Nghiên cứu khả năng thủy phân protein của alpha chymotrypsin và papain khi bị viêm

BỘ Y T Ế
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG THUỶ PHÂN
PROTEIN CỦA a-CHYMOTRYPSIN VÀ
PAPAIN KHI BỊ VIÊM
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 1995-2000

Người thực hiện

: Sinh viên Lê Thị Diễm Hồng

Người hướng dẫn : PGS. TS. iNguyễn Xuân Thắng
Nơi thực hiện

: Bộ môn hoá sinh-Vi sinh

Thòi gian thực hiện: 6/03 đến 23/05/2000

HÀ NỘI, 5-2000

ĩ n i


LƠ I CAM- Ơ9Í

Em xin được bàv tỏ ỉòng biết ơn chân ửiầnh, lờ i cảm ơn sâu sắc
tới PGS. TS. Nguyễn Xuân Thắng, người ửiầv đã n h iệt tình hướng
dẫn và h ế t lòng giúp đỡ em hoàn thành bẩn khoầ luận nầỵ.

ẼĨĨ1 xừl

thành cẩm ơn cha mẹ, các thây giáo, cô giáo trưởng

đại học Dược Hà N ộ i đặc biệt là cấc thầỵ giáo, cô giảo, các cô k ỹ
thuật viên Bộ môn Hoá Sinh

-

Vi sinh đã động viên, giúp đỡ em n h iệt

tình trong suốt thời gian học tập và thưc hiện đ ề tài.

Hà Nội, ửiáng 5 năm 2000
Sinâ viên Lê Tili (Diêm J-Cồng


MỤC LỤC

Mục lụ c ........................................................................................................................ 1
Chú giải chữ viết tá t.................................................................................................. 2
Phần I: Đặt vấn đề..................................................................................................... 3
Phần II: Tổng quan................................................................................................... 4
1. Tổng quan lý thuyết về viêm.......................................... ....................................4
2. Các mô hình nghiên cứu gây viêm thực nghiệm..............................................10
3. Tổng quan về enzym chống viêm...................................................................... 11
Phần III: Kết quả thực nghiệm............................................................................ 14
1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm................................................. 14
2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét.................. ...................................................17
3. Bàn luận............................................................................................................. 32
Phần IV: Kết luận và đề xuất................................................................................. 35

A. Kết luận............................................................................................................. 35
B. Đề xuất............................ ................................................................................... 36
Tài liệu tham khảo....................................................................................................37


CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

Ịrr

Immunoglobulin

Globulin miễn dịch

IL

Interleukin

INF

Interferon

NSAID

Non-steroid anti-inflammatory drug

Thuốc chống viêm phisteroid

PAF

Platelet activating factor

Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu

TNF

Tumor necrosis factor

Yếu tố hoại tử khối u


PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỂ
Viêm là quá trình bệnh lý rất phố biến, gặp trong nhiều bệnh, do nhiều
nguyên nhân gây ra. Nhìn chung, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể,
giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm. Nhưng nếu viêm nặng và kéo dài
sẽ dẫn đến những rối loạn chức năng của các cơ quan bộ phận của cơ thể, gâv
nhiều ảnh hưởng xấu cho cơ thể và có thể gây nguy hại tới tính mạng của
người bệnh.
Để đáp ứng được yêu cầu đó, ngưòd ta đã nghiên cứu ra nhiều loại
thuốc chống viêm như thuốc chống viêm Steroid, thuốc chống viêm phi
Steroid (NSAID). Bên cạnh tác dụng tốt, chúng vẫn còn chứa đựng những yếu

tố bất lợi đối với cơ thể như gây suy giảm miễn dịch, xốp xương, loãng
xương, kích ứng đường tiêu hoá, ...
Chính vì vậv, các thuốc chống viêm có chứa các enzym như protease
(papain, a-chymotrypsin) được chế tạo từ những chất gần gũi với cơ thể con
người đã và đang được nghiên cứu. Các enzym protease này có vai trò rất
quan trọng trong điều trị như kích thích tiêu hoá, chống viêm... Trước đây, ở
Việt Nam đã có nhiều côns trình nghiên cứu về protease nhưng chủ yếu để
ứng dụng chúng trong phònơ chốns suy dinh dưỡng ở trẻ em mà chưa quan
tâm tìm hiểu tác dụng chống viêm và cơ chế chống viêm của chúng. Do đó,

chúns tôi đã tiến hành đề tài: ”Nghiên cứu khả năng thuỷ phân Protein của
a - Chymotrypsin và papain khỉ bị viêm”.
Đê tài này nhằm một sô mục tiêu sau đây:
1. Nghiên cứu khả nãns phân huv protein ở nhữns trạng thái biến tính
khác nhau của a-chymotrypsin và papain.
2. Góp phần tìm hiểu cơ chế chống viêm của papain và achvmotrypsin.
3. Tìm hiểu cơ chế tác dụng của chât sây viêm trên in vivo và cơ chế
chống viêm trên in viĩro.


