Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.16 MB, 60 trang )
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
Cộng hoà xã hội chủ nghĩa Việt Nam
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
Khoa Hóa
Bộ môn Công nghệ thực phẩm
NHIỆM VỤ
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên
: NGUYỄN THỊ THANH TÂM
Lớp
: 09H2A
Khóa
: 2009 - 2014
Ngành
: Công nghệ thực phẩm
1. Tên đề tài
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế phẩm enzyme protease kĩ thuật
từ mầm giá đỗ.
2. Nội dung các phần của đề tài
- MỞ ĐẦU
- Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
- Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
- TÀI LIỆU THAM KHẢO
- PHỤ LỤC
4. Cán bộ hướng dẫn
Họ và tên cán bộ :KS. BÙI VIẾT CƯỜNG
Phần
: Toàn bộ
5. Ngày giao nhiệm vụ
: 16 – 02 – 2014
6. Ngày hoàn thành nhiệm vụ
: 30 – 05 – 2014
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
Thông qua bộ môn
Đà Nẵng, ngày........tháng........năm 2014
TỔ TRƯỞNG BỘ MÔN
Đà Nẵng, ngày........tháng........năm 2014
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Ký,
ghi
rõ
họ
tên)
(Ký, ghi rõ họ tên)
PGS.TS. Đặng Minh Nhật
KS. Bùi Viết Cường
Kết quả điểm đánh giá:........
Sinh viên đã hoàn thành và nộp
toàn bộ bản báo cáo cho bộ môn
Đà Nẵng, ngày........tháng........năm 2014
Đà Nẵng, ngày........tháng........năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Sinh viên thực hiện
(Ký, ghi rõ họ tên)
(Ký, ghi rõ họ tên)
Nguyễn Thị Thanh Tâm
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
LỜI CẢM ƠN
Sau hơn 3 tháng nghiên cứu, được sự hướng dẫn tận tình của Thầy Bùi Viết
Cường, cùng với sự giúp đỡ của các thầy cô và các bạn sinh viên trong phòng thí
nghiệm, em đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình.
Trước hết cho phép em bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc nhất đến Thầy
Bùi Viết Cường đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em từ việc chọn đề tài cho đến khi
hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình. Trong suốt thời gian em thực hiện đồ án,
mặc dù rất bận rộn trong công việc nhưng Thầy vẫn dành nhiều thời gian và tâm
huyết trong việc hướng dẫn em. Thầy đã cung cấp cho em rất nhiều kiến thức bổ
ích, luôn định hướng, góp ý và sửa chữa những chỗ sai, để từ đó giúp em nắm bắt kĩ
lưỡng, chi tiết hơn về nội dung, cũng như các vấn đề liên quan đến đồ án, và hoàn
thành đồ án một cách tốt nhất.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực
phẩm – Sinh học – Hóa dầu, các thầy cô ở phòng thí nghiệm và tất cả bạn bè đã
giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi, khích lệ và động viên em trong suốt thời gian
thực hiện đề tài tốt nghiệp của mình.
Cuối cùng cho em được cảm ơn các thầy cô trong hội đồng bảo vệ tốt nghiệp
đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và nhận xét cho đồ án của em.
Đà Nẵng, ngày 30 tháng 05 năm 2014
Sinh viên thực hiện
NGUYỄN THỊ THANH TÂM
MỤC LỤC
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-5-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học, hơn 1000 hệ enzyme đã được
tìm thấy và thu hồi từ những cơ thể sinh vật để phục vụ cho các lĩnh vực công
nghiệp, nghiên cứu khoa học, y học, thực phẩm… trong đó enzyme protease đã
được chú trọng và phát triển từ rất sớm nhờ những ứng dụng quan trọng và phổ biến
của nó trong đời sống. Protease được sử dụng để làm mềm thịt, làm trong nước quả,
chống lại hiện tượng kết tủa của bia khi làm lạnh, điều chế dược phẩm giúp tiêu hóa
tốt hơn... trong đó hơn 70% lượng enzyme protease được sử dụng trong chất tẩy rửa
công nghiệp.
Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme protease là động vật, thực vật và vi
sinh vật. Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu chính để thu nhận một lượng lớn chế
phẩm enzyme protease phục vụ cho mục đích công nghiệp và thương mại. Tuy
nhiên, so với các protease có nguồn gốc vi sinh vật thì protease thực vật có nhiều ưu
điểm như không hoặc ít chứa độc tố, khả năng chịu nhiệt của enzyme protease từ
thực vật kém hơn và có thể dễ dàng loại bỏ chúng khi cần thiết. Vì thế, những năm
gần đây việc nghiên cứu các loại protease từ thực vật đang được quan tâm và chiếm
một tỷ lệ đáng kể trong công nghiệp sản xuất enzyme. Một số enzyme thực vật như
bromelain, papain, ficin, urease đã được tinh chế và sử dụng nhiều.
Mầm giá đỗ được xem là loại thực phẩm “thế hệ mới”, ngoài giá trị dinh
dưỡng cao như chứa nhiều vitamin, khoáng chất, trong giá đỗ còn chứa một lượng
lớn các enzyme như α-amylase, invertase. Đặc biệt là hệ enzyme cysteine protease
có tác dụng thủy phân protein dự trữ có trong hạt giúp cho quá trình nảy mầm, sinh
trưởng và phát triển của hạt. Việc nghiên cứu enzyme protease làm tăng giá trị kinh
tế của đậu xanh và góp phần giải quyết nhu cầu enzyme của Việt Nam. Vì vậy, tôi
đã chọn đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế phẩm enzyme
protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ” là đề tài tốt nghiệp.
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-6-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
Đề tài nghiên cứu của tôi được tiến hành theo hướng sau:
1. Xác định số lần lạnh đông, tan giá tối ưu để thu được enzyme protease có hoạt lực
cao nhất.
2. Xác định được lượng SiO2 cần thiết sử dụng trong quá trình phá vỡ tế bào mầm giá
đỗ để thu được enzyme proteaze có hoạt lực cao nhất.
3. Tối ưu hóa quá trình phá vỡ tế bào mầm giá đỗ với 2 biến: lạnh đông, tan giá và
lượng bột SiO2 để thu được enzyme protease có hoạt lực cao nhất.
