Cell based screening assay for inhibitors of porcine circovirus type2 (PCV2) replication 2

 

4. DISCUSSION 
 

 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 

Discussion 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 58  

  


 

4. DISCUSSION 
 
PCV2  is  a  widespread  virus  that  causes  an  array  of  diseases  and  syndromes  in  pigs  (PCVAD) 

(Grau‐Roma et al., 2010). Currently, the only antiviral strategy is prevention by vaccination and no drug 
exists for controlling the disease by limiting viremia. Thus, there is an unmet need to develop antivirals 
that could effectively inhibit PCV2 replication and this study was aimed at addressing this issue through 
the  establishment  of  a  primary  screening  assay  in  an  effort  to  facilitate  drug  discovery  against  PCV2 
replication. The assay was developed by monitoring the expression of Rep protein through IFA to assess 
PCV2 replication. Screening assays in drug discovery are generally divided  into cell‐based and cell‐free 
formats.  In  this  study,  a  whole‐cell  approach  was  chosen  for  development  primarily  because  of 
availability  of  materials;  cell  lines  and  virus  stocks  were  readily  available  and  protocols  were  already 
established. Before commencing, materials had to be standardized by obtaining a uniform batch of (1) 
stable  cell  line  highly  permissive  to  infection  and  supports  high  titer  growth  of  the  virus,  (2)  large 
amounts of antibodies that effectively recognize the target, and (3) large volume of infectious, high titer 
virus. 
Two  cell  lines  considered  for  the  screening  assay  were  PK15‐C1  and  3D4/31  because  of  their 
widespread use in producing PCV2 in cultures. Porcine kidney (PK15) cells are the most widely used for 
growing PCV2 according to literature survey. Moreover, a cell line derived from a subpopulation of PK15 
cells  that  were  shown  highly  permissive  to  PCV2  infection  had  been  previously  generated  (Zhu  et  al., 

2007) and was mainly used in this study. The porcine‐derived transformed monocytic cell line 3D4/31,  is 
another cell line chosen because it had been previously utilized in studies of PCV2 infection biochemistry 
and dynamics (Misinzo et al., 2005; Misinzo et al., 2006), thus showing that the cells are permissive to 
PCV2  infection.  Cell  line  optimized  for  use  in  the  screening  assay  should  be  permissive  to  infection, 
support viral replication and exhibit high infection rates with the virus. 3D4/31 and PK15‐C1 cells were 
grown  in  monolayer  and  incubated  with  stock  PCV2.  Infected  cells  at  early  time  points,  i.e.  24  and  48 
HPI, did not show signs of CPE, consistent with the literature (Allan et al., 1998). Significant cell death 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 59  

  


 

4. DISCUSSION 
 
th

was observed from 72 HPI onwards; on the 4  day following infection 50% of cells had died, and on the 
8th  day  90%  had  lifted  off.  To  determine  whether  PCV2  infection  caused  these  observations,  medium 
obtained from both cell lines grown with the virus was subjected to either PCR or IFA. PCV2‐specific PCR 
of DNA extracted from virus‐containing media resulted to the amplification of a 250 bp portion of the 
virus ORF2 (Liu et al., 2005). Moreover, harvested media used to infect freshly seeded cells resulted to 
positive staining for Rep protein by IFA. These observations confirmed presence of PCV2 in the collected 
media from both cell lines but it was insufficient proof of virus replication within cells. 
To confirm PCV2 replication, infected cell lysates were probed for Rep protein by western blot 
and  detected  in  situ  by  IFA.  The  two  splice  variants  of  Rep  protein  –  Rep  (37  kDa)  and  Rep’  (20  kDa), 

were  detected  by  Western  blot  in  PK15‐C1  but  not  in  3D4/31  lysates.  When  infected  cells  were 
processed for IFA, however, both cell lines stained positive for Rep expression, although infection rates 
were significantly less for 3D4/31 than PK15‐C1 cells. Furthermore, 3D4/31 cells exhibited less than 5% 
infection rate at the highest MOI tested (15, corresponding to infection with 105 TCID50), while PK15‐C1 
exhibited  at  least  10%  infection  rate  at  the  lowest  MOI  (0.17,  corresponding  to  infection  with  103 
TCID50).  These  data  confirm  that  both  cells  supported  PCV2  replication,  although  PK15‐C1  was  more 
permissive  to  PCV2  infection  compared  to  3D4/31.  High  infection  rate  was  observed  in  PK15‐C1  cells  
infected at low MOI (0.17), while a low infection rate was observed in 3D4/31  infected at high MOI (15). 
As a result, PK15‐C1 cells were chosen for optimizing the screening platform.  
Before concluding that 3D4/31 cells are not permissive to PCV2 infection, however, caveat must 
be considered.  One possible explanation for the observed disparity in infection rates between the two 
cell  lines  is  differential  virus  adaptation.  PCV2  used  in  the  experiment  had  undergone  more  than  10 
passaged and expanded in PK15‐C1, and was more adapted to it compared to 3D4/31 cells.   Meanwhile, 
PCV2 had been passaged less than five times in the monocytic cells. Lower adaptation possibly resulted 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 60  

  


 

4. DISCUSSION 
 

to less infection and consequently reduced levels of replication. This hypothesis is supported by previous 
studies  (Yu  et  al.,  2007)  where  tissues  and  cells  collected  from  PCV2‐infected  pigs  were  stained  for 

presence  of  PCV2  antigens.  The  group  concluded  that  monocytic  cells  were  a  main  site  of  viral 
persistence  but  not  for  viral  replication.  Further  adaptation  of  the  virus  would  be  needed  to  increase 
infection rates in 3D4/31 cells, but this is already beyond the scope of this study. 
Growth curve for PK15‐C1 was established to determine the time point at which DNA replication 
at S phase occurs. Whole genome content was extracted and the quantity was plotted against duration 
of incubation. It was observed that PK15‐C1 cells have DNA doubling time of 15.5 hours, and subsequent 
infections  with  PCV2  were  performed  less  than  15.5.  hours  post‐seeding.  Previous  studies  on  PCV2 
infection dynamics revealed that PCV2 replication is dependent on enzymes expressed at S phase and 
viral replication occurs normally after mitosis (Tischer et al., 1987). To expedite infection, cells have to 
be infected prior to mitosis, preferably before S phase. Alternatively, infected cells could be treated to 
glucosamine  to  circumvent  the  need  to  participate  in  cellular  mitosis  prior  to  onset  of  viral  genome 
replication.  
The second prerequisite before commencing the screening assay is large volumes of antibody. 
The monoclonal antibody #4 was previously generated by conventional hybridoma technology and was 
shown to recognize both splice variants of the Rep protein (Meng et al., 2010). Medium collected from 
several rounds of hybridoma cell culture was pooled (1 liter) and frozen in small volumes. Aliquots were 
tested  for  Rep  protein  recognition  by  western  blot  and  yielded  positive  results  with  strong  staining. 
Antibodies were used only once for uniformity of results. FITC‐conjugated antibodies used in the study 
were also purchased in large volumes (10 ml) of the same batch and lot to reduce variability between 
experiments. Antibodies were tested  and found capable of recognizing its target. 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 61  

  


 

