Nghiên cứu phân lập chủng nấm men sinh coenzym q10

BÔ Y TÉ
TRl/ÔNG DAI HOC Dl/OC HÀ NÔI

NGUYÊN QUANG HUNG

NGHIÊN CtJtJ PHÂN LÂP CHÜNG NAM MEN SINH
COENZYME Q10

(KHOÂ LUÂN TOT NGHIÊP DUOC SŸ KHOÂ 2002 - 2007)

Ngufôi hutfng dân:

TH.S LÊ XUÂN HOÀNH

Noi thufc hiên:

Bô mon Công Nghiêp Diïdc

Thôi gian thirc hiên: 02/2007 - (

HÀ NÔI, THÂNG 05/2007
f

r 9-i


l o i

carn 0R

Vụi six bief an sõu sae nhõf, foi xin diroe by fụ long cõm cm ehõn

fhnh foi Th.Đ Lờ Xuõn Tjonh, giõng viờn bụ mon Cụng Rghiờp Burge,
ngiri fhay dõ frire fiởp hirụng dan, dụng viờn foi frong suof quõ frinh
fhire hiờn v hon fhnh hhoõ luõn ny.
Tụi xin by fụ long bief on fol cõe fhy eụ, eõe M fhuõf viờn frong
bụ mon Cụng Rghiờp Birge dõ fan finh eh! dõn, fao dieu hiờn eho fụi
frong suof quõ frinh hon fhnh hhoõ luõn.
Cuoi eựng, eho fụi gui loi cõm on sõu sõe foi gia dinh, ban bố
nhỷng ngiri dõ luụn dụng viờn, hhuyờ'n hhieh giỷp fụi daf duge hờ'f
quõ ngy hụm nay.
ợ} Rụi, fhõng 5 nam 2Q7
Sinh viờn
Hguyộn ỷuang ùjirng


DANH MUC CÂC BÂNG
Irang
Bâng 1.1

Nông dô CoQlO trong câc té chüc.

8

Bâng 1.2

Sir phân bo cüa câc loai CoQ à câc chi nam men.

14

Bâng 3.1

Câc chüng nam men sac tô phân lâp dune

22

Bâng 3.2

Két quâ quét phoUV- VIS câc mâu dich chiét.

24

Bâng 3.3

Dô hâp thu cüa câc dich chiét.

25

Bâng 3.4

Thôi gian hru và diên tich peak cûa câc mâu.

26

Bâng 3.5

Luçmg sinh khôi nâm men cüa câc chüng thü

28

nghiêm.
Bâng 3.6

Cuc dai hâp thu cûa câc dich chiét.

29

Bâng 3.7

Dô hâp thu cûa câc dich chiét à 275 nm.

29

Bâng 3.8

Dô hâp thu nguyên tü Se cüa câc mâu.

31

DANH MUC CAC HÎNH VÊ, DO THI
Trang
Hînh 1.1

So' dô chuôi hô hâp té bào

6

Hînh 3.1

Hînh ânh dich chiét cüa mot so chüng nâm men

23

Hînh 3.2

Phô hâp thu UV- VIS a: Mâu HCQ2, b: Mâu HCQ5

25

Hînh 3.3

Sàc kÿ dô æ CoQ 10 chuân, b: Mâu HCQ5 tai 275 nm

27

Hînh 3.4

Dô thi dirông chu an thé hiên moi quan hê giüa nông dô

31

Se và dô hâp thu nguyên tu


MUC LUC
Trang
LễI CM ON
MUC LUC
DANH MUC CC BNG, HINH Vẫ, DO THI
DAT VAN DE
PHAN I: TễNG QUAN

1. Khõi quõt vờ CoenzymQlO
1.1. Gioi thiờu chung
1.2. Cõu truc hoõ hoc, trnh chat hoõ l
1.2.1. Cõu truc hoõ hoc
1.2.2. Tmhchõt hoõ l
1.3. Nguụn gục, co chộ hoat dụng, vai trụ tõc dung
1.3.1. Nguụn gục
1.3.2. Co chộ hoat dụng
1.3.3. Vai tro tõc dung
1.4. Su phõt tri en cỹa CoQlO
1.4.1. Lich sỹ phõt triởn
1.4.2. Sõn xuõt CoQlO
2. Nõm men
2.1. Khõi niờm
2.2. Hợnh thõi, cõu truc cỹa nõm men
2.3. Dinh duụng nõm men
2.4. Sinh sõn cỷa nõm men
2.5. ỷng dung cỹa nõm men
2.5.1. ỹng dung chung
2.5.2. ỹng dung trong ùùnh vue y- duoc
2.6. Nõm men v CoQlO
PHN II: PHUONGPHP NGHIấN CĩU

1. Nguyờn võt lieu, thiột bi
1.1. Nguyờn lieu, hoõ chõt
1.2. Mõy moc,thiột bi
1.3. Mot sụ mụi trifng sỹ dung trong nghiờn cỷu
2. Phuong phõp nghiờn cỹu
2.1. Phõn lõp nõm men sõc to tự lõ cõy
2.2. Tõch chiột CoQlO tự nõm men

2.3. Dinh tmh, so bụ dõnh giõ hm lirong CoQlO
2.3.1. Dinh tợnh
2.3.2. So bụ dõnh giõ hm luong

1
2

2
2
2
3
4
4
4
5
8
9
9
10
11
11
11
11
12
12
12
13
13
15

15
15
15
16
16
16
17
18
18
18


2.4. Xâc dinh chinh xâc CoQlO bàng phiiong phâp sàc kÿ
long hiêu nâng cao
2.5. Khâo sât ânh hiïông cûa câc chat oxy hoâ manh trong
môi trurông nuôi cây toi khâ nâng sinh tong hop CoQlO
2.6. Khâo sât khâ nâng tong hop Selen htm co tù nguôn
Selen vô co cüa chüng nâm men sinh CoQ 10
PHAN III: KÊT QUÂ VÀ BÀN LUÂN

