến năm 2012, tổng số vụ ngộ độc thực phẩm đã tăng lên tới 168
vụ với 5541 ca ngộ độc và 34 trường hợp tử vong. Có rất nhiều nguyên nhân khiến
thực phẩm bị nhiễm bẩn và độc, chẳng hạn như việc sử dụng tùy tiện phân bón, thuốc
bảo vệ thực vật, thuốc tăng trọng, kháng sinh, hóa chất trong chăn nuôi trồng trọt nông
nghiệp, thủy hải sản; thậm chí sử dụng cả các chất bảo quản, phụ gia, phẩm màu công
nghiệp, thuốc tẩy v.v… trong sản xuất, chế biến thức ăn đồ uống. Thêm vào đó, tại
một số cơ sở, việc sản xuất chế biến thực phẩm được đặt cạnh cống rãnh, ao tù; dụng
cụ lưu trữ, chế biến không đảm bảo vệ sinh.
Yếu tố gây ngộ độc thực phẩm gồm cả độc tố tự nhiên, chất độc hóa học, vi sinh
vật gây bệnh và độc tố của chúng. Trong đó, vi sinh vật gây bệnh và độc tố của chúng
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
1


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

thường là những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm tức thời. Theo số liệu báo cáo năm

2012 của 48 tỉnh/thành phố, đã giám sát được 12.295 mẫu, kết quả cho thấy thực phẩm
ô nhiễm vi sinh vật chủ yếu là tổng số bào tử nấm mốc men (40%), Coliforms
(30,8%), E.Coli (20,2%). Về ô nhiễm hóa học, ngoài các mẫu phát hiện có hàn the, độ
ôi khét, vẫn còn có mẫu dương tính với DEHP. Những số liệu trên cho thấy tình hình
VSATTP ở nước ta vẫn còn nhiều vấn đề, do vậy việc kiểm soát chất lượng VSATTP
là thực sự cần thiết.
Xuất phát từ tình hình trên, đề tài: “Đánh giá chỉ tiêu vi sinh và hàn the trong
chả lụa tại một số cơ sở sản xuất ở Cần Thơ” được thực hiện nhằm cung cấp thông
tin về tình trạng vệ sinh an toàn trong chả lụa được sản xuất tại một số cơ sở trên địa
bàn thành phố Cần Thơ.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Đánh giá sự tồn tại của các vi sinh vật gây ngộ độc trong thực phẩm cũng như
hàn the có trong chả lụa được sản xuất tại một số cơ sở trên địa bàn thành phố Cần
Thơ.

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
2


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về chả lụa
Giò lụa, giò chả hay chả lụa (phương ngữ Nam bộ) là tên gọi của món ăn được
làm từ hai nguyên liệu cơ bản là thịt nạc thăn lợn giã nhuyễn kết hợp với nước mắm
ngon, gói trong lá chuối và luộc chín. Chả lụa là một sản phẩm truyền thống rất được

yêu thích ở nước ta, được chế biến công phu và có hương vị đặc biệt, chả lụa giòn và
thơm đậm mùi thịt tươi luộc cộng với mùi đặc trưng của lá chuối tươi được luộc chín.
Vì đây là một món ăn được dùng ngay mà không qua xử lý nhiệt nên vấn đề vệ
sinh rất được quan tâm. Hơn nữa, để chả lụa giòn, dai và giữ được lâu người sản xuất
thường sử dụng hàn the - một chất bị cấm sử dụng trong thực phẩm - trong quá trình
sản xuất, chế biến và điều này làm tăng sự lo ngại khi sử dụng chả lụa.
2.1.1. Quy trình chế biến chả lụa
Nguyên liệu

