Nghiên cứu định lượng thuốc nhỏ mắt tobramycin 0,3 % bằng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang tạo dẫn chất sau cột

Bễ Y Tẫ
TRĩễNG DAI HOC DlTOC H NễI
... C8 8 S ... f f l ...CợôBD...

NGUYEN THIANH TUYET

NGHIấN CtJXJ DINH LlTONG THUễC NHễ MT
TOBRAMYCIN 0,3 % BANG PHI/ONG PHP HPLC VễI
DETECTOR HUNH QUANG, TAO DN CHAT SAU CễT
(KHO LUN TOT NGHIấP DĩOC S KHOA 2002- 2007)

Nguựi huõng dõn: PGS.TS Thõi Phan Qunh Nhu
PGS.TS Thõi Duy Thợn
Nai thuc hiờn: Phụng hoõ l I - Viờn kiờm nghiờm thuục trung uang
Bụ mon Hoõ duỗfc - Tnrcmg Dai hoc Dirac H Nụi
Thõi gian thuc hiờn : Tỷr thõng 10/2006 dộn thõng 5/2007

H Nụi, Thõng 5 -2007


L Ô 3 C Â H I0 R
Khoâ luân này duac thuc hiên và hoàn thành tai phông Hoâ lÿ I - Viên
kiëm nghiêm thuôc trung uong và Bô mon Hoâ duac - Truông Dai hoc Duac
Hà Nôi. Trong quâ trînh thuc hiên khoâ luân này, tôi dâ nhân duac su giüp dà
tân tinh cua câc thày, cô huông dân, câc giâng viên cüa bô mon Hoâ duac và
câc cân bô cüa phông Hoâ Lÿ I - Viên kiëm nghiêm thuôc trung uong.
Loi dàu tiên tôi xin bày tô long biet on sâu sac toi:
• PGS.TS THÂI DUY THÎN
• PGS.TS THÂI PHAN QUŸNH NHlT
Dâ giüp dô tôi nhüng tài liêu và hucfng dân nhùng kÿ nâng cân thiët trong
quâ trînh thuc hiên khoâ luân.

Tôi xin câm an su giüp dô cüa câc thày, câc cô, câc kÿ thuât viên trong
bô mon Hoâ duac và câc cân bô phong Hoâ lÿ I Viên kiëm nghiêm thuôc
trung uong dâ giüp dô tôi hoàn thành tôt khoâ luân tôt nghiêp cüa minh.
Tôi xin câm an su quan tâm cüa Ban giâm hiêu, phông dào tao Nhà
truàng và câc thây giâo, cô giâo dâ truyên dat kiên thuc cho tôi trong suôt thôi
gian tôi hoc tâp tai trucmg.
Cuôi cüng tôi xin tô long biét an tôi gia dînh, ban bè và nhüng nguôi thân
luôn sât cânh bên tôi trong suôt quâ trînh hoc tâp cüng nhu thuc hiên dê tài.
Hà Nôi ngày 20 thâng 5 nâm 2007
Sinh viên
Nguyên Thi Ânh Tuyet


MUC LUC

Trang

DAT VAN Dấ...................................................................................1
ằ

PHAN 1: TễNG QUAN..................................................................... 3
1.1. Tong quan vộ Tobramycin..........................................................................3
1.2. Mot so phirang phõp duac õp dung de djnh luong Tobramycin........ 4
1.2.1. Phirang phõp vi sinh võt...................................................................... 4
1.2.2. Phirang phõp HPLC.............................................................................6
1.3. Tong quan vố phirong phõp HPLC........................................................... 8
1.3.1. Khõi quõt chung................................................................................... 8
1.3.2. Nguyờn tõc cõu tao cỷa hờ thong mõy HPLC.................................... 8
1.3.3. Cõc dai luỗrng dõc trung.......................................................................9
1.4. Co sụ l thuyởt ve hunh quang...............................................................11

1.4.1. Su hinh thnh quang pho hunh quang............................................ 11
1.4.2. ĩng dung cỷa phộp do hunh quang................................................ 13
1.5. Phirong phõp HPLC vol Detector hunh quang - tao dõn xuõt sau cụt
13
1.5.1. Phuong phõp HPLC voti detector hunh quang............................... 13
1.5.2. Tao dõn xuõt sau cụt..........................................................................14
1.5.3. Phõn ỹng tao dõn xuõt phõt hunh quang cỹa Tobramycin.............16

PHAN 2: THlTC NGHIấM V KẫT QU.....................................17
2.1. Nguyờn võt lieu v phuong phõp thuc nghiờm......................................17
2.2.1. Doi tuong nghiờn cỹu........................................................................ 17
2.2.2. Thiột bj v hoõ chõt............................................................................ 17


2.2.3. Nôi dung và phirang phâp nghiên ciru..............................................18
2.2. Kët quâ thuc nghiêm và nhân x é t...........................................................20
2.2.1. Lira chon dieu kiên sâc k ÿ ................................................................20
2.2.2. Dânh giâ phirong phâp...................................................................... 28
2.2.3. Üng dung dinh luçmg Tobramycin trong chë phâm.........................36
2.2.4. Bàn luân..............................................................................................38

KÉT LUÂN...................................................................................... 41
TÀI LIEU THAM KHÂO
PHU LUC


NHÜNG CHÜ VIÊT TÂT
BP

:

Duac diën Anh.

Em

:

Birôc song bure xa (Emission).

Ex

:

Birôc song kfch thfch (Excitation).

EP

:

Duac diën Châu Âu.

HD

:

Han dùng.

HPLC

:

Sâc kÿ long hiêu nâng cao.