4. Xác định nhiệt độ tối ưu trồng giá đỗ để thu được enzyme protease có hoạt lực cao
nhất.
5. Xác định thời gian trồng giá đỗ để thu được enzyme protease có hoạt lực cao nhất.
6. Tối ưu hóa điều kiện trồng giá đỗ (nhiệt độ, thời gian) để đạt hiệu suất thu hồi
enzyme protease có hoạt lực cao nhất.
Do thời gian làm đề tài có hạn, những hiểu biết về enzyme nói chung và
proteaza nói riêng còn hạn chế cho nên đồ án không thể tránh khỏi những sai sót.
Tôi rất mong được sự góp ý nhiệt tình của các thầy cô và các bạn để đề tài được
hoàn chỉnh hơn.
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-7-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1
Enzyme
1.1.1. Định nghĩa enzyme
Enzyme là những chất xúc tác sinh học được hình thành trong tế bào và có
bản chất là protein. Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường mạnh hơn nhiều so
với các chất xúc tác tổng hợp. Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa
học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong
cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng có trật tự theo những chiều hướng xác
định với tốc độ cực nhanh.
Bản chất của enzyme là những chất hữu cơ có phân tử lượng lớn hơn 20.000
đến 1.000.000 dalton. Enzyme hòa tan được trong nước hoặc trong dung dịch muối
loãng, do kích thước phân tử lớn nên chúng không qua được màng bán thấm.
Enzyme cũng bị biến tính và mất tác dụng xúc tác bởi các tác nhân hóa lý như axit,
kiềm đặc, muối kim loại nặng, trong các dung môi hữu cơ như rượu, aceton, các
chất gây kết tủa thuận nghịch đối với các chế phẩm enzyme như muối ammonium
sulfat, natri clorua và các dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp. Ở nhiệt độ cao enzyme
bị biến tính và mất khả năng xúc tác.
Enzyme cũng có tính lưỡng tính, nghĩa là trong điều kiện pH của môi trường
nó có thể tồn tại ở dạng anion, cation hoặc dạng trung hòa điện. Vì vậy có thể dùng
kỹ thuật điện di để phân tích các loại enzyme và dạng phân tử của enzyme.
Enzyme có nhiều tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học như:
enzyme có cường lực xúc tác rất lớn, có tính đặc hiệu cao. Mỗi enzyme chỉ xúc tác
làm chuyển hóa được một hoặc một số cơ chất nhất định theo một kiểu phản ứng
nhất định. Enzyme tác dụng trong điều kiện êm dịu, thường tác dụng thích hợp ở áp
suất thường, nhiệt độ 30÷50oC, pH trung tính, không cần nồng độ axit hay nồng độ
kiềm mạnh, áp suất cao, do đó không đòi hỏi các thiết bị chịu axit, kiềm và chịu áp
suất cao đắt tiền.
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-8-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
Enzyme có thể được phân tách từ nhiều nguồn như động vật, thực vật và vi
sinh vật. Mỗi nguồn enzyme có một số tính chất đặc trưng, cung cấp những enzyme
đặc hiệu cho quá trình chế biến. Do đó mặc dù vi sinh vật đóng vai trò là nguồn
cung cấp enzyme chính cho thị trường enzyme, bởi giá thành rẻ và đa dạng về
chủng loại enzyme nhưng các enzyme động vật và thực vật cũng góp phần làm cho
nguồn enzyme trở nên đa dạng. Khi sử dụng enzyme có nguồn gốc vi sinh vật cho
ngành y dược và thực phẩm phải đảm bảo trong chế phẩm không có độc tố, không
gây bệnh.
Hiện nay nhiều nghiên cứu đã thu nhận được nhiều loại enzyme từ thực vật
như bromelain, papain và ficin. Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ
(carica papaya) còn bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (pineapple plant), ficin
thu được từ nhựa cây cọ (ficus carica), enzyme protease còn được tìm thấy trong
các hạt thóc, hạt đỗ khô, hạt đỗ nảy mầm, khoai tây... tuy enzyme trong thực vật
chiếm một phần nhỏ trong nền công nghiệp sản xuất enzyme, nhưng với những đặc
tính ưu việt của chúng như không hoặc chứa ít độc tố, nguồn nguyên liệu tự
nhiên… đây sẽ là nguồn cung cấp enzyme lớn và hiệu quả, tạo ra những nguồn
enzyme tinh khiết ứng dụng cao cho khoa học.
1.1.2. Các đơn vị hoạt độ của enzyme
Đơn vị hoạt độ của một enzyme được coi là lượng enzyme có khả năng xúc
tác làm chuyển hóa được một lượng cơ chất nhất định trong một đơn vị thời gian
nhất định ở điều kiện tiêu chuẩn.
+ Đơn vị UI (đơn vị quốc tế)
Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được một micromole cơ
chất sau thời gian một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 UI = 1 µM cơ chất (10-6 M/phút)
+ Đơn vị katal (kat)
Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa một mol cơ chất sau thời gian
một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 kat =1 Mol cơ chất /giây
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-9-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
1 UI = 1/60 x 10-6 kat = 16,67 nkat
Hoạt lực enzyme hoặc hoạt lực xúc tác được biểu diễn bằng một số đơn vị
hoạt độ enzyme.
+ Hoạt độ riêng
Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt
độ enzyme trên đơn vị khối lượng protein.
UI hoặc Kat /1 mg (ml) protein
+ Hoạt độ phân tử (hoặc hoạt độ riêng phân tử)
Được biểu diễn bằng số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử
enzyme sau một đơn vị thời gian (thường là phút).
+ Hoạt độ tâm xúc tác
Là số phân tử cơ chất bị chuyển hóa bởi một trung tâm hoạt động sau một
phút.
1.1.3. Cơ chế tác dụng và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme
1.1.3.1. Cơ chế tác dụng
Theo Michaleis –Menten muốn cho phản ứng enzyme xảy ra thì cơ chất phải
được gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme tạo thành phức hợp enzyme cơ chất
(ES). Quá trình tạo thành phức enzyme - cơ chất (ES) và sự biến đổi cơ chất thành
sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua 3 giai đoạn:
E+S
ES
P+E
Giai đoạn thứ nhất enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành
phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi
hỏi năng lượng hoạt hóa thấp.