Xử lý

Xay
Phối trộn
Vào khuôn

Làm chín
Bao gói

Chả lụa
Hình 1. Quy trình chế biến chả lụa tổng quát
Muốn cho chả ngon, béo, người ta cho vào xay chung với thịt một lượng mỡ
heo tới 40%, rồi trộn đường, bột năng, bột ngọt, hàn the, bột nở, hương nước mắm và
hương thịt, muối đỏ (để tạo màu hồng tự nhiên cho chả). Thiếu một trong những hóa
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
3


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

chất này, chả lụa sẽ không ngon, không dai, không giòn và không đẹp.
Trong đó, hương thịt và hàn the chiếm một vị trí quan trọng bởi nếu thiếu hoặc ít, chả
sẽ kém ngon hơn rất nhiều và nhanh hư.
2.1.2. Các hình thức hư hỏng thường gặp
a. Sự thối rữa thịt
Phân huỷ thối rữa là do sự biến đổi phức tạp, đặc trưng nhất xảy ra trong thịt.
Trong đó sự phân huỷ protein đóng vai trò quan trọng trong sự phân huỷ thối rữa do
hoạt động của các vi sinh vật trên bề mặt thịt gây ra được chia làm 3 giai đoạn:
– Quá trình thuỷ phân protein dưới tác dụng của enzim protease do vi sinh
vật tiết ra tạo sản phẩm cuối cùng là acid amin.
– Quá trình khử acid amin thành amoniac, rượu, H2S,…
– Các chất hữu cơ được tạo thành do sự phân huỷ sơ bộ acid amin lại tiếp
tục chuyển hoá. Tuỳ theo điều kiện thích hợp các chất đó có thể bị oxi hoá hoàn toàn
cho các hợp chất vô cơ, các chất độc, hoặc có mùi hôi thối.
Quá trình thối rữa càng sâu thì vi khuẩn yếm khí càng nhiều, khi đó mô thịt có
màu xám hoặc xám xanh, mềm nhũn, mất tính đàn hồi, pH chuyển từ môi trường acid
đến môi trường kiềm. Các chất khí có mùi khó chịu cũng thoát ra và tăng dần lên.
b. Sự hoá nhầy bề mặt
Đây là dạng hư hỏng thường gặp ở điều kiện bảo quản lạnh, nhất là đô ẩm của
không khí cao, sự hoá nhầy gây ra bởi các giống trực khuẩn chịu lạnh, hiếu khí.
Nhiệt độ tối ưu cho sự hoá nhầy là khoảng 2 – 10 oC, ẩm độ thấp thì thịt chóng
mất nước.
c. Sự lên men chua
Thịt có thể bị chua do vi khuẩn lactic và nấm men nhất là đối với thịt có nhiều
glycogen.
Ban đầu các acid hữu cơ ức chế các vi khuẩn thối rữa phát triển, nhưng môi
trường acid nấm mốc dễ phát triển.

Nấm mốc hoạt động tạo thành amoniac và kiềm nitrua, những chất này là chất
trung hoà môi trường acid tạo điều kiện cho các vi khuẩn gây thối phát triển: Bacillus
subtilis, Bacillus mesenterieus, Bacterium proteus.
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
4


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

d. Thịt bị ôi
Do sự biến đổi mỡ có trong thịt. Vi khuẩn phân giải mỡ thúc đây quá trình oxi
hoá của mỡ, do tác dụng đồng thời của ánh sáng và không khí.
Một số chất béo bị ôi sau khi bị thuỷ phân. Do các vi khuẩn: Pseudomonas,
Achromobacter và một số nấm men.
e. Sự mốc thịt
Sự mốc thịt gây ra do sự phát triển của các loài nấm mốc trên bề mặt thịt. Quá
trình mốc thường bắt đầu bằng sự xuất hiện trên bề mặt thịt những vết chấm hoặc
những mạng tơ có màu trắng, về sau những vết đó lây lan dần và có màu sậm hơn.
Nấm mốc phát triển trên bề mặt thịt không làm thịt bị biến đổi sâu sắc tức thời,
nhưng nó chuẩn bị cho các vi khuẩn gây thối rữa hoạt động sau này. Khi nhiễm loại
mốc đen dạng chùm Cladosporium gerbarum một loài nấm mốc bất toàn có khả năng
mọc sâu vào những lớp bên trong. Khi ăn chúng có thể bị ngộ độc.
2.2. Tổng quan về hàn the
Hàn the còn được gọi là borate sodium, có tên khoa học là sodium tetraborate,
tên thương mại là borax, với công thức hóa học là Na2B4O7.10H2O, có trọng lượng
phân tử 201,22; bột kết tinh thể màu trắng đục, vị hơi nồng, có mùi bốc mạnh. Hàn the