JP

:

Duac diën Nhât.

NSX

:

Ngày sân xuât.

RSD

:

Dô lêch chuân tuang dôi.

S

:

Dô lêch chuân.

SKS

:

So kiëm soât.

TCCS

:

Tiêu chuân ca sa

USP

:

Duac diën Mÿ.

UV - VIS

:

Quang ph6 tu ngoai - khâ kiën.

VSV

:

Vi sinh vât.


* Câc don vi do lircmg diroc viët tât nhu sau:
- Dan vi do chiêu dài:

Centimet

:

cm

Milimet

:

mm

Micromet

:

|im

Nanomet

:

nm

Gam

:

g

Miligam

:

mg

Microgam

:

Hg

Lit

:

L

Mililit

:

mL

Microlit

:

^L

- Dan vi do khoi luang:

- Dan vi do thé tich:


DAT VAN DE
Hiên nay trên thi truông thuôc, câc chë phâm khâng sinh rât phong
phu và da dang. Aminoglycosid là nhôm khâng sinh 1cm, rât cô hiêu quâ trong
dièu tri, dâc biêt vôi câc nhiêm khuân nàng. Là mot khâng sinh trong nhôm
này, Tobramycin duoc chî dinh trong câc truông hop: nhiêm khuân tiët niêu,
nhiêm trùng mâu, viêm màng nâo, viêm phoi, nhiêm khuân mât,... do câc
chung vi khuân nhay câm.
Công ty co phàn Duoc phâm Hà Tây dâ sân xuât và liru hành trên thi
truông sân phâm “Thuôc nhô mât Tobramycin 0,3%” vôi tiêu chuân co sô
dinh luong bâng phirong phâp vi sinh vât.
Cüng nhir câc khâng sinh khâc trong nhôm aminoglycosid, Tobramycin
không cô hâp thu quang ô vùng tü ngoai - khâ kiën, vi vây phirong phâp dinh
luong ph6 biên vân là phirong phâp vi sinh vât. Phirong phâp này mât nhiêu
thôi gian, dô chrnh xâc chira thât cao và không cô khâ nàng dinh tmh. Vi vây,
chat lirong sân phâm không diroc dânh giâ mot câch on dinh. De giüp cho
công ty co phàn Diroc phâm Hà Tây cô môt phirong phâp dinh lirong sân
phâm chfnh xâc, on dinh và nhanh chông hon, chüng tôi nhân thây râng:
Diroc diën Mÿ USP 28 [26] dâ âp dung phirong phâp sâc kÿ long hiêu
nâng cao vôi detector UV - VIS, tao dân xuât tnrôc côt dë dinh lirong
Tobramycin, nhimg qui trînh tao dân xuât này rât phüc tap. Gân dây trong EP
2003 [22] hay BP 2005 [18], phirong phâp sâc kÿ long hiêu nàng cao vôi
detector diên hôa (detector do dong) dâ duoc dira vào sü dung dë thay thé
phuong phâp vi sinh vât. Phirong phâp này tiên hành nhanh, kêt quâ tin cây, song
hàu hët câc co sô kiëm nghiêm trong nirôc hiên nay không dâp üng diroc câc dieu
kiên dinh lirong. Mât khâc dë dinh luong câc chë phâm cô chüa hoat chât vôi

lirong nhô hoac không cô hâp thu quang ô vùng tü ngoai - khâ kiën thi phirong
phâp sâc kÿ long hiêu nàng cao vôi detector UV - VIS lai không âp dung duoc.

1


Detector huÿnh quang hiên nay cüng dâ diroc dùng phë bien düng thü hai
sau detector UV- VIS tai câc co sô kiêm nghiêm trong kÿ thuât HPLC. No
duoc âp dung dë phât hiên tôt nhiêu chat phât huÿnh quang tu nhiên cüng nhu
câc dân chat co huÿnh quang. Tobramycin là hop chat aminoglycosid, tuong
tu nhu câc hop chat amin khâc no cüng cô khâ nàng tao dân chat phât huÿnh
quang vôi mot sô thuôc thü. Viêc phât hiên câc chat bàng quang phô huÿnh
quang lai cô tmh dâc hiêu cao và rât nhay.
Do dô, chüng tôi dâ tien hành nghiên cüu dê tài:
“Nghiên cûu dinh luong thuôc nhô mât Tobramycin 0,3% bàng
phuong phâp HPLC vâi detector huynh quang, tao dân chat sau côt” vôi
câc mue tiêu sau:
- Xây dung duoc mot phuong phâp dinh luong Tobramycin bàng HPLC
vôi Detector huÿnh quang - tao dân chât sau côt và dânh giâ phuong phâp vùa
xây dung
- Üng dung phuong phâp vùa xây dung dë dinh luong Tobramycin trong
chë phâm, tien tôi tiêu chuân hôa lai “Thuôc nhô mat Tobramycin 0,3%” cüa
công ty co phân Duoc phâm Hà Tây.

2


PHAN 1. TONG QUAN
1.1. TONG QUAN VE TOBRAMYCIN
Tobramycin là môt khâng sinh nhôm aminoglycosid thu duoc tir môi

truông nuôi cây Streptomyces tenebrarius hoàc cô thé bân tong hop tir
Kanamycin.
Công thûc phân tü '• c 18H37N5o 9.
Phân tü luong

: 467,5.