1. Phân lâp và thuân khiét
2. Tâch chiét CoQ 10
3. Dinh tfnh, so bô dânh giâ hàm luong
3.1. Dinh tmh
3.2. So bô dânh giâ hàm luong
4. Xâc dinh chmh xâc CoQ 10 bâng phucfng phâp sâc kÿ long
hiêu nâng cao
5. Khâo sât ânh huông cûa câc chât oxy hoâ manh trong môi
trucmg nuôi cây toi khâ nâng sinh tong hop CoQ 10
6. Khâo sât khâ nâng tong hop selen hüu co tù nguôn selen

vô co cüa chüng nâm men sinh CoQlO
PHÂN IV: KÊT LUÂN VÀ DE XUAT

1. Kê't luân
2. Dê xuât

18
19
19

22

22
22
23
23

25
26
28
30

33
33
33


DAT VAN DE
Ngy nay, vcfi su phõt triởn cỹa nờn kinh tộ thù cuục sụng cỹa con ngirụ'i
ngy cng duoc nõng cao, di cựng vai no l su xuõt hiờn ngy cng nhiờu cõc

bờnh nguy hiởm nhu: dõi thõo dirng, ung thu, bờnh tim mach...Mụt trong
nhiờu nguyờn nhõn gõy bờnh duoc xõc dinh l do su co mõt cỹa gục tu do. De
phong v diờu tri cõc cõn bờnh ny sõn phõm duoc khuyộn cõo sỹ dung l cõc
hoat chõt chụng oxy hoõ, chụng gục tu do nhu: CoenzymQlO, P-caroten,
Selen hỷu co, VitaminE...
CoenzymQlO duoc phõt hiờn du tiờn vo nõm 1957. Trõi qua quõ trinh
nghiờn cuu lõu di, ngiri ta dõ tợm ra vai tro rõt quan trong cỹa CoenzymQlO
trong viờc sõn xuõt ra ATP- nguụn nõng luong sinh hoc cỹa co thộ. Khụng
nhựng thộ, CoenzymQlO con duoc dõc biờt quan tõm vụi vai trụ l mot chõt
chụng oxy hoõ, mot nguyờn tụ vi luong tuong tu cõc vitamin tan trong du co
tõc dung trong phong v diờu tri nhiờu loai bờnh nhu: bờnh tim mach, ung thu,
dõi thõo ducmg, Parkinson...v lm giõm quõ trợnh lõo hoõ, giỹ gợn tuụi thanh
xuõn cho con ngiri. Tai nhiờu ntfục trờn thộ giụi CoenzymQlO dõ duỗ/c sõn
xuõt dirụi nhiờu dang thuục v m phõm cho con nguụri. Tuy nhiờn nirc ta
CoenzymQlO võn con ợt duoc quan tõm cõ trong lợnh vue sõn xuõt v sỹ dung.
Nhm gụp phõn tợm hiởu thờm kiộn thiùc vờ lợnh vue ny dụng thi tợm kiộm
nguụn nguyờn lieu dura CoenzymQlO, chỹng tụi tien hnh dờ ti: Nghiờn
cuu phõn lõp chỹng nõm men sinh CoenzymQlO vụi cõc mue tiờu:
- Phõn lõp nõm men sinh CoenzymQlO
- Khõo sõt õnh huụng cỷa cõc chõt oxy hoõ manh trong mụi triidng nuụi
cõy tụi khõ nõng sinh tong hỗfp CoenzymQlO.
- Khõo sõt khõ nõng tong hỗfp Selen hiùti ccf cỹa chỹng nõm men sinh
CoenzymQlO.

1


PHAN I. TONG QUAN
1. Khõi quõt vộ CoenzymQlO
1.1. Gioi thiờu chung

CoenzymQlO (CoQ 10) hay con co tờn khõc l Ubidecarenone, l mot
coenzym nụi sinh, l dõn xuõt cỹa benzoquinon, co mot mach nhõnh
hydratcarbon di gụm 10 nhom isopren. CoQ 10 l thnh phõn cỹa chuụi hụ
hõp tộ bo trờn mng ty thộ, no l mot chõt mang quan trong vai vai tro võn
chuyởn electron(e') v proton(H+) tir chõt cho l NADH (hoc FMNH2) tụi
chõt nhõn l chuụi cytocrom, giup cho ty thộ thuc hiờn chiợc nõng tong hop
nõng ltfỗmg sinh hoc (ATP)-nguụn nng luong de duy tri moi hoat dụng sụng
cỹa co thộ. [9], [10], [19]
CoQlO co trong moi tộ bo cỹa co thộ cõc loi dụng võt co vu. Ngoi ra,
CoQ 10 con co ụr cõc loi vi sinh võt hiờu khi v thuc võt bõc cao [11], [14].
Trong tộ bo, ty thộ l noi ch ira nhiờu CoQlO nhõt [14]. Tai dõy, CoQlO kột
ho'p vdi cõc enzym khõc trong chuụi hụ hõp de thuc hiờn chirc nng tong ho'p
ATP. Ngoi chiợc nõng ny CoQlO cụn co chiic nõng loai bụ gục tu do, bõo vờ
mng ty thở khụi su peroxy hoõ mng, bõo vờ tộ bo khụi tõc hai cỹa gục tu
do. [8]
CoQ 10 l chõt chong oxy hoõ tan trong du duy nhõt co thở con ngu'i tu
tong hop duoc. Xột vờ dõc diởm chong oxy hoõ, CoQ 10 duoc xộp vo nhom
polyphenol (nhom ny gụm cụ : VitaminA, VitaminE, VitaminC, CoQ,
Bioflavonoid...)- do l cõc chõt chong oxy hoõ khụng co bõn chõt enzym.
CoQ 10 co mõt tai khõp cõc co quan trong co thở, nhỹng co quan giu CoQ 10
nhõt l tim, gan, thõn, tuy, hờ thong miờn dich; cụn phụi l co quan co ợt
CoQ 10 nhõt. Nụng dụ CoQ 10 trong cõc co quan giõm dan theo tuụi gi. [1],
[7]
1.2. Cõu truc hoõ hoc, tmh chõt l hoõ

2


1.2.1. Cõu truc hoõ hoc
O

h 3c c x X

|

xh

3

T

ầH3
H3C O ^ ^ Y ^ ( C H 2^ CH2)n H
O
CoenzymQlO (n = 10)
Cõu truc co bõn cỹa CoQ 10 gụm 2 phõn: Nhõn benzoquinon v duụi
hydratcarbon. [11], [13]
Su co mõt cỹa nhõn benzoquinon lm cho cõu truc cỷa CoQ 10 gn giụng
vụi cõu truc cỹa Vitamin K v Vitamin E [1], [4]. Nhụ khõ nng bien dụi
thuõn nghich giỹa hai dang quinon v quinol cỹa nhõn benzoquinon nờn
CoQ 10 co thở ton tai 3 dang cõu truc: dang oxy hoõ, dang khỹ v dang
luụng gục. Cõc dang cõu truc ny tham gia vo quõ trinh oxy hoõ khỹ giỹ'a
nhCrng dehydrogenase v cytocromb trong chuụi hụ hõp tộ bo cỹa ty thở. [9],
[ 11]