4. DISCUSSION 
 
The third pre‐condition that must be satisfied was production of large volume of infectious PCV2 

with high titer. Initial attempts to produce high  titer virus were unsuccessful and titer did not exceed 
104  TCID50/ml.  It  was  observed  that  virus  production  in  roller  bottles  also  did  not    improve  titer. 
Superinfection of persistently infected PK15‐C1 cells was found to  reduce viral titers, because treatment 
with trypsin was lethal to infected cells. This was in contrast to previously observed titer enhancement 
by superinfection, where a three‐fold increase in virus titer was obtained (Allan et al., 1998; O'Dea et al., 
2008). This disparity in results from superinfection studies could be attributed to the difference in cell 
lines used in this study compared with those done by Allan et al. and O’Dea et al. These groups used the 
parental  PK15  cells  comprised  of  a  heterogenous  mixture  of  slow‐  and  fast‐growing  cells  displaying  a 
wide range of PCV2 infection permissivity, while this current study used the subclone PK15‐C1, which is 
mainly comprised of slow‐growing cells highly permissive to PCV2 infection (Zhu et al., 2007). Virus titer 
was  significantly  enhanced  (100‐fold)  only  when  pooled  virus  medium  was  concentrated  by 
ultracentrifugation;  titer  reached  106  TCID50/  ml  and  infection  rate  in  PK15‐C1  using  the  concentrated 
virus was greater than 50% when infected with 105 TCID50 (50 MOI).  Passage of concentrated virus in 
PK15‐C1 cells  did  not significantly  alter the titer, and pooled virus media was  frozen  in  small  aliquots      
(‐80o C) until further use.  
Once  all  the  necessary  materials  had  been  obtained,  development  of  the  screening  assay  was 
performed. Detection of PCV2 infection and replication through IFA of Rep protein is a well‐established 
method  abundantly  found  in  the  literature  (Allan  et  al.,  1998;  Liu  et  al.,  2005;  Meng  et  al.,  2010). 
Fluorescence  detection  system  was  adopted  over  colorimetric  detection  because  of  the  inherent 
sensitivity  of  fluorescent  dyes.  The  IFA  had  been  shown  to  work  in  96‐well  plate  format  without 
difficulty, and scaling down to the 384‐well plate format was expected to be straightforward. Optimizing 
required tweaking three parameters: 1) cell seeding density, 2) MOI, and 3) duration of infection prior to 
fixation.  
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 62  

  


 

4. DISCUSSION 
 
For uniformity of results, it was necessary to have an even  monolayer of cells per well and any 

unnecessary  perturbation  that  might  lead  to  disruption  of  the  cell  sheet  must  be  avoided.  It  was 
previously  observed  that  induction  with  glucosamine  leads  to  enhancement  of  infection  but  with 
concomitant  cytotoxicity  (Tischer  et  al.,  1987;  Allan  and  Ellis,  2000).  It  was  therefore  prudent  to  test 
whether the benefits outweighed the risks of glucosamine treatment in 384‐well plates. Comparison of 
cells  treated  and  untreated  with  glucosamine  yielded  strong  evidence  for  cytotoxicity.  The  central 
portion  of  treated  wells  was  devoid  of  cells  in  contrast  to  the  more  confluent  cell  sheets  observed  in 
untreated wells. Significant glucosamine‐induced cytotoxicity was observed at various MOI (1, 2, 3, and 
4) and different incubation periods (48 and 60  hours).  Similar results were obtained  at other seeding 
densities.  Although  the  cytotoxicity  of  glucosamine  could  be  empirically  reduced  by  shortening  the 
durationof cell contact and thorough washing with PBS prior to replacement with fresh media, doing this 
was not an easy task. Due to the small area of the wells in 384‐well plates, however, glucosamine could 
not  be  completely    removed  without  disrupting  the  cell  sheet.  Washing  with  buffer  also  resulted  to 
mechanical disruption causing cells to lift off the wells. Most importantly, enhancement of infection was 
not  observed  in  glucosamine‐induced  cells.  Infection  rates  in  cells  treated  with  glucosamine  were  not 
significantly  higher  in  comparison  to  those  observed  in  untreated  cells.  Thus,  the  benefits  of 
glucosamine induction did not   outweigh its inherent cytotoxicity  and was considered inessential to the 
assay being developed. Further optimizations  precluded the use of glucosamine. 
Aside  from  an  even  monolayer  of  cells,  another  important  prerequisite  for  the  assay  was 

infection rate of at least 50%. It is necessary to achieve this minimum infection rate in untreated cells so 
that  %  inhibition  of  replication  that  results  from  the  screening  would  yield  unequivocal  results. 
Achieving this requirement depended on the interplay of three factors: (1) seeding density, (2) MOI at 
the time of infection, and (3) duration of infection prior to fixation. Seeding at insufficient density would 
result to low cell confluence at the time of assay; doing so at excessive density would result to very high 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 63  

  


 

4. DISCUSSION 
 

density of cells growing on top of each other. Infection at excessively high MOI would result to greater 
cell  death  and  consequently  larger  regions  devoid  of  cells  on  the  well;  conversely,  infection  with 
insufficient  MOI  would  result  to  infection  rates  less  than  50%.  Balance  also  had  to  be  achieved  with 
duration  of  infection.  Although  higher  infection  rates  could  be  achieved  if  cells  were  infected  for  a 
longer  duration,   incubation for too long would result to most of the infected cells lifting off and  dying 
as  a  consequence  of  virus‐induced  apoptosis  (Liu  et  al.,  2005).  On  the  other  hand,  prolonging  the 
duration of  incubation of  cells  infected at low  MOI  would result to overgrowth and   and  formation of 
multiple layers.  
Initial tests  performed at low MOI (< 10) resulted to low infection rate (< 20%), even  after the 
duration  of  incubation  was  extended  from  48  to  72  hours.  Although  prolonged  incubation  resulted  to 
higher  infection  rates  for  all  seeding  densities,    these  were  less  than  50%  and  cells  seeded  at  higher 
density  formed stacks of cells with multiple layers. Infection with higher MOI (> 10), alternatively, did 

not result to higher infection rates  and cell death became more evident. This consequently led to larger 
areas  denuded  of  cells,  and  this  phenomenon  was  more  prominent  in  wells  incubated  for  longer  
durations.  For  cells  infected  with  10  MOI,  infection  rates  observed  at  48  HPI  were  lower  than  in  cells 
infected with < 1 MOI. At 60 HPI, infection rate was twice as much as that of cells fixed at 48 HPI, and 
this was consistent among all trials; furthermore, the observed infection rates were higher compared to 
cells infected with < 1 MOI. One   hypothesis to explain this phenomenon is that progeny virus within 
cells had not yet been released at 48 HPI. The observed higher infection rate at 60 HPI might be due to 
re‐infection  of  cells  with  the  released  virus.  The  greater  amount  of  cell  death  observed  at  60  HPI 
compared  to  48  HPI  supports  this  hypothesis.  Moreover,  it  was  recently  published  that  host  cell 
apoptosis induced by PCV2 ORF3 is essential for virus exit and concomitant release of progeny virus into 
the environment leading to increased infection rates and viremia (Karuppannan and Kwang, 2010) The 
group  also  observed  that  the  initial  amount  of  cell‐free  virus  in  the  culture  measured  by  quantitative 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 64  