Công thûc eau tao

:

Tên khoa hoc: 4-0-(3-Amino-3-deoxy-a-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-60-(2,6-diamino-2,3,6-trideoxy-a-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [1].
Tinh chat: [1], [18]
+ Bôt tràng hoàc tràng ngà. Dë tan trong nuôc, rât khô tan trong ethanol
96%, thuc të không tan trong cloroform và ether.
+ Gôc quay eue riêng [a]D20 tir +138° dën +148°.
Duoc lÿ và co che tac dung: [1], [4]
+ Tobramycin là môt khâng sinh nhôm aminoglycosid cô tâc dung vôi
nhiêu vi khuân Gram (-) hiëu khi và môt sô vi khuân Gram (+) hiëu khi.
Thuôc không cô tâc dung vôi Chlamydia, nam, virus và da sô vi khuân yëm khi.

3


+ Tobramycin rõt giụng Gentamycin vờ tfnh chat vi sinh hoc v dục tfnh:
tõc dung manh trờn vi khuõn Gr(-) dõc biờt trờn truc khuõn mỹ xanh; gõy dục
vụi thợnh giõc v thn, tuy nhiờn dc diởm quan trong nhõ't cỷa Tobramycin l
cụ hoat tfnh manh hon Gentamycin dụi vụi phn lụn cõc chỹng Pseudomonas
aeruginosa v ợt dục vụi thn hon so vụi Gentamycin.
+ Co chộ tõc dung cỹa Tobramycin: Lie chộ su tong hop protein cõc vi

khuõn nhay cõm bng cõch gn khụng thun nghich vụi cõc tiởu don vi 30S
cỹa Ribosom.
Chùdinh: [4]
Duoc chợ dinh trong cõc bờnh nhiờm khuõn nng de doa tụi tmh mang,
dc biờt vụi cõc bờnh m nguyờn nhõn chua rụ rng hoc bi nhiờm khuõn
huyột do vi khuõn Gram (-).
Dang thuục v hm luỗfng: [4]
Thuục khụng hõp thu qua duụng uong, thuụng duoc dựng duụi cõc dang:
Lo 5 mL 0,3% dở nhụ mat. Tup 3,5 g mụ tra mõt 0,3%.
Thuục tiờm: Lo 20 mg/2 mL; 60 mg/6 mL; 80 mg/8 mL; 80 mg/2 mL; 1,2 g/30 mL.
1.2. MOT Sễ PHĩGNG PHP DlTOC P DUNG DE DINH LlTONG
TOBRAMYCIN
1.2.1. PHUONG PHP VI SINH VT

Nguyờn tõc: Tobramycin khuyờch tõn vo mụi truụng dung dich dac dõ
cõy vi sinh võt chù thi, tao ra cõc vụng ỹc chộ vi sinh võt cụ duụng kinh t lờ
thuõn vụi logarit nụng dụ tuong ỹng. Hoat lue cỹa chat thỹ duoc so sõnh vụi
chat chuõn theo phuong phõp thụng kờ.
+ Xõc dinh hoat lue khõng sinh cỹa Tobramycin bng phuong phõp vi
sinh võt theo JP 14 [25].
Chỹng vi khuõn: Bacillus subtilis ACTT 6633

4


+ Dinh luçmg Tobramycin bâng phirong phâp vi sinh vât theo tiêu chuân
co sô cüa mot sô ché phâm sân xuât trong nirôc: [5], [6]
a. Chüng vi khuân: Bacillus pumilus NCTC 8241.
b. Dung dich dêm phosphat pH 8,0 ± 0,1 :
c. Môi trudng dinh litong:

Cao men bia

3,0 g

Pepton

6,0 g

Casein pancreatic

4,0 g

Glucose

1,0 g

Cao thit

1,5 g

Thach

15,0 g

Nuôc cât

100 mL

pH sau khi tiêt trùng

8,2 ± 0,2

d. Chuân bi dung dich chuân và dung dich thü:
+ Dung dich chuân: Cân chmh xâc khoâng 25,0 mg Tobramycin chuân, hôa
tan và pha loâng trong dung dich dêm phosphat 8,0 dë diroc câc dung dich chuân
cô nông dô Tobramycin chmh xâc khoâng 10 IU/mL, 20 IU/mL và 40 IU/mL.
+ Dung dich thü (ché phâm): Hüt chmh xâc 5,0 mL ché phâm (tuong üng
vôi khoâng 3 mg Tobramycin), pha loâng vôi dung dich dêm phosphat pH 8,0
dë diroc câc dung dich thü cô nông dô Tobramycin khoâng 10 IU/mL, 20 IU/mL
và 40 IU/mL.
+ Tien hành thü và trnh toân két quâ theo phirong phâp xâc dinh hoat lue
khâng sinh - Duoc diën Viêt nam III [3].

5


1.2.2. PHUONG PHÂP HPLC

1.2.2.1. Chirong trînh HPLC 1: [181, [22]
* Dieu kiên sac ky:
- Côt styren-divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8 |um).
- Nhiêt dô côt: 55°C.
- Pha dông: Hôn hop pha trong nuôc dâ loai carbon dioxyd chüa: 52 g/L
natri sulfat khan; 1,5 g/L natri octansulfonat; 3 mL/L tetrahydrofuran và 50
mL/L dung dich kali dihydrophosphat 0,2 M dâ duoc chînh pH vè 3,0 bâng
acid phosphoric loâng.
- Toc dô dông: 1 mL/phüt.
- Dung dich tao dân xuât sau côt: Dung dich natri hydroxyd 2% pha
trong nuôc dâ loai carbon dioxyd. Toc dô 0,3 mL/phüt.
- Detector: Detector diên hôa (detector do dông) hoàc câc thiê't bi tuong

tu. Nhiêt dô detector dât ô 35°C.
- Thë tich tiêm: 20 (aL.
- Nông dô dung dich chuân và thü: khoâng 0,1 mg/mL trong nuôc.
1.2.2.2. Chirong trinh HPLC 2: [14]
* Dieu kiên sac ky:
- Côt Purospher® STAR RP-18e (4 x 55 mm, 3 |um, Merck).
- Pha dông: Acetonitril - nuôc (50 : 50).
- Toc dô dông: 1,3 mL/phüt.
- Dung dich tao dân xuât: Dung dich 1-naphthyl isothiocyanat (NITC)
trong pyridin.
- Detector UV-VIS: 230 nm.
- Thë tich tiêm: 10 ^iL.
- Nông dô dung dich chuân và thü: khoâng 5 |ng/mL trong nuôc.