O
h.c o ^

A

O*

^ c Hj

HjCO"' Y

h+

e

h 3C

0 ^ ^ /C H 3

HặO^

O
Dang oxy hoõ

OH

^RH

e -, h + H j C O ^ A ^ c n ,

H" , Ê

OH
Dang luụng gục

OH
Dang khỹ

Duụi hydratcacbon cỹa CoQ 10 gụm 10 nhom isopren, cựng vụi nhõn
benzoquinon cng lm tõng tmh thõn du cỹa ton phõn tỹ, giỹp CoQ 10 dộ
dng di chuyởn trong lụp lipid kộp cỹa mng ty thở dở thuc hiờn chirc nõng
võn chuyởn e" [1]- Duụi hydratcacbon cỹa CoenzymQ cụn duoc dựng lm yộu
tụ dở phõn loai. Riờng nguụi, chợ co CoQlO co nghla l duụi hydratcacbon
gụm 10 nhom isopren, cụn cõc loi khõc thợ tờn cỹa CoenzymQ chợ sụ luỗfng
nhom isopren tuong ung co trong phõn tỹ, eu thở: [10], [11]

3


n = 6> CoenzymQ6
n=7

-> CoenzymQ7

n=8

-> CoenzymQ8

n = 9ằ CoenzymQ9
n = 10 ằ CoenzymQlO
Tõt cõ cõc chõt ny dờu l nhỷng coenzym oxy hoõ khỹ co chỹ'c nng, vai
trụ sinh hoc giụng nhau. [10]
1.2.2. Tinh chõt hoõ l
CoQ 10 tinh khiột ton tai dang tinh thở mu vng hoõc vng cam, nụng
chõy ụ nhiờt dụ 48 C, tan trong du v cõc dung mụi huỹ co, dõc biờt dở tan
trong Aceton, Ethanol, n-Hexan, Ethylacetat...CoQ10 bi phõn hu v bien
mu tir tir khi tiộp xỹc vụi õnh sõng, nhiờt dụ, dụ õm. [11], [13]

Cõu truc benzoquinon trong phõn tir lm cho CoQ 10 dờ bi khir. Duụi
hydratcatbon gụm mot chuụi dõy nụi dụi liờn hỗfp di, kột hop vụi nhõn
benzoquinon tao cho CoQ 10 tmh chõt hõp thu õnh sõng tir ngoai tir buục sụng
270 -> 290 nm, co ^max= 275 nm [11], [13]. Dõy l tmh chõt quan trong duoc
un g dung dở dinh tmh v dinh luong CoQ 10 bang phộp do phụ hõp thu tir
ngoai.
1.3. Nguụn gục, co chộ hoat dụng, vai trụ tõc dung
1.3.1. Nguụn goc
Coenzym Q10 l hop chõt co nguụn gục tu nhiờn, duoc tong hỗfp trong ccf
thở. ễ nguụi, CoQlO duoc tong hỗfp gan qua 17 phõn ung vụi su tham gia
cỹa nhiờu enzyme cựng vụi ft nhõt

8 loai Vitamin (gụm VitaminBl,

VitaminB2 , VitaminB3, VitaminBs, VitaminBụ, VitaminB9 (acid folie),
VitaminBi2, VitaminC) v mot sụ nguyờn tụ vi luong (kờm, dụng...).Quõ
trinh sinh tong hop CoQ 10 trong co thở gụm 3 giai doan co bõn: [16], [23]

4


- Giai doan 1: Tong hop decaprenyl tir Acetyl CoA, tir dụ tong hop duụi
hydratcacbon.
- Giai doan2: Tong hop Acid parahydroxylbenzoic tir tyrosin v
phenylamin, roi tong hop nhõn benzoquinon.
- Giai doan 3: Gõn nhõn benzoquinon v duụi hydratcacbon dở tao thnh
CoQ 10 nho enzym decaprenyl diphotphat synthethase.
Ngoi luong CoQ 10 nụi sinh, co thở chỹng ta con duoc cung cap CoQ 10 tir
thuc n vụi hm luỗmg tu thuục vo khõu phõn an v thụi quen n uụng cỹa
tim g vựng [11]. Cõc loai thuc phõm co nhiờu CoQ 10 gụm: cõc tụ chỹc dụng

võt nhu tim, gan, long dụ trỹng; mot so loai cõ nhu cõ hụi, cõ sacdin; mot sụ
loai du thuc võt nhu du dõu nnh, du cõi v trong mot so loai rau, dõc biờt
l rau sỹp la,rau spinach. [18], [19]
Trong co thở, nụng dụ CoQ 10 thay dụi tu theo tirng loai mụ, nụng dụ cao
nhõt l tim do võy tim l co quan du tiờn bi õnh huụng khi co thộ thiộu
CoQlO. Luong CoQlO nụi sinh dat tụi da quanh tuoi 20 sau dụ giõm dn.
Luong ny sở giõm 25% tuoi 30 v giõm 50% tuoi 39-43. [7]
Nhu võy, khõ nõng tong hop CoQ 10 cỹa co thở thù giõm dn theo dụ tuoi,
con luong cung cap tir thuc õn lai rat ợt do khõu phn õn chỹa ợt hoõc do
CoQ 10 bi phõn hu trong quõ trinh chộ bien, vi võy viờc cung cap CoQ 10 tir
thuục hay tir cõc dang thuc phõm chỷc nõng l rat cn thiột, dõc biờt vụi nhung
ngucfi cụ nhu cu cao vờ CoQ 10 nhu: ngui gi, nguụd bi bờnh tim mach, ung
thu, Parkinson...
1.3.2. Ca chờ hoat dụng
Trong chuụi hụ hõp tộ bo, H+ v e" duoc võn chuyởn tir NADH (hoõc
FMNH2) tụi CoenzymQ (oxy hoõ). Sau do, CoenzymQ (khỹ) võn chuyởn e'
dộn phtfc hỗfp enzym võn chuyởn diờn tỹ (hờ thụng cytorom) cụn H+ duỗfc

5


chuyën truc tiép tôi O" dë tao thành H20. [1], [10]
£33EC7 +

Fumarate FADH;?