  


 

4. DISCUSSION 
 

real‐time  PCR  was  low  compared  to  the  amount  of  virus  associated  with  cells.  However,  the  levels 
reached  equivalence  at  later  time  points  in  infection,  i.e.  between  48‐72  HPI,  indicating  that  progeny 
virus must have been released within this time frame.  
Although  normal  screening  assays  do  not  usually  employ  higher  than  10  MOI,  it  was  deemed 
necessary  to  explore  the  possibility  of  obtaining  high  infection  rates  (at  least  50%).  An  increase  in 

infection  rate  was  expected  at    MOI  >  10,  since  a  dose  response  was  previously  observed  when 
performing  PCV2 titration in 96‐well plates. However, this was not observed when the assay was scaled 
down to 384‐well plates. One possible explanation was inefficient infection due to suboptimal contact 
between  virus  and  cells.  To  rule  out  this  possibility,  virus  infection  was  expedited  by  gentle 
centrifugation of 384‐well plates previously seeded with cells at 200 RPM for 1 minute during infection. 
It was observed that due to the small diameter of the wells in a 384‐well plate, addition of protein‐rich 
liquids  such  as  culture  medium  (5%  FBS)  often  resulted  to  bubble  formation.  Bubbles  forming  at  the 
interface between the medium and cell surface pose a significant barrier to virus infection, because the 
virus  could  not  directly  contact  the  cells.  In  some  instances  it  was  impossible  to  determine  by  ocular 
inspection  whether  a  bubble  had  been  introduced  by  pipetting  since  the  wells  were  too  small. 
Centrifugation of plates forces the medium towards the bottom of the plate, hence effectively removing 
any  introduced  bubble.  In  spite  of  this,  no  significant  improvement  in  infection  rate  was  observed 
suggesting that the low infection rate was not due to bubble formation. 
A  second  attempt  to  increase  infection  rate  by  enhancing  host‐virus  interaction  was  by  pre‐
incubating  PCV2  and  PK15‐C1  in  suspension  prior  to  seeding.  The  rocking  motion  during  incubation 
would  aid  virus‐cell  contact  and  facilitate  infection.  This  also  did  not  lead  to  significant  increase  in 
infection rates, but instead resulted to greater cell death. The number of cells attached to the bottom of 
the plate 24 hours post‐seeding was significantly less than the number of attached cells in plates seeded 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 65  

  


 

4. DISCUSSION 

 

and  infected  normally.  Whether  cell  death  was  due  to  enhanced  virus  infection  or  to  mechanical 
shearing during pre‐incubation with the virus could not be determined.  
From the previous experiments, it was confirmed that the observed low infection rate was not 
due to inefficient virus‐host contact. Another possibility was that the fluorescence intensity of FITC was 
weak  and  could  not  be  efficiently  detected  by  the  imaging  software,  hence  resulting  to  the  perceived 
low infection rates despite high MOI. Fluorescein is the most widely used green‐fluorescent labeling dye 
and reaches maximum excitation at 494 nm, which is close to that emitted by argon‐ion laser (488 nm). 
Fluorescein has several derivatized dyes such as FITC, whose quantum yield reaches maximum of 0.57. 
Quantum yield is a measure of fluorescence efficiency and is defined as the number of emitted photons 
per  number  of  photons  of  absorbed  (LifeTechnologies,  2010).  Alexa  Fluor  dyes  are  modified 
fluorophores  that  reach  higher  quantum  yields;  Alexa  Fluor  546  has  a  yield  of  0.79  and  therefore 
exhibits  a  more  intense  fluorescence  emission.  When  FITC  and  AlexaFluor  546  were  compared, 
fluorescence was more intense in the wells labeled with Alexa Fluor 546 but the actual infection rates 
did not differ significantly. Infection rates remained the same although cells were seeded at the same 
density and infected with the same MOI. This suggested that the low infection rates previously observed 
with FITC was not due to weak fluorescence emission. This showed that although quantum yield was not 
high, FITC was sufficient for signal detection in the screening format. 
In summary, development of a cell‐based assay with fluorescence detection in a 384‐well plate 
format  was  not  successful.  Despite  optimization  with  cell  seeding  density,  MOI,  and  duration  of 
incubation prior to fixation, infection rates in PK15‐C1 cells did not reach the minimum requirement of 
50%.    Enhancement  of  infection  rates  by  glucosamine  was  also  not  observed.  Infection  rates  greater 
than 50% could be achieved, however, using the concentrated virus (106 TCID5‐0/ml) in the 96‐well plate 
format at 16 MOI. But in the 384‐well plate format, infection rates failed to reach 50% even at 25 MOI. 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 66  

  


 

4. DISCUSSION 
 

Both  inefficient  virus‐host  interaction  and  low  fluorescence  intensity  had  been  ruled  out  as  possible 
causes of the observed low infection rates.  
Since  the  IFA  for  Rep    was  previously  shown  to  work  in  the  96‐well  plate  format,  POC  trial  of 
reference drugs for PCV2 replication inhibition was performed. Testing drugs entailed  determining the 
possible  cytotoxic  effects  and  the  maximum  concentration  tolerated  by  the  cell  lines  being  used.  In 
order  to  setup  a  cytotoxicity  assay,  a  standard  curve  of    FI  was  initially  generated  at  various  seeding 
densities  and  without  the  drug.  FI  was  plotted  against  duration  of  incubation  with  alamar  blue.  Cells 
seeded  at  6000  per  well  was  amenable  for  incubation  with  alamar  blue  for  less  than  4  hours  and 
generates  a  linear  response  in  FI.  The  same  results  were  obtained  when  absorbance  at  570  nm  was 
measured. 
The NF‐ĸB inhibitor Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE) was previously  shown to inhibit PCV2 
replication  in  vitro  at  an  approximate  EC50  of  15  µg/ml  through  an  unidentified  mechanism  of  action 
(Wei et al., 2008). In this study, this drug was added at the time of infection with PCV2 at 15 MOI. No 
adverse cytotoxicity was observed at the tested concentrations(0.01, 0.05, 0.10, 0.50, 1.0, 5.0, and 10.0 
µM)  and  only  6%  growth  control  was  determined  at  10  µM.  This  suggested  that  CAPE  did  not  induce 
significant  death  in  PK15‐C1  cells,  even  at  maximum  concentration  of  10.0  µM.  To  test  whether  PCV2 
replication was inhibited, infected cells treated with CAPE were fixed and processed for IFA. Cells were 
treated with the drugs at various time points: 1) 4 hours prior to (T = ‐4), 2) during (T = 0), and 3) 4 hours 
after (T = 4) infection. The infection rates observed in the treated cells did not differ from drug‐treated 
cells for all time points tested. The experiment was repeated several times but low infection rates were 
still  obtained.  Replication  inhibition  tests  were  also  performed  using  other  reference  drugs  such  as 

U0126 and Mycophenolic Acid (MPA), and similar ambiguous results were obtained due to low infection 
rates. U0126 is a MEK 1 /2 inhibitor found to inhibit PCV2 replication at EC50 of less than 10 µM (Wei and 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 67  

  


 