6


I.2.2.3. Chiùcmg trợnh HPLC 3: [19]
* Dieu kiờn sõc ky:
- Cụt Ultrasphere RP 8 (4,6 x 250 mm, 5 ^m).
- Pha dụng: Acetonitril - dờm phosphat 0,05 M (62 : 38),diờu chợnh vố
pH 3,5 bng acid phosphoric.
- Toc dụ dụng: 2,5 mL/phỹt.
- Dung dich thuục thỹ acid 2,4,6 trinitrobenzensulfonic: Hụa tan 2,5 g
acid 2,4,6 trinitrobenzensulfonic trong vựa dỷ 10 mL hụn hop (Acetonitril nuục) (80 :20).
- Detector UV-VIS: 340 nm.
- Thở tich tiờm: 20 (ixL.
- Nụng dụ dung dich chuan v thỹ: khoõng 0,02 mg/mL trong dờm
phosphat pH 7,4.
Ngoi cõc phirong phõp trờn, ngirụi ta cỹng dõ nghiờn cỹu phirong phõp

dinh luong Tobramycin bng sac k long trao dụi anion vụi detector diờn hụa
(detector do dụng) [27]. Cõc phirong phõp dinh lirong Tobramycin nờu trờn
thuụng mõt nhiờu thụi gian (phirong phõp vi sinh võt) hoc tien hnh phỹc tap
v dụi hụi phõi cụ thuục thỹ, trang thiờ't bi dõc biờt (phirong phõp HPLC).
Mõt khõc do Tobramycin cụ cõu trỹc cỹa mụt aminoglycosid, khụng hõp
thu quang ụ vựng tỹ ngoai - khõ kiộn, nờn khụ cụ thở dinh luong bng phuong
phõp hoõ hoc hoc phõt hiờn bng quang phụ UV- VIS. Mụt trong cõc biờn
phõp thuụng duoc sỹ dung dở phõt hiờn ra cõc chat khụng cụ khõ nng hõp thu
quang ụ vựng tỹ ngoai - khõ kiờn bng cõc detector quang phụ l cho no phõn
ỹng vụi mụt thuục thỹ dở tao thnh dõn xuõt cụ khõ nng dõp ỹng vụi cõc
detector thich hop. Tobramycin l hop chat aminoglycosid, tuong tu nhu cõc
hop chat amin khõc nụ cỹng cụ khõ nng tao dõn xuõt phõt hunh quang vụi
mụt sụ thuục thỹ. Viờc phõt hiờn cõc chõt bng quang phụ hunh quang cụ

7


tfnh dc hiờu cao v rõt nhay, do dụ chỹng tụi dõ chon huụng nghiờn cỹu l
dinh lirong Tobramycin bng sc k long hiờu nng cao vụi detector hunh quang.
1.3. TONG QUAN VE PHlTONG PHAP HPLC [2], [8], [10]
1.3.1. KHI QUT CHUNG
Sc k long hiờu nng cao (HPLC) l mot phirong phõp phõn tich hoõ l,
dựng dở tõch v dinh luong cõc thnh phn trong hụn hop dua vo õi lue khõc
nhau cỹa cõc chõt vụi hai pha luụn tiộp xỹc v khụng dụng tan vcfi nhau. Pha
dụng l chõt long chõy qua cụt vụi mụt toc dụ nhõt dinh duụi õp suõt cao, cụn
pha tợnh chỷa trong cụt hiờu nng cao (hat nhụi). Khi dung dich cỷa hụn hop
cõc chõt cõn phõn tich dua vo cụt, chỹng sở duoc hõp thu hoc phõn bụ' vo
pha tợnh tu thuục vo bõn chõt cỹa cụt v cỹa chõt cõn phõn tich dua vo cụt.
Khi ta bom pha dụng vụi õp suõt cao thi tu thuục vo õi lue cỹa cõc chõt vụi
hai pha, chỹng sở di chuyởn qua cụt vụi toc dụ khõc nhau dõn dộn su phõn

tõch. Cõc chõt sau khi ra khụi cụt duoc nhõn biờt bụi bụ phn phõt hiờn goi l
detector, kột quõ xỹ l cuụ'i cỹng duoc hiởn thi trờn mn hinh mõy vi tfnh.
1.3.2. NGUYấN TC CAU TAO CĩA Hấ THONG MY HPLC
Hờ thụng k thut HPLC bao gụm cõc bụ phõn chmh:
-

