Xây dựng quy trình định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC và HPTLC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





ĐINH THỊ THÚY HƯƠNG




XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ANTHOCYANIN TRONG THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
VÀ HPTLC




LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC






HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





ĐINH THỊ THÚY HƯƠNG





XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ANTHOCYANIN TRONG THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
VÀ HPTLC



LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC


CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 6072 04 10



Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Tường Vy

NCS. Cao Công Khánh



HÀ NỘI 2014
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc tới cô
giáo PGS.TS. Nguyễn Tường Vy, NCS Cao Công Khánh là những người đã trực
tiếp ở bên hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện
luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các anh chị ở labo Hóa độc thực
phẩm - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, những người đã
dìu dắt, hướng dẫn và đóng góp rất nhiều ý kiến quý báu giúp đỡ tôi hoàn thành
luận văn này.
Tôi xin cảm ơn các anh chị của nhóm tải báo đã giúp tôi rất nhiều trong
việc tìm tài liệu tham khảo cho luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, các
thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại trường và thực hiện
luận văn này.
Cuối cùng tôi xin dành lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã
luôn ủng hộ, khích lệ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua.
Hà Nội, ngày 23 tháng 8 năm 2014.
Học viên


Đinh Thị Thúy Hương



MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC, CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN
DANH MỤC HÌNH VẼ TRONG KHÓA LUẬN
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về thực phẩm chức năng 3
1.2. Tổng quan về anthocyanin 3
1.2.1. Cấu trúc anthocyanin 3
1.2.2. Tác dung của anthocyanin 5
1.2.3. Tính chất của Anthocyanin 7
1.2.4. Một số phƣơng pháp phân tích anthocyanin 8
1.3. Tổng quan về HPTLC 10
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng 10
1.3.2. HPTLC 12
1.4. Tổng quan về HPLC 14
1.4.1.Khái niệm chung 14
1.4.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 14
1.4.3. Thiết bị sắc ký lỏng 16
1.5. Tổng quan về chiết pha rắn SPE 20
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 21
2.2. Nguyên vật liệu – thiết bị 21
2.2.1.Nguyên vật liệu 21
2.2.2. Thiết bị 22
2.3. Nội dung nghiên cứu 23
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 23
2.4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích anthocyanin bằng HPLC 23
2.4.2. Khảo sát các điều kiện phân tích anthocyanin bằng HPTLC 25
2.4.3.Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 26

2.4.4. Thẩm định quy trình 27
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 27
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28
3.1.Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích anthocyanin bằng HPLC 28
3.2. Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích Anthocyanin bằng HPTLC 31
3.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu 32
3.4. Thẩm định phƣơng pháp 34
3.4.1. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu 34
3.4.2. Tính thích hợp hệ thống 36
3.4.3. Khoảng tuyến tính 38
3.4.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng 33
3.4.5. Độ thu hồi của phƣơng pháp 42
3.4.6. Độ lặp lại của phƣơng pháp 44
3.5. Kết quả áp dụng phƣơng pháp xác định Anthocyanin trong một số
sản phẩm 46
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 48
4.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật 48
4.1.1. Lựa chọn phƣơng pháp 48
4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu 48
4.1.3. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng 50
4.1.4. Thẩm định phƣơng pháp đã xây dựng 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54
KẾT LUẬN 54
KIẾN NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

AOAC (Association of Official Analytical Chemists) Hiệp hội các nhà hóa
phân tích chính thức

PDA (Photodiod array detector) Detector mảng diod
HPLC (high – performance liquid chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
HPTLC (high – performance thin layer chromatography) Sắc ký lớp mỏng hiệu
năng cao
LOD (Limit of Detection) Giới hạn phát hiện
LOQ (Limit of quantification) Giới hạn định lượng
RSD (Relative standard deviation) Độ lệch chuẩn tương đối
SD (Standard deviation) Độ lệch chuẩn
S Diện tích pic (mAu.s)
C Nồng độ
HL Hàm lượng
t
R
Thời gian lưu
µL microlit
TPCN Thực phẩm chức năng
m Khối lượng
TFA Trifluoroacetic acid
TCA Trichloroacetic acid


DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Tên bảng
Trang
Bảng 1.1
Các phương pháp phân tích Anthocyanin
8
Bảng 2.1