Hînh 1.1: Sa do chuôi hô hâp té bào
Bên ngoài ty thë, CoQ 10 là chât chông oxy hoâ manh tuong tu câc chât
chông oxy hoâ khâc nhu: vitamin A, vitaminE, vitaminC, J3-caroten...[8], [11].
Khâ nâng trung hoà gôc tu do cüa CoQ 10 côn co nhüng uu diëm noi bât bôi

câ 3 dang ton tai cüa CoQ 10 dèu cô khâ nàng loai bô gôc tu do: [1]
Dang khü cüa CoQ 10 thuôc nhom câc chât chông oxy hoâ polyphenol, cô
khâ nâng trung hoà hai gôc tu do (R*):
OH

O

+ 2R1

+ 2RH

O
Dang khü

Dang oxy hoâ

Dang oxy hoâ cô khâ nàng trung hoà tiép hai gôc tu do nua nhà khâ nâng
chuyën dang luông gôc:

6


Dang luụng goc
Dõc biờt hai dang oxy hoõ v dang khir co thở phõn ỷng vụi nhau mot cõch
thuõn nghich tao ra gục Semiquinon v trung ho tiộp hai gục tir do:
OH

O

O*

OR
+2R*

O
Gục semiquinon
Hu hột cõc gục semiquinon rõt bờn, co thở ton tai lõu di, mot sụ cụ dục
tmh do chỹng gõn dong hoõ tri vo cõc cao phõn tỹ sinh hoc, nhung riờng vụi
CoQ 10 (v c vitaminA, C, E) thi semiquinon khụng dục, do võy nụ l chõt
trung ho cõc gục tu do rat tụt.
CoQ 10 cụ ngay mng ty thở, nụ l chõt chụng oxy hoõ duoc sỹ dung du
tiờn dở loai bụ gục tu do sinh ra tiù chuụi hụ hõp te' bo- mot trong nhỷng trung
tõm phõt sinh gục tu do m chỹ yộu l nhỷng gục tu do cụ hoat tinh cao nhu:
OH, 0 2, H20 2. Tir dụ CoQ 10 giỹp bõo vờ mng ty thở trõnh khụi quõ trinh
peroxy hoõ mng (quõ trợnh POL), bõo vờ ADN, ARN cỹa tộ bo trõnh khụi
tõc hai cỹa gục tu do nụi mụi v ngoai mụi. Trong mõu, CoQlO bõo vờ cõc
LDL-cholesterol khụi su tõn cụng cỹa cõc gục tu do, ngn cõn quõ trinh oxy
hoõ cõc LDL-cholesterol- nguyờn nhõn gõy xo vỷa, tõc nghởn mach mõu dõn
tụi cõc bờnh vờ tim mach v tai bien mach mõu trong dụ dõc biờt nguy hiởm l


tai bien mach mõu nõo. Ngoi ra, CoQlO cụn cụ loi trong phụng v diờu tri
nhiờu bờnh khõc m cỹ chộ bờnh sinh lien quan tụi goc tu do. [1], [11]
1.3.3. Vai tr tac dung
Nhu dõ biột, nng liro'ng duoc tao ra tir cõc phõn iùng oxy hoõ khỹ trong co
thở sinh võt duỗfc giõi phụng ra chu yộu duụi dang nhiờt, cụn mot phn duoc
tfch lu duụi dang ATP- nguụn nõng luong sinh hoc cung cõp cho moi hoat
dụng sụng cỹa co thở. Cõc kột quõ nghiờn cỹli dõ chợ ra rng CoQlO l chùa
khoõ cỹa quõ trinh sinh tụng hop ATP, nờu khụng cụ CoQlO thợ sở khụng thở
tong hop ATP, tộ bo sở khụng cụ du nõng luong dở thuc hiờn cõc chuc nng

sinh hoc cỹng nhu duy tri su sụng [17]. Thộo nhõn dinh cỹa mot bi bõo trờn
tụ tap chf tim mach cỹa M xuõt ban nam 1990 thi: CoQlO l yộu tụ cõn thiột
cho ty thở thuc hiờn cõc chỹc nõng cỹa nụ v nụ (CoQlO) l yộu tụ thiột yộu
cho cuục sụng cỹa chỹng ta. [17]
Bng 1.1 : Nụng dụ CoQlO trong cõc to chirc
Co quan

Nụng dụ CoQlO (|uig/g)

Tim

144,0

Thõn

66,5

Gan

54,9

Tuy

32,7

Nõo

13,4

Ruụt

16,7

Tir su cn thiột ny, dở dng nhõn thõy cõc tộ chirc hoat dụng cng nhiờu,
nhu cu nõng luong cng lụn thi nụng dụ CoQlO trong to chuc dụ cng cao.
[H ]

Loi fch trong phụng v diờu tri bờnh tõt cỹa CoQlO dờu dira vo hai tõc
dung chụng oxy hoõ v tao nõng luong sinh hoc. Rat nhiờu chộ phõm chira

8


CoQlO dang don le v dang hụn hop vụi cõc chat chụng oxy hoõ khõc dirac
sir dung trong phong v diờu tri mot so bờnh nhir:
- Cõc bờnh tim mach: Suy tim xung huyột, dau thõt ngirc, tõng huyột õp, co
tim thiộu mõu eue bụ, bờnh co tim, bờnh van tim, bờnh mach vnh, loan nhip
tim v dựng cõ cho nguụi bờnh sau mo tim. [7], [17], [22], [23]
- Cõc bờnh liờn quan dộn goc tu do: Di lợng, duc thu tinh thở, ung thu, tiởu
duụng, bộo phợ, bờnh gan thõn, Alzheimer, Parkinson...[17], [18], [22]
Cõc nghiờn cuu dõ cho thõy, vụi bờnh Parkinson, Alzheimer...thi CoQlO
phõt huy tõc dung tụt khi dựng liờu cao 600-800 mg/ngy, v tụt nhõt l
dựng CoQlO hng ngy tự dụ tuoi trung niờn de phong trõnh cõc bờnh ny.