không tan trong acid, tan ít trong nước lạnh, tan nhiều trong nước nóng, khi tan trong
nước hoặc trong không khí ẩm, hàn the cũng có thể bị thuỷ phân tạo ra acid boric theo
phản ứng:
Na2B4O7 + 7H2O

4H3BO3 + 2NaOH.

Khi sử dụng trong chế biến thực phẩm, hàn the có tác dụng hạn chế sự phát
triển của vi khuẩn, nấm mốc nên thực phẩm lâu bị hỏng. Với sản phẩm được chế biến
từ thịt (protein), hàn the có tác dụng làm giảm tốc độ khử oxy của sắc tố myoglobine
trong các sợi cơ của thịt nạc nên nó giữ và duy trì được màu sắc tươi nguyên thủy của
thịt; bên cạnh đó hàn the còn có tác dụng giữ và làm tăng tính ổn định của các phân tử
protein nên sản phẩm sẽ cứng, dai, giòn, đàn hồi (Trần Đáng, 2007).
Các nghiên cứu độc học đã chỉ ra rằng hàn the có khả năng tích tụ trong các mô
mỡ, thần kinh gây tác hại trên nguyên sinh chất và sự đồng hóa các chất albuminoit.
Mặt khác, do hàn the kết hợp với mạch peptide của protein, cũng như liên kết cấu trúc
mạng của glucid, hình thành các dẫn chất mà các men tiêu hóa protein và glucid khó
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
5


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

phân hủy được chúng, làm cản trở quá trình hấp thụ các protein, glucid gây hiện tượng
khó tiêu, chán ăn, mệt mỏi cho người sử dụng. Hàn the còn có thể gây nhiễm độc mãn
tính (do chúng tích luỹ trong cơ thể) gây ảnh hưởng tới tiêu hóa, hấp thu, chuyển hoá,

ảnh hưởng không tốt tới chức năng thận với biểu hiện ăn mất ngon, giảm cân, tiêu chảy,
động kinh, suy thận .
Nguy cơ với sức khỏe cộng đồng và cá nhân của hàn the là rất cao. Do đó, Bộ Y
tế đã ban hành Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31/8/2001, không cho phép sử
dụng hàn the làm phụ gia trong chế biến thực phẩm tại Việt Nam.

2.3. Các con đường vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm
Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm theo các con đường (Đặng Kim Thoại, 2007):
+ Do môi trường không đảm bảo vệ sinh, vi sinh vật từ đất, nước bẩn, không
khí, dụng cụ và các vật dụng khác nhiễm vào thực phẩm.
+ Do thiếu vệ sinh trong quá trình chế biến, thực phẩm không được nấu chín
kỹ, ăn thức ăn sống.
+ Do bảo quản thực phẩm không hợp vệ sinh, không che đậy để côn trùng vật
nuôi,… tiếp xúc vào thực phẩm mang theo vi khuẩn gây bệnh.
+ Do bản thân thực phẩm, gia súc, gia cầm bị bệnh từ trước khi giết mổ vì vậy
thịt của chúng mang các vi trùng gây bệnh hoặc trong quá trình giết mổ, vận chuyển,
bảo quản chế biến, thực phẩm đã bị nhiễm vi khuẩn và các hoá chất độc hại khác.
2.4. Giới thiệu các vi sinh vật thường gây ô nhiễm trong thịt và các sản phẩm
từ thịt

2.4.1. Coliforms tổng số
Coliforms là những trực khuẩn đường ruột, Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy
tiện, không có nha bào, có khả năng lên men đường lactose sinh hơi, sinh acid ở nhiệt
độ 35 - 37 oC trong 24 - 48 giờ (Lê Thanh Mai et al., 2004). Hình dạng vi khuẩn
Coliforms được thể hiện trong Hình 2.