Danh mục các mẫu phân tích
21
Bảng 2.2
Danh mục các pha động HPLC khảo sát
24
Bảng 2.3
Gradient hệ pha động HPTLC khảo sát
25
Bảng 3.1
Gradient hệ pha động 1,2
29
Bảng 3.2
Chương trình gradient của hệ pha động, 3 và 4
30
Bảng 3.3
Kết quả định lượng Anthocyanin trong mẫu bột
Bilberry theo dung môi dùng để chiết mẫu
33
Bảng 3.4
Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống với dung dịch
biberry trên HPLC
37
Bảng 3.5
Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống với dung dịch
Bilberry trên HPTLC
38
Bảng 3.6
Kết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩn
cyanidin chloride
39

Bảng 3.7
Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường
chuẩn
39
Bảng 3.8
Kết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩn bilberry
40
Bảng 3.9
Độ thu hồi của phương pháp HPLC với mẫu thực
phẩm chức năng dạng dung dịch
42
Bảng 3.10
Độ thu hồi của phương pháp HPTLC với mẫu thực
phẩm chức năng dạng dung dịch
43
Bảng 3.11
Độ lặp lại của phương pháp HPLC với mẫu bột đông
khô Bilberry
44
Bảng 3.12
Độ lặp lại của phương pháp HPLC trên nền mẫu nang
mềm
45
Bảng 3.13
Độ lặp lại của phương pháp HPTLC trên nền mẫu
nang mềm
46
Bảng 3.14
Kết quả phân tích Anthocyanin trong thực phẩm chức
năng

47



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN

Tên hình
Trang
Hình 1.1
Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin
4
Hình 1.2
Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
16
Hình 3.1
Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Bilberry với hệ pha
động 1
29
Hình 3.2
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bilberry với hệ pha động
2
29
Hình 3.3
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bilberry với hệ pha động
3
30
Hình 3.4
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin với hệ pha
động 4
30

Hình 3.5
Sắc ký đồ dung dịch đánh giá độ phân giải với hệ
pha động 4
31
Hình 3.6
Hình ảnh HPTLC với hệ pha động 4
32
Hình 3.7
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn gốc cyanidin chloride 10
µg/mL
33
Hình 3.8
Sắc ký đồ dung dịch bilberry chiết bằng
methanol:HCl2N(80:20)
33
Hình 3.9
Sắc ký đồ dung dịch bilberry sau thủy phân.
35
Hình 3.10
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 100 µg/mL
35
Hình 3.11
Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không
chứa anthocyanin
35
Hình 3.12
Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không
chứa anthocyanin được thêm chuẩn cyanidin
36
Hình 3.13

Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không
chứa anthocyanin được thêm chuẩn cyanidin trên
HPTLC
36
Hình 3.14
Đường chuẩn dung dịch gốc Cyanidin chloride
39
Hình 3.15
Đường chuẩn dung dịch bilberry trên HPTLC
40
Hình 3.16
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 0,5 µg/mL
41
Hình 3.17
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 0,2 µg/mL
42

1


ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay cuộc sống ngày càng phát triển hiện đại, các bệnh về tim
mạch, ung thư hiện đang rất phổ biến và có chiều hướng gia tăng nhanh. Đời
sống ngày càng phát triển, người dân cũng quan tâm đến sức khỏe của bản
thân nhiều hơn. Ở nước ta trong năm năm trở lại đây thực phẩm chức năng
được đưa vào và sử dụng rất rộng rãi, tràn lan vì chúng được biết đến là
những chế phẩm có thể sử dụng thường xuyên, lâu dài để phòng ngừa nguy
cơ gây bệnh, bổ dưỡng mà rất an toàn, ít hoặc hầu như không có tác dụng phụ
đối với hầu hết các lứa tuổi. Chính vì thế việc mọi người lựa chọn thực phẩm