PHẦN II: TỔNG QUAN
1. Tổng quan lý thuyết về viêm:
Theo Ado (1973), viêm là một phản ứng tại chỗ của các mạch máu tổ
chức liên kết và hệ thần kinh đối với nhân tố gây bệnh và mối liên hệ của nó
đối với tính phản ứng của cơ thể.
Theo Vũ Triệu An, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể mà nền
tảng của nó là phản ứng tế bào, phản ứng này được hình thành và phát triển
phức tạp dần trong quá trình tiến hoá của sinh vật [4].
Trong từ điển Bách Khoa Dược học định nghĩa: Viêm là một phản ứng
tại chỗ của cơ thể, do các mô bị kích thích hoặc bị thương tổn. Đó là một
phản ứng phức tạp của các mô liên kết và của mần hoàn mao mạch ở nơi bị
tác động, được biểu hiện bằng các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau và rối loại
chức phận [12].
1.1. Nguyên nhân gây viêm: [4], [8]
Có nhiều nguyên nhân gây viêm, có thể chia thành hai nhóm như sau:
1.1.1. Nguyên nhân bên ngoài:
- Sinh vật: Do nhiễm vi khuẩn, virus, ký sinh trùng
- Vật lý: Cơ học (đụng đập, chấn thương), nhiệt (bỏng nóng hoặc bỏng
lạnh), bức xạ ion.
- Hoá học: Các chất hoà tan gây hoại tử tế bào như các dung dịch hoá chất

(acid, kiềm, muối, ...) hoặc các chất đặc gây thực bào của bạch cầu.
1.1.2. Nguyên nhân bên trong:
Các nguyên nhân bên trong có thể gập như hoại tử tổ chức, xuất huyết,
tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng (viêm tắc động mạch), do phản ứng
kháng nguyên kháng thể ...

4


Tuy nhiên, rất khó phân biệt rõ ràng hai loại nguyên nhân gây viêm
như trên vì trong thực tế, các nguyên nhân bên ngoài thường kèm theo các
biến đổi trong cơ thể và từ đó tạo ra các nguyên nhân bên trong.
1.2.

Những phản ứng chính tại ổ viêm:
Tại ổ viêm có hai loại phản ứng chính xảy ra: [4], [8].

1.2.1 Phản ứng tuần hoàn:
Phản ứng này xảy ra rất sớm sau tổn thương và phát triển ở mức độ
khác nhau, phụ thuộc vào sự trầm trọng của tổn thương mô và theo một trình
tự sau:
1.2.1.1. Co mạch chớp nhoáng ở các tiểu động mạch xảy ra ngay khi có tác
nhân kích thích, do hưng phấn thần kinh co mạch và các cơ tron bị kích thích.
1.2.1.2. Xung huyết động mạch, giãn tiểu động mạch, mao mạch và tiểu tĩnh
mạch: Sau khi co mạch chớp nhoáng ở các tiểu động mạch là hiện tượng giãn
mạch. Đầu tiên là giãn các tiểu động mạch rồi mao mạch và tiểu tĩnh mạch
dẫn đến tăng tuần hoàn tại chỗ nhằm cung cấp năng lượng cho hoạt động tại ổ
viêm (gây nóng và đỏ) và đưa nhiều bạch cầu tới ổ viêm làm nhiệm vụ bảo vệ.
Nguyên nhân của hiện tượng giãn mạch là do ba yếu tố chính:
a. Hưng phấn thần kinh giãn mạch ở vùng động mạch và tiểu động mạch.

b. Do tác động của các yếu tố thể dịch có mặt tại ổ viêm như histamin,
bradykinin, leucotrien... gây co tế bào nội mô; hoặc các cytokin (IL-1,
TNF, INF-y ...) gây nên sự tái tổ chức cấu trúc bộ xương tế bào, dẫn đến
hình thành những vùng nối gian bào rộng, những lỗ hổng giữa các tế bào.
c. Các sợi liên kết ở vùng mao mạch và tiểu động mạch bị tổn thương, làm
giảm trương lực thành mạch, gây giãn mạch.