Giai đoạn thứ hai xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ
các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.
Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới
dạng tự do [4 tr 23].
1.1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme
a. Nồng độ enzyme
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-10-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào
nồng độ enzyme.
v = k [E]
v: vận tốc phản ứng
[E]: Nồng độ enzyme
Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme tăng vận
tốc không thay đổi.
b. Nồng độ cơ chất
Trong tất cả các phản ứng enzyme, khi các điều kiện khác được giữ cố định,
thì vận tốc phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất.
Theo Michaelis - Menten khi nồng độ cơ chất thấp vận tốc phản ứng phụ
thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Ở những nồng độ cơ chất cao thì vận tốc
phản ứng tiến gần đến vận tốc cực đại. Nhưng nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì
vận tốc phản ứng không thể tăng được nữa.
c. Chất kiềm hãm
Các chất kiềm hãm hoặc chất ức chế có thể làm giảm hoạt độ của enzyme.
Các chất ức chế tham gia trong điều hòa, kiểm tra các quá trình trao đổi chất trong
hệ thống sống. Các chất này có thể là những ion, các phần tử vô cơ, hữu cơ kể cả
các protein, cho phản ứng kiềm hãm thuận nghịch và không thuận nghịch. Các chất
gây biến tính protein là những chất kìm hãm không đặc hiệu của enzyme. Nhiều
chất khác không làm biến tính protein enzyme nhưng vẫn làm giảm hoạt độ xúc tác
của nó theo cơ chất.
d. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa
Chất hoạt hóa như ion kim loại ( Mn 2+, Zn2+…) có tác dụng hoạt hóa đối với
enzyme. Tuy nhiên tác dụng hoạt hóa chỉ giới hạn ở những nồng độ xác định, vượt
qua giới hạn này có thể làm giảm hoạt tính của enzyme. Một số chất khác có thể tác
dụng theo cách gián tiếp như loại trừ các yếu tố kìm hãm khỏi môi trường phản
ứng.
e. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-11-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
Theo qui luật của các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứng
enzyme càng tăng khi tăng nhiệt độ, nhưng vì enzyme có bản chất là protein do đó
khi tăng nhiệt độ đến một giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ bị giảm
do sự biến tính của enzyme. Đại lượng đặc trưng cho ảnh hưởng nhiệt độ đến vận
tốc phản ứng hóa học cũng như phản ứng enzyme là hệ số nhiệt Q10.
Mỗi enzyme đều có một nhiệt độ thích hợp nhất cho sự hoạt động xúc tác gọi
là nhiệt độ tối thích. Nhiệt độ tối thích của một enzyme phụ thuộc vào cơ chất, pH
môi trường, thời gian tác dụng, tại nhiệt độ enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính gọi
là nhiệt độ tới hạn, tại đây enzyme ít có khả năng phục hồi lại hoạt độ.
f.
Ảnh hưởng của pH môi trường
pH môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme vì nó ảnh hưởng đến
mức độ ion hóa cơ chất và độ bền của enzyme. Đa số enzyme bền trong giới hạn pH
giữa 5 và 9, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có mặt của cơ chất, ion Ca 2+…,
pH tối thích có thể thay đổi tùy theo tính chất, nồng độ của cơ chất, nhiệt độ của
phản ứng và bản chất của loại dung dịch đệm.
Ngoài các yếu tố chính đã nêu trên, hoạt độ của enzyme còn phụ thuộc vào
yếu tố khác như: ánh sáng, sóng siêu âm, tia bức xạ… trong hệ thống sống, enzyme
còn phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng phát triển của nguồn sinh enzyme [9 tr 15].
1.2. Enzyme protease thực vật
Enzyme protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình
thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản
phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy
phân liên kết este và vận chuyển axit amin [5 tr 58].
So với các protease từ động vật thì các protease từ thực vật được phát hiện
muộn hơn. Các enzyme phân giải protein từ nguồn thực vật đã nhận được sự chú ý
đặc biệt vì những ưu điểm của chúng như có khoảng pH, nhiệt độ hoạt động rộng và
hoạt động tốt khi có mặt của các hợp chất hữu cơ, không hoặc có ít độc tố. Do đó,
việc tìm kiếm và tinh chế các protease từ thực vật với những đặc tính riêng biệt luôn
là một thách thức cho ngành nghiên cứu hiện nay.
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-12-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
Protease có nhiều trong hệ thực vật, các protease này liên quan đến việc điều
hòa hoạt động cấp tế bào ở tất cả các loài. Trong thực vật, các protease có vai trò
phân giải protein dự trữ trong suốt quá trình nảy mầm của hạt, tái tạo các protein
thực vật bị hư hỏng, điều chỉnh quá trình già hoá ở các loại thực vật, sửa đổi các
protein để thực hiện chức năng cụ thể ở các tế bào thực vật. Các protease ở thực vật
ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát triển và chống chịu sâu bệnh ở thực vật.
Vì thế, trong hệ thực vật chứa rất nhiều enzyme protease và hoạt tính của chúng
cũng rất mạnh.
Các loại protease chính ở thực vật bao gồm: serin, cystein, aspartic và các
metallaprotease. Trong đó serine và cysteine là các loại protease chiếm phần nhiều
nhất. Cystein có vai trò điều khiển quá trình nảy mầm của hạt và sự già hoá của tế
bào. Còn serine có vai trò điều chỉnh trong việc thu nhận protein [14 tr 97]. Theo
một số tài liệu, trong giá đỗ chứa rất nhiều enzyme protease thuộc họ cystein [14].