[11]
- CoQlO con co tõc dung kich thich hờ miởn dich do dụ co tõc dung tụt khi
sir dung phụi hop de diờu tri cõc bờnh nhiờm khuõn v cõ vefi bờnh AIDS. [11],
[18]
Mot dc diởm rat quan trong cua CoQlO do l tmh an ton cao, hu nhu
khụng cụ tõc dung phu, nộu co thi chi xuõt hiờn khi dựng liờu cao v tõc dung

phu ny cỹng khụng nguy hiởm. [11]
1.4. Sir phõt triờn cỹa CoQlO
1.4.1. Lich sphõt triờn
CoQlO duỗfc phõt hiờn ln dau tiờn vo nõm 1957, trõi qua 50 nõm nghiờn
cuu v phõt triởn, su hiởu biờt cỹa chỹng ta vờ vai trụ tõc dung cỹa nụ dụi vụi
sire khoố ngy cng cõn kở, sõu sc hon. [17], [20, [22]
Lich sỹ phõt triởn cỹa CoQlO :
- Nõm 1957, tien si Frederick Crõne truụng dai hoc Wisconsin (M) dõ
phõn lõp duo'c mot chat vng cam tự ty thở tim bụ. Cựng nõm dụ, giõo su
Morton cỹa Anh cỹng tợm ra mot hỗfp chat tuong tu v duoc giụi thiờu vụi tờn
Ubiquinone- nghợa l ubiquitous quinone.

9


- Nàm 1958, giâo sur Karl Folkers và công su ô hâng Merck dâ xâc dinh
duoc câu truc hoâ hoc cüa CoQ 10 và tong hop duoc nô trong phong thi
nghiêm. Ho cüng là nhûng nguoi dàu tiên sân xuât CoQ 10 bang phuong phâp
lên men, tâch chiét tü nâm men. Ho dâ phât hiên ra câc ubiquinone khâc nhau
ô sô luong nhom isopren và CoQ 10 thi duoc tim thây trong ty thë cüa dông vât
cô vu trong khi Coenzym Q6 thi duoc tîm thây ô vi khuân.
- Nâm 1961, CoQlO duoc sü dung thü nghiêm trong diêu tri ung thu.
Nguôi ta dâ phât hiên thây su thiéu hut enzym trong mâu cüa nhüng bênh
nhân ung thu và nông dô CoQ 10 rât thâp ô nhüng bênh nhân bi Myeloma,
Lymphoma, ung thu vu, phoi, tuy, tuyén tiên liât, thân...
- Nâm 1964, CoQ 10 duoc sü dung trong diêu tri suy tim cho kêt quâ tôt. Su
thành công này duoc lÿ giai là do hiêu quâ cung câp nâng luong cüa CoQ 10
cho co tim.
- Nàm 1970, khâ nâng chông oxy hoâ cüa CoQlO duoc phât hiên, nô trô
thành mot thuôc, mot chât dinh duông cô ich trong diêu tri câc vân dê vê tim

mach an toàn và hiêu quâ.
- Nâm 1978, nhà khoa hoc nguoi Anh Peter Mitchell dâ nhân duoc giai
Nobel hoâ hoc cho kêt quâ nghiên cüu vê vai trô cüa CoQ 10 trong co ché sân
xuât nâng luong cüa té bào.
- Tü dàu nhûng nâm 1980, CoQlO dâ duoc thü nghiêm rât nhiêu trên lâm
sàng, tat câ câc kêt quâ dêu chüng minh vai trô và tâc dung cô loi cüa CoQ 10.
Hiên nay, ô câc nhiêu nuôc nhu: Nhât, Mÿ, Canada...CoQ 10 duoc sü dung
rông râi, không càn kê don. Nô duoc dùng vôi câ mue dich phong, chüa bênh
và châm soc sâc dep, chông lâo hoâ. CoQ 10 dang là mot thuôc cô nhiêu triën
vong, nô dang duoc sü dung trong diêu tri rât nhiêu cân bênh thô'i dai rât nguy
hiëm cho con nguôi nhu: ung thu, parkinson, dâi duông, cao huyét âp, béo phî,
Alzheimer... [11], [15]
1.4.2. Sân xuât CoQlO

10


Tlt nhüng nghiên cuu ban dâu cho dén iing dung vào sân xuât CoQlO
nguyên lieu, dén nay co nhiêu buée tiê'n dài. Luc dâu CoQlO duoc sân xuât
bàng phuong phâp lên men, tâch chiét tù nâm men. Dén nay dô vân là phuong
phâp chmh dùng dë sân xuât CoQlO, tât nhiên dâ cô rat nhiêu câi tién dé tao
ra hiêu suât cao hon [20], [24]. CoQlO côn duoc chiét tù vi khuân, tir câc to
chirc cüa dông vât, thuc vât bâc cao, tuy nhiên do giâ thành cao nên ît duoc su
dung. [24]
Phuong phâp tong hop hoâ hoc cüng là phuong phâp duoc dùng dë sân
xuât CoQlO ô quy mô công nghiêp, tuy nhiên sân phâm thu duoc không phâi
là CoQlO tu nhiên mà thuông à dang dông phân cis, trans, isome...[17]
Hiên nay, câc sân phâm cô chùa CoQlO duoc sân xuât bôi nhiêu công ty,
tâp doàn duoc phâm vôi nhiêu chüng loai, mâu ma nhu : viên nang mêm, nang
dâu...và hàm luong rat phong phü: 30 mg, 60 mg, 100 mg, 120 mg, 200 mg,

400 mg. Ngoài ra, côn cô dang phôi hop cüa CoQlO vôi câc châ't khâc dë tâng
tmh hiêu quâ khi sü dung nhu: VitaminE + CoQlO, Selen + CoQlO,...
2. Nâm men
2.1. Khâi niêm
Nâm men là tên chung chî nhôm nâm cô câu tao don bào, sinh sân chü yéu
theo phuong thüc nây chôi, mot sô theo kiëu phân cat và bào tü. [2], [5]
2.2. Hinh thâi, câu truc cüa nâm men
Nâm men thuông cô dang hinh câu, hinh bàu duc, hinh elip, hinh chôp,
hinh quâ dua vôi kich thuôc té bào khoâng 2 - 15(a m. [2]
Nâm men thuôc giôi eucaryota, là vi sinh vât diën hinh cho nhôm nhân thât
vôi câu truc té bào gôm 3 phân chmh: thành té bào, té bào chat và nhân, trong
dô dâc biêt là thành té bào cô chùa mannan, glucan giüp chüng chông chiu tôt
vôi diêu kiên ngoai cânh. [2], [5]
2.3. Dinh dtfông nâm men [5]

11


Nõm men thuục nhụm vi sinh võt di clirng, rõt dở phõt triởn trong mụi
trirng nuụi cõy m khụng dụi hụi

khatkhe vờ dinh duụng nhir vikhuõn.