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
6

Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

Hình 2. Hình dạng Coliforms dưới kính hiển vi điện tử
(Nguồn: ngày 23/5/2013)

Những vi khuẩn này có thể tồn tại ở trong ruột người, súc vật và cả ngoại cảnh
gồm các loài sau (Lê Thanh Mai et al., 2004):
-

Escherichia coli

-

Klebsiela

-

Enterobacter

-

Citrobacter

Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng
trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng
hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác (Trần Linh Thước, 2010).

2.4.2. Escherichia coli

Hình 3. Hình dạng vi khuẩn E. coli
(Nguồn: ngày 23/5/20130)

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
7


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

Escherichia coli là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc, hình que chiều dài khoảng
2.0 μm, không sinh bào tử, di động, Gram âm, vô hại, là một vi khuẩn bình thường của
đường ruột ở người, động vật máu nóng và chim. Vì rằng, nó thường có mặt ở nồng độ
rất cao (hàng triệu/g nội chất của ruột già) nên từ lâu nó đã được sử dụng như một vi
sinh vật chỉ thị cho sự nhiễm phân tiềm tàng và sự có mặt của các tác nhân gây bệnh
đường ruột trong thực phẩm và nước. Hình dạng E. coli được thể hiện trong Hình 3.
E. coli có khả năng thủy phân tryptophane trong môi trường sinh indol, không
sinh acetoin (acetyl methylcarbinol), không sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất
(TCVN 5287:1994).
Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong
đường tiêu hoá, ngược lại chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý
đường tiêu hoá. Tuy nhiên có ít nhất 4 dòng sau đây có thể gây bệnh cho người và một
số loài động vật (Nguyễn Tiến Dũng, 2007):
- Enterobathogenic E. coli (EPEC)

- Enterotocigenic E. coli (ETEC)
- Enteroinvasive E. coli (EIEC)
- Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC)/ verocytocin E. coli (VTEC) hay E.
coli O157:H7
E. coli gây bệnh bằng cách phá hỏng các chức năng bình thường của hệ tiêu
hoá. Các dòng E. coli khác nhau có thể tiết các chất độc. Những chất độc này xâm
nhập và làm tổn thương các tế bào tiêu hoá. Vi khuẩn E. coli chỉ có thể gây bệnh khi
chúng có khả năng vào trong đường ruột, có khả năng chống chịu được các điều kiện
trong hệ tiêu hoá và có khả năng gây độc lên tế bào tiêu hoá. E. coli không cần có các
gene đặc hiệu để vào trong đường ruột. E.coli vô hại thường có khả năng vượt qua
hàng rào bảo vệ ở đường ruột. Thức ăn và nước uống là con đường lý tường giúp E.
coli xâm nhập vào trong đường ruột. Khi vào được bên trong, E. coli phải có khả năng
gắn chặt vào tế bào của hệ tiêu hoá để gây bệnh. Một số tạo ra pili, một số tạo ra phức
hợp intimin giúp chúng bám chặt vào thành tiêu hoá.
Các dòng E. coli gây bệnh khi chúng xâm nhiễm vào người qua con đường thực
phẩm có thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu hoá, các biểu hiện lâm sàng biến
động có thể từ nhẹ đến rất nặng, có thể đe dọa mạng sống của con người phụ thuộc vào
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
8