4. DISCUSSION 
 

Liu, 2009); although never been tested against PCV2, MPA is a potent and reversible inhibitor of Inosine 
Monophosphate Dehydrogenase (MPDH) that had been tried on a diversity of viruses (Cline et al., 1969; 
Panattoni et al., 2007). At this point, it is premature to draw conclusions whether these reference drugs 
failed  to  inhibit  PCV2  replication,  precisely  because  the  basal  infection  rates    in  untreated  cells  were 
unexpectedly low (<20%) and a clear reduction in infection could not be assessed properly. 
Since  in  both  384‐  and  96‐well  plate  formats  the  infection  rates  failed  the  minimum  target  of 
50%,  the  IFA  format  was  abandoned  and  efforts  were  turned  towards  an  assay  format  that  didn’t 
require a minimum infection rate. ELISA had been used previously as a platform for HTS (Lavery et al., 
2001; John et al., 2005; Zuck et al., 2005). Although IFA and ELISA were very similar formats, some steps 
had to be added when  performing ELISA to ensure minimal background signals; endogenous peroxidase 
had to be quenched by addition of freshly prepared 1% hydrogen peroxide prior to blocking. This was 
found to significantly reduce background signals when compared with unquenched cells. Fixed cells had 
to  be  blocked  with  5%  BSA  in  order  to  reduce  nonspecific  binding  of  #4  mAb  to  the  cells.  Stringent 
washing with detergent also had to be  performed after every antibody incubation step.  

One major difference between signals obtained from ELISA and IFA was that FI in the latter was 
counted  per  individual  cell,  whereas  in  the  former  an  average  absorbance  reading  for  the  whole  well 
was    measured.  Therefore,  great  care  must  be  taken  to  ensure  that  background  signal  is  at  minimum 
and sample signals are at maximum levels. If background signals were too high, there would be greater 
chances that the average signal from the untreated wells  would not significantly differ from the treated 
wells. This would lead to overestimated false‐negative rate, and therefore lower the chances of finding 
hits.  
There  are  many  parameters  for  evaluating  assay  performance  or  sensitivity,  and  in  this  study 
S/N and S/B ratios were  used because these could easily be derived from the raw data. S/B ratio gives a 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 68  

  


 

4. DISCUSSION 
 

straightforward description of the difference between the signals from the samples and controls, while 
S/N ratio gives further information on variation in control signals. To test whether cell‐based ELISA could 
be  a  sensitive,  high‐performance  assay  for  detection  of  PCV2  replication,  S/N  and  S/B  ratios  derived 
from  setups  with  various  cell  seeding  densities,  MOI,  secondary  antibody  dilutions,  duration  of 
incubation prior to fixation, and duration of  incubation with the  OPD substrate were compared.    S/N 
and S/B ratios were  at maximum when cells were incubated in substrate for 60 minutes. Therefore, 1 
hour  was  concluded  the  optimum  duration  of  incubation  with  substrate  for  signal  detection.  This  was 

longer  than  the  usual  substrate  incubation  period  in  normal  ELISA,  but  was  necessary  because  of  low 
amounts  of  detected  antigen  in  the  cells.  When  samples  were  incubated  for  90  minutes,  however, 
nonspecific signals became more prominent, hence resulting to lower S/N ratios.  
Cells  incubated  in  1:200  dilution  of  secondary  antibody  generally  yielded    better  S/N  and  S/B 
ratios  compared  to  cells  incubated  in  1:100  dilution  of  secondary  antibody.    The  trend  was  observed 
regardless of MOI or duration of infection prior to fixation and was probably due to reduced nonspecific 
binding  of  antibodies  and  therefore  less  background  signals  obtained  with  higher  dilutions  of  HRP‐
conjugated antibody.  
When considering the effect of seeding density and MOI on the S/N and S/B values, no general 
trend could be obtained although there  was a perceived increase in S/B values as seeding density was 
increased and infection was done at 10 MOI. This trend was reversed at 20 MOI, but these differences 
failed  to  reach  significance.  Data  for  the  S/N  ratios  were  even  more  confounding,  and  none  of  the 
differences reached significance. One possible reason for inconsistent results was the low infection rates 
of cells. Infection rates at 15 MOI assessed by IFA was less than 5%. This was mainly due to the stringent 
blocking and washing required of ELISA. In comparison with cells processed for IFA, infection rates of as 
high as 30% could be observed. Thus, blocking and stringent washing acted like double‐edged swords; 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 69  

  


 

4. DISCUSSION 
 

while  these  significantly    reduced  background  signals,  binding  of  antibody  to  Rep  protein  might  have 
been inadvertently hindered as well. This resulted to low sensitivity and insufficient separation between 
the positive and control signals. 
Another parameter for assessing assay robustness and repeatability is the Z’ factor (Zhang et al., 
1999; Sui and Wu, 2007). Since it takes into consideration the variability of values both from the control 
and  sample  signals,  it  is  the  usual  parameter  of  choice  for  determining  whether  the  screening  assay 
would be amenable to HTS. A Z’ factor of > 0.5 indicates amenability for HTS, while a value between 0 
and  0.5  indicates  faulty  reagents  or  suboptimal  assay,  and  a  negative  value  indicates  that  the  assay 
results to variable data and not amenable for HTS (Inglese et al., 2007; Sui and Wu, 2007).  Z values for 
cell‐based  ELISA  was  not  calculated  for  the  cell‐based  ELISA  assay  since  the  number  of  replicates  and 
trials performed were insufficient for comparison.  
 
The  unexplained    sudden  drop  in  infection  rate  obtained  was  the  main    impediment  in  the 
progress of this study. Initial infection rates using the concentrated virus (106 TCID50/ml) was > 50% in 
the 96‐well plate format at 15 MOI. When the assay was scaled down to 384‐well plates, infection rates 
failed to reach 50%  despite high MOI (25). Furthermore, reverting to 96‐well plates for reference drug 
testing  at  15  MOI    yielded  the  same  low  infection  rate.  This  could  be  due  to  either  the  virus  losing 
infectivity and virulence or the cell line becoming  less permissive to PCV2 infection.  
In order to address the possibility of cells losing permissiveness to PCV2 infection, PK15‐C1 could 
be  re‐cloned  from  the  original  parental  stock  and  used  immediately  for  screening  studies.  Other  cell 
lines possibly highly permissive to PCV2 infection could also be discovered. Although the cell line most 
widely used for propagating PCV2 is PK15, other non‐porcine cell lines such as simian cos‐7 (Liu et al., 
2005), human epithelial and alveolar cells (Chaiyakul et al., 2010)  had previously been used. Moreover, 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 70  

  

 