Nguụn dinh duụng cỷa nõm men

gụmco: nguụncacbon

nhir: cõc

loai

hydratcacbon, cõc loai nrou, acid hỹu co, acid amin, protein.. .;nguụn nito bao
hm cõ nito vụ co v nito h Cru co nhir: muụi amoni, muụi nitrat, ure.. v mot
sụ nguyờn tụ vi liùong khõc (Mg, K a..
2.4. Sinh sõn cỹa nõm men [2]
Nõm men cụ cõ hai hinh thiùc sinh sõn vụ tinh v hỹu tmh.
Hinh thỹc sinh sõn vụ tmh cỹa nõm men gụm cụ ba kiởu: kiởu nõy chụi,
kiởu phõn cõt v kiởu sinh sõn bõng bo tỹ. Nõy chụi l hinh thuc sinh sõn don
giõn, phụ bien nhõt cỹa nõm men v cụ tõt cõ cõc chi. Phõn cõt l hinh thuc
sinh sõn cỹa chi Schizosaccharomyces. Cụn hinh thuc sinh sõn bng bo tỹ thi
gụm cụ ba loai nhụ hcfn, dụ l: bo tỹ dot chi Geotrichum, bo tỹ õo nõm
Candida Albican v bo tỹ ban cõc chi Sporobolomyces, Bullera,
Aessosporon.
Hinh thỹc sinh sõn hỹu tmh xõy ra khi hai tộ bo nõm men kột hop vụi
nhau hinh thnh nờn hỗfp tỹ. Hop tỹ phõn chia thnh cõc tộ bo nm trong
nang, nang chm duoc phõt tõn ra ngoi. Hinh thuc sinh sõn ny lai gụm hai
loai: tiộp hop dang giao- nộu hai tộ bo nõm men cụ hinh thõi, kfch thuục
giụng nhau tiộp hop vụi nhau v tiộp hop di giao- nộu hai tộ bo nõm men cụ
hinh thõi, kfch thuục khõc nhau tiộp hỗfp vụi nhau.
2.5. ĩng dung cỹa nõm men
2.5.1. ng dung chung [2], [3], [5]
Nõm men v cõc sõn phõm cỹa nụ dõ duoc sỹ dung trong cụng nghiờp thuc
phõm tự rõt lõu. Diởn hinh l Saccharomyces cerevisiae duoc sỹ dung trong
sõn xuõt bõnh mợ, bia, ruỗm, glycerol v men invertase. Cụn Saccharomyces
fragilis thi duoc sỹ dung sõn xuõt sựa v cõc sõn phõm tự sỷa.

12


Nõm men cỹng duoc sir dung dở sõn xuõt cõc acid amin, vitamin, protein,

trong dụ dõc biờt l nõm men sinh protein dõ duoc sir dung lm thuc phõm cho
con nguụi trong chien tranh thộ gicfi ln 2 v trong cõc chiộn dich chong dụi ụ
/v '

An Dụ, Angieri.
Ngoi ra, nõm men cụn duoc sỹ dung trong chn nuụi: sir dung cõc sõn
phõm phu cỹa nghnh cụng nghiờp khõc (rợ duụng, dich thu phõn gụ,...) dở
lm chõt dinh duụng cho võt nuụi, nõng cao chõt luong thit; v trong viờc xỹ
l cõc nguụn phộ thõi nhu: du mụ, cõc sõn phõm cỹa du mụ sỹ dung trong
cõc nghnh cụng nghiờp, giao thụng, dụi sụng...trõnh gõy ụ nhiờm mụi truụng.
2.5.2. ng dung trong lợnh vue y- ditffc [2], [3, [11]
Nhiờu loai nõm men cụ khõ nõng tong hofp mot luong enzym ngoai bo lụn
so vụi nhu cõu sỹ dung trong trao doi chõt cỹa chỹng. Nhỷng loai ny duofe
ỷng dung trong sõn xuõt cõc chộ phõm enzym quy mụ cụng nghiờp nhu:
amylase, lipase, glucoamylase...dựng lm thuục hụ tro tiờu hoõ.
Nhiờu nuục trờn thộ giụi dang sỹ dung nõm men S. Boulardi duụi dang cõc
chộ phõm dụng khụ nhu: Bioflor, Ultra-Levue dở diờu tri mot sụ bờnh: ợa chõy
nhiờm trựng cõp tmh do vi khuõn, virus, nõm; diờu tri hụi chỹng kich thich
ruụt...
Hiờn nay, nhiờu loi thuục chi Saccharomyces dang duoc sỹ dung lm
cụng eu dở mang cõc ADN tõi to hop phuc vu cho viờc sõn xuõt cõc chộ phõm
thuục thộ hờ mụi cỹa kù thuõt di truyờn.
ĩhg dung quan trong nhõt cỹa nõm men hiờn nay dụ l sỹ dung trong
phuong phõp bõt dụng tộ bo dở sõn xuõt ethanol, 6- APA...
2.6. Nõm men v CoQlO
Theo cõc kờt quõ nghiờn curu dõ duoc cụng bụ, trong cõc chi nõm men dõ
duoc phõt hiờn nguụi ta tim thõy tõt cõ cõc loai CoenzymQ (Ubiquinon). Mụi
loai CoenzymQ ton tai mot sụ chi nhõt dinh, cụ thở thõy diờu ny qua bõng
duụi dõy: [12]

13


Bâng 1.2: Su phân bo cüa câc loai CoQ à câc chi nâm men
Tên chi
Arxiozyma, Hanseniaspora, Saccharomyces,
Nematospora, Torulaspora, Nadsoni,...
Ambrosiozyma, Williopsis, Candida, Pichia,
Hormoascus, ...
Arthroascus, Botryoascus,
Endomyces,Clavispora, Zygozyma, Hyphpichia...
Aciculoconidium, Filobasidium, Lipomyces,
Leucosporidium, Rhodotorula, Trichosporon,...
Bullera, Cryptococcus, Filobasidiella,
Saitoella Filobasidium, Rhodoforula,
Rhodosporidium, Schizosaccharomyces,
Sporodiobolus, Sporobolomyces, Tremella,
Trichosporon, Leucosporidium..

Loai CoQ
CoQ6
CoQ7
CoQ8
CoQ9

CoQ 10

Tùf bâng trên co thë thây câc chi nâm men sinh CoQ 10 cüng khâ nhiêu. Sân
xuât Coq 10 tùf nâm men vân là phuong phâp chmh và hiêu quâ nhât duoc su'
dung do: nâm men thucmg lành trnh, nuôi cây nhanh, dë dàng, dat hiêu quâ

kinh tê' cao. Tuy nhiên phuong phâp này vân cô mot so khô khàn, trô ngai nhu:
màng tê' bào nâm men khâ dày nên khô phâ vô, luong CoQ 10 nâm men sân
xuât ra không nhiêu [9]. Do dô nêu chi nuôi cây thông thucmg thî luong
CoQ 10 thu diro'c rât nhô dân tôi giâ thành sân phâm së cao. Vï vây càn phâi âp
dung câc bien phâp khoa hoc kÿ thuât hiên dai nhu: dot bien gien, chuyën
gien...dë nâng cao hiêu suât sinh tong hçfp CoQ 10 cüa nâm men.