Bợnh chỷa dung mụi pha dụng: Bợnh thuụng lm bng thu tinh hoc

thộp khụng rợ. Dung mụi chay sc k duoc loc qua mng loc (thuụng mng loc
cụ 0,45 (im) v duội khi ho tan.
-Bom cao õp: Bom ny cụ chỹc nng bom dung mụi vo cụt dở thuc hiờn
quõ trợnh tõch. Bom ny duoc dieu chợnh õp suõt dở tao ra duoc nhỹng toc dụ
on dinh nhõt cỹa cõc chõt cho phự hop vụi quõ trợnh sc k.
-Van bom mõu: Van ny dở bom mõu phõn tich vo cụt tõch theo nhỹng
luỗfng nhõt dinh khụng doi trong mot quõ trợnh sc k. Cõc van ny cụ dung
tich tỹ 5-500 jil, thuụng dựng 20, 50, 100 [il.
-Cụt tõch: L cụt chỹa pha tợnh, quyột dinh hiờu quõ cỹa su tõch mot

8


hôn hop mâu. Côt tâch thucmg làm bàng thép không rî, dàc biêt tro vôi hoâ
châ't và chiu duoc âp suât cao, cô chiêu dài khoâng 10- 30 cm, duông ki'nh
trong 4- 10 mm, hat chât nhôi cô (J> =5- 10 (im. Thông thucmg chât nhôi côt là
Silicagel hoàc Silicagel dâ duoc silan hoâ hoàc duoc bao mot lôp mông hüu
co, ngoài ra con dùng câc hat khâc: Nhôm oxit, châ't trao doi ion...
-Hê thong phât hiên chât phân tich ( detector): Là bô phân phât hiên câc
chât khi chüng ra khôi côt. Tuÿ theo tfnh chât cüa câc chât cân phân tich mà
nguôi ta sü dung câc detector khâc nhau nhu:
>

Detector hâp thu UV-VIS: 190- 900 nm dë phât hiên câc chât hâp

thu quang. Dây là loai thông dung nhât.
> Detector huÿnh quang: Dë phât hiên câc châ't hüu co phât huÿnh
quang tu nhiên cüng nhu câc dân chât cô huÿnh quang. Dây là loai detector
cô dô chon loc cao nhât.
> Detector diên hoâ (do dông, dô dân, eue pho, diên luong.. )
> Detector khôi pho.
> Detector tân xa ânh sang bay hoi.
> Detector chiê't xuât vi sai: Detector khüc xa.
> Detector do dô dân nhiêt, hiêu üng nhiêt...
-

Hê thong thu nhân và xü lÿ kê't quâ: Dë ghi tm hiêu phât hiên do

detector truyên sang.
1.3.3. CÂC DAI LUONG DÀC TRUNG

• Thâi gian liûi ( tR )
Thôi gian luu cüa môt châ't là thôti gian tfnh tù lüc tiêm mâu dê'n lüc xuâ't
hiên dinh cûa pic trên sàc dô.
Thôi gian luu dàc trung cho toc dô di chuyën cüa mot châ't, no là hàng
dinh và câc chât khâc nhau thi thcfi gian luu sê khâc nhau trong cüng mot diêu
kiên HPLC dâ chon. Do dô no là dai luong dùng dë dinh tînh mot chât.

9


• Hê so dung litçfng (k ’):

r

r

r

Hê sô dung luçmg là tÿ sô giüa luçmg chât tan trong pha tînh và luçmg
chât tan trong pha dông ô thoi diêm cân bàng.
k'= ———= -^--1 ( t0 là thcfi gian luu cüa chât không bi luu giü)
to
to
*Dô chon loc a:
r

r

r

Dô chon loc a cho biêt hiêu quâ tâch cüa hê thông sàc kÿ.
—t
a _ ak ' At_ LR
B lO
b-* t
^ B lRAf L0

B là chât bi luu giü manh hon A
Dê tâch hai chât cân co a >1, thuàng dùng trong khoâng 1,05-2,0.
Nêu a quâ Ion thi thoi gian phân tich kéo dài.
r

f

'y

r

•Sô âîa lÿ thuyêt N và chiêu cao âïa lÿ thuyêt H:
Côt sâc kÿ duoc coi nhu cô N lôp mông, ô môi lôp su phân bô chât
tan vào hai pha duoc coi là dat dên mot trang thâi cân bàng.Nhüng lôp mông
này duoc goi là dïa lÿ thuyêt. H là chiêu cao dïa lÿ thuyêt
H =—
N

(L là chiêu dài côt)

Sô dïa lÿ thuyêt là dai luçmg biêu thi hiêu nàng cüa côt trong mot
diêu kiên sâc kÿ nhât dinh.
r

r

\

Sô dïa lÿ thuyêt duoc tfnh bâng công thuc sau:
N = 16(—)2 = 5,54(-^—)2
W
W05

W: chiêu rông do ô dây pic.
W05: chiêu rông do ô nüa chiêu cao pic.

Côt cô N lôn hay H nhô là côt cô hiêu lue cao, khi dô dô doâng pic nhô.
Trong thuc té N nam trong khoâng 2500 dén 5500 là vùa dü.

10


Dụ phõn giõi R:
Dụ phõn giõi l dai luỗmg biờu thi dụ tõch cỷa cõc chõt ra khụi
nhau trờn mot diờu kiờn sc k dõ cho.
_ 2(tRB ~ ùra) _ 1,1
~ẽ ra) _
^ oc\
b
Wa +W b W0,5A+W0i5B
4
a
k'A
r

f

f

Hờ sụ bõt dụi xỹng:
r

r

r

r

r

Hờ sụ bõt dụi xỹng cho biờt mue dụ khụng dụi xỹng cỹa pic trờn sõc
dụ thu duoc.
T = H ẽ 2a

a, b l dụ rụng do ụ 1/20 chiờu cao pic.