4. DISCUSSION 
 

new porcine‐derived cell lines recently established for propagation of swine viruses (Ferrari et al., 2003) 
can be employed, although PCV2 was not included in the panel of tested viruses.  It would be interesting 
to  grow  PCV2  using  the  Newborn  Swine  Kidney  (NSK)  and  Newborn  Pig  Trachea  (NPTr)  cells  and 
determine  whether  improved  infection  rates  and  viral  titers  could  be  obtained.  For  these  swine  cell 
lines, no methodology exists for growing PCV2 and such protocols have to be established which could be 
a time‐consuming process. Another likely candidate would be pig lymphocytic cells, since in vivo studies 
in  pigs  showed  that  PCV2  preferentially  infect  and  replicate  within  these  cells  during  early  stages  of 
infection  (Yu  et  al,  2007).  Staining  for  PCV2  antigens  from  samples  derived  from  infected  pigs  also 
showed  high  localization  in  lymph  nodes  (Chae,  2004),  suggesting  high  tropism  of  PCV2  towards 
lymphocytes.  
In  order  to  determine  whether  cell  line  permissiveness  was  at  fault  for  the  reduced  virus 
infection, further studies were performed using the original PK15‐C1 clones obtained in 2005 (Zhu et al., 
2007) to propagate PCV2 at low MOI (1.6). This also failed to increase the virus titer, suggesting that the 
virus must have lost its virulence. 
One  method  to  address  the  issue  of  possible  decrease  in  viral  infectivity    is  the  production  of 
highly concentrated virus by ultracentrifugation. Subsequent passage in PK15‐C1 cells could yield a large 
volume  of  stock  with  the  same  titer  and  possibly  more  virulent  PCV2.  Serial  passaging  of  virus  in  cell 
lines  had  been  shown  to  either  attenuate  parasites  and  viruses  (Ebert,  1998;  Badgett  et  al.,  2002)  or 
make them more highly pathogenic (Clark, 1978; Kaul et al., 2009) due to mutations. For PCV2, evidence 
of enhanced replication in cell culture was observed after serial passage (120 times) in PK15 cells caused 
by two point mutations in the Cap sequence (Fenaux et al., 2004). Moreover, serial passage of live wild‐
type  PCV2  in  postweaned  pigs  could  also  enhance  virulence.  These  methods  were  not  tested  in  the 
study  due  to  time  constraints.  Another  possible  solution  is  to  reconstitute  the  PCV2  virus  from  the 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 71  

  


 

4. DISCUSSION 
 

plasmid  vector.  The  PCV2  Beijing  strain  used  in  this  study  (GenBank  Accession  No.  AY847748)  was 
previously  cloned  in  M13  plasmid.  The  whole  viral  genome  excised  from  the  plasmid  could  be  self‐
ligated  to  produce  the  virus  and  afterwards  used  to  infect  PK15‐C1  cells,  with  the  hope  of  obtaining 
higher infection rates1. 
 
In  summary,  the  goal  of  developing  a  cell‐based  method  for  primary  screening  of  potential 
inhibitors of  PCV2 replication  and  subsequent validation using reference compounds that inhibit PCV2 
replication  were  not  met  due  to  factors  such  as  unexplained,  sudden  decrease  in  infection  rates  and 
time constraints in troubleshooting. It is recommended for further studies to generate higher titers of 
PCV2 and verify stability of cells in supporting high infection rates (> 50%) before proceeding with the 
assay  development.    A  stable  virus  stock  consistently  inducing  >50%  infection  rates  in  cultures  also 
needs  to  be  obtained.  Without  these,  assay  development  in  primary  screening  for  PCV2  replication 
inhibitors  would not yield satisfactory results.  
 

                                                            
1

 This is currently being done at the time of this manuscript revision. However due to time constraints, the results 
of this experiment could not be included in this document 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 72  

  


 

5. BIBLIOGRAPHY 
 

 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 

Bibliography 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 73  


 

5. BIBLIOGRAPHY 
 

5.1 Journal Articles 
 
Allan, G., McNeilly, F., Kennedy, S., Daft, B., Clarke, E., Ellis, J., Haines, D., Meehan, B., and Adair, 
B. (1998). Isolation of porcine circovirus‐like viruses from pigs with a wasting disease in 

the USA and Europe Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 10, 3‐10. 
 
Allan,  G.,  and  Ellis,  J.  (2000).  Porcine  circoviruses:  a  review.  Journal  of  Veterinary  Diagnostic 
Investigation 12, 3‐14. 
 
Badgett,  M.,  Auer,  A.,  Carmichael,  L.,  Parrish,  C.,  and  Bull,  J.  (2002).  Evolutionary  dynamics  of 
viral attenuation. Journal of Virology 76, 10524‐10529. 
 
Blanchard, P., Mahé, D., Cariolet, R., Keranflec'h, A., Baudouard, M.A., Cordioli, P., Albina, E., and 
Jestin,  A.  (2003).  Protection  of  swine  against  post‐weaning  multisystemic  wasting 
syndrome (PMWS) by porcine circovirus type 2 (PCV2) proteins. Vaccine 21, 4565‐4575. 
 
Chae, C. (2004). Postweaning multisystemic wasting syndrome: a review of aetiology, diagnosis 
and pathology. The Veterinary Journal 168, 41‐49. 
 
Chae,  C.  (2005).  A  review  of  porcine  circovirus  2‐associated  syndromes  and  diseases.  The 
Veterinary Journal 169, 326‐336. 
 
Chaiyakul,  M.,  Hsu,  K.,  Dardari,  R.,  Marshall,  F.,  and  Czub,  M.  (2010).  Cytotoxicity  of  ORF3 
Proteins from a Nonpathogenic and a Pathogenic Porcine Circovirus Journal of Virology 
84, 11440–11447. 
 
Clark,  H.  (1978).  Rabies  viruses  increase  in  virulence  when  propagated  in  neuroblastoma  cell 
culture. Science 199, 1072‐1075. 
 
Cline,  J.,  Nelson,  J.,  Gerzon,  K.,  Williams,  R.,  and  Delong,  D.  (1969).  In  vitro  antiviral  activity  of 
mycophenolic acid and its reversal by guanine type compounds  Applied Environmental 
Microbiology 18, 14‐20. 
 
Ebert, D. (1998). Experimental Evolution of Parasites. Science 282, 1432‐1436. 

 
Ellis, J., Clark, E., Haines, D., West, K., Krakowka, S., Kennedy, S., and Allan, G.M. (2004). Porcine 
circovirus‐2 and concurrent infections in the field. Veterinary Microbiology 98, 159‐163. 
 
Ellis, J., Hassard, L., Clark, E., Harding, J., Allan, G., Willson, P., Strokappe, J., Martin, K., McNeilly, 
F., Meehan, B., et al. (1998). Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning 
multisystemic wasting syndrome. Can Vet J 39. 
 
Faurez,  F.,  Dory,  D.,  Grasland,  B.,  and  Jestin,  A.  (2009).  Replication  of  porcine  circoviruses. 
Virology Journal 6, 60‐67. 
 
Fenaux, M., Halbur, P., Gil, M., Toth, T., and Meng, X. (2000). Genetic characterization of type 2 
porcine  circovirus  (PCV‐2)  from  pigs  with  postweaning  multisystemic  syndrome  in 
different  geographic  regions  of  North  America  and  development  of  a  differential  PCR‐
restriction  fragment  length  polymorphism  assay  to  detect  and  differentiate  between 
infections with PCV‐1 and PCV‐2. Journal of Clinical Microbiology 38, 2494‐2503. 
 
Fenaux,  M.,  Opriessnig,  T.,  Halbur,  P.,  Elvinger,  F.,  and  Meng,  X.  (2004).  Two  Amino  Acid 
Mutations  in  the  Capsid  Protein  of  Type  2  Porcine Circovirus  (PCV2)  Enhanced  PCV2 
Replication  In  Vitro  and Attenuated  the  Virus  In  Vivo Journal  of  Virology  78,  13440–
13446. 
 