5


1.2.1.3. Phản ứng tuần hoàn quá mạnh trên dẫn tới các rối loạn nghiêm trọng
như giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chậm dần, gây tăng tính thấm thành
mạch làm thoát dịch rỉ viêm giàu protein vào các mô quanh huyết quản. Do
sự chèn ép của dịch ri viêm và do một số yếu tố mạch máu như liệt thần kinh
vận mạch, tế bào nội mạc sưng to, tăng độ nhót cửa máu... gây ứ máu làm mất
tuần hoàn từ động mạch sang tĩnh mạch, thiếu ôxy, gây rối loạn chuvển hoá
nghiêm trọng, tổn thương tổ chức và viêm phát triển toàn diện (biểu hiện lâm
sàng là phù và đau).
1.2.2. Phản ứng tế bào:
Đây là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả năng bảo vệ của cơ thể
chống viêm và trong phản ứng này, bạch cầu đóng vai trò quan trọng nhất.
Do tốc tộ tuần hoàn chậm lại, các bạch hầu, chủ vếu là bạch cầu đa
nhân trung tính dạt vào thành mạch, bám vào nội mô rồi dừng lại tại một
điểm, gọi là vách tụ cầu. Dưới tác dụng của các chất trang gian hoá học như
IL-l, TNF và nội độc tố, bạch cầu và tế bào nội mô bộc lộ hai loại phân tử
dính trên bề mặt là selectin, integrin. Nhờ đó, khả năng dính của bạch cầu với
tê bào nội mô tăng lên rõ rệt.
Sau khi dính vào tế bào nội mô, bạch cầu chuyển động nhẹ dọc theo bề
mặt nội mô, luồn những chân giả vào kẽ hở giữa các tế bào nội mô. ơiúng
xuyên qua vùng nối đã dãn rộng giữa các tế bào nội mô để xen vào giữa tế bào

nội mô và màng đáy, và từ đó đi vào khoảng gian bào ngoài mao mạch. Hiện
tượng bạch cẩu vận động hướng tới ổ viêm được coi là hiện tượng hoá ứng
động bạch cầu. Tác dụng này là do ổ viêm có một số chất có tác dụng gây hoá
ứng động: các sản phẩm của vi khuẩn (các peptid có acid amin tận cùng là Nformyl-methionin), các thành phần của hệ thống bổ thể bị hoạt hoá (C3a, C5a,
C5b,6,7), các sản phẩm chuyển hoá của acid arachidonic theo đường
lipoxygenase hoá (đặc biệt là Ịeucotnen B4), các cytokin, các mảnh vụn sợi

6


tạo keo và các sản phẩm phân huỷ tế bào. tơ huyết và các sán phám phân huv
của tơ huyết. [8]
Tại ổ viêm, các bạch cầu được hoạt hoá và khi được hoạt hoá, khả năng
thực bào của chúng tăng lên rõ rệt. Quá trình thực bào diễn ra như sau: mới
đầu bạch cầu tiếp cận vói đối tượng thực bào, rồi bao vây và nuốt đối tượng
thực bào bao gồm tất cả vi khuẩn và các mảnh tế bào bị phân huỷ tại ổ viêm.
Khi bị thực bào, nghĩa là khi đối tượng đã lọt vào trong thực bào thì có thể xảy
ra năm khả năng: [4]
+ Đối tượng thực bào bị tiêu đi nhờ vai trò của lisosom: Khi các vi khuẩn bị
thực bào, chúng tập trung ở khôns bào và gắn với màng bào tương tạo
thành thể phagosom, phagosom liên kết với ĩysosom thành phaaolvsomo
chứa nhiều hydrolase acid: các men này đóng vai trò phân tiuv vi trùng
đổng thời tiêu huỷ cả tế bào thực bào.
+ Đối tượng thực bào không bị tiêu huỷ, mà tồn tại lâu trong tế bào như bụi
than trong thực bào ở phổi (gây bệnh bụi than) ...
+ Đối tượng thực bào không bị tiêu huỷ và có thể theo thực bào đi nơi khác
gây những ổ viêm mới (như trong bệnh lao mãn tính).
+ Đối tượng thưc bào có thể bi nhả ra mà đại thực bào không chết.
ơ

.

.