14


PHAN II. PHIJONG PHP NGHIấN CĩU
1. Nguyờn võt liờu, thiet bi
1.1. Nguyờn liờu, hoõ chat
- Glucose

(Trung Quoc)

- Methanol

(Dire)

- Amoni sulfat

(Trung Quoc)

- Ethanol

(Dire)

- Magie sulfat

(Trung Quoc)

- Acid percloric

(Dire)

- Natri selenit

(Dire)

- Kalidihydrophotphat (Trung Quoc)
- Dimethylsulfoxid

(Nhõt)

- Ethyl acetate

(Trung Quoc)

- n-Hexan

(Trung Quoc)

- Kalinitrat

(Trung Quoc)

- Kalipermanganat

(Trung Quoc)

- Kalibicromat

(Trung Quoc)

- La cõy lõy vuem thuc võt trucmg dai hoc Dirỗfc HN, thi trõn Chõu Qu,
thi trõn Ho.
1.2. Mõy mục, thiet bi
SANYO

- Buụng cõy vụ trựng

(Nhõt)
(Nga)

- Noi hõp õp lue
- Tỹ õm

Memmert

(Dut)

- Tỹ sõy

Memmert

(Dỹc)

- Mõy lc ong nghiờm

HS501

(Dỹ-c)

- Mõy lõc binh tam giõc

Taitec

(Nhõt)

- Mõy ly tõm

Rotofix 32 (Dỹc)

- Mõy do quang pho UV-VIS

Varian Cary (Australia)

- Mõy phõn tfch pho hõp thu nguyờn tỹ

Shimazu

(Nhõt)

- Mõy sõc k long cao õp

Shimazu

(Nhõt)

- Dùa pộtri, ong nghiờm, bợnh non cõc loai, ong eppendorf, ong falcon,
pipetman cõc loai, dau cụn cõc loai.

15


1.3. Mot so mụi truựng sỹ dung trong nghiờn cỷu
* Mụi tru'dng 1: Mụi truụng co bõn
Glucose

5g

Cao ngụ

0,5 g

(NH4)2S04

0,3 g

MgS04

0,1 g

KH2P 0 4

0,2 g

Nuục vựa du

100 ml

* Mụi trung 2: Mụi trirụng 1 + thach 2%
* Mụi trirụrng 3: Mụi trucmg 1 + thach 2% + Amoxicilin 0,01%
* Mụi trucmg 4: Mụi truụ'ng 1 + K N 030,5%
* Mụi trucmg 5: Mụi tru'ụ'ng 1 + KM n04 0,5%
* Mụi trirdng 6: Mụi tnrụng 1 + K 2Cr 20 7 0,5%
* Mụi trucmg 7: Mụi trucmg 1 + N a2Se03 0,001%
2. Phiùcmg phõp nghiờn ciùu
2.1. Phõn lõp nam men sac totợclõ cõy
Phõn lõp nõm men co sõc tụ tựf vng nhat > dụ tir la cõy trờn mụi trucmg
(3) theo 2 phuong phõp:
Phuong phõp pha loõng: Cõn lg la cõy, cõt nhụ vo cục cụ mụ sach chtra
20 ml nuục cõt dõ tiờt trựng, ngõm v lac trong 10 phỹt. Tu vo luong te bo
trong dich sau khi soi trờn kmh hiởn vi, pha loõng tụi nong dụ thfch hop. Sau
dụ cõy lờn mụi trucmg (3). Dựng que gat trõi dờu trờn mõt thach. Nuụi cõy
30C trong 5 ngy.
Phuong phõp bo tu bõn: Cõt mot khoanh lõ cụ diờn tợch gõn bõng diờn tợch
mõt thach. Cụ' dinh lõ trờn nõp hụp pộtri bõng bõng dmh hai mõt, mõt duụi cỹa
lõ huụng xuong mõt thach. Hng ngy doi dùa thach. Cõc dùa thach nuụi cõy
30C trong 5 ngy.

16


Câc mâu nâm men sac to tir vàng dén dô sau khi phân lâp duoc tién hành
thuân khiét trên môi trucmg so (2) bâng câch cây zic zac nhiêu làn cho tcti khi
thu dirçc chung thuân khiét. GiCr giong thu duç/c trong ong nghiêm à nhiêt dô
5°C.

2.2. Tâch chiêt CoQlO tùnâm men
So dô chiét tâch:
Nâm men
j 72h, 30°C
Dich lên men
Dich loai bô

<---------

~-1
Sinh khôi
p— ---------------D M S O

▼Khuây 2 phüt
Dich mâu
*
^
▼Khuây 5 phüt

Hôn hop dm chiét

Hôn nhü dich
, r Ly tâm 4000v/phüt
Tâch pha
|

Lây phân dich trên

Dich chiét CoQlO

Ouv trinh chiét tâch:
Nâm men diroc cây vâo ong nghiêm chüa 10 ml dich môi trucmg (1), nuôi
lâc à 170 vông/phüt, 30°C trong 24 gift. Sau dô chuyén vâo bïnh non dung tfch
500 ml chirâ 140 ml dich nuôi cây.