Feng, B., Simeonov, A., Jadhav, A., Babaoglu, K., Inglese, J., Shoichet, B., and Austin, C. (2007). A 
High‐Throughput Screen for Aggregation‐Based Inhibition in a Large Compound Library. 
Journal of Medicinal Chemistry 50, 2385‐2390. 
 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 74  


 

5. BIBLIOGRAPHY 

 
Feng,  B.,  Toyama,  B.,  Wille,  H.,  Colby,  D.,  Colling,  S.,  May,  B.,  Prusiner,  S.,  Weissman,  J.,  and 
Shoicet,  B.  (2008).  Small‐molecule  aggregates  inhibit  amyloid  polymerization.  Nature 
Chemical Biology 4, 197‐199. 
 
Ferrari,  M.,  Scalvini,  A.,  Losio,  M.N.,  Corradi,  A.,  Soncini,  M.,  Bignotti,  E.,  Milanesi,  E.,  Ajmone‐
Marsan,  P.,  Barlati,  S.,  Bellotti,  D.,  et  al.  (2003).  Establishment  and  characterization  of 
two new pig cell lines for use in virological diagnostic laboratories. Journal of Virological 
Methods 107, 205‐212. 
 
Finsterbusch,  T.,  and  Mankertz,  A.  (2009).  Porcine  circoviruses  ‐  small  but  powerful.  Virus 
Research 143, 177‐183. 
 
Fox, S., Farr‐Jones, S., Sopchak, L., Boggs, A., Nicely, H., Khoury, R., and Biros, M. (2006). High‐
throughput  screening:  updates  on  practices  and  success.  Journal  of  Biomolecular 
Screening 11, 864‐869. 
 
Gonzales, J., Oades, K., Leychkis, Y., Harootunian, A., and Negulescu, P. (1999). Cell‐based assays 
and instrumentation for screening ion‐channeltargets. Drug Discovery Today 4, 431‐439. 
 
Grau‐Roma, L., Fraile, L., and Segalés, J. (2010). Recent advances in the epidemiology, diagnosis 
and  control  of  diseases  caused  by  porcine  circovirus  type  2.  The  Veterinary  Journal  In 
Press, Corrected Proof. 

 
Ha, Y., Ahn, K.K., Kim, B., Cho, K.D., Lee, B.H., Oh, Y.S., Kim, S.H., and Chae, C. (2009). Evidence of 
shedding  of  porcine  circovirus  type  2  in  milk  from  experimentally  infected  sows. 
Research in Veterinary Science 86, 108‐110. 
 
Harding, J.C.S. (2004). The clinical expression and emergence of porcine circovirus 2. Veterinary 
Microbiology 98, 131‐135. 
 
Hertzberg, R.P., and Pope, A.J. (2000). High‐throughput screening: new technology for the 21st 
century. Current Opinion in Chemical Biology 4, 445‐451. 
 
Inglese, J., Johnson, R., Simeonov, A., Xia, M., Zheng, W., Austin, C., and Auld, D. (2007). High‐
throughput screening assays for the identification of chemical probes. Nature Chemical 
Biology 3, 466‐479. 
 
Jacobsen, B., Krueger, L., Seeliger, F., Bruegmann, M., Segalés, J., and Baumgaertner, W. (2009). 
Retrospective study  on  the occurrence  of porcine  circovirus  2  infection  and  associated 
entities in Northern Germany. Veterinary Microbiology 138, 27‐33. 
 
John, S., Fletcher, T., and Jonsson, C. (2005). Development and application of a high‐throughput 
screening assay for HIV‐1 integrase enzyme activities. Journal of Biomolecular Screening 
10, 606‐614. 
 
Kamstrup,  S.,  Barfoed,  A.M.,  Frimann,  T.H.,  Ladekjær‐Mikkelsen,  A.‐S.,  and  Bøtner,  A.  (2004). 
Immunisation  against  PCV2  structural  protein  by  DNA  vaccination  of  mice.  Vaccine  22, 
1358‐1361. 
 
Karuppannan, A.K., and Kwang, J. (2010). ORF3 of porcine circovirus 2 enhances the in vitro and 
in vivo spread of the of the virus. Virology In Press, Corrected Proof. 
 

Karuppannan,  A.K.,  Liu,  S.,  Jia,  Q.,  Selvaraj,  M.,  and  Kwang,  J.  (2010).  Porcine  circovirus  type  2 
ORF3 protein competes with p53  in binding to Pirh2 and mediates the deregulation of 
p53 homeostasis. Virology 398, 1‐11. 
 
Kaul,  A.,  Wörz,  I.,  and  Bartenschlager,  R.  (2009).  Adaptation  of  the  hepatitis  C  virus  to  cell 
culture. Methods in Molecular Biology 510, 361‐372. 
 
Kennedy, S., Moffett, D., McNeilly, F., Meehan, B., Ellis, J., Krakowka, S., and Allan, G.M. (2000). 
Reproduction  of  Lesions  of  Postweaning  Multisystemic  Wasting  Syndrome  by  Infection 
of  Conventional  Pigs  with  Porcine  Circovirus  Type  2  Alone  or  in  Combination  with 
Porcine Parvovirus. Journal of Comparative Pathology 122, 9‐24. 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 75  


 

5. BIBLIOGRAPHY 

 
Kixmöller,  M.,  Ritzmann,  M.,  Eddicks,  M.,  Saalmüller,  A.,  Elbers,  K.,  and  Fachinger,  V.  (2008). 
Reduction  of  PMWS‐associated  clinical  signs  and  co‐infections  by  vaccination  against 
PCV2. Vaccine 26, 3443‐3451. 
 
Larochelle,  R.,  Bielanski,  A.,  Müller,  P.,  and  Magar,  R.  (2000).  PCR  Detection  and  Evidence  of 
Shedding of Porcine Circovirus Type 2 in Boar Semen. Journal of Clinical Microbiology 38, 
4629‐4632. 
 

Larochelle,  R.,  Magar,  R.,  and  D’Allaire,  S.  (2002).  Genetic  characterization  and  phylogenetic 
analysis of porcine circovirus type 2 (PCV2) strains from cases presenting various clinical 
conditions. Virus Research 90, 101‐112. 
 
Lavery,  P.,  Brown,  M.,  and  Pope,  A.  (2001).  Simple  absorbance‐based  assays  for  ultra‐high 
throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening 6, 3‐9. 
 
Lindenbach,  B.D.  (2009).  Measuring  HCV  Infectivity  Produced  in  Cell  Culture  and  In  Vivo. 
Methods in Molecular Biology 510, 329‐336. 
 
Liu, J., Chen, I., and Kwang, J. (2005). Characterization of a Previously Unidentified Viral Protein 
in  Porcine Circovirus  Type  2‐Infected  Cells  and  Its  Role  in Virus‐Induced  Apoptosis. 
Journal of Virology 79, 8262–8274. 
 
Liu, J.,  Chen, I., Du,  Q., Chua,  H.,  and Kwang, J.  (2006).  The  ORF3  Protein  of Porcine  Circovirus 
Type 2 Is Involved in Viral Pathogenesis In Vivo Journal of Virology 80, 5065–5073. 
 