Cystein protease (EC.3.4.22) là nhóm protein có trọng lượng phân tử trong
khoảng 33÷39 kDa [14 tr 427], các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân
các loại liên kết: peptide, amide, ester thiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –
SH trong tâm hoạt động. Nhóm sulfuahydryl -SH trong phân tử của enzyme đóng
vài trò rất quan trọng trong các phản ứng của enzyme, là thành phần trực tiếp tham
gia các phản ứng xúc tác. Chúng có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức
chất enzyme-cơ chất. Khoảng pH hoạt động của enzyme cystein khá rộng (3,5÷8,0)
tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của enzyme trong
vùng pH từ 5,7÷7,0 và nhiệt độ thích hợp là 50÷57oC, điểm đẳng điện của enzyme
pI = 6,1.
Hiện nay đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều
enzyme trong số này (papain, bromelain, ficin) được ứng dụng rộng rãi trong công
nghiệp.
Việc sử dụng thực vật làm nguồn nguyên liệu cho protease còn nhiều hạn
chế, do chịu sự tác động của nhiều nhân tố như đất đai, điều kiện khí hậu phù hợp
cho sự tăng trưởng. Tuy việc sản xuất protease từ nguồn thực vật là quá trình mất
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-13-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
nhiều thời gian nhưng so với các protease có nguồn gốc vi sinh vật thì enzyme
protease có nguồn gốc thực vật đang được ưa chuộng hiện nay. Papain và bromelain
đại diện cho các protease có nguồn nguyên liệu từ thực vật và đã được biết đến từ
rất lâu. Papain là cysteine protease được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ
nhựa trái đu đủ. Bromelain được phân lập từ chồi, ngọn, vỏ dứa.
a)
b)
Hình 1.1.Cấu trúc không gian của enzyme protease
a) Enzyme cystein protease b) Enzyme vicilin peptidohydrolase
Theo nhiều nghiên cứu thì trong họ đỗ có chứa rất nhiều enzyme cysteine
protease như đậu tương, đậu xanh… ngoài ra nó còn chứa nhiều trong các hạt lương
thực như ngũ cốc, gạo, khoai tây [16]. Năm 1874 Group-Besanez công bố đã nhận
được protease từ hạt một loại đỗ. Trong suốt quá trình nảy mầm, các chất dự trữ có
trong hạt sẽ được hệ enzyme phân giải tinh bột, protein và lipid tạo ra các sản phẩm
để vận chuyển đi nuôi cây trồng. Tuy nhiên vẫn còn một lượng nhỏ các enzyme liên
quan đến quá trình trao đổi chất trong suốt quá trình phát triển và nảy mầm của hạt,
hoạt tính enzyme sẽ tăng lên trong những ngày đầu nảy mầm.
Gần đây có nhiều nghiên cứu đã tìm thấy trong mầm giá đỗ của đỗ xanh có
chứa enzyme protease có tên là vicilin peptidohydrolase (EC 3.4.22.34) [31] được
tinh chế từ phương pháp điện gel polyacrylamine và điểm đẳng điện từ dung dịch
giá đỗ. Vicilin là enzyme thuộc họ endopeptidases cysteine thủy phân liên kết
peptid của protein, giúp cho quá trình tiêu hóa protein được dễ dàng [16].
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-14-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
1.3. Công nghệ enzyme
Hiện nay việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh
mẽ trên quy mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên
thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế ở các mức độ
tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng.
Công nghệ sản xuất enzyme được xem như một kỹ thuật quan trọng của công
nghệ sinh học do có các chức năng sau:
+ Enzyme là chất xúc tác cho mọi biến đổi vật chất trong công nghệ sinh học.
+ Enzyme và nhiều hoạt chất sinh học khác là sản phẩm của công nghệ sinh học.
Chúng có thể dùng làm công cụ mới của công nghệ sinh học, hay sử dụng trong các
lĩnh vực khác.
+ Enzyme được xem là thuốc thử có tính chuyên hóa cao mà không có enzyme thì các
quá trình công nghệ sinh học không thể tối ưu hóa được.
Có thể thu nhận enzyme từ động vật như trypsin, chymotrypsin, từ thực vật
như papain của đu đủ, amylase của đại mạch hoặc enzyme từ vi sinh vật, nhưng dù
là nguồn enzyme nào thì cũng phải dựa vào đặc trưng sinh học của đối tượng. Đối
với vi sinh vật cần chú ý đến khâu chọn giống, vấn đề di truyền giống, đặc tính sinh
lý, hóa sinh của giống. Đối với enzyme từ động vật và thực vật thì cần chú ý tới
loại, giống vật nuôi, cây trồng có chứa loại enzyme đó, thời điểm nuôi trồng…
1.4. Đỗ xanh và mầm giá đỗ
1.4.1. Đỗ xanh
Hình 1.2. Hạt đỗ xanh
Hình 1.3. Cấu tạo bên trong của hạt đỗ xanh.[24]
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-15-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
Cây đỗ xanh có tên khoa học Vigna radiata (L) là cây đậu đỗ quan trọng
đứng hàng thứ ba sau đậu nành và đậu phụng (2 loại cây công nghiệp ngắn ngày),
có khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể thích nghi với các vùng có điều
kiện khắc nghiệt. Hạt đỗ xanh (mung bean, green gram) là hạt của cây đỗ xanh,
được trồng chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, là cây trồng khá quen thuộc ở Châu Á và
rất phổ biến ở Việt Nam. Hạt đỗ xanh có hình trụ, thuôn, tròn đều, có màu xanh
bóng, xanh xám, vàng, mốc hoặc đen xám… nằm ngăn cách nhau trong vách xốp
của quả [8 tr 15].
1.4.2. Mầm giá đỗ
Mầm giá đỗ là hạt đỗ nảy mầm, dài chừng 3÷7 cm. Đây là một loại thực
phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giá đỗ thường được ủ cho nảy mầm từ hạt đỗ như
đỗ xanh, đỗ đỏ, đỗ tương, đỗ đen… giá của loại đỗ nào sẽ mang phần bản chất,
thành phần giá trị dinh dưỡng của loại đỗ sinh ra nó. Nói chung giá đỗ tốt hơn hạt
đỗ về cả chất và lượng và nó được xem là “thực phẩm của thế hệ mới” [22].