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

liều lượng, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người (Nguyễn Tiến Dũng,
2007).
Dòng ETEC bám vào hệ tiêu hoá và tiết độc tố. Chúng gây tiêu chảy không

kèm theo sốt. Gây bệnh phổ biến trên trẻ sơ sinh chứa plasmid mã hóa một
enterotoxin. Có 2 loại enterotoxin khác nhau được tìm thấy trong các dòng ETEC, cả 2
loại enterotoxin đều gây bệnh viêm ruột.
Dòng EHEC bám vào tế bào nhờ một loại protein tên là intimin, chứa plasmid
mã hóa một verotoxin tiết chất độc có tên là Shiga toxin gây triệu chứng bệnh lỵ, đôi
khi gây bệnh thận. Độc chất của EHEC là một cytotoxin, nó phá huỷ tế bào ruột kết,
có thể gây bệnh và ảnh hưởng đến chức năng thận. Điển hình nhất là dòng E.coli
O157:H7.
Một số dòng gây bệnh khác hiếm gặp khác của E. coli là:
EIEC (Enteroinvasive E. coli) thường gây tổn thương đối với tế bào ruột già,
thường gây tiêu chảy kèm sốt.
EPEC (Enteropathogenic E. coli) thường gây tiêu chảy, tiêu chảy ra máu. Đây
là nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh tại các nước kém phát triển..

2.4.3. Vi khuẩn hiếu khí
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong
điều kiện có sự hiện diện của oxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong
mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm (Trần Linh Thước, 2010).
Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đáng giá chất lượng của mẫu về
vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong
quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm (Trần Linh Thước, 2010).

2.4.4. Nấm men và nấm mốc
Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn
400.000 loài nấm men và nấm mốc đã được mô tả. Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật,
có vách tế bào và lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài men và
mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn carbon hữu cơ để cung
cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài. Vì thế vi sinh vật này thường được phân lập
từ thực phẩm hoặc các nguồn giàu dinh dưỡng khác. Có thể phân biệt nấm men và
nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau: nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
9


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

bào tử hoặc khuẩn ty; nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi,
thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành
chuỗi. (Trần Linh Thước, 2010).
Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay
đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu
của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm.
2.5. Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt
Bảng 1. Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt
(Theo Quyết định 46/2007/QĐ-BYT “Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và
hóa học trong thực phẩm”)
SẢN PHẨM

LOẠI VI SINH VẬT

GIỚI HẠN VI SINH VẬT
(trong 1g hoặc 1mL sản
phẩm)

Thịt và sản phẩm thịt
đóng gói

TSVSVHK
Coliforms

10
50

E. coli

Không có

S. aureus
Cl. perfringens

10
10

Cl. botuliniums

Không có

Salmonella

Không có

Listeria monocytogenes

Không có

TSVSVHK

Coliforms

10
50

E. coli

Không có

S. aureus

10

Cl. perfringens
Salmonella

10
Không có

Listeria monocytogenes

Không có

Thịt và sản phẩm thịt
không đóng gói

4

2

5

2
2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
10


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện thí nghiệm
3.1.1. Mẫu thí nghiệm
Gồm 5 loại mẫu chả lụa mua từ 5 cơ sở sản xuất chả lụa trên địa bàn thành phố
Cần Thơ.
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát
triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.3. Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ tháng 08 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013.
3.1.4. Vật liệu nghiên cứu
a. Môi trường và thuốc thử
Dung dịch pha loãng:
- NaCl

9g

- Nước cất

1000mL

Môi trường Endo (Lê Thanh Mai et al., 2004)
- Peptone

10g

- Fucshin kiềm (C20H20CIN3)

0.3g

- Lactose (C12H22O11)

10g

- K2HPO4

2.5g

- Na2SO3

3.3g

- Agar

15g

- Nước cất

1000mL

Pha chế: Hòa tan các chất và môi trường, khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian
15 phút.
Simmons Citrate Agar (SCA) (Trần Linh Thước, 2010)
- Sodium citrate