chức năng để phòng chống và bồi bổ sức khỏe rất nhiều. Tuy nhiên không
phải ai cũng hiểu tường tận về thực phẩm chức năng. Đa số các thực phẩm
chức năng có giá thành khá cao, và ở Việt Nam việc kiểm soát chất lượng sản
phẩm này chưa chặt chẽ nên xảy ra nhiều bất cập như không có hoặc có rất ít
hoạt chất dẫn đến việc sử dụng chúng không mang lại hiểu quả.
Theo các nghiên cứu thì các hợp chất Anthocyanin có các hoạt tính rất
tốt như: Chống viêm, xơ vữa động mạch, ức chế đông tụ tiểu cầu, chống ung
thư, thúc đẩy hình thành cytokine điều hòa phản ứng miễn dịch, có hoạt tính
chống oxy hóa rất mạnh. Chính vì thế mà các thực phẩm chức năng chứa
Anthocyanin được sản xuất ngày càng nhiều và đối tượng sử dụng cũng rất
phong phú [4], [5], [11].
Trên thế giới có một số nghiên cứu về phương pháp xác định hàm
lượng các chất thuộc nhóm Anthocyanin trên các mẫu thực phẩm bằng cách
sử dụng các kĩ thuật chính như: UV-VIS, HPLC-PDA, MS, ESI [16], [22],
[24]. Mỗi phương pháp đều có các ưu nhược điểm riêng. Tuy nhiên các
phương pháp trên chủ yếu nghiên cứu trên đối tượng mẫu là thực phẩm, đồ
uống, rất ít nghiên cứu về thực phẩm chức năng. Tại Việt Nam hầu như chưa
2

có nghiên cứu nào về phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin trong
thực phẩm chức năng. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi đặt vấn đề nghiên
cứu đề tài:
“Xây dựng quy trình định lượng Anthocyanin trong thực phẩm chức
năng bằng phương pháp HPTLC và HPLC”
Với các mục tiêu sau đây:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin
trong thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật HPLC và kỹ thuật HPTLC.
2. Áp dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng phân tích một số mẫu thực phẩm
chức năng trên thị trường

3


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Khái niệm về thực phẩm chức năng:
Thực phẩm chức năng (Functional foods) được người Nhật sử dụng đầu
tiên trong những năm 1980 để chỉ những thực phẩm chế biến có chứa những
thành phần tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng giúp nâng cao sức khoẻ
cho người sử dụng. Theo Viện Khoa học và Đời sống quốc tế (International
Life Science Institute - ILSI) thì "thực phẩm chức năng là thực phẩm có lợi
cho một hay nhiều hoạt động của cơ thể như cải thiện tình trạng sức khoẻ và
làm giảm nguy cơ mắc bệnh hơn là so với giá trị dinh dưỡng mà nó mang
lại". Theo IFIC, thực phẩm chức năng là những thực phẩm hay thành phần

của chế độ ăn có thể đem lại lợi ích cho sức khoẻ nhiều hơn giá trị dinh dưỡng
cơ bản. Thực phẩm chức năng có thể là sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hoặc
là thực phẩm trong quá trình chế biến được bổ sung thêm các chất khác. Cũng
như thực phẩm thuốc, thực phẩm chức năng nằm ở nơi giao thoa giữa thực
phẩm và thuốc và người ta cũng gọi thực phẩm chức năng là thực phẩm -
thuốc.
Bộ Y tế Việt Nam theo thông tư số 08/TT – BYT ngày 23/08/2004 về
việc “ Hướng dẫn việc quản lý các sản phẩm thực phẩm chức năng” định
nghĩa thực phẩm chức năng: “là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các
bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình
trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh”. Tuỳ theo
công thức, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức năng
còn có các tên gọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ
sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, sản phẩm dinh dưỡng y học.
1.2. Tổng quan về Anthocyanin
1.2.1. Cấu trúc của Anthocyanin:
4

Anthocyanin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid, là những glucozit do
gốc đường glucose, glactose kết hợp với gốc aglucol có màu
(anthocyanidin). Aglycon của chúng có cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình
1. Các gốc đường có thể được gắn vào vị trí 3,5,7; thường được gắn vào vị trí
3 v à 5 còn vị trí 7 rất ít. Phân tử anthocyanin gắn đường vào vị trí 3 gọi là
monoglycozit, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycozit [4], [12].


R
1
OH

OH O
+
3
R
2



OH
OH


A
3
5
7
B

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản của aglycon của anthocyanin
Các aglycon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào
vị trí R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH
3
[8], [27].
Bảng 1. Cấu trúc cơ bản của Anthocyanin
Cấu trúc cơ bản
Anthocyanidin
R
3
′
R