Hình 1.4. Mầm giá đỗ
Giá đỗ xanh được sử dụng phổ biến vì hương vị nhẹ, vị ngọt, màu sắc đẹp và
độ giòn của nó. Giá đỗ xanh được sản xuất và sử dụng trong nhiều thế kỷ, được
phát triển thành một loại rau hữu ích. Nó là loại thực phẩm chứa nhiều giá trị dinh
dưỡng, rất dễ trồng, đơn giản và đảm bảo vệ sinh.
1.4.2.1. Thành phần dinh dưỡng có trong giá đỗ xanh
Giá đỗ giàu vitamin đặc biệt là vitamin C, khoáng chất, amino axit, protein
và chất có nguồn gốc thực vật (phytochemicals), những chất cần để mầm cây phát
triển, cũng là các chất bổ dưỡng cho người. Ăn giá cũng là một cách để tăng giá trị
dinh dưỡng và khả năng hấp thụ dinh dưỡng của các loại đậu và ngũ cốc khác.
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-16-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng có trong 104g giá đỗ [25]
Thành phần dinh dưỡng
Năng lượng
Năng lượng của chất béo
Protein
Nước
Threonine
Isoleucine
Leucine
Lysine
Glutamic axit
Hàm lượng
31,2 g
2g
3,2g
94 g
81,1 mg
137 mg
182 mg
173 mg
167 mg
Thành phần dinh dưỡng
Methionine
Cystine
Phenylalanine
Tyrosine
Valine
Arginine
Alanine
Aspartic axit
Glycine
Hàm lượng
35,4 mg
17,7 mg
122 mg
54,1 mg
135 mg
205 mg
103 mg
498 mg
65,5 mg
Trong giá có hàm lượng chất xơ rất cao và đặc biệt là giàu hệ enzyme
protease. Enzyme protease có trong mầm giá đỗ là một loại protein đặc biệt giúp
tiêu hóa các chất dinh dưỡng trong thực phẩm và giúp tăng cường hoạt động của
các enzyme trong cơ thể. Trong hạt đỗ khô cũng chứa enzyme protease, nhưng chỉ
khi nảy mầm enzyme mới được kích thích và hoạt động mạnh mẽ.
Ngoài ra trong giá đỗ còn chứa một lượng lớn enzyme như amylase,
investaza.
1.4.2.2. Các điều kiện cho đỗ nảy mầm
Theo các nghiên cứu đã chứng minh, hạt đỗ sau khi ngâm cho lên mầm
thành giá thì giá trị dinh dưỡng có trong hạt đỗ tăng lên rất nhiều lần như vitamin
B2 tăng thêm 2÷4 lần, vitamin E gấp 12 lần, vitamin B11 cũng tăng gấp 9 lần [30].
Vì vậy để cho giá nảy mầm tốt cần phải đảm bảo một số công đoạn và các điều
kiện như:
− Chuẩn bị nguyên liệu
Trong sản xuất giá đỗ thường chọn đỗ xanh để làm giá. Tuy nhiên để có
được một mẻ giá thành công trước khi ngâm ủ hạt giống cần chọn những loại hạt
đạt những tiêu chuẩn sau: hạt nhỏ, đều, chắc, mẩy, loại bỏ những hạt lép, lửng, tạp
chất, sâu mọt. Nên dùng loại đậu mới thu hoạch để làm giá, như vậy tỷ lệ nảy mầm
của hạt sẽ cao (xấp xỉ 100%).
− Rửa và ngâm hạt
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-17-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
Cho hạt vào nước để loại bỏ hạt lép, lửng. Làm ướt hạt rồi xát hạt như vo gạo
trong khoảng 15÷30 phút cho hạt mỏng vỏ, sau đó rửa lại bằng nước sạch, tạo điều
kiện nảy mầm. Việc rửa hạt để loại bỏ hạt lép, hạt bị sâu mọt rất quan trọng, đảm
bảo độ đồng đều trong khối hạt, tránh hiện tượng bốc nóng khối hạt, làm úng mầm.
Khối hạt được ngâm trong nước ấm ở nhiệt độ 35÷380C trong thời gian 8÷12 giờ
sau đó đem ủ.
− Ủ đỗ
Giá đỗ được trồng theo hai phương pháp, trồng trên cát hoặc ngâm trong
nước. Theo kinh nghiệm dân gian thì đỗ được ủ và tưới nước hằng ngày mà không
cần sử dụng đất giống những loại thực vật khác.
− Chăm sóc đỗ sau khi ủ
Trong quá trình ủ đỗ, chú ý tưới nước nhiều lần trong ngày, những ngày đầu
tiên tưới nhiều lần, khoảng 5 giờ tưới một lần để mầm giá phát triển, những ngày
tiếp theo tưới nước vào các buổi sáng, trưa, tối.
− Kỹ thuật ra giá
Sau khoảng 4÷5 ngày ủ tuỳ thời tiết, có thể ra giá. Giá được coi là tốt khi
màu sắc thân giá trắng đều, mầm đỗ vàng sáng, rễ màu nâu nhạt, lá màu vàng hay
xanh nhạt, chiều dài thân giá 3÷5cm, đường kính thân giá 2,5÷3mm, rễ không quá 1
cm, lá không quá 3 mm... là đạt tiêu chuẩn. [33]
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trồng giá đỗ
− Ánh sáng
Giá đỗ có thể lớn lên trong điều kiện có hoặc không có ánh sáng. Trồng
trong bóng tối giá có màu trắng còn nếu trồng giá có cho ánh sáng đi qua, không
che chắn thì giá có màu xanh do cây quang hợp.
− Độ ẩm
Việc ngâm hạt trước khi nảy mầm có ảnh hưởng rất lớn, vì khi ngâm thể tích
của hạt tăng lên đáng kể, quá trình nảy mầm khi lượng nước đạt 25÷30%. Các
enzyme ở trạng thái “nghỉ” được “đánh thức” trở lại trạng thái hoạt động, enzyme
được giải phóng tự do. Tại nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, nó hoạt động mạnh nhất
phân giải các chất hữu cơ có trong hạt. Đồng thời các quá trình hóa lý, sinh hóa, lý
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-18-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
học xảy ra liên tiếp, nên lượng enzyme tăng lên đáng kể. Vì vậy, cần giữ độ ẩm vừa
phải và liên tục, tránh lúc quá khô hoặc quá nhớt để đảm bảo hạt nảy mầm tốt.