2g

- NaCl

5g

- K2HPO4

1g
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
11


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

- NH4H2PO4

1g

- MgSO4

0.2g

- Bromothymol blue

0.08g

- Agar

15g

- Nước cất

1000mL

Đun nóng nhẹ và thỉnh thoảng lắc. Đun sôi 1-2 phút cho đến khi hoà tan. Phân phối
vào 1/3 ống nghiệm. pH cuối 6.8±0.2.
Môi trường peptone d’indol:
- Tryptone

10g

- NaCl

5g

- Nước cất

1000mL

Hòa tan 15g bột khan trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn.
Chỉnh pH = 7.3. Phân 5 - 10ml môi trường vào các ống nghiệm 16mm x 160mm. Khử
trùng nhiệt ướt ở 1210C/20 phút.
Môi trường MR - VP (Methyl Red Voges Prokauer) (TCVN 5287:1994)
- Peptone

5g

- Glucose

5g

- K2HPO4

5g

- Nước cất

1000mL

Pha chế: Đun để hòa tan thành phần trên trong nước cất, rót vào các ống nghiệm có
dung tích phù hợp, hấp thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Điều chỉnh pH là 7,5  0,1
ở 25oC.
Thuốc thử Kovas’s
- P.méthyl amino bezandéhyde

5g

- Alcool amylique

75mL

- HCl

25mL

Hòa tan P.méthyl amino bezandéhyde trong Alcool amylique, đun cách thủy nhẹ ở 50
– 550C cho đến khi tan hoàn toàn. Thêm HCl vào, vừa cho vào vừa làm lạnh với nước
đá. Bảo quản ở 4 0C trong chai màu nâu.
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
12


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

Thuốc thử Methyl Red (MR):
- Methyl red

0,1g

- Ethanol 95%

300mL

- Nước cất

200mL

Thuốc thử Barritt (Trần Linh Thước, 2010)
Dung dịch A chứa 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối.
Dung dịch B chứa 40% KOH hoặc NaOH.
Khi sử dụng, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc
kết quả sau 20 phút.
Môi trường PCA (Plate Count Agar):
- Tryptone

0.5%

- Yeast extract

0.25%

- Glucose

0.1%

- Agar

1.2-1.8%

- Nước

Vừa đủ 100%

Hòa tan 26.5g bột khan môi trường PCA trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến
khi tan hoàn toàn, chỉnh pH=7.0  0.2. Phân vào chai 100ml môi trường . Khử trùng
nhiệt ướt ở 1210C trong 20 phút.
Môi trường YDC (TCVN 5750:1993)
- Beef extract

5g

- Glucose

20g

- Oxytetracyline

0.1g

- Agar

15g

- Nước cất

1000mL

Pha chế: đun sôi hòa tan thành phần trên trong nước cất, để nguội khoảng 45ºC trong
nồi cách thủy, điều chỉnh pH là 6.6 ± 0.1 ở 25ºC, chứa từng lượng có dung tích 100ml
vào bình có dung tích phù hợp, hấp thanh trùng 121ºC trong 15 phút. Trong trường
hợp không có oxytetracyline có thể thay thề bằng chloramphenicol (C11H12C12N2O5)

và được chuẩn bị như sau: từ các lọ đã chứa 100mL môi trường không có
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
13


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

oxytetracyline, làm chảy môi trường và duy trì ở 45ºC trong nồi chưng cách thủy.
Chuẩn bị dung dịch 0.1% oxytetracyline bằng cách hòa tan 0.1g oxytetrcyline trong
100mL nước cất, lọc thanh trùng. Cho 10mL dung dịch 0.1% oxytetrcyline vào 100mL
môi trường đã nóng chảy, lắc để trộn đều.
b. Hoá chất khác
– Acid clodidric
– Cồn 900
– Giấy quì xanh
– Nghệ
c. Thiết bị dụng cụ
– Máy đồng hóa mẫu.
– Tủ sấy dùng để khử trùng nhiệt khô ở 180oC.
– Bếp đun cách thuỷ 45oC, 50oC  1oC.
– Ống hút khắc vạch 1mL, 2mL, 5mL, 10mL.
– Máy vortex (HEIPOLPH, Đức).
– Tủ cấy (Totelstar Bio-II-A, Tây Ban Nha).
– Nồi thanh trùng (Breukelen, Hà Lan).
– Tủ ủ (Herich, Đức).
– Cân phân tích (Ohaus Corp, ARA520, Mỹ).