Liu, J., Zhu, Y., Chen, I., Lau, J., He, F., Lau, A., Wang, Z., Karuppannan, A., and Kwang, J. (2007). 
The ORF3 Protein of Porcine Circovirus Type 2 Interacts withPorcine Ubiquitin E3 Ligase 
Pirh2 and Facilitates p53Expression in Viral Infection. Journal of Virology 81, 9560–9567. 
 
Mankertz, A., Mankertz, J., Wolf, K., and Buhk, H. (1998). Identification of a protein essential for 
replication of porcine circovirus. Journal of General Virology 79, 381‐384. 
 
Mankertz, A., Mueller, B., Steinfeldt, T., Schmitt, C., and Finsterbusch, T. (2003). New Reporter 
Gene‐Based Replication Assay Reveals Exchangeability of Replication Factors of Porcine 
Circovirus Types 1 and 2 Journal of Virology 77, 9885–9893. 
 
Mankertz,  A.,  Çaliskan,  R.,  Hattermann,  K.,  Hillenbrand,  B.,  Kurzendoerfer,  P.,  Mueller,  B., 
Schmitt,  C.,  Steinfeldt,  T.,  and  Finsterbusch,  T.  (2004).  Molecular  biology  of  Porcine 

circovirus: analyses of gene expression and viral replication. Veterinary Microbiology 98, 
81‐88. 
 
Martin,  H.,  Le  Potier,  M.‐F.,  and  Maris,  P.  (2008).  Virucidal  efficacy  of  nine  commercial 
disinfectants against porcine circovirus type 2. The Veterinary Journal 177, 388‐393. 
 
Meehan,  B.,  McNeilly,  F.,  Todd,  D.,  Kennedy,  S.,  Jewhurst,  V.,  Ellis,  J.,  Hassard,  L.,  Clark,  E., 
Haines,  D.,  and  Allan,  G.  (1998).  Characterization  of  novel  circovirus  DNAs  associated 
with wasting syndromes in pigs. Journal of General Virology 79, 2171‐2179. 
 
Meng, T., Jia, Q., Liu, S., Karuppannan, A.K., Chang, C.‐C., and Kwang, J. (2010). Characterization 
and  epitope  mapping  of  monoclonal  antibodies  recognizing  N‐terminus  of  Rep  of 
porcine circovirus type 2. Journal of Virological Methods 165, 222‐229. 
 
Misinzo, G., Meerts, P., Bublot, M., Mast, J., Weingartl, H., and Nauwynck, H. (2005). Binding and 
entry characteristics of porcine circovirus 2 in cells of the porcine monocytic line 3D4/31. 
Journal of General Virology 86, 2057‐2068. 
 
Misinzo, G., Delputte, P., Meerts, P., Lefebvre, D., and Nauwynck, H. (2006). Porcine Circovirus 2 
Uses Heparan Sulfate and Chondroitin Sulfate B Glycosaminoglycans as Receptors for Its 
Attachment to Host Cells. Journal of Virology 80, 3487‐3494. 
 
Misinzo,  G.,  Delputte,  P.,  and  Nauwynck,  H.  (2008).  Inhibition  of  Endosome‐Lysosome  System 
Acidification  Enhances Porcine Circovirus  2 Infection  of Porcine  Epithelial  Cells. Journal 
of Virology 82, 1128‐1135. 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 76  

 

5. BIBLIOGRAPHY 
 

 
Muhling,  J.,  Raye,  W.,  Buddle,  J.,  and  Wilcox,  G.  (2006).  Genetic  characterisation  of  Australian 
strains of porcine circovirus types 1 and 2. Australian Veterinary Journal 84, 421‐425. 
Nawagitgul,  P.,  Morozov,  I.,  Bolin,  S.,  Harms,  P.,  Sorden,  S.,  and  Paul,  P.  (2000).  Open  reading 
frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein. Journal of General 
Virology 81, 2281‐2287. 
 
Niagro, F.D., Forsthoefel, A.N., Lawther, R.P., Kamalanathan, L., Ritchie, B.W., Latimer, K.S., and 
Lukert,  P.D.  (1998).  Beak  and  feather  disease  virus  and  porcine  circovirus  genomes: 
intermediates  between  the  geminiviruses  and  plant  circoviruses.  Archives  of  Virology 
143, 1723‐1744. 
 
O'Dea, M.A., Hughes, A.P., Davies, L.J., Muhling, J., Buddle, R., and Wilcox, G.E. (2008). Thermal 
stability of porcine circovirus type 2 in cell culture. Journal of Virological Methods 147, 
61‐66. 
 
Panattoni, A., D’Anna, F., and Triolo, E. (2007). Antiviral activity of tiazofurin and mycophenolic 
acid  against  grapevine  leafroll‐associated  virus  3  in Vitis  vinifera explants.  Antiviral 
Research 73, 206‐211. 
 
Pringle, C.R. (1998). The universal system of virus taxonomy of the International Committee on 
Virus  Taxonomy  (ICTV),  including  new  proposals  ratified  since  publication  of  the  Sixth 
ICTV Report in 1995. Archives of Virology 143, 203‐210. 
 

Raye, W., Muhling, J., Warfe, L., Buddle, J., Palmer, C., and Wilcox, G. (2005). The detection of 
porcine circovirus in the Australian pig herd. Australian Veterinary Journal 83, 300‐304. 
 
Sanchez,  R.E.,  Nauwynck,  H.J.,  McNeilly,  F.,  Allan,  G.M.,  and  Pensaert,  M.B.  (2001).  Porcine 
circovirus  2  infection  in  swine  foetuses  inoculated  at  different  stages  of  gestation. 
Veterinary Microbiology 83, 169‐176. 
 
Segalés,  J.,  Urniza,  A.,  Alegre,  A.,  Bru,  T.,  Crisci,  E.,  Nofrarías,  M.,  López‐Soria,  S.,  Balasch,  M., 
Sibila, M., Xu, Z., et al. (2009). A genetically engineered chimeric vaccine against porcine 
circovirus  type  2  (PCV2)  improves  clinical,  pathological  and  virological  outcomes  in 
postweaning multisystemic wasting syndrome affected farms. Vaccine 27, 7313‐7321. 
 
Shen,  H.G.,  Beach,  N.M.,  Huang,  Y.W.,  Halbur,  P.G.,  Meng,  X.J.,  and  Opriessnig,  T.  (2010). 
Comparison  of  commercial  and experimental  porcine circovirus  type 2  (PCV2) vaccines 
using a triple challenge with PCV2, porcine reproductive and respiratory syndrome virus 
(PRRSV), and porcine parvovirus (PPV). Vaccine 28, 5960‐5966. 
 
Shibata,  I.,  Okuda,  Y.,  Yazawa,  S.,  Ono,  M.,  Sasaki,  T.,  Itagaki,  M.,  Nakajima,  N.,  Okabe,  Y.,  and 
Hidejima,  I.  (2003).  PCR  Detection  of  Porcine  circovirus  type  2  DNA  in  Whole  Blood, 
Serum, Oropharyngeal  Swab,  Nasal Swab,  and  Feces  from  Experimentally  Infected Pigs 
and Field Cases. The Journal of Veterinary Medical Science 65, 405‐408. 
 