− Nhiệt độ
Nhiệt độ đóng vai trò đặc biệt quan trọng, nó ảnh hưởng đến chuyển hóa tế
bào và tốc độ tăng trưởng mầm của giá đỗ. Khi nảy mầm nhiệt độ tăng lên do sự
thải nhiệt của quá trình hô hấp. Trong thời gian nảy mầm cần phải tưới nước để
tránh bốc nóng khối hạt.
− Không khí
Oxi rất cần thiết cho sự nảy mầm vì làm tăng các quá trình oxy hóa trong hô
hấp. Tuy nhiên mức cần thiết cũng rất khác nhau ở các loại cây. Đối với giá đỗ thì
không cần lượng oxy quá lớn, cần tránh tạo nhiều CO 2 vì nó ức chế nảy mầm. Do
đó khi ngâm ủ phải đảo khối cát, cung cấp oxy và thải bớt CO 2 tránh gây hô hấp
yếm khí làm hạt thối hỏng, có mùi ê.
− Thời gian trồng
Thời gian trồng để đỗ dài và mập phải tối thiểu 4 ngày đêm, dụng cụ sử
dụng: phải sạch sẽ và làm vệ sinh cuối mẻ trồng, tuyệt đối không bị nhiễm nấm,
khuẩn, vi sinh vật.
− pH môi trường
pH trung tính là môi trường tốt nhất cho sự nảy mầm và phát triển của đỗ
xanh. Môi trường pH có tính axit có thể làm chậm hoặc thậm chí ngăn chặn sự nảy
mầm và phát triển của đỗ xanh.[21]
1.5. Phương pháp phá vỡ tế bào thực vật
Việc nghiên cứu các phương pháp phá vỡ cấu trúc thực vật với mục đích xác
định phương pháp tốt nhất để thu hồi enzyme protease có hoạt tính cao, ít bị biến
tính, nhằm rút ngắn thời gian thu nhận, giảm chi phí thực hiện và đạt hiệu suất thu
hồi cao nhất.
Có rất nhiều phương pháp để phá vỡ tế bào thực vật, giải phóng enzyme như
nghiền giã, xay bằng máy xay sinh tố, sóng siêu âm, lạnh đông, sử dụng dung môi
hữu cơ… vì thế, việc lựa chọn phương pháp phá vỡ tế bào thích hợp có vai trò rất
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-19-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
quan trọng ảnh hưởng đến chế phẩm enzyme cần thu nhận.
Trong quá trình phá vỡ tế bào, cần chú ý đến các yếu tố như nhiệt độ khi
nghiền, pH của môi trường, lực cắt, thời gian thực hiện quá trình… vì chúng có ảnh
hưởng đến hàm lượng protein và hoạt tính của enzyme giải phóng ra. Trong đó
nhiệt độ và lực phá vỡ các liên kết, cấu trúc tế bào thực vật giải phóng enzyme là
hai yếu tố quan trọng nhất.
1.5.1. Phương pháp sử dụng sóng siêu âm
Sóng siêu âm có bản chất là sóng cơ học, hình thành do sự lan truyền dao
động của các phần tử trong không gian, có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng
nghe của con người. Khi tần số âm thanh đủ lớn, hiện tượng sủi bọt khí sẽ xảy ra,
tạo nên vô số các vi bọt trong pha lỏng. Các bọt sẽ lớn lên trong pha dãn của sóng
âm thanh và bị xẹp đi trong pha nén, bọt xẹp đi do các sóng gây sốc mạnh xuyên
qua chất lỏng. Việc xẹp các bóng bọt sẽ chuyển năng lượng âm thanh thành năng
lượng cơ học ở dạng các sóng gây sốc tương ứng với áp suất hàng ngàn atmosphere
(300 MPa). Năng lượng này sẽ truyền chuyển động tới các bộ phận của tế bào, các
tế bào sẽ bị phá vỡ khi động năng của các bộ phận này trong tế bào lớn vượt quá độ
vững chắc của vách tế bào.
Tuy phương pháp sử dụng sóng siêu âm là một phương pháp sử dụng phổ
biến, hữu ích, dùng nhiều trong quy mô công nghiệp nhưng phương pháp này
thường chỉ áp dụng cho vi sinh vật, còn đối vơi nguồn thu nhận là động vật hoặc
thực vật thì ít sử dụng phương pháp này.
1.5.2. Lạnh đông, tan giá lặp đi lặp lại
Khi lạnh đông chậm, trong dịch bào xuất hiện các tinh thể đá có kích thước
lớn làm phá vỡ hệ thống keo do mất nước, phá hủy cấu trúc mô tế bào. Vì thế khi
tan giá các chất dinh dưỡng, protein và enzyme dễ dàng thoát ra ngoài theo dịch
bào, làm cho quá trình phá vỡ tế bào tốt hơn, cho hoạt tính enzyme protease cao
hơn.
1.5.3. Nghiền với bột SiO2
Khi tế bào thực vật được nghiền với hạt thủy tinh thì cấu trúc tế bào thực vật
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-20-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
sẽ bị phá vỡ nhờ lực nghiền cắt giữa cối, chày va chạm với các hạt thủy tinh. Bột
thủy tinh là chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và làm tăng khả năng ma sát
với vật liệu. Tỷ lệ và hiệu suất giải phóng enzyme có thể thay đổi do thay đổi thời
gian nghiền, tốc độ nghiền, lực nghiền và kích cỡ các hạt.
1.5.4. Dùng áp suất cao
Phá vỡ tế bào bằng cách dùng áp suất cao để đẩy nguyên liệu (dịch huyền
phù tế bào dưới dạng bột nhão được làm đông ở -20 0C) qua các lỗ hẹp của máy nén
thì tế bào sẽ bị phá vỡ do sự thay đổi pha và thay đổi thể tích cũng như do lực cắt
của các tinh thể đá. Phương pháp này có thể sử dụng để phá vỡ các tế bào nuôi cấy
ở quy mô lớn.
1.5.5. Tự phân
Là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng phân
giải một số thành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những enzyme có
trong tế bào và là của tế bào đó. Bình thường các enzyme này không hoạt động
mạnh, nhưng nếu điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tế bào mà trùng với mức
hoạt động tối ưu của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào,
làm chết tế bào.
Phương pháp này có nhược điểm vì trong quá trình thủy phân, các enzyme
có trong tế bào không chỉ thủy phân các chất ở thành tế bào mà cả những chất có
trong tế bào, thậm chí các enzyme cũng bị phá hủy. Phương pháp này hiện nay
không được sử dụng nhiều.
1.6. Quy hoạch thực nghiệm
Bất kỳ một cuộc thí nghiệm nào cũng gồm nhiều thí nghiệm, mỗi thí nghiệm
lặp nhiều lần với nhiều phép đo khác nhau. Tương ứng với sự phân chia đó có sai số
của cuộc thí nghiệm, sai số của mỗi điểm thí nghiệm và sai số của phép đo. Nhiệm
vụ của phép đo không chỉ để xác định giá trị của đại lượng cần đo. Mà còn ước
lượng sai số khi đo.
Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm là vấn đề cần thiết để hiểu biết sai số
của thực nghiệm, độ chính xác và độ tin cậy của phép đo.
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-21-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
Phân tích này gồm các bước sau :
− Kiểm tra giá trị của tất cả các hệ số hồi qui bằng cách so sánh với sai số lặp lại (S bj).
− Sự phù hợp giữa mô tả toán học với kết quả thực nghiệm.
Trong nghiên cứu này áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo
phương án trực giao cấp 2 cấu trúc có tâm. Ưu điểm của quy hoạch thực nghiệm
cấp II là cung cấp thông tin tối đa để người nghiên cứu đạt được kết quả tốt nhất,
nhanh nhất và rẻ nhất. Khi sử dụng phương án trực giao thì khối lượng tính toán ít,
mọi hệ số trong phương trình hồi quy được xác định độc lập nhau.
1.7. Ứng dụng của enzyme protease
1.7.1. Trong công nghệ thực phẩm
1.7.1.1. Công nghiệp chế biến sữa
Enzyme protease được thêm vào sữa trong suốt quá trình sản xuất phomat để
làm đông tụ sữa. Dưới tác dụng của renin thu từ ngăn thứ tư dạ dày bê, casein của
sữa sẽ đông tụ thành khối đặc hòa tan tạo thành khối phomat.
Ngoài ra có thể sử dụng protease để thu casein kỹ thuật (từ sữa) để sản xuất
vectri, chất màu, keo dán, hương liệu.
1.7.1.2. Công nghiệp chế biến thịt
Để làm mềm thịt có thể sử dụng papain, bromelin, ficin, hoặc dùng protease
từ hạt đậu tương nảy mầm. Tuy nhiên các enzyme này chỉ phân giải được các liên
kết peptit ở vùng không xoắn của collagen.
1.7.1.3. Trong sản xuất bia
Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia
và rút ngắn thời gian lọc. Hệ enzyme protease được cho vào sau khi cho malt vào để
thực hiện quá trình đạm hóa phân giải protein trong nguyên liệu thành các
polypeptide và axit amin có giá trị trong bia. Enzyme protease còn làm trong bia và
ổn định chất lượng sản phẩm, nhiều nghiên cứu cho thấy pepsin, ficin, chế phẩm
enzyme protease nấm sợi và papain đều có tác dụng tốt trong quá trình ổn định chất
lượng bia, trong đó papain được sử dụng nhiều hơn cả.
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-22-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
1.7.1.4. Trong chế biến thủy sản
Nước mắm là một thực phẩm, gia vị truyền thống giàu dinh dưỡng chứa
nhiều loại axit amin đặc biệt là các axit amin không thay thế. Nhờ hệ enzyme có sẵn
do hệ vi sinh vật sống trong ruột cá, các protid của cá được thủy phân thành các axit
amin, peptid. Hiện nay có thể bổ sung enzyme protease bên ngoài vào để rút ngắn
thời gian chế biến. Trong chế biến đồ hộp cá rán, phương pháp ướp cá với enzyme
sau đó mới rán, sẽ làm cho thịt cá thơm ngon hơn, màu sắc hấp dẫn và chất lượng
đồ hộp cao hơn.
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi để:
- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong
thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.
- Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bánh kẹo nhằm tăng mùi và vị của
bánh, làm thức ăn chăn nuôi gia súc.
1.7.2. Trong công nghiệp da
Trong công nghiệp da, enzyme protease được dùng để làm mềm da giúp rút
ngắn thời gian xử lý, tránh ô nhiễm môi trường.
Việc xử lý da đã được tiến hành bằng cách ngâm da trong dung dịch
enzyme, hay phết dịch enzyme lên bề mặt da. Enzyme sẽ tách các chất nhờn và
làm đứt một số liên kết trong phân tử collagen làm cho da mềm hơn.
Hiện nay, ngoài sử dụng enzyme thu từ vi sinh vật như protease tách từ vi
khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus), còn sử dụng
nguồn enzyme từ thực vật như papain từ đu đủ, bromelain từ quả thơm đã đem lại
nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng.
1.7.3. Trong công nghiệp dệt
Protease được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi được bóng,
dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các
sợi tơ tự nhiên làm giảm độ đàn hồi, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm
giảm lượng hoá chất để tẩy trắng.
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-23-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
1.7.4. Trong công nghiệp chất tẩy rửa
Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại
chất tẩy rửa. Việc ứng dụng enzyme vào các chất tẩy rửa nhiều nhất là trong bột giặt
chiếm khoảng 25% tổng lượng enzyme bán trên thế giới.
1.7.5. Trong y học
Enzyme protease được ứng dụng rộng rãi trong y học, nó được điều chế
thành dược phẩm giúp hỗ trợ tiêu hóa, chữa bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết
thương…
Enzyme protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng để
nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc. Ngoài ra, còn dùng
enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh.
1.8. Tình hình nghiên cứu enzyme protease từ thực vật
1.8.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Trong những năm gần đây, nhiều tác giả trong nước đã nghiên cứu thu nhận
được một số protease thực vật ở những mức độ tinh khiết khác nhau tùy theo mục
đích sử dụng. Một số công trình như:
− Dương Thị Hương Giang và Lê Thanh Hùng (2002), “nghiên cứu các điều kiện
nhằm ổn định phương pháp tinh sạch bromelain từ nước khóm thô”.
− Võ Sỹ Hùng (1995), “nghiên cứu khai thác nguồn protease từ quả bí đao, nghiên
cứu tính chất và ứng dụng của chúng, từ đó tiếp tục tinh sạch protease tách từ ruột
quả bí đao Việt Nam”.
− Chiêm Lâm Phúc Diễn (2009), “nghiên cứu thu nhận enzyme papain để ứng dụng
vào phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng”.
− Ngô Kim Chi và các công sự (2010), “nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain từ
phế thải chồi dứa và ứng dụng thủy phân chitosan thu oligochitosan”.
− Trần Cảnh Đình, Vũ Xuân Sơn và Nguyễn Thị Hường Viện nghiên cứu hải sản
(2010), “nghiên cứu chế độ thủy phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme papain và
bromelain”.
Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu nào nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu
nhận enzyme protease từ nguồn nguyên liệu giá đỗ tại Việt Nam.
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-24-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
1.8.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Trên thế giới cũng có rất nhiều công trình nghiên cứu về enzyme protease
thực vật nói chung như papain, bromelain, ficin. Đặc biệt là những công trình
nghiên cứu trên nguồn nguyên liệu giá đỗ đã được nghiên cứu và phát triển từ lâu.
− Năm 2001 CHEN Zhong, YANG Xiao – Quan, “nghiên cứu ảnh hưởng của
enzyme protease từ mầm giá đỗ mà làm bất hoạt chất ức chế trypsin đậu nành”
[24].
− Năm 2007, Mahbubar Rahman, Bangladesh, “nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính của
enzyme trong suốt thời gian nảy mầm ở những giống đỗ xanh khác nhau” [13].
− Năm 2009, Rajeswari Jinka, Vadde Ramakrishna, Sridhar K Rao, “thu nhận và tinh
chế enzyme cystein protease từ hai lá mầm của giống đỗ Horse Gram ở Ấn Độ”
[33].
− Năm 2010 Seenvivasan, Roopa, Geetha, “nghiên cứu thu nhận và tinh chế đặc tính
kháng khuẩn của enzyme papain từ đủ đu” [32].
− Năm 2011, Syed Adil Ahah và các cộng sự, “nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian
nảy mầm đến giá trị dinh dưỡng của giống đỗ xanh” [19].
Vì vậy, nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ nguồn nguyên liệu giá đỗ có
một vai trò rất lớn nhằm tạo ra chế phẩm enzyme có hoạt tính tốt và giá thành rẻ
đáp ứng cho các yêu cầu khác nhau.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Hạt đỗ xanh ủ theo các điều kiện nhiệt độ và thời gian được khảo sát.
2.1.2. Các loại hóa chất sử dụng
− Tyrosine, thuốc thử Folin Ciocanto của hãng Merck, độ tinh khiết 100%.
− Casein từ sữa của Nhật, độ tinh khiết ≥ 98%
− Tricloacetat, Na2CO3, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4 độ tinh khiết ≥ 99% của Trung
Quốc.
− Bột nghiền thủy tinh SiO2 của Trung Quốc.
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
Đồ án tốt nghiệp
-25-
GVHD: KS. Bùi Viết Cường
2.1.3. Các máy móc thiết bị phân tích
Cân kỹ thuật điện tử, máy đo pH OaKaton (Châu Âu), máy ly tâm EBA 20
Hettich (Đức), máy đo quang phổ UV-VIS Agilent technologies Cary 60
(Singapore). Và một số dụng cụ, máy móc thiết bị thường được sử dụng trong
phòng thí nghiệm như ống nghiệm, bình tam giác, đũa khuấy, phễu lọc, pipet, cốc,
giấy lọc, giá đựng ống nghiệm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vật lý
Tiến hành thu nhận dịch chứa enzyme bằng các phương pháp vật lý sau:
2.2.1.1. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp lạnh đông, tan giá nhiều lần rồi nghiền
với lượng bột SiO2 không đổi.
Giá ủ sau 4 ngày được lạnh đông bằng tủ đá ở nhiệt độ < 0 oC, rồi rã đông lặp
đi lặp lại với số lần lần lượt từ 1÷8 lần, đem nghiền với khối lượng bột SiO 2 không
đổi, bằng khối lượng mẫu giá ủ. Mỗi mẫu được nghiền trong thời gian 15 phút, giữ
ổn định nhiệt độ trong quá trình nghiền mẫu bằng cách để cối trong thau nhựa chứa
đá lạnh khi nghiền mẫu.
Thêm vào đó đệm phosphat pH = 7 để ổn định enzyme (1 : 3 w/v). Lọc để
tách căn bằng vải lọc thô, sau đó đem ly tâm ở 5500 vòng/phút trong 20 phút. Đem
xác định hoạt tính của enzyme protease.
2.2.1.2. Phá vỡ tế bào bằng cách lạnh đông, tan giá số lần nhất định rồi nghiền với
lượng bột SiO2 thay đổi
Giá ủ sau 4 ngày đem lạnh đông, tan giá số lần nhất định rồi nghiền với
lượng bột SiO2 thay đổi từ 40%; 60%; 80%; 100%; 120%; 140%; 160%; 180% so
với khối lượng mẫu giá ủ. Mỗi mẫu được nghiền trong thời gian 15 phút, giữ ổn
định nhiệt độ trong quá trình nghiền mẫu bằng cách đặt cối trong thau nhựa chứa đá
lạnh khi nghiền mẫu.
Thêm vào đó đệm phosphat pH = 7 để ổn định enzyme (1 : 3 w/v). Lọc để
tách cặn bằng vải lọc thô, sau đó đem ly tâm ở 5500 vòng/phút trong 20 phút. Đem
xác định hoạt tính của enzyme protease.
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thu nhận chế SVTH : Nguyễn Thị Thanh Tâm
phẩm enzyme protease kĩ thuật từ mầm giá đỗ.
Lớp :
09H2A