•

o

+ Đối tượng thực bào làm chết thực bào như vi trùng lao, hay liên cầu
khuẩn.
1.3. Các chất trung gian hoá học tham gia vào quá trình viêm:
Trong phản ứng viêm có sự tham gia của rất nhiều chất trung gian hoá
học. Các chất này được giải phóng ra ngay khi có tác động ban đầu của viêm
và trong suốt quá trình viêm, duy trì và khuếch đại phản ứng viêm. Các chất
trung gian hoá học gổm có:

7


1.3.1. Các protein của huyết tương: [8]
-

Hệ thống bổ thể, trong đó đáng chú ý nhất là các thành phần C3a và C5a
làm tăng tính thấm thành mạch và gây giãn mạch, chủ yếu là do giải phóng
histamin từ các dưỡng bào. C5a cũng hoạt hoá đường chuyển hoá
lipoxygenase của acid arachiđonic ở các bạch cầu đa nhân trung tính và
các bạch cầu đơn nhân, gây giải phóng tiếp các chất trung gian hoá học của
viêm. C5a còn là tác nhân hoá ứng động mạch vđi bạch cầu.

- Bradykinin, một chất gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch được

giải phóng từ 0C2- globulin khi hệ thống kinin bị hoạt hoá dưới tác dụng
của yếu tố Hageman (yếu tố x n của đường đông máu nội sinh).
-

Hệ thống đông và tiêu tơ huyết: Hệ thống đông máu là một ỉoạt những
protein của huyết tương có thể bị hoạt hoá bởi yếu tố Hageman. Bưđc cuối
cùng của quá trình là sự chuyển fibrinogen thành fibrin do tác động của
thrombin. Trong quá trình biến đổi này, các fibrinopeptid được hình thành,
nó sây tăng tính thấm mao mạch và có hoạt tính hoá ứng động với bạch
cầu.

1.3.2. Các amỉn hoạt mạch: [8]
-

Histamin: được hình thành sẵn có trong các hạt và được giải phóng do sự
mất hạt của các dưỡng bào khi đáp ứng vói các kích thích: tổn thương vật
lý (chấn thương, bỏng), phản ứng miễn dịch làm gắn các kháng thể với các
dưỡng bào, các đoạn của bổ thể được gọi là các độc tố gây phản vệ (C3a và
C5a), các protein giải phóng histamin xuất phát từ bạch cầu, các
neuropeptid, các cytokin (IL-1, IL-8). Histamin gây giãn các tiểu động
mạch và tăng tính thấm thành mạch của các tiểu tĩnh mạch.

-

Serotonin: có tác động tương tự như Histamin, được giải phóng từ các tiểu
cầu bị kích thích khi chúng kết dính sau khi tiếp xúc vói sợi tạo keo, ADP,
các phức hợp nguyên kháng - kháng thể, hoặc do yếu tố hoat hoá tiểu cáu

8

(PAF) có nguồn gốc từ các dưỡng bào trong các phản ứnợ do tác động
trung gian của IgE.
1.3.3. Các chất chuyển hoá của Acỉd arachidonỉc: [8]
Các chất chuyển hoá của acid arachidonic như prostaglandin,
prostacyclin,

thromboxan

(chuyển hoá

theo

đường

cyclooxvgenase),

leucotrien (chuyển hoá theo đường lipoxygenase). Acid arachidonic là một
thành phần bình thường của màng lipid và được giải phóng do tác động của
phospholipase A2. Các chất chuvển hoá của nó như prostacyclin và
thromboxan đóng vai trò quan trọng trong điều hoà đông máu. Trong viêm,
prostaglandin A2 làm tăng tốc độ dòng máu và kết hợp với các yếu tố khác
gây tăng tính thấm thành mạch và gây đau. Prostagỉanđin A2 có hiệu quả
chống viêm vì nó làm tăng mức AMP vòng và ức chế chức năng hiệu ứns của
tẽ bào viêm. Còn các leucotrien là các chất trung gian tiền viêm mạnh, có tác
dụng hoá ứng động bạch cầu.
1.3.4. Yếu tô hoạt hoá tiểu cầu (PAF): [8]
PAF là một dẫn xuất của phospholipid màng được sinh ra sau khi hoạt
hoá phospholipase A2 và thường được giải phóng đổng thời với các chất
chuyển hoá của acid arachidonic. Nhiều loại tế bào có khả năng tổng hợp PAF

như bạch cầu đa nhân, đại thực bào, dưỡng bào, tiểu cầu, tế bào nội mô. tế bào
biểu mô. PAF hoạt hoá mạnh bạch cầu đa nhân trung tính, kích thích sự dính
và xuyên mạnh của bạch cầu, giải phóng các men của thể tiêu, sinh oxy phản
ứng và các eicosanoid, gây hoạt hoá và kết dính tiểu cầu.
1.3.5. Các cytokin: [8]
Các cytokin là những polypeptid do nhiều loại tế bào sản xuất ra (chủ
yếu là Lympho bào và đại thực bào bị hoạt hoá), tham gia vào các phản ứn£
miẻn dịch tế bào và cũng siữ vai trò quan trọng trong phản ứng vièm. Các