4
′
R
5
′
R
3

R
5

R
6

R
7


Cyanidin
−OH
−OH
−H
−OH
−OH
−H
−OH
Delphinidin
−OH
−OH
−OH

−OH
−OH
−H
−OH
Pelargonidin
−H
−OH
−H
−OH
−OH
−H
−OH
Malvidin
−OCH
3

−OH
−OCH
3

−OH
−OH
−H
−OH
Peonidin
−OCH
3

−OH
−H

−OH
−OH
−H
−OH
Petunidin
−OH
−OH
−OCH
3

−OH
−OH
−H
−OH
5

Cấu trúc của anthocyanin cho phép nó thay đổi màu sắc khác nhau tùy
thuộc giá trị pH. Việc bổ sung các OH trong cấu trúc phân tử sẽ loại bỏ các
điện tích dương của cấu trúc và gây ra độ hấp thụ của các proton bước sóng
lớn hơn do đó xuất hiện màu xanh lá cây [21], [22].
Anthocyanins do cách sắp xếp vòng thơm của chúng, chúng có thể hấp
thụ bức xạ trong phạm vi năng lượng thấp của quang phổ nhìn thấy được.
Trong kết quả của Vitis vinifera L., sáu anthocyanidins chính (cyanidin,
peonidin, delphinidin, petunidin, pelargonidin và malvidin) có mặt như 3-O-
glucosides, cũng như acetyl, hình thức este p-coumaroyl và caffeoyl của
chúng. Một chú ý đặc biệt đã được trao cho tác dụng nội phân tử, chứng minh
sự tồn tại của một truyền điện tích trạng thái kích thích nội phân tử của p-
coumaroyl và các hình thức este caffeoyl [8], [21].
1.2.2. Tác dụng của anthocyanin.
Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng khuẩn, kháng nấm, có vai

trò tạo điều kiện cho sự thụ phấn, phát tán nhờ màu sắc sặc sỡ trên cành hoa
và quả. Mặt khác,anthocyanin là chất có khả năng hấp thụ tia UV nhằm bảo
vệ bộ gen của thực vật trước các tia tử ngoại. Sinh tổng hợp anthocyanin ở vỏ
được tăng cường để đáp ứng phù hợp với môi trường: hạn hán, ánh sáng
mạnh, UV, nhiệt độ cao, thiếu nitơ và phosphor, nhiễm nấm, vi khuẩn, tổn
thương, côn trùng, ô nhiễm… [12], [31].
Đối với sức khỏe của con người, theo nghiên cứu của David Heber, Đại học
Harvard (Mỹ), chất anthocyanin có thể cắt được cơn đau tim, giảm thiểu các
tổn thương não liên quan đột quỵ và ngăn cản sự tạo thành các cục máu đông
trong lòng mạch máu (nguyên nhân dẫn đến tắc mạch, gây tai biến mạch máu
não và những cơn nhồi máu cơ tim đột ngột), hạn chế sự suy giảm sức đề
kháng. Các nhà khoa học cũng đã chứng minh được rằng anthocyanin có tác
dụng tốt trong chống lão hóa, ngăn ngừa sự phát triển của các khối u, bướu,
6

hạn chế nguy cơ bị đột quỵ, giảm nguy cơ mắc ung thư… Khi tiêm một lượng
nhỏ anthocyanin chiết xuất từ khoai lang vào các tế bào ung thư ruột già, chất
này đã chứng tỏ khả năng ngăn chặn tế bào ung thư phát triển. Các nhà nghiên
cứu cũng phát hiện trong một số trường hợp, sự biến đổi về cấu trúc của các
phân tử anthocyanin cũng làm tăng khả năng chống ung thư của chúng. Các
nghiên cứu còn cho thấy anthocyanin còn có tác dụng tốt trong việc điều hòa
lượng đường huyết của những bệnh nhân đái tháo đường. Khả năng chữa
bệnh của anthocyanin vẫn đang được nghiên cứu để tìm hiểu cơ chế và ứng
dụng trong y học. Các ứng dụng trên đã mở ra một triển vọng về việc sản xuất
thực phẩm, dược phẩm chức năng chữa bệnh có hiệu quả [21], [26].
Trong lĩnh vực thực phẩm, với khả năng chống oxy hóa cao, anthocyanin
được sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy
hóa cho thực phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, với một lượng nhỏ nguyên
liệu vỏ khoai lang (1% khối lượng), khả năng bảo quản của các sản phẩm thực
phẩm có chứa mỡ được kéo dài khá lâu và có thể so sánh với chất chống oxy

hóa tổng hợp BHA. Ngoài các tác dụng chống oxy hóa, anthocyanin còn được
sử dụng như chất màu tự nhiên tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm
và khá an toàn. Ví dụ: dịch chiết anthocyanin từ các loại rau củ có màu đỏ
như vỏ quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang… đã được dùng để làm chất màu thay
thế màu tổng hợp trong sản xuất kẹo cứng [18].
Anthocyanin ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá an
toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm,
anthocyanin còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quí như: khả năng
chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa
các sản phẩm thực phẩm, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng, có tác dụng làm
bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư, tác
dụng chống các tia phóng xạ [8], [27].
7