– Các dụng cụ thông dụng như: đĩa petri, ống nghiệm, pipet, bình tam giác
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp thu mẫu
Kiểm tra mẫu 3 lần lặp lại, mỗi lần cách nhau 1 tháng.
Cách lấy mẫu, bảo quản mẫu và chuẩn bị mẫu thử để kiểm tra vi sinh vật
– Lấy vài lát cắt trên một cây chả cho vào túi nilon
– Bảo quản ở tủ lạnh 4 oC.
3.2.2. Định tính hàn the
3.2.2.1. Nguyên tắc

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
14


Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

Mẫu thực phẩm được acid hóa bằng acid hydrocloric (PA 36%), sau đó đun
nóng trên nồi cách thủy, acid boric (H3BO3) hoặc natri borat (Na2B4O7) được phát hiện
bằng giấy nghệ. Sự có mặt của H3BO3 hoặc Na2B4O7 sẽ chuyển màu của giấy nghệ
sang màu đỏ cam. (Nguyễn Thị Thanh Hương, 2012)
3.2.2.2. Chuẩn bị thuốc thử
Chuẩn bị giấy nghệ từ bột nghệ: Cân 1,5 - 2 g bột nghệ cho vào bình nón dung tích
250 mL, thêm 100 mL cồn 80% lắc mạnh cho tan hỗn hợp rồi lọc qua giấy lọc. Cho dịch ra
một khay thủy tinh nhúng giấy lọc vào dịch lọc, chờ thấm đều lấy ra phơi khô ở nhiệt độ
phòng sau đó cắt thành những dải giấy có kích thước 1x6cm. Giấy nghệ được bảo quản
trong lọ kín tránh ánh sáng, ẩm và hơi CO2, SO2, NH3, NO…

3.2.2.3. Xử lý mẫu thử
Cho vào cốc có mỏ dung tích 200 mL: Gồm: 25g mẫu thực phẩm đã nghiền nhỏ
trong cối sứ + 50 mL nước cất.
Dùng đũa thủy tinh trộn mẫu. Acid hóa bằng 1,7 mL HCl. Kiểm tra bằng giấy
quỳ xanh (giấy qùy phải chuyển sang màu đỏ). Đun cách thủy trong 30 phút, để lắng
hoặc ly tâm. Sau đó chắt lấy phần dịch trong để phân tích.
+ Nếu mẫu có chất béo thì làm lạnh bằng nước đá hoặc để trong tủ lạnh rồi vớt bỏ lớp
chất béo đã đông lại.
+ Nếu mẫu có màu thì loại màu bằng cách cho sợi len nguyên chất vào mẫu để hấp thụ
hết màu rồi lấy dịch trong không màu đem phân tích.
3.2.2.4. Định tính acid boric hoặc natri borat trong mẫu thử
Nhúng dải giấy nghệ vào dịch thử cho thấm đều, lấy giấy ra để khô tự nhiên rồi
đọc kết quả sau 1 giờ, nhưng không quá 2 giờ.
Tiến hành đồng thời một mẫu trắng để so sánh (thay 25 g mẫu thử bằng 25 mL
nước cất và làm theo quy trình trên).
Nếu màu của giấy nghệ chuyển từ vàng sang đỏ cam thì trong mẫu có H3BO3
hoặc Na2B4O7.

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Vi sinh vật học
15