Song,  Y.,  Jin,  M.,  Zhang,  S.,  Xu,  X.,  Xiao,  S.,  Cao,  S.,  and  Chen,  H.  (2007).  Generation  and 
immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing cap protein of porcine 
circovirus type 2. Veterinary Microbiology 119, 97‐104. 
 
Stevenson, G., Kiupel, M., Mittal, S., and Kanitz, C. (1999). Ultrastructure of porcine circovirus in 
persistently‐infected PK15 cells. Veterinary Pathology 36, 368‐378. 
 
Sui, Y., and Wu, Z. (2007). Alternative Statistical Parameter for High‐Throughput Screening Assay 

Quality Assessment. Journal of Biomolecular Screening 12, 229‐234. 
 
Sundberg, S.A. (2000). High‐throughput and ultra‐high‐throughput screening: solution‐ and cell‐
based approaches. Current Opinion in Biotechnology 11, 47‐53. 
 
Tischer, I., Gelderblom, H., Vettermann, W., and Koch, M. (1982). A very small porcine virus with 
circular single‐stranded DNA. Nature 295, 64‐66. 
 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 77  


 

5. BIBLIOGRAPHY 

 
Tischer, I., Peters, D., Rasch, R., and Pociuli, S. (1987). Replication of porcine circovirus: induction 
by glucosamine and cell cycle dependence. Archives of Virology 96, 39‐57. 
 
Tomás, A.,  Fernandes, L.T.,  Valero,  O.,  and Segalés,  J.  (2008).  A  meta‐analysis on  experimental 
infections with porcine circovirus type 2 (PCV2). Veterinary Microbiology 132, 260‐273. 
 
Wang, X., Jiang, P., Li, Y., Jiang, W., and Dong, X. (2007). Protection of pigs against post‐weaning 
multisystemic  wasting  syndrome  by  a  recombinant  adenovirus  expressing  the  capsid 
protein of porcine circovirus type 2. Veterinary Microbiology 121, 215‐224. 
 

Wei, L., Kwang, J., Wang, J.,  Shi, L., Yang, B., Li, Y.,  and Liu, J. (2008). Porcine circovirus type  2 
induces the activation of nuclear factor kappa B by IĸBα degradation. Virology 378, 177‐
184. 
 
Wei,  L.,  and  Liu,  J.  (2009). Porcine circovirus type  2 replication  is  impaired  by  inhibition of  the 
extracellular signal‐regulated kinase (ERK) signaling pathway. Virology 386, 203‐209. 
 
Yu,  S.,  Opriessnig,  T.,  Kitikoon,  P.,  Nilubol,  D.,  Halbur,  P.G.,  and  Thacker,  E.  (2007).  Porcine 
circovirus type 2 (PCV2) distribution and replication in tissues and immune cells in early 
infected pigs. Veterinary Immunology and Immunopathology 115, 261‐272. 
 
Zhang,  J.,  Chung,  T.,  and  Oldenburg,  K.  (1999).  A  Simple  Statistical  Parameter  for  Use  in 
Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular 
Screening 4, 67‐73. 
Zhu, Y., Lau, A., Lau, J., Jia, Q., Karuppannan, A.K., and Kwang, J. (2007). Enhanced replication of 
porcine  circovirus  type  2  (PCV2)  in  a  homogeneous  subpopulation  of  PK15  cell  line. 
Virology 369, 423‐430. 
 
Zuck, P., O’Donnell, G., Cassaday, J., Chase, P., Hodder, P., Strulovici, B., and Ferrer, M. (2005). 
Miniaturization of absorbance assays using fluorescent properties of white microplates. 
Analytical Chemistry 342, 254‐259. 
 

5.2 Books 
Johnston,  P.  (2002).  Cellular  Assays  in  HTS.  In  High  Throughput  Screening  Methods  and 
Protocols, W. Janzen, ed. (New Jersey, Humana Press), pp. 87‐106. 
 
Schweitzer,  R.,  and  Abriola,  L.  (2002).  Electrochemiluminescence: A  Technology  Evaluation  and 
Assay  Reformattingof  the  Stat6/P578  Protein–Peptide  Interaction.  In  High  Throughput 
Screening Methods and Protocols, W. Janzen, ed. (New Jersey, Humana Press), pp. 87‐

106. 

 
 

5.3 Online References 
BoehringerIngelheimVetmedica (2010). IngelVac CircoFlex. 
/> 
FortDodgeAnimalHealth (2009). Suvaxyn. 
/> 
LifeTechnologies (2010). Alexa Fluor Dyes Spanning the Visible and Infrared Spectrum. 
/>Handbook/Fluorophores‐and‐Their‐Amine‐Reactive‐Derivatives/Alexa‐Fluor‐Dyes‐
Spanning‐the‐Visible‐and‐Infrared‐Spectrum.html 
 
Novartis (2010). Drug Discovery and Development Process. 
/> 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    
 

Page | 78  


 

5. BIBLIOGRAPHY 
 

Schering‐Plough (2009). Circumvent PCV. 
/>
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    

 

Page | 79  


 

6. APPENDICES  
 

 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 

Appendices 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    

 

Page | 80  


 

6. APPENDICES  
 

6.1  Effect  of  glucosamine  treatment  on  infection  rates  at  various  seeding 
densities 
 
 
 
 
 
 

(A) 

(B) 

(C)

(D) 

(E) 

(F) 

(G)

(H) 

(I) 

(J) 

(K)

(L) 

(M) 

(N) 

(O)

(P) 

 
 
 
 
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 

Figure 6.1 | Effect of Glucosamine Treatment on Infection Rates in Cells Seeded at 2000 per 
 well. Cells were infected with PCV2 BJW at MOI 1 (A, B, I, J), 2 (C, D, K, L), 3 (E, F, M, N), and 4 
 (G, H, O, P) and fixed at 48 HPI (A‐H) and 60 HPI (I‐P). Infected cells were either untreated (A, C, 
E, G, I, K, M, O) or treated (B, D, F, H, J, L, N, P) with glucosamine. Images are representative of 
 3 independent trials. Green (FITC) – PCV2 Rep protein; Blue (DAPI) – cell nuclei 

 
 
 
 
 
 
 
Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    

 

Page | 81  


 

6. APPENDICES  
 

 
 
 
 
 
 

(A) 

(B) 

(C)

(D) 

(E) 

(F) 

(G)

(H) 

(I) 

(J) 

(K)

(L) 

(M) 

(N) 

 
 
 
 
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 

(O)

(P) 

 
 Figure 6.2 | Effect of Glucosamine Treatment on Infection Rates in Cells Seeded at 3000 per 
 well. Cells were infected with PCV2 BJW at MOI 1 (A, B, I, J), 2 (C, D, K, L), 3 (E, F, M, N), and 4 
(G, H, O, P) and fixed at 48 HPI (A‐H) and 60 HPI (I‐P). Infected cells were either untreated (A, C, 
E, G, I, K, M, O) or treated (B, D, F, H, J, L, N, P) with glucosamine. Images are representative of 
 3 independent trials. Green (FITC) – PCV2 Rep protein; Blue (DAPI) – cell nuclei 

 
 
 
 
 
 
 

 
 

Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication    

 

Page | 82