1.2.3. Tính chất của anthocyanin:
- Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá
phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực.
- Khi đun nóng lâu trong nước, anthocyanin bị phá hủy và mất màu.
- Anthocyanin hòa tan tốt trong nước và trong dịch bão hòa, khi kết hợp với
đường làm cho phân tử anthocyanin càng dễ hòa tan hơn.
- Màu sắc của anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các sắc tố có
mặt và nhiều yếu tố khác… Khi tăng số lượng nhóm –OH trong vòng benzen
thì màu càng xanh đậm. Khi tác dụng với Sn có màu lam, với Al có màu tím,
với Fe, Cu thì bị biến màu [14].
- Mức độ methyl hóa các nhóm –OH trong vòng benzen càng cao thì màu
càng đỏ. Nếu nhóm –OH ở vị trí thứ 3 kết hợp với các gốc đường thì màu sắc
cũng thay đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít.
- Màu sắc của anthocyanin phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường, khi
pH> 7 các anthocyanin cho màu xanh, pH< 7 các anthocyanin cho màu đỏ.
Tóm lại, các thực phẩm có chứa nhiều anthocyanin là nguồn cung cấp

chất có hoạt tính sinh học, góp phần giúp trẻ lâu và phòng tránh bệnh tật. Bên
cạnh đó, anthocyanin có các đặc tính quý báu của chất màu tự nhiên mà các
chất màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được
[27], [31].
Cấu trúc của anthocyanin là những gì cho phép nó thay đổi màu sắc
khác nhau trong giá trị pH. Việc bổ sung các nhóm -OH vào trong cấu trúc
phân tử sẽ loại bỏ các điện tích dương của cấu trúc và gây ra độ hấp thụ của
các proton bước sóng lớn hơn do đó do đó xuất hiện màu xanh lá cây xuất
hiện màu xanh lá cây [21], [22].


8

1.2.4. Một số phương pháp phân tích Anthocyanin:
Stt
Kỹ
thuật
phân
tích
Mẫu
phân
tích
Điều kiện phân tích
Điều kiện xử lý
mẫu
Tài
liệu
tham
khảo
1

HPLC
Rượu
vang đỏ
-Ascentis C18, 25 cm × 4.6
mm I.D., 5 μm particles
(581325-U)
-Pha động: (A) water:formic
acid (9:1), (B)
acetonitrile:water:formic
acid (5:4:1)
-Tốc độ dòng: 1 mL/phút
-Nhiệt độ cột: 25 °C
-Detector PDA: 520 nm
-Thể tích tiêm mẫu: 10µL
Pha loãng với
nước, ly tâm và
đi qua một màng
lọc 0,45 µm
trước khi tiêm
sắc ký
[22]

2
HPLC
Mẫu
nước
hoa quả
-Cột ACE Phenyl
(250 × 4,6 mm, 5 µm)
-detector PDA: 520µm

-Pha động: acetonitril - 10%
(v/v) acetic acid and 1%
(v/v) phosphoric acid trong
nước.
-Tốc độ dòng: 1 mL/phút
-Nhiệt độ cột: 25
o
C
-Thể tích tiêm mẫu: 25µL
Lọc qua màng
lọc trước khi
tiêm sắc ký
[33]
3
HPLC
Mẫu
nước
hoa quả
-Cột Synergi Hydro-RP 80
Å (150.0 × 2.0 mm, 4 µm)
-Pha động: acetonitril–acetic
acid:trifluoroacetic
acid:acetonitril:nước(10:0,2:
5:84,8)
-Tốc độ dòng: 1 mL/phút
-Nhiệt độ cột: 25
o
C
-Detector MS: 520 nm
-Thể tích tiêm mẫu: 20µL

Lọc qua màng
lọc trước khi
tiêm sắc ký

[33]
4
UHPLC
Bilberry
-Cột Acclaim RSLC 120
C18, (2.2 μm; 2.1 × 150
mm)
-Pha động: A: 10% Formic
Acid
B: 10% Formic Acid, 22.5%
Methanol, 22.5%
Chiết bằng
methanol-
10%acid
phosphoric, pha
loãng, lọc thô.