9


cytokin chính gồm các yếu tố hoại tử u (TNF a và P) và các interleukin (IL-l.
IL-6, IL-8...). TNF, IL-1, IL-6 tham gia phát triển phản ứng viêm tại chỗ hoặc
hệ thống, một số phản ứng có thể trở thành mãn tính. Tại chỗ, chíing làm hoạt
hoá nội mô, tăng tổng hợp các phân tử dính của tế bào nội mô. Chúng còn gây
sốt, làm tăng lượng bạch cầu đa nhân trang tính, tăng sinh nguyên bào sợi và
kích thích tổng hợp collagen... Còn IL-8 là một tác nhân hoá ứng động và hoạt
hoá mạnh đối với bạch cầu đa nhân trung tính. Nó là chất cảm ứng mạnh của
các cytokin khác, chủ yếu là TNF và DL-L

2. Các mô hình nghiên cứu gây viêm thực nghiệm: [18]
Như đã nêu ở trên, viêm là quá trình bệnh lý rất phổ biến, gặp trong
nhiều bệnh với các cơ chế gây viêm phức tạp do nhiều nguyên nhân và yếu tố
sây viêm gây ra. Nhưng để có mô hình gây viêm trong thực nghiệm người ta
thường dùng các phương pháp:
2.1. Gây viêm bàng cơ học:
Trên chuột cốns hoặc chuột nhắt trắng, cạo lông và nạo mất một phần
bề mặt da để gây viêm.
2.2. Gây vièm bằng bỏng:

Dùng que sắt nung nóng ở nhiệt độ thích hợp thường 200°c, gây viêm
bằng cách gây bỏng.
2.3. Gây viêm bằng hoá chất:
2.3.1. Sử dụng Kaolin:
Gây viêm chuột bằng cách tiêm hỗn dịch kaolin 10% vào chân hoặc bàn
chân chuột cống trắng hoặc chuột nhắt trắng [18].
2.3.2. Sử dụng Formol:
Tiêm dung dịch Formol 2%vào chân, bàn chân chuột cống trắng hoặc
chuột nhắt trắng [19].

Ỉ0


2.3.3. Sử dụng Dextran:
Tiêm dung dịch Dextran 6% vào chân, bàn chân chuột cống trắng hoặc
chuột nhắt trắng.
Ngoài các hoá chất trên còn dùng dầu eroton 1% [18] và các chất khác.
Tất cả quá trình gây viêm trên đều có cơ chế chung là gây biến tính protein
bình thường của súc vật thí nghiệm tại nơi tiêm. Những protein lạ này sẽ tạo
nên những phản ứng viêm do vậy khi cơ thể loại bỏ các loại protein bị biến
tính sẽ làm cho quá trình viêm giảm đi. Điều này có thể được giải thích tại sao
việc sử dụng protease như a-chymotrypsin hoặc papain có vai trò trong quá
trình chống viêm mà trong bản khoá luận này muốn quan sát điều đó.

3. Tổng quan ve enzym chống viêm:
Các thuốc chống viêm hoá dược, bên cạnh khả năng chống viêm, còn
chứa đựng nhiều tác dụng phụ như gây loét dạ dày, dễ làm chả)' máu, ... Vì
vậy, trên thế ơiới, người ta đang hướng đến sử dụng các enzym có tác dụng
chống viêm như trypsin, a-chymotrvpsin, papain, ... Các enzym nàv có ưu
điểm là tương đối gần gũi với cơ thể con người nên phần nào giúp tránh được

những tác dụng không mong muốn.
Trong bản khoá luận này chúng tôi nghiên cứu hai enzym chống viêm
đó là papain và a-chymotrypsin.
3.1. Papain:
3.1.1. Cấu tạo, tính chất của papaiìt:
Papain được lấv từ nhựa quả đu đủ xanh Carica papaya L. Papayaceae
[7], [12]. Papain ở dạng kết tinh hav bột có màu trắng hơi vàng, dễ tan trong
nước và glycerin, không tan trong phần lớn các dung môi hữu Cứ. Papain có
phân tử lượng 23400 [12]. Cấu trúc bậc 1 của nó gổm 212 acid amin với trung
tâm hoạt độns; là cystein ở vị trí 25 có mang nhóm - SH. Papain là một
[’rotease tương đối bền. Nó ổn định và hoạt động trong khoáng PH tương đối