T nam trong khoõng 0,5-2,5 thợ phộp dinh luỗmg duoc chõp nhõn.
1.4. CO Sễ L THUYấT VE HUNH QUANG
1.4.1. SUHẻNH THNH QUANG PHO HUNH QUANG [2], [3], [7], [9]

Hiờn tuỗmg hunh quang l quõ trợnh phõt xa quan trong cỹa nguyờn tỹ,
ion hay phõn tỹ duoc kfch thfch nho hõp thu bỹc xa diờn tỹ.
Theo thuyờt luong tỹ, mụi hat so cõ'p (nguyờn tỹ, ion, phõn tỹ) co mot hờ
thong duy nhõt cõc trang thõi nng luỗmg. Trang thõi nng luỗmg thõp nhõt goi
l trang thõi co bõn (S0). Khi bi kfch thich, nhu duoc hõp thu photon õnh sang
thợ nng luỗmg cỹa photon sờ duoc truyờn sang hat v hat sở duoc chuyộn sang
mot nng luỗmg cao hon goi l trang thõi kfch thich Sf, S2 ... (ụ mụi trang thõi
phõn tỹ cụ thở ton tai cõc phõn mỹc nng luỗmg khõc nhau 0; 1; 2; 3...). Hiờn
tuong hunh quang xõy ra khi: Cõc nguyờn tỹ tỹ mỹc thõp nhõt cỷa trang thõi
kfch thfch vờ trang thõi co bõn giõi phụng ra nng luỗmg bng cõch bỹc xa cõc
photon õnh sõng, goi l su phuc hụi cụ bỹc xa, v õnh sõng bỹc xa ny chmh
l hunh quang (kộo di 10'9 ằ 10'6 giõy). So phõn tỹ co khõ nng hunh
quang tuong dụi ft bụi vợ hunh quang yờu cõu cõc dc diởm vờ cõu trỹc sao
cho quõ trợnh phuc hụi khụng bỹc xa xõy ra vụi toc dụ thõp v tõng cuong toc

11

dô phât huÿnh quang. Nhiêu phân tü không co câc dâc diëm này và toc dô quâ
trînh hôi phuc không büc xa vè müc nàng luong co bân lôn hon dâng kë so vôi
quâ trînh hôi phuc co büc xa. Vî thé mà quâ trînh huÿnh quang không xây ra.
Trong hiên tuong phât quang, mot phàn nàng luong cüa ânh sâng kfch
thich bi tiêu tôn chuyën thành nhiêt nàng do va cham, vi vây nàng luong ânh
sâng kfch thich bao gicf cüng lôn hon nàng luong ânh sâng büc xa, hay nôi
câch khâc, buôc song ânh sâng büc xa luôn dài hon buôc song cüa ânh sâng
kfch thfch.
Trong phô huÿnh quang thuông dùng 2 khâi niêm:
a). Pho kich thich: Excitation spectrum (Ex)
Là duông biëu diên su phu thuôc cûa cuong dô phât quang tuong dôi
(relative intensity) theo buôc song cûa ânh sâng kfch thfch.
Buôc song eue dai cüa phô kfch thfch cüng chmh là buôc song eue dai
hâp thu cüa chât duoc kfch thfch (duoc hoat hôa) vî vây phô kfch thfch cüng
chmh là duông biëu diên môi quan hê giüa cuông dô hâp thu cüa chât dô và
buôc song büc xa hâp thu.
b). Pho bûc xa (pho huÿnh quang):

Emission spectrum (Em)

Là duông biëu diên su phu thuôc cüa cuông dô huÿnh quang cüa chât
dâ duoc hoat hoâ theo buôc song cüa ânh sâng phât ra (bûc xa huÿnh quang).
c). Vi du:
Pho kich thich

Pho birc xa

Histamin dihydroclorid 1 |ig/ml

""T
300 nm

400 nm

400 nm

500 nm

6Ô0 nm

Hïnh 1. Pho kich thich và pho bûc xa cüa Histamin
(Dung dich 1 /JglmL, eue dai Ex = 350 nm, eue dai Em = 440 nm)

12


1.4.2. ĩNG DUNG CA PHẫP DO HUNH QUANG [7], [9].
1.4.2.1. Dinh tợnh
Dua vo cõp buục song eue dai Ex/Ei n dở dinh tfnh vợ vụi mot chõ't nhõt
dinh duoc kich thfch bng mot tia cụ buục song no dụ thợ sở cho mot tia cụ
buục song hunh quang nhõt dinh.
1.4.2.2. Dinh lurong
Dua vo su phu thuục tuyờ'n tfnh giỹa cuụng dụ hunh quang vụi nụng dụ
chõt phõt quang m phuong phõp duoc õp dung dở dinh luong.
Phộp do hunh quang duoc õp dung dở dinh luong cõc chõt cụ khõ nng
phõt hunh quang tu nhiờn hoc cõc chõ't cụ thở tao ra dõn chõt thfch hop cụ
khõ nng phõt hunh quang.
1.5. PHlTCNG PHP HPLC VễI DETECTOR HUNH QUANG - TAO

DN XUT SAU CễT
1.5.1. PHUONG PHP HPLC VễI DETECTOR HUNH QUANG
Quang pho hunh quang ngoi viờc õp dung dở dinh tfnh, dinh luong cõc
chõ't trờn mõy do quang pho hunh quang thợ nụ cụn duoc õp dung dở chờ' tao
bụ phõn phõt hiờn cỷa mõy sc k long hiờu nng cao: Detector hunh quang.
Vờ nguyờn tõc cõu tao detector hunh quang gụm hai bụ don sõc hoõ, mot bụ
cung cõ'p chựm tia kfch thfch, mot bụ thu nhõn chựm tia phõt xa hunh quang.
Hai bụ phõn ny bụ' tri truục v sau buụng do. Trong detector hunh quang,
dốn nguụn tao chựm tia kfch thfch thuụng dựng l dốn xộnon cụ khõ nng phõt
ra bure xa trong khoõng rụng 200 - 800 nm.
Detector hunh quang dụng vai trụ nhu mot mõy quang pho hunh quang
kờ't nụ'i vụi sõc k long dở phõt hiờn vờ dinh tfnh v dinh luong cõc chõt sau
khi ra khụi cụt sõc k. Nụ duoc õp dung dở phõt hiờn tụt nhiờu chõ't hỹu co
phõt hunh quang tu nhiờn cỹng nhu cõc dõn chõt cụ hunh quang. Nguyờn

13


tõc cỹa phộp do hunh quang l: Khi chiộu mụt chựm tia sõng kich thfch cụ
buục song xõc dinh vo chõ't mõu, chõ't ny phõt ra chựm tia phõt xa hunh
quang cụ buục song xõc dinh tu thuục tựng chõt v cụ cuụng dụ phu thuục
vo hm luong cỹa chỹng.[9], [20], [21], [24]
;
Bốnnguon^snon

Bụ phõn don sc
' da'bỷc xa

Thõukinh
Thõu klnh /

ễng nhõn quang

Bễ phõn dtm =( jầ........... v .......B ...... ằ .... I
kich thich

r ,

%J

y r^

đ
Mõu do

(

J
BanS dlodc

Hinh 2. Sa õụ cõu tao cỹa mụt detector hunh quang
1.5.2. TAO DN XUAT SAU CễT

Tựy theo cõc chõt cõn dinh luong cụ khõ nng phõt quang hay khụng m
nguụi ta tien hnh dinh luỗmg truc tiờ'p hay giõn tiờ'p thụng qua dõn chõt cỹa
nụ. Cụ nhỹng hop chõ't bợnh thuụng thi khụng phõt quang hoc phõt quang
yờ'u, nhung khi chuyởn sang cõc dõn chõ't khõc thợ phõt quang rõt manh.
(VD: mụt sụ cõc amino acid, duụng, ion vụ c o ,...) [7], [9].
Trong truụng hỗrp dụ, nguụi ta cụ thở cho chõ't cõn phõn tfch phõn ỹng vụi
cõc thuục thỹ dở tao dõn xuõ't phõt hunh quang manh truục khi di dờ'n
detector hunh quang. Nờ'u chõt cõn phõn tfch duoc phõn ỹng vụi thuục thỹ

truục khi qua cụt thợ k thuõt ny goi l tao dõn xuõt truục cụt (pre-column).
Nờ'u chõ't cõn phõn tfch duoc phõn ỹng vụi thuục thỹ sau khi dõ di qua khụi cụt
v truục khi dờ'n detector, thợ duoc goi l tao dõn xuõt sau cụt (post-column).

14


K thuõt tao dõn xuõt tnrục cụt khụng doi hụi phõi cụ thiột bụ phõn ỹng di
kốm theo mõy HPLC nhir k thuõt tao dõn xuõt sau cụt. Nhung tao dõn xuõt
trirục cụt doi hụi dõn xuõt tao thnh phi turong dụi bờn, on dinh v luỗfng
thuục thCr du cụ thộ gõy õnh hiùụng trong qỹa trợnh tõch trờn cụt. Sir dung k
thuõt tao dõn xuõt sau cụt cụ thộ khc phuc dirỗfc cõc nhuoc diờm ny nờn
pham vi ỷng dung cua no rõt 1dm [7], [21], [24].
Viờc tao dõn xuõt sau cụt doi hụi phõi cụ bụ phõn tao dõn xuõt hay cụn
goi l buụng phõn iùng sau cụt thich hop. Buụng phõn rùng sau cụt cụ thộ cụ
nhiờu kiờu thiột kộ khõc nhau, nhung dờu dira trờn nguyờn l hoat dụng l: cõc
thuục thỹ sở diroc bam vo buụng phõn irng theo mot hờ thụng bofm riờng,
Dụng thdi chat cõn phõn tfch sau khi ra khụi cụt cỹng duoc di qua buụng phõn
ỷng tao dõn xuõt vụi thuục thỹ. Dõn xuõt duoc tao thnh sở duoc dua dộn
detector dộ phõt hiờn.

B otti thuoc thỷ

Hợtih 3. Sa õụ eau tao cỹa mot mõy HPLC
Või detector huynh quang v bụ tao dõn xuõt sau cụt
Phõn ufng tao dõn xuõt sau cụt cõn duoc thuc hiờn trong thdi gian ngn
nhiờt dụ thfch hop. Nờn chon thuục thur m trong diờu kiờn tao dõn xuõt, thuục
thỹ du khụng bi phõt hiờn bcfi detector [24].

15

Câc thuôc thir tao dân xuât sau côt thirdng duac su dung vôi detector
huÿnh quang [24]:
Thuôc thu

Fluorescamin

Câc chât cô thé tao dân chât vôi

Detector phât hiên chât

thuôc thur

dân xuât

Câc horp chât chüa nhôm amin bâc Ex = 390 nm
nhât: Câc amin, acid amin, peptid.

Dansyl clorid

Em = 470 nm

Câc protein, amin, acid amin, hçfp Ex = 335 nm - 365 nm
Em = 520 nm

chât phénol.
O-

Câc hop chât chu'a nhôm amin bâc Ex = 300 nm

Phthalaldehyd

nhât.