9

Acetonitrile
-Tốc độ dòng: 0.475
mL/phút
-Nhiệt độ cột: 35
O
C

-Detector :Absorbance, vis,
520 nm
-Thể tích tiêm mẫu: 2 µL
5
HPTLC
Powdere
d berry
extract
-Thiết bị: TLC sampler4
(ATS4, camag, muttenz,
switxerland)
-Bản mỏng: Silica gel 60
F254 (10mm × 20mm)
-Pha động: Ethylacetate:2-
butanone:nước:acid formic
(7:3:0,8:1,2)
-Quét sắc đồ ở 520 nm, tốc
độ 20 mm/giây
-Hiện vết: Phun thuốc thử
Dragendoft
Chiết với
methanol :
0,1%HCL, pha
loãng bằng ethyl
acetate
[16]
6
HPLC
Bilberry
extract

-Cột:5 µm YMC-Pack Pro
C18 RS, 250 X 4.6 mm / 2
µm YMC-UltraHT Pro C18
RS, 100 X 3.0 mm.
-Pha động: A: water/formic
acid (90/10)
B:ACN/methanol/water/for
mic acid (22.5/22.5/40/10)
-Tốc độ dòng: 1.0 ml/min
-Nhiệt độ cột: 30
0
C
- Detector : VIS at 535 nm
-Thể tích tiêm mẫu: 10 µL
Mẫu được hòa
trong
methanol:nước(
85:15), rung
siêu âm, lọc
trước khi chạy
sắc ký
[32]
7
HPLC-
DAD-
ESI-
MS/MS
Quả
mọng
(berries)

-Cột: YMC-pack ODS-AM
C18 (250×4,6 mm, 5 µm)
-Pha động: ACN:nước:acid
formic (87:3:10, v/v/v)-
acetonitril:nước:acid
formic (40:50:10, v/v/v)
-Tốc độ dòng: 0,8mL/phút
-Nhiệt độ cột: 40
0
C
-Thể tích tiêm: 25 µL
-Detector: Sử dụng kỹ
thuật ESI để ion hóa chất
phân tích và phân tích khối
phổ 2 lần MS/MS.
Mẫu được chiết
bằng
methanol/formic
acid(97:3)trước
khi tiêm sắc ký
[24]
10

1.3. Tổng quan về HPTLC
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng:
Sắc kí giấy và sắc kí lớp mỏng đã được xây dựng, phát triển và ứng
dụng từ lâu. Tuy nhiên hiện nay sắc kí giấy ít được sử dụng. Phổ biến nhất
hiện nay là sắc kí lớp mỏng. Ở nước ta phương pháp sắc kí lớp mỏng đã được
sử dụng rộng rãi, đã có nhiều tài liệu, chuyên gia có kinh nghiệm về phương
pháp này.

Trong sắc kí mặt phẳng, quá trình sắc kí được tiến hành trên một tờ
giấy hay một lớp bột rải đều và được giữ trên mặt một tấm kính, chất dẻo hay
kim loại, ví dụ nhôm. Bản thân lớp mỏng có thể là pha tĩnh hoặc chỉ là chất
mang để giữ pha tĩnh trên đó. Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp
mỏng do tác dụng của lực mao dẫn và đôi khi cả trọng lực và điện thế [1],
[13]
a. Nguyên tắc của SKLM
Cũng như tất cả các phương pháp sắc ký khác, quá trình tách hỗn hợp
các chất bằng SKLM xảy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh.
Trong SKLM, pha tĩnh được rải thành một lớp mỏng trên một giá đỡ phẳng.
Dưới tác dụng của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm
xuất phát – nơi hỗn hợp chất cần phân tích đã được đưa lên bản mỏng. Trong
quá trình di chuyển của pha động qua lớp mỏng chất hấp thụ (pha tĩnh), nhờ
các quá trình hấp thụ và giải hấp thụ được lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố
khác nhau mà những chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động của
pha động với các tốc độ khác nhau. Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp phân
tích có thể sẽ được tách riêng ra ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng [29].
Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi
thích hợp và được hút lên bản sắc ký nhờ lực mao dẫn tách dung dịch thí
nghiệm dựa trên độ phân cực của các thành phần trong dung dịch [13], [29]
11

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ
số lưu giữ R
f
. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển
của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
R
f

d
R
:

Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích.
d
M
: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động( đo
trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm).
R
f
: Có giá tr ị dao động từ 0-1 [1].
Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10–30µm được rải đều và kết dính
thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông. Bản
mỏng có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5÷20cm, nhiều
khi có đưa thêm chất huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện
chất phân tích. Chất hấp phụ thường dùng nhất là silicagel [7], [9].
Pha động dùng cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Để
tăng cường rửa giải thường dùng 2 dung môi. Nguyên lý chia tách dựa vào hệ
số phân bố giữa 2 pha. Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký chủ yếu dựa vào
kinh nghiệm [1].
b .Kỹ thuật TLC:
 Đưa chất phân tích lên bản mỏng:
Lượng hỗn hợp các chất được đưa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan trọng
đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến giá trị R
f
, lượng mẫu đưa lên bản
mỏng khoảng 0,1 - 50µg được pha trong dung môi thích hợp. Thể tích dung
dịch chấm 1 – 5 µL đối với với sắc ký phân tích và 0,1 – 0,2µL đối với sắc
ký điều chế.

Đường xuất phát cách mép bản mỏng khoảng 1,5 – 2,0 cm và cách bề mặt
dao động 0,8 – 1,0 cm.
12

 Khai triển sắc ký:
Sau khi chấm sắc ký, bản đã được sấy khô được cho bào bình sắc ký đã bào
hòa pha động. Mép dưới bản mỏng được nhúng vào pha động nhưng vết chấm
còn cách bề mặt pha động khoảng 1cm.
 Phát hiện vết sắc ký đồ:
Dựa trên các tính chất lý hóa khác nhau của chất phân tích để lựa chọn
cách phát hiện thích hợp các vết sắc ký.
o Phun thuốc thử hiện mầu
o Soi dưới đèn UV
o Dùng densitometer: Thiết bị này đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản
mỏng khi soi dưới đèn UV – VIS. Chất phân tích hấp thụ bức xạ được
ghi lại thành pic sắc ký [9], [13], [29].
c, Ứng dụng của SKLM trong phân tích kiểm nghiệm:
 Phân tích định tính.
 Thử tinh khiết.
 Bán định lượng,
 Định lượng [2], [23].
1.3.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao:
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tân tiến nhất
của công cụ TLC. HPTLC với dụng cụ tinh vi được điều khiển bởi một phần
mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng, độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất của các
số liệu đưa ra. Trong phân tích HPTLC, các thông số của quá trình phân tích
được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó lặp lại được độ lặp lại cao. Các bước
của quá trình phân tích bao gồm phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết
được tiến hành bán tự động, giảm thiếu tối đa các sai số có thể gặp phải. Quá
trình phun mẫu được tiến hành bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu

phun, tốc độ phun và không có nguy cơ hỏng cơ học bản mỏng. Trong quá
trình khai triển, điều kiện khai triển về nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt
13

chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành tại các
phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống
phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng.
Thiết bị của HPTLC:
- Thiết bị chấm mẫu bán tự động.
- Thiết bị phát triển tự động.
- Buồng chụp ảnh TLC được điều khiển thông qua phần mềm
winCAT và phần mềm Video Scan trên máy tính: quét bản mỏng với
hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải
cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy
tính [2], [19].
Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta đưa
vào thị trường bản mỏng hiệu năng cao (high – performance plates). Bản này
được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn (dày khoảng 100 µm) với bột mịn có kích
thước hạt 5 µm độ đồng đều cao hơn. Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ
phân tích được tăng lên bởi vì:
 Vết sắc ký nhỏ hơn.
 Thời gian sắc ký ngắn hơn.
 Lượng dung môi dùng ít hơn.
Pha tĩnh dùng silica và pha liên kết siloxan cho sắc ký lớp mỏng hiệu
năng cao (HPTLC) có sẵn trên thị trường. Tuy vậy trong kỹ thuật này kể cả
HPTLC sai số của phương pháp dao động trong khoảng 5 – 10% [9], [13],
[29]
Ưu điểm của HPTLC:
+ Phù hợp với cả phân tích định tính và phân tích định lượng
+ Trong một lần triển khai sắc ký có thể phân tích đồng thời rất nhiều

mẫu một lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao.
14

+ Các mẫu phân tích và các dung dịch chuẩn được chấm trên cùng 1
bản mỏng sắc ký, khai triển cùng trong một điều kiện dung môi, nhiệt
độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường
giữa các lần phân tích [19].
Do bởi các ưu điểm trên nên chúng tôi lựa chọn kỹ thuật HPTLC để
nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin trong
thực phẩm chức năng.
1.4. Tổng quan về HPLC
1.4.1. Khái niệm chung
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography –
HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha
động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào
ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với
tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. Thành phần pha động đưa
chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp
lý [2], [5].
1.4.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký [2], [1], [5]
Thời gian lƣu:
Khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi pic đến detector là
thời gian lưu t
R
.
Thời gian chết: thời gian t
M
của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó
bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động).
Thời gian lưu hiệu chỉnh: t