Bùnh non duoc lac vụi toc dụ 140 vụng/phỹt, chiờỹ sõng lien tue trong 48
gid 30C. Dich nuụi cõy thu duoc dem ly tõm trong 5 phỹt vụi toc dụ 4000
vụng/phỹt. Loai bụ lụp dich, cõn v tinh luong sinh khụi tộ bo.
Dung mụi phõ tộ bo (DMSO) duoc ngõm nụng 55C, sau dụ cho vo
ong falcon vụi t le lg sinh khụi : 5 ml DMSO. Lõc manh trong 2 phỹt. Thờm
1 ml dung dich dờm photphat NaH2P04/Na2HP04 pH=7, 15 ml hụn hop dung
mụi chiột (hụn hỗfp Ethylacetat:n-Hexan =1:1) roi lõc tiộp trong 5 phỹt.
Ly tõm trong 5 phỹt vụi toc dụ 4000 vụng/phỹt. Dựng pipet hỹt lõy lụp
dung mụi phfa trờn. Bõo quõn mõu trong tỹ lanh sõu.
2.3. Dinh tmh, sabụ dõnh giõ liCffng CoQlO
2.3.1.. Dinh tinh: Dua vo phụ hõp thu UV-VIS
- Cõc mõu thu duoc tỹ quõ trinh tõch chiột dem quột phụ hõp thu UV-VIS
trong khoõng buục sụng tỹ 200>500 nm. Xõc dinh cõc eue dai hõp thu v so
vụi eue dai hõp thu cỹa CoQ 10 chuõn.
2.3.2. Sofbụ dõnh giõ hm litỗfng
Lõy 1 ml dich chiột cỹa mụi mõu dem pha loõng 4 ln bõng hụn hop dung
mụi chiột roi tiộn hnh do quang phụ hõp thu ụ buục sụng 275 nm.
Tỹ kột quõ dụ hõp thu D, so bụ dõnh giõ hm luong trong mụi mõu v so
sõnh khõ nng tong hop CoQ 10 cỹa cõc chỹng nõm men.
Dua vo quột phụ hõp thu UV- VIS v kột quõ do dụ hõp thu chỹng tụi
chon ra mot sụ chỹng tụt nhõt dở tiộn hnh cõc thỹ nghiờm tiộp sau.
2.4. Xõc dinh chinh xõc CoQlO bang phuong phõp sõc k long hiờu
nõng cao (HPLC)
Tiờ'n hnh chay HPLC vụi cõc mõu dõ duoc lua chon roi so sõnh thụi gian

luu, sõc k dụ vụi CoQ 10 chuõn.
- Chuõn bi mõu chuõn: Lõy viờn thuục Coenzyme Q10 cỹa hõng
ECKHART Corp (M). Ho vo 10 ml Ethanol bng cõch dun nụng ụ 50C
trong 2 phỹt. Loc qua giõy, thu lõy phõn dich loc.

18


- Chuân bi mâu thü : Lây 1 ml dich chiét cüa môi mâu, cô can, hoà tan can
bang 10 ml Ethanol. Loc, thu lây dich loc.
- Tién hành chay sàc kÿ long hiêu nâng cao theo tiêu chuân BP 2005:
Diêu kiên chay : + Côt Symmetry Ci8 (Waters) 150*4,6 mm
+ Pha dông: Methanol: Ethanol vôi tÿ lê 80:20(v:v)
+ Detector PDA
+ Toc dô dông: 2 ml/phüt
+ Nhiêt dô côt: 30°C
+ Thôi gian chay: 20 phüt.
2.5. Khâo sât ânh huâng cüa câc chat oxy hôa manh trong môi trucfng
nuôi cây toi khâ nâng sinh tong hop CoQlO
- Tién hành khâo sât vôi câc chüng duoc lua chon à trên.
- Câc chüng này diroc lên men trong câc môi tnrông 4,5,6 à 30°C trong 72
giô. Ly tâm thu sinh khôi, tâch chiét lây phân dich chu*a CoQ 10.
- Dich chiét thu duoc dem quét pho hâp thu UV-VIS à bu'ôc sông tùr
200—>500 nm. So sânh eue dai hâp thu vôi eue dai hâp thu cüa dich chiét ô
diêu kiên bînh thucmg và vôi CoQ 10 dë dânh giâ ânh huông cüa câc chât oxy
hoâ.
- Lây 1 ml dich chiét cüa môi mâu, pha loâng 4 lân bàng hôn hop dung
môi chiét roi do dô hâp thu à buôc sông 275 nm. So sânh vôi dô hâp thu cüa
mâu lên men trong diêu kiên không cô chât oxy hoâ.
2.6. Khâo sât khâ nâng tong hap Se hüu cor tit nguôn Se vô co’ cüa

chüng nâm men sinh CoQlO
a.

Nuôi cây

- Nguôn Se vô co : muôi Na2Se03
- Câc chüng thü nghiêm duoc nuôi cây à 30°C trong 72 giô:
+ Nuôi cây 24 giô trong ong nghiêm chira 10 ml môi truông (1) (Nhân
giông cap I).

19


+ Chuyởn dich nuụi cõy trong ong nghiờm vo binh non dung tich 500 ml
chỹa 90 ml dich nuụi cõy. Nuụi cõy trong 48 giụ, cho thờm vo mụi truụng
nuụi cõy 1 mg muụi Na2Se03 giỹ thu-20 (Nhõn giụng cõp II).
- Dich nuụi cõy du'ac ly tõm vai toc dụ 4000 vong/phỹt trong 5 phỹt. Loai
bụ dich, thu sinh khụi. Rira sinh khụi bõng nirục cõt (2 lõn) vụ trựng tụi khi
khụng cụn Se vụ cụ (thỹ Se vụ ca bng thuục thỹ Bac nitrat(AgN03): thỹ tụi
khi nirục rira khụng cụn cho kột tua trang vụi AgN03)
b. Dinh liùỗfng Selen hỹu ccf bõng phitong phõp F-AAS
* Cõc diờu kiờn do:
- Nguụn : Dốn cathod rụng Selen
- Circmg dụ dốn : 14,5 mA
- Birục sụng : 196,0 nm
- Dụ rụng khe : 1,3 nm
- Chiờu cao bumer : 5 mm
- Khi ngon lira : Acetylen-Khụng khi nộn
- p lire khi nộn : 160 kPa
- Toc dụ khi Acetylen : 2,4 ml/phỹt

- Thụi gian chụ : 5 giõy
- Thụi gian do : 10 giõy
* Xự l mõu: Cõn mot luụng mõu khoõng 1 g sinh khụi cho vo cục, thờm
acid nitric v acid percloric theo t le: 0,1: 4: 1 roi tien hnh vụ cụ hoõ trong
16 vi sụng trong 60 phỹt. Sau khi vụ cụ hoõ xong, de mõu nguụi, tien hnh bay
hụi dung mụi trờn bởp diờn tụi khi thở tich cỹa mụi mõu con 0,5 ml.
* Chuõn bi dung dich chuõn: Tự dung dich chuõn goc Selen lOOOmcg, pha
cõc dung dich cụ nụng dụ 4,0; 8,0 |~ig/ml bõng dung dich HC104 4%
* Chuõn bi dung dich thu: cho vo mụi mõu thu 1 ml acid HC104 v mot
luong nhụ nuac roi cho tõt cõ vo bợnh dinh mỷc 25,00 ml. Thờm nuụ'c cho
vira dỷ 25,00 ml, lõc dờu.

20