Em = 400 nm - 600 nm

1.5.3. PHÂN ÜNG TAO DÂN XUAT PHÂT HUŸNH QUANG CÜA TOBRAMYCIN
Phân tuf Tobramycin cô ch ira câc nhôm chrïc amin dang R-NH2, do do no
cô thé tao dân xuât phât huÿnh quang vôi câc thuoc thü nhu fluorescamin,
dansyl clorid và ortho-phthalaldehyd. Trong do thuoc thü ortho-phthalaldehyd
duac su dung pho bien hcfn câ [21] [24].
Phucfng trinh phân rïng tao dân xuât phât huÿnh quang cüa hop chât chüa
nhôm amin vôi thuôc thu ortho-phthalaldehyd:

Hdp chât phât huÿnh quang

Trong phân ung tao dân xuât phât huÿnh quang vôi ortho-phthaldehyd
phâi cô thêm mot chât cô nhôm mercapto (-SH), thucfng sü dung là
mercaptoethanol hoac mercaptoacetic.

16


PHAN 2. THl/C NGHIÊM VÀ KÊT QUÂ

2.1. NGUYÊN VÂT LIÊU VÀ PHI/ONG PHÂP THIIC NGHIÊM
2.1.1 DÜI TlTONG NGHIÊN CT
J tJ

•

Thuoc nhô mât Tobramycin 0,3 % cüa công ty co phân Duoc phâm Hà

Tây (HATAPHAR).
Thành phân:
Tobramycin sulfat tucfng üng voi Tobramycin

3.0 mg

Benzalkonium clorid

0,1 mg

Natri clorid

9.0 mg

Nuôc cât

Vd 1,0 mL

•

Chât chuân Tobramycin (C18H37N50 9); SKS: 0103167, duoc sân xuât tai

Viên kiëm nghiêm thuôc Trung uong (Hàm luong nguyên trang: 949,64 )ig/mg).
2.1.2. THIÊT BI VÀ HOÂ CHAT
2.I.2.I. Dung môi, hoâ chât
+ Methanol tinh khiét HPLC.

+ Natri pentansulfonat tinh khiét HPLC.
+ Acid boric.
+ Natri hydroxyd.
+ O-phthalaldehyd (Ortho-phthalaldehyd, OPA).
+ Mercaptoethanol.
+ Dung dich polyoxyethylen lauryl ether
+ Natri sulfat khan.
+ Acid acetic tinh khiét HPLC.

17


2.I.2.2. Thiet bi, dung eu
+ Mây HPLC vôi detector huÿnh quang và bô phàn üng tao
dân xuàt sau côt.
+ Mây lac siêu âm.
+ Mây do pH.
+ Bô loc dung môi, loc mâu vol màng loc 0,45 jim.
+ Cân phân tfch co dô chmh xâc ±0,1 mg.
+ Câc dung eu thuÿ tinh chrnh xâc: binh dinh mire, pipet
chmh xâc, ong dong ...
2.1.3. NÔI DUNG VÀ PHI/ÛNG PHÂP NGHIÊN CÜU
2.I.3.I. Nôi dung
Khâo sât lua chon dieu kiên sac kÿ
Tobramycin là chat htfu co phân eue, tan nhiêu trong nirôc. Vi vây de
phân tfch và dinh ltfông tôt, chüng tôi chon phuong phâp HPLC pha dâo: Tien
hành trên mây sàc kÿ long hiêu nâng cao detector huÿnh quang cô bô tao dân
xuât sau côt.
Và trên ca sô cô sân côt RP-18 Brava ODS (150 x 4,6 mm; 5 fj,m),
chuong trînh sàc kÿ duoc xây dung trên chuân Tobramycin cùng vôi viêc phân

tfch mâu nghiên cûu nhâm khâo sât chon diêu kiên sâc kÿ thfch hop:
❖ Khâo sât chon càp biréc song kfch thfch và buôc song phât xa cho
detector huÿnh quang.
♦♦♦ Khâo sât chon thành phàn pha dông thfch hçfp cho phép phân tfch
Tobramycin.
♦♦♦ Khâo sât chon dung dich thuôc thû tao dân xuât sau côt.
♦♦♦ Khâo sât chon toc dô dong pha dông và toc dô bom thuôc thü’.
Tir câc diêu kiên dâ lua chon chüng tôi tien hành dânh giâ tfnh thfch hop
cüa hê thông sàc kÿ.

18


Dânh giâ phuong phâp: [13]
Phircfng phâp phân tfch cân diroc dânh giâ theo câc tiêu chf sau :
o Tfnh dàc hiêu cûa phirong phâp
o Dô tuyén tfnh giüa nông dô Tobramycin và diên tfch pic
o Dô lap lai cüa phirong phâp
o Dô düng cûa phirong phâp
2.1.3.2. Phirong phâp nghiên cuu
- Phirong phâp thuc nghiêm dë tîm ra diëu kiên sàc kÿ tôi iru, thu thâp sô
lieu và xü lÿ thông kê (sü dung công eu hô tro là phân mêm thông kê SPSS)
dë dânh giâ két quâ.
- Phirong phâp eu thë : HPLC vôi detector huÿnh quang- tao dân chât sau
côt dua trên phân üng cüa Tobramycin vôi thuôc thü tao dân xuât cô khâ nàng
phâp huÿnh quang.
2.1.3.3. Câc dâc trimg thông kê dë xur lÿ két quâ phân tich.
Giâ tri trung binh :

Dô lêch chuân:

Dô lêch chuân tuong dôi :
RSD (%) = ^ . 1 0 0

Trong dô : Xj là két quâ cüa lân xâc dinh thü i.
n là sô lân xâc dinh.

19