R’
= t
R
- t
M
Hệ số phân bố K:
K =
M
S
C
C

Trong đó:
C
S
, C
M
: nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động
15

K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Các chất trong
hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng
hơn.
Hệ số dung lƣợng k’:
k’ =
M
S
MM
SS
V

V
K
VC
VC
.
.
.
=
M
MR
t
tt

Trong đó:
V
S
, V
M
tương ứng là thể tích của pha tĩnh, pha động.
k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha vào hệ số V
S
/V
M

Thông thường chọn k’ = 1-5.
Hệ số chọn lọc α:
Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B:
α =
M
A

R
M
B
R
A
B
A
B
tt
tt
k
k
K
K
'
'

Trong đó:
K
B
, K
A
lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước).
k’
A
,k’
B
tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B.
(t
R

)
A
, (t
R
)
B
tương ứng là thời gian lưu của chất A, B.
Hai chất A và B chỉ có thể tách được khỏi nhau nếu > 1. Trong phân tích sắc
ký, thường lựa chọn điều kiện phân tích để có được α = 1,05 - 2. Nếu α quá
lớn, thời gian phân tích kéo dài.
Số đĩa lý thuyết:
Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký
2
2/1
2
55,516
W
t
W
t
H
L
N
RR

Trong đó:
16

L: chiều dài của cột được chia thành N đĩa lý thuyết; H: chiều cao của đĩa lý
thuyết; W: chiều rộng của pic sắc ký; W

1/2
: chiều rộng pic ứng với một nửa
chiều cao của pic.
Độ phân giải của cột:
Độ phân giải (R
S
) của cột đánh giá khả năng tách định lượng hai chất trong
hỗn hợp trên cột sắc ký:
R
S
=
BA
A
R
B
R
BA
A
R
B
R
WW
tt
WW
tt
,
2/1
,
2/1
.18,1

.
2
1

Trong đó:
W
A
, W
B
tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B.
W
1/2,A
, W
1/2,B
tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B ứng với một nửa chiều cao
của pic.
1.4.3 Thiết bị sắc ký lỏng [1], [2]







Hình 1.2. Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [1].
a. Hệ thống cung cấp pha động:
- Nguốn cấp pha động: pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi
hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp, được chứa
trong bình thủy tinh hoặc thép không rỉ.
Hệ thống cấp

dung môi
Bơm
Bộ phận tiêm mẫu
Cột sắc ký
Detector
Hệ thống thu
nhận và xửa lý
số liệu (máy
ghi, máy tính)
Buồng cột
17

- Bộ phận loại khí (degasser): trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45 µm)
và đuổi khí hòa tan trong pha động để tránh việc khí hòa tan có thể làm biến
dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền. Có thể loại khí hòa tan
bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ….
- Bộ phận trộn pha động (mixer): trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc áp
suất cao
 Chương trình dung môi ở áp suất thấp: mỗi bình chứa dung môi có một
van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó
chỉ dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu.
 Chương trình dung môi ở áp suất cao: Mỗi dung môi có một bơm riêng,
việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao.
- Bơm: về mặt kết cấu có 3 loại thường gặp: Bơm đẩy một pittong, bơm làm
đầy nhanh và bơm kép đẩy kéo.
b. Bộ phận tiêm mẫu:
- Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu
cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu. Vòng
chứa mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50÷20 µL. Có vòng
chứa mẫu lớn hơn.

- Ngoài ra, đôi khi người ta tiêm mẫu bằng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột.
Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao. Cách tiêm này có độ
lặp lại thấp, sai số lớn hơn so với khi dùng van tiêm.
- Hiện nay hay dùng van tiêm mẫu vì có ưu điểm là sẽ dễ dàng tự động hóa,
cột không bị tắc hay bị làm bẩn bởi các mảnh của vách ngăn, thể tích đưa vào
cột hằng định nên độ lặp lại cao.
c. Cột sắc ký
- Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ,
thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm.