Nghiên cứu phân tích hoạt chất flunarizine trong thuốc viên nang bằng phương pháp HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ NGỌC HẠNH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT
FLUNARIZINE TRONG THUỐC VIÊN
NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I

HÀ NỘI 2015


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ NGỌC HẠNH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT
FLUNARIZINE TRONG THUỐC VIÊN
NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I
CHUYÊN NGÀNH: CNDP VÀ BÀO CHẾ
MÃ SỐ:

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
Nơi thực hiện:Trường Đại Học Dược Hà Nội
Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa
Thời gian thực hiện: 15/01 – 19/5/2015

HÀ NỘI 2015


LỜI CẢM ƠN
Trải qua thời gian tham gia học tập lớp dược sĩ chuyên khoa cấp I và
quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, bản thân đã nhận được nhiều sự
quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ những kiến thức quý báu từ các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội cũng với các anh chị đồng nghiệp của Trung
tâm Kiểm nghiệm Thanh Hóa.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới
PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Đồng thời, tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, cùng toàn
thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, và tạo điều
kiện để tôi hoàn thành khóa học này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo và tập thể cán bộ Trung tâm
Kiểm Nghiệm Thanh Hóa đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời
gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin phép được gửi những tình cảm sâu sắc và lòng
biết ơn vô hạn tới gia đình, người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn giúp
đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành
tốt luận văn chuyên khoa.
Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2015
Học viên: Đỗ Ngọc Hạnh


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AcCN

Acetonitril

AFTA

Khu vực mậu dịch tự do Asean

BYT

Bộ Y tế

CP

Dược điển Trung Quốc

DĐVN

Dược điển Việt Nam

EP

Dược điển Châu Âu

HD

Hạn sử dụng

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

MeOH

Methanol

PVP K

Poly Vinyl Pyrovidon Kali

RS

Độ phân giải

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SKS

Số kiểm soát

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

TLC

Sắc ký lớp mỏng

tR

Thời gian lưu

TT

Thông tư

USP

Dược điển Mỹ

UV-VIS

Quang phổ tử ngoại khả kiến

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới

WTO

Tổ chức thương mại thế giới


MỤC LỤC
MỤC

TRANG

ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chương 1. TỔNG QUAN

3

1.1. Tổng quan về tiêu chuẩn kỹ thuật của thuốc.

3

1.2 Tổng quan về Flunarizin

4

1.2.1 Cấu trúc phân tử, tính chất lý hóa

4

1.2.2.Tính chất dược động học, tác dụng dược lý

5

1.2.3 Tổng quan về các tiêu chuẩn kỹ thuật thuốc viên nang
Flunarizin

6

1.3.Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao

9

1.3.1. Khái niệm chung

9

1.3.2. Một số thông số đặc trưng của sắc ký

9

1.3.4.Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao trong kiểm nghiệm
thuốc

13

1.4. Nội dung thẩm định phương pháp bằng HPLC

14

1.4.1 Tính phù hợp của hệ thống sắc ký

14

1.4.2. Độ đặc hiệu/chọn lọc

14

1.4.3. Độ tuyến tính

15

1.4.4. Độ đúng

15

1.4.5. Độ chính xác

16

Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

17


2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

17

2.1.1 Hóa chất, vật liệu

17

2.1.2 Chất chuẩn

17

2.1.3 Mẫu thử nghiên cứu

18

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ

19

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU

20

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

21

2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký để xây dựng phương pháp
định tính, định lượng hoạt chất Flunarizin trong chế phẩm thuốc

21

viên nang bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích định tính, định lượng đã
xây dựng
2.3.3 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng kiểm nghiệm một số
mẫu thuốc viên nang Flunarizin lưu hành trên thị trường

22

24

2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

24

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

25

3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
ĐỂ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
HOẠT CHẤT FLUNARIZIN TRONG CHẾ PHẨM THUỐC

25

VIÊN NANG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

27

3.2.1 Chuẩn bị mẫu

27

3.2.2. Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống

27


3.2.3 Độ đặc hiệu của phương pháp

29

3.2.4. Khoảng nồng độ tuyến tính

30

3.2.5. Độ chính xác

32

3.2.6. Độ đúng

35

3.3 ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU THUỐC THU
THẬP TRÊN THỊ TRƯỜNG
3.3.1 So sánh phương pháp đã xây dựng với phương pháp đã
đăng ký trong TCCS (phương pháp đo quang, kèm chất chuẩn)
3.3.2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng phân tích một số mẫu
nghiên cứu

37

37

39

Chương 4. BÀN LUẬN

42

4.1 VỀ XÂY DỰNGPHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

41

4.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

43

4.3 VỀ SO SÁNH KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG
PHÁP HPLC MỚI XÂY DỰNG VỚI PHƯƠNG PHÁP UV-VIS

44

MÀ NHIỀU TCCS ĐÃ XÂY DỰNG
4.3 VỀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH CÁC MẪU THUỐC
VIÊN NANG FLUNARIZIN 5,0 mg SẢN XUẤT TRONG NƯỚC

44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

45

KẾT LUẬN

45

ĐỀ XUẤT

46

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG
TÊN BẢNG

TRANG

Bảng 1.1: Một số điều kiện định lượng hoạt chất Flunarizin

7

Bảng 2.1: Danh sách các mẫu phân tích

18

Bảng 2.2. Thành phần tá dược trong các chế phẩm thuốc viên
nang Flunarizin sản xuất trong nước.

20

Bảng 2.3. Công thức bào chế mẫu Placebo

21

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát các điều kiện sắc ký

26

Bảng 3.2. Kết quả thẩm định độ thích hợp của hệ thống sắc ký.

28

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính.

31

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp

33

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương
pháp

34

Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp

36

Bảng 3.7 Kết quả định lượng mẫu thử bằng phương pháp UVVIS

38

Bảng 3.8. Kết quả so sánh hai phương pháp thử

39

Bảng 3.9 Kết quả phân tích các mẫu nghiên cứu bằng phương
pháp HPLC đã xây dựng.

40

DANH MỤC CÁC HÌNH

TÊN HÌNH

TRANG

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Flunarizin

4

Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn Flunarizin.

29

Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử Flunarizin.

29

Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch mẫu Placebo.

30

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ
và diện tích píc flunarizin

31

ĐẶT VẤN ĐỀ
Flunarizin là thuốc đối kháng calci có chọn lọc. Thuốc hấp thu tốt
qua đường ruột, đạt nồng độ đỉnh trong vòng 2-4 giờ và đạt trạng thái cân
bằng hằng định ở tuần thứ 5 thứ 6. Thuốc gắn kết với protein 90%, chuyển
hóa hoàn toàn qua gan. Thuốc và các chất chuyển hóa thải trừ qua đường
mật ra phân, thời gian thải hoàn toàn khoảng 18 ngày. Thuốc ngăn chặn sự
quá tải Calci tế bào, bằng cách giảm Calci tràn vào quá mức qua màng tế
bào, không tác động đến sự co bóp và dẫn truyền cơ tim. Thuốc được dùng
để phòng các cơn đau nửa đầu có triệu chứng báo trước và không có triệu
chứng báo trước, điều trị chứng chóng mặt tiền đình do rối loạn tiền đình.
Điều trị các chứng thiểu năng tuần hoàn não và suy giảm chức năng tuần
hoàn não, suy giảm oxy tế bào não bao gồm: chóng mặt, nhức đầu nguyên
nhân mạch máu, rối loạn kích thích, mất trí nhớ, kém tập trung và rối loạn
giấc ngủ [5],[17].
Hiện nay theo thống kê của Cục Quản lý Dược Việt Nam có 53 chế
phẩm thuốc viên nang Flunarizin được cấp số đăng ký trong vòng 5 năm
gần đây; gồm 16 thuốc sản xuất trong nước và 37 thuốc nhập ngoại có
nguồn gốc từ các nước trong khu vực như: Ấn Độ, Bangladet, Pakistan,
Hàn Quốc, Trung Quốc, ...
Tham khảo các tiêu chuẩn cơ sở của các thuốc được đăng ký cho
thấy, mức chất lượng công bố và phương pháp thử khác nhau theo từng tiêu
chuẩn cơ sở [6], [7], [8] [15], [16] gây khó khăn rất nhiều cho các đơn vị
làm công tác kiểm tra chất lượng thuốc, vì không có một phương pháp
chung để kiểm tra chất lượng sản phẩm. Đặc biệt đối với thuốc ngoại nhập
việc có được một bản tiêu chuẩn kỹ thuật gốc dùng để kiểm tra chất lượng
sản phẩm là rất khó khăn và thường không kịp thời.
DĐVN IV; Dược điển Anh (BP 2013); Dược điển Mỹ (USP 34);
Dược điển Châu Âu (EP 2012); Dược điển của Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO Pharmacopoeia 2012) chưa có chyên luận quy định về chất lượng
của viên nang Flunarizin [13], [18].

1


Dược điển Trung Quốc (CP 2005) có một chuyên luận quy định về
chất lượng và phương pháp thử nghiệm cho thuốc viên nang Flunarizin với
chỉ tiêu định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
nhưng các điều kiện sắc ký chưa được chỉ rõ ràng dẫn đến sự lúng túng khi
tiến hành phân tích chất lượng mẫu thuốc (thiếu điều kiện về cột sử dụng
và tốc độ pha động) [14].
Trong tiêu chuẩn chất lượng của một chế phẩm thuốc chỉ tiêu định
tính và định lượng là những chỉ tiêu chất lượng quan trọng, luôn được quan
tâm xây dựng đảm bảo tính hiện đại, tiên tiến phù hợp đáp ứng yêu cầu của
sự phát triển khoa học công nghệ ngày nay.
Hiện nay kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao đã trở thành một trong
những kỹ thuật phổ biến, xuất phát từ những ưu việt của nó như: có độ
nhạy cao, đặc hiệu với từng hoạt chất, khoảng tuyến tính rộng, độ đúng
cao, độ lặp lại tốt đáp ứng yêu cầu của một kỹ thuật phân tích hiện đại.
Phương pháp đã được các phòng kiểm tra chất lượng của các công ty sản
xuất dược phẩm, các phòng thí nghiệm của Trung tâm kiểm nghiệm triển
khai, áp dụng để kiểm tra chất lượng nguyên liệu, thành phẩm sản xuất
thuốc và coi đây là phương pháp quy chiếu.
Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu phân tích hoạt chất Flunarizin trong thuốc viên nang
bằng phương pháp HPLC” với mục tiêu:
1. Xây dựng và hoàn chỉnh phương pháp định tính, định lượng hoạt
chất cho thuốc viên nang Flunarizin và nghiên cứu thẩm định phương pháp
bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng kiểm tra một số chế phẩm
thuốc viên nang Flunarizin 5,0 mg sản xuất tại Việt Nam, đánh giá so sánh

kết quả với phương pháp đã đăng ký trong bản TCCS.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về tiêu chuẩn kỹ thuật của thuốc.
Thuốc là một loại hàng hóa đặc biệt có ảnh hưởng rất lớn đến sức
khỏe thậm chí là tính mạng của người sử dụng, chính vì vậy việc đảm bảo
chất lượng thuốc luôn được quan tâm từ khâu sản xuất, kiểm tra chất lượng,
phân phối lưu thông, tồn trữ, sử dụng nhằm đảm bảo hiệu lực điều trị và an
toàn cho người sử dụng.
Khái niệm chất lượng thuốc được hiểu theo hai nghĩa:
- Theo nghĩa hẹp: chất lượng thuốc là sự phù hợp các chỉ tiêu chất
lượng với tiêu chuẩn kỹ thuật đã đăng ký và công bố.
- Theo nghĩa rộng: ngoài sự phù hợp trên còn phải đảm bảo hiệu lực,
hiệu quả công tác điều trị và tính an toàn cho người sử dụng [10].
Theo luật chất lượng hàng hóa sản phẩm có hai loại tiêu chuẩn:
+ Thứ nhất: tiêu chuẩn cơ sở do nhà sản xuất đăng ký và công bố đây
là bản cam kết các chỉ tiêu chất lượng sản phẩm của nhà sản xuất đối với
các cơ quan quản lý và kiểm tra chất lượng thuốc.
+ Thứ hai: quy chuẩn kỹ thuật do nhà nước ban hành và bắt buộc áp
dụng đối với các sản phẩm hàng hóa cùng loại muốn lưu hành trên lãnh thổ
của quốc gia (Việt Nam). Đây là các chỉ tiêu, tiêu chuẩn liên quan đến
quyền lợi của người tiêu dùng, đến độ an toàn của người sử dụng, tất cả các
mặt hàng cùng loại của nước ngoài muốn được lưu hành trên thị trường,
lãnh thổ Việt Nam phải đáp ứng mức tiêu chuẩn này.
Đối với các thuốc lưu hành trên thị trường Việt Nam hiện nay có hai
cấp tiêu chuẩn kỹ thuật:
+ Tiêu chuẩn cơ sở: của nhà sản xuất xây dựng, đăng ký và công bố

áp dụng cho chế phẩm thuốc của chính nhà sản xuất đó, đơn vị có thẩm
quyền phê duyệt
+ Tiêu chuẩn DĐVN là tiêu chuẩn cấp nhà nước về thuốc khuyến
khích các cơ sở sản xuất thuốc trong nước áp dụng các tiêu chuẩn kỹ thuật
3


của chuyên luận thuốc đã được ban hành trong DĐVN, khi các cơ sở sản
xuất xây dựng tiêu chuẩn cơ sở thì mức tiêu chuẩn không được thấp hơn
mức tiêu chuẩn đã quy định trong DĐVN. Đối với các thuốc nước ngoài
khi đăng ký nhập khẩu vào Việt Nam thì tiêu chuẩn kỹ thuật của sản phẩm
không được thấp hơn so mức tiêu chuẩn DĐVN nếu đã có chuyên luận của
chế phẩm đó.
Ngày nay cùng với sự hội nhập toàn cầu, Việt Nam tham gia WTO;
AFTA... các loại hàng hóa trong đó có thuốc chữa bệnh ngày càng phong
phú về chủng loại, dạng bào chế đã góp một phần quan trọng trong công
tác chăm sóc, bảo vệ sức khỏe nhân dân, song nếu hàng rào kỹ thuật của
chúng ta không tốt các sản phẩm thuốc nước ngoài có tiêu chuẩn chất
lượng không phù hợp dễ dàng tràn vào Việt Nam, bán với giá rẻ, các doanh
nghiệp sản xuất trong nước không đủ sức cạnh tranh ngay tại thị trường nội
địa, và người chịu thiệt thòi nhất là người bệnh, người tiêu dùng. Chính vì
vậy công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng phải luôn được quan
tâm đúng mức.
Trong những năm gần đây hàng loạt các văn bản pháp quy về dược
được ban hành trong đó quan trọng các văn bản sau: Luật Dược; Thông tư
09/2010/TT-BYT về quản lý chất lượng thuốc; thông tư 04/2010/TT-BYT
hướng dẫn lấy mẫu thuốc để kiểm tra chất lượng, thông tư 44/2014/TTBYT về đăng ký thuốc đã hoàn thiện dần hành lang pháp lý cho công tác
kiểm tra giám sát chất lượng thuốc dùng cho người.
1.2 Tổng quan về Flunarizin.
1.2.1 Cấu trúc phân tử, tính chất lý hóa.

- Công thức phân tử: C26H26F2N2 . 2 HCl (Khối lượng phân tử: 477,42)
- Công thức cấu tạo:

4


F

N

H
N

F

H

-

-

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Flunarizin
Tên khoa học: 1 [bis (4-flurophenyl)methyl)-4-[(2E)-3-phenylprop-2en-1-yl] piperazine
Dạng thường dùng: Flunarizin dihydroclorid.
Khả năng hòa tan: Flunarizin ít tan trong methanol và ethanol; rất ít tan
trong nước; thực tế không tan trong benzen; tan tốt hơn trong các dung
dịch acid.
Nhiệt độ nóng chảy: Flunarizin HCl có nhiệt độ nóng chảy là 204 2100C [14].
Flunarizin hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS. Cực đại hấp thụ tại
bước sóng 226 nm và 253 nm, có hai cực tiểu ở 221 nm và 234 nm

[14].

1.2.2.Tính chất dược động học, tác dụng dược lý
Dược động học
- Hấp thu: Flunarizin hấp thu tốt quan đường uống, đạt nồng độ đỉnh
trong vòng 2-4 giờ, và đạt trạng thái hằng định ở tuần thứ 5-6.
- Phân bố: phân bố nhanh chóng và rộng rãi đến các mô, gắn kết với
protein 90%.
- Chuyển hóa: Flunarizin bị chuyển hóa hoàn toàn qua gan
- Thải trừ: thuốc và các chất chuyển hóa được bài tiết ra phân qua đường
mật. Thời gian thải trừ hoàn toàn khoảng 18 ngày [5].

5


Tác dụng dược lý
- Flunarizin là thuốc có tác dụng ngăn chặn sự quá tải Calci tế bào,
bằng cách giảm Calci tràn vào tế bào một cách quá mức qua màng tế bào.
Thuốc không có tác dụng trên co bóp cơ tim và dẫn truyền co bóp cơ tim
[5].
Chỉ định
- Dự phòng đau nửa đầu dạng cổ điển (có triệu chứng báo trước) hoặc
đau nửa đầu dạng thông thường (không có triệu chứng báo trước).
- Điều trị chứng chóng mặt tiền đình do rối loạn chức năng hệ thống
tiền đình.
- Điều trị các triệu chứng do thiểu năng tuần hoàn não và suy giảm
oxy tế bào não bao gồm: chóng mặt, nhức đầu nguyên nhân mạch máu, rối
loạn kích thích, mất trí nhớ, kém tập trung và rối loạn giấc ngủ [5].
1.2.3 Tổng quan về các tiêu chuẩn kỹ thuật thuốc viên nang Flunarizin
DĐVN IV ban hành từ năm 2009 chưa có chuyên luận thuốc viên

nang Flunarizin [10].
Dược điển của các nước tiên tiến phiên bản mới nhất như: BP 2015;
USP38; EP 2010 cũng chưa ban hành chuyên luận thuốc viên nang
Flunarizin [13] ; [18].
Dược điển Trung Quốc CP 2010 đã ban hành chuyên luận thuốc viên
nang Flunarizin, và chuyên luận nguyên liệu Flunarizin dạng muối HCl
trong đó phương pháp định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhưng các điều kiện sắc ký không được quy
định cụ thể gây khó khăn cho người phân tích [14].
Các cơ sở sản xuất thuốc viên nang Flunarizin xây dựng và công bố
tiêu chuẩn cơ sở của mình, trong TCCS quy định phương pháp định tính
bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), dựa vào phổ hấp thụ UV-VIS
so sánh với phổ của dung dịch chuẩn, làm song song chỉ tiêu định lượng
bằng phương quang phổ tử ngoại UV-VIS và so sánh với dung dịch chuẩn
hoặc tính toán kết quả theo giá trị E (1% ; 1cm) [ 6], [7], [8].

6


Một số kỹ thuật đã được áp dụng để phân tích định lượng hoạt chất
Flunarizin hiện nay:
Bảng 1.1: Một số điều kiện định lượng hoạt chất Flunarizin
Kỹ
thuật
phân
tích

Mẫu phân
tích

Chuẩn
Nguyên
độ môi liệu
trường
Flunarizin
khan

UV-VIS

UV-VIS

UV-VIS

Các điều kiện phân tích

Nồng độ
mẫu phân
tích

Cân chính xác 0,2g chế
phẩm, hòa tan trong 15 ml
anhydric acetic, 10 ml acid
acetic băng, thêm 5 ml dung
dịch thủy ngân acetat (tt),
thêm 1 giọt tím tinh thể.
Chuẩn độ bằng Acid
percloric 0,1N đến khi xuất
hiện màu xanh.
Song song làm mẫu trắng.
1 ml acid percloric 0,1N

tương đương với 23,87 mg
Flunarizin.
2HCl
C26H26F2N2. 2HCl.

Viên nang Bước sóng λ=253 nm;
cứng
Mẫu trắng: HCl 0,05N;
Siberizin
E(1% ;1cm)=439

Tài
liệu
tham
khảo

[14]

0,01 mg/ml
[8]

Viên nang Bước sóng λ=254 nm;
0,01 mg/ml
cứng
Mẫu trắng: HCl 0,05N;
Sibelium
So sánh song song với mẫu
chuẩn.

[15]

Viên nang Bước sóng λ=254 nm;
0,01 mg/ml
cứng
Mẫu trắng: HCl 0,1N:

[6]

7


Kỹ
thuật
phân
tích

Nồng độ
mẫu phân
tích

Tài
liệu
tham
khảo

Viên nang Bước sóng λ=252 nm;
0,01 mg/ml
cứng
Mẫu trắng: HCl 0,1N trong
Serapid

Isopropanol.
So sánh song song với mẫu
chuẩn.

[16]

Mẫu phân
tích

Các điều kiện phân tích

Sibethephar Isopropanol (11 :89)
m
So sánh song song với mẫu
chuẩn.
UV-VIS

HPLC

HPLC

HPLC

Thuốc viên
nang
Flunarizin
5,0 mg

Cột : C18
0,01 mg/ml

Pha động: MeOH : dung
dịch Đệm phosphat pH =
3,5 (75:25)
Detector: UV 253 nm
Thể tích tiêm mẫu 20 µl.

[14]

Thuốc viên
nén
hỗn
hợp
Flunarizin
và
propranolol

+ Cột: C8
+ Pha động: MeOH : dung
dịch đệm phosphat 10 mM
pH=3,8 (70 : 30);
+ Detector : 242 nm;
Nhệt độ cột 400C;
+ Thể tích tiêm mẫu : 20 µl;
+ Tốc độ dòng 0,8 ml/phút.

[19]

Thuốc viên
nang
Hagizine

5,0 mg

+ Cột: Rp 18
+ Pha động: AcCN :
MeOH : Dung dịch A gồm:
(5,9 g Tetrabutylamonium
hydrogensulfat + 1,8 g

[9]

8


Kỹ
thuật
phân
tích

Mẫu phân
tích

Các điều kiện phân tích

Nồng độ
mẫu phân
tích

Tài
liệu
tham

khảo

amoni acetat + 1000ml
nước) : (30:30:40);
+ Detector : 253 nm;
Nhệt độ cột 400C;
+ Thể tích tiêm mẫu = 20
µl;
+ Tốc độ dòng 1,2 ml/phút.
1.3.Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.1. Khái niệm chung
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid
Chromatography – HPLC) là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích hòa
tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh.
Tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các
chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. Lựa
chọn thành phần pha động để chất phân tích ra khỏi cột được rửa giải với
thời gian hợp lý [10], [13], [18].
1.3.2. Một số thông số đặc trưng của sắc ký
Thời gian lưu: Khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào hệ thống sắc ký đến
khi chất phân tích được phát hiện tại detector.
Thời gian chết: thời gian tM của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của
nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động).
Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR - tM
Hệ số phân bố K:

K=

CS
CM

CS, CM: nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động.

9


K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Các chất
trong hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng
dễ dàng hơn.
Hệ số dung lượng k’: k’ =

C S .VS
V
t t
 K. S = R M
C M .VM
VM
tM

VS, VM tương ứng là thể tích của pha tĩnh, pha động.
k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha và hệ số VS/VM
Thông thường chọn k’ = 1-5.
Hệ số chọn lọc α:
Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B:
α=

K B k ' B t R B  t M


K A k ' A t R  A  t M

KB, KA lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước).
k’A, k’B tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B.
(tR)A, (tR)B tương ứng là thời gian lưu của chất A, B.
Hai chất A và B chỉ có thể tách được khỏi nhau nếu  > 1. Trong phân tích
sắc ký, thường lựa chọn điều kiện phân tích để có được α = 1,05 - 2. Nếu α
quá lớn, thời gian phân tích kéo dài.
Số đĩa lý thuyết: Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột
sắc ký
2

 t 
L
t 
N   16 R   5,54 R 
H
W 
 W1 / 2 

2

L: chiều dài của cột (đơn vị độ dài);
H: chiều cao của đĩa lý thuyết (đơn vị độ dài);
W: chiều rộng của pic sắc ký (phút);
W1/2: chiều rộng pic ứng với một nửa chiều cao của pic.
10


Độ phân giải của cột
Độ phân giải (RS) đánh giá khả năng tách hai pic liền kề trong sắc ký đồ:

t R B  t R A 1,18.t R B  t R A 

W1 / 2 , A  W1 / 2 , B
.W A  WB 

RS = 1

2

Ở đây: WA, WB tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B;
W1/2,A, W1/2,B tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B ứng
với một nửa chiều cao của pic.
Cột sắc ký và pha tĩnh
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không
gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10
mm. Cột thường nhồi hạt cỡ 5-10 µm. Ưu điểm của cột nhồi hạt cỡ nhỏ là
chạy tốn ít dung môi, thời gian ngắn và số đĩa lý thuyết lớn.
Để bảo vệ cột sắc ký, người ta sử dụng cột bảo vệ được lắp trước cột
sắc ký để loại các tạp chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích
làm giảm tuổi thọ cột. Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng
loại.
Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxid (silica).
Nhóm OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn
chất siloxan.

Bề mặt silica

Dẫn chất clorosilan

Dẫn chất siloxan

Dựa vào gốc R’ của dẫn chất siloxan, người ta chia ra 2 nhóm:
- Pha tĩnh không phân cực có R’ là:
11


 Gốc octadecyl (C18)
 Gốc octyl (C8)
 Gốc phenyl
- Pha tĩnh phân cực có R’ là:
 Cyano
 Amino
 Diol
Dựa vào độ phân cực tương đối của pha tĩnh và pha động đã hình thành hai
loại sắc ký phân bố là sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo:
Sắc ký phân bố pha thuận: thường dùng pha tĩnh lỏng phân cực như
triethylen glycol, nước. Còn pha động là dung môi ít phân cực hơn như
hexan.
Sắc ký phân bố pha đảo: pha tĩnh không phân cực như hydrocacbon
(C18 hoặc C8) còn pha động phân cực hơn pha tĩnh như nước, acetonitril.
Detector
Có nhiều detector được sử dụng trong HPLC và thường sử dụng 6 loại
sau:
- Detector hấp thụ UV-VIS
- Detector huỳnh quang
- Detector chỉ số khúc xạ
- Detector tán xạ ánh sáng bay hơi
- Detector đo dòng
- Detector đo độ dẫn

Trong nghiên cứu này, để quy trình xây dựng được có khả năng ứng
dụng rộng, chúng tôi lựa chọn detector PDA, loại detector phổ biến trong
cấu hình tiêu chuẩn của thiết bị HPLC hiện tại. Về bản chất, đây là một

12


detector UV-Vis cho phép đồng thời ghi nhận tín hiệu hấp thụ đồng thời
trên toàn dải phổ UV gần và VIS. Dải bức xạ UV-VIS (thường các detector
PDA có dải bước sóng trong khoảng 190 – 800 nm) sau khi đi qua tế bào
đo được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một
mảng diod quang. Mỗi diod quang đón nhận một phần dải bức xạ tương
ứng với một khoảng bước sóng hẹp. Như vậy, mỗi một diod có thể phát
hiện một sự hấp thụ ở một bước sóng nhất định. Toàn bộ dãy diod được
quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ phận vi xử lý. Kết quả phổ có thể hiện
trên màn hình máy tính hoặc được lưu trữ để in ra dưới dạng bản phổ bằng
máy in.
Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tích
trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và
định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc
ký với phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết
trước.
1.3.4.Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao trong kiểm nghiệm thuốc
Trước tình hình thuốc đa thành phần và các thuốc phức tạp được sản
xuất ngày càng nhiều thì việc ứng dụng kỹ thuật HPLC trong công tác kiểm
tra giám sát chất lượng thuốc ngày càng chiếm ưu thế.
Dược điển Việt Nam IV (2009), có 168 chuyên luận sử dụng kỹ
thuật sắc ký lỏng (HPLC) để kiểm tra các chỉ tiêu định tính, định lượng, và
xác định tạp chất liên quan.
Trong khi đó Dược điển Việt Nam III có 27 chuyên luận sử dụng các

kỹ thuật: quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS; sắc ký bản mỏng (TLC);
phương pháp chuẩn độ hóa học để thực hiện các chỉ tiêu định tính, định
lượng, xác định tạp chất đến Dược điển Việt Nam IV đã chuyển sang kỹ
thuật HPLC. Điều này cho thấy rõ xu hướng phát triển và yêu cầu nâng cấp
tiêu chuẩn và khả năng ứng dụng của phương pháp HPLC.
HPLC giúp ta thực hiện phép thử định tính, định lượng và tạp chất
nhiều khi không cần xử lý.
13


Định tính Sự giống nhau về thời gian lưu của chất phân tích trên sắc
ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử là cơ sở của phép thử định tính. Trên máy
HPLC hiện đại với Detector Diod array có thể quét phổ UV-VIS của pic
ứng với chuẩn và pic thử rồi chồng hai phổ với nhau để thấy sự giống nhau
về hình dạng phổ thông qua hệ số match.
+ Hệ số match xấp xỉ 1,000 thì hai phổ định tính giống nhau hoàn
toàn.
+ Hệ số match > 0,900 thì hai phổ định tính tương tự nhau.
+ Hệ số match < 0,900 thì hai phổ định tính khác nhau.
Ngoài ra đối với Detector Photo Diod Array cò có thể kiểm tra được
mức độ tinh khiết của pic thông qua hệ số angel purity; threshold purity.
Định lượng Việc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ pic chuẩn và
pic thử (phương pháp chuẩn ngoại) hoặc tỷ lệ đáp ứng của pic chuẩn và pic
thử so với đáp ứng chuẩn nội (phương pháp chuẩn nội) trong cùng một điều
kiện sắc ký xác định là cơ sở của phép thử định lượng. Khi mẫu thử là một
thuốc đa thành phần thì ta có thể định lượng đồng thời các thành phần hoạt
chất được tách ra đạt yêu cầu theo quy định.
Thử tạp chất Về cơ sở giống với phép thử định lượng. Ngoài ra đối
với phép thử tạp chất liên quan, khi không biết tên tạp chất hoặc không có
tạp chuẩn ta có thể tính tỷ lệ tạp chất dựa vào % diện tích pic tạp so với

diện tích pic hoạt chất.
1.4. Nội dung thẩm định phương pháp bằng HPLC
1.4.1 Tính phù hợp của hệ thống sắc ký
Tính phù hợp của hệ thống khẳng định các thông số kỹ thuật, các
điều kiện sắc ký đã chọn ổn định trong điều kiện phân tích.
1.4.2. Độ đặc hiệu/chọn lọc
Độ đặc hiệu là khả năng phân biệt rõ chất cần phân tích khi có mặt
các thành phần khác có thể có trong mẫu thử. Thông thường gồm các tạp
chất, sản phẩm phân hủy, chất nền.
14


Trong HPLC, tính chọn lọc/đặc hiệu được thể hiện khi kết quả thu
được trên sắc ký đồ (mẫu trắng, mẫu placebo thêm chuẩn, mẫu thử, mẫu
chuẩn) cho thấy pic của chất cần phân tích được phân tách hoàn toàn với
các pic tạp.
1.4.3. Độ tuyến tính
Độ tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng của quy trình
(trong khoảng xác định) để thu được các kết quả tỉ lệ trực tiếp đến nồng độ
của chất phân tích trong mẫu thử.
Độ tuyến tính được xác định bằng cách quan sát đồ thị đáp ứng giữa
nồng độ hoặc hàm lượng của chất phân tích với giá trị đo được.
Như vậy khoảng tuyến tính phải phủ toàn bộ khoảng xác định.
Đường chuẩn phải có dạng đồ thị: Y = ax + b
Yêu cầu:
- Số điểm đường chuẩn n ≥ 5
- Hệ số tương quan r ≥ 0,998
- % Hệ số chắn b < 2% - 5%
1.4.4. Độ đúng
Độ đúng của một quy trình phân tích biểu diễn mức độ gần nhau

giữa giá trị trung bình của dãy kết quả thực nghiệm với giá trị thực của chất
phân tích có trong mẫu thử hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận.
Thường tiến hành ≥ 3 mức nồng độ nằm trong khoảng xác định của
phương pháp. Mỗi mức nồng độ tối thiểu 3 mẫu.

Yêu cầu:
- Định lượng: Thu hồi 98,0 – 102,0 %; RSD ≤ 2,0%
- Độ hòa tan: Thu hồi 97,0 – 103,0 %; RSD ≤ 3,0%
- Tạp chất: phụ thuộc vào mức giới hạn.
15


Thu hồi 95,0 – 105,0 % hoặc 90,0 – 110,0% ; RSD ≤ 10 -15%(20%)
( Tỉ lệ thu hồi: lượng tìm thấy/ lượng lí thuyết)
1.4.5. Độ chính xác
Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả mức độ gần nhau
(mức độ phân tán) giữa một dãy kết quả thu được của các mẫu thử được
chuẩn bị từ một mẫu đồng nhất trong điều kiện đã đề ra.
Độ chính xác chia làm 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian và
độ tái lặp.
Độ lặp lại
Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của quy trình phân tích tiến hành
trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại
biểu thị độ chính xác trong định lượng.
Thường được tiến hành trên 3 mức nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ
3 lần (suy ra từ độ đúng). Cũng có thể 6 lần ở nồng độ 100%
Yêu cầu:
- Định lượng: RSD ≤ 2,0%
- Độ hòa tan: RSD ≤ 3,0%
- Tạp chất: RSD ≤ 10 -15%

Độ chính xác trung gian
Độ chính xác trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trong
cùng một phòng thí nghiệm, nhưng được thực hiện: Các ngày khác nhau,
kiểm nghiệm viên khác nhau, điều kiện phân tích khác nhau.

Yêu cầu:
- Định lượng: RSD ≤ 3,0%
- Độ hòa tan: RSD ≤ 4,0%
- Tạp chất: RSD ≤ 10 -15%
16