il


rộn°- từ pH = 4- 9. Tác dụng tiêu hoá protein của Dapain tiến hành tốt nhất ở

môi trường pH = 6,4 - 6,5. Nhiệt độ thích nghi khá cao, có thể đến 80°c,
nhưng cao hơn 90°c sẽ mất tác dụng [7].
Papain được hoạt hoá bởi các chất khử (Ví dụ: Thioglycolai:, glutathion,
cystein, sulfid, bisulfid, thiosulfat cvaniđ), là nbữns chất làm cho trung tâm
hoạt động của papain ở dạng nhóm - SH. Papain bị bất hoạt khi nhóm - SH bị
oxy hoá, chuyển thành liên kết disulfua. Các chất ức chế papain là các chất
oxy hoá, các thuốc thử phản ứng với nhóm - SH (ví dụ nhu' iodoacetat,
iodoacetamid, methyl bromid, N-ethylmaleimid), các ion kim loại nặng (ví dụ,
Zn2+, Fe2+, Cu2+, Pb2+, Hg2+) và các muối thuỷ ngân hữu cơ. Sự bất hoạt papain
clưới tác động của các kim loại nặng có tính thuận nghịch, nó được phục hồi
khi có mặt EDTA và các chất khử (ví dụ như cystein). [16]
3.1.2. Tác dụng sinh học và dược lý của papain:
Papain làm mềm thịt ăn, làm trong đổ uống, làm mềm da. Papain phân

huỷ protein, đổns thời cũng được dùng làm xúc tác trong tổng hợp các chất
angiotensin, dynorphin, enkaphalin, peptid... [12].
Men papain có tác dụng như men pepsin của dạ dày và nhất là giống
men trypsin của tuỵ tạng trong sự tiêu hoá các chất thịt. Papain có tác dụng trị
giun đũa, giun kim, sán lợn, làm một số vi trùng Gram (+) và Gram (-) ngừng
phát triển. Papain còn có tác dụng làm đông sữa, tác dụng giảm độc đối với
toxin và toxanbumin, alacaloid [7], [16].
Papain còn có tác dụng chống viêm, chống phù. Nó có khả năng tiêu
huỷ các mô chết mà không làm ảnh hưởng tới các mô xung quanh. [16]
Nhờ các tác dụng trên, trong y dược người ta sử dụng papam làm thuốc
tẩy giun, trị các chứng khó tiẻu, chậm tiêu, viêm dạ dày - ruột, hỗ trợ trong
các trường hợp viêm, phù. sau phẫu thuật, chấn thương, nhiễm trùns. [16]

12


3.2. a - Chymotrypsin:

3.2.1. Cấu tạo và tính chất của a - Chymotrypsin:
CL - Chymotrypsin có nguồn gốc từ tuỵ lợn, bò... đã được nghiên cứu từ

lâu. a - Chymotrypsin được lấy từ tuỵ bò bằng cách chiết với nước acid. [12,
138]. Đặc trung quan trọng của nó là khả năng tiêu protein ở pH = 8 [3]. C6chymotrvpsin thuộc loại serin-protease [2] ưu tiên cắt các liên kết tyrosin,
tryptophan, phenylalanin, leucin, thủy ngân các liên kết peptid, amid, este.
[15]
Trong dịch tuỵ lúc đầu a - Chymotrypsin được sản sinh dưới dạng
không hoạt động đó là a - chymotrypsinogen do những tế bào hình hạt nho
của tuỵ tạo ra. Sau đó dịch tuỵ chuyển cc - chymotrypsinosen đến tá tràng, ở
đây ct - chymotrypsinogen được men trypsin hoạt hoá thành a-ctiymotrypsin
[12]. cc-chymotrypsin cắt các liên kết peptid có nhóm carboxyl của các acid

amin thơm. [3]
3.2.2. Tác dụng của a - Chymotrypsin:
Có tác dụng của một enzym phân giải protein, a-chymoưypsin được
dùng uống, tiêm bắp hoặc dùng tại chỗ đê chống viêm và điều trị một số chấn
thương, với tính chất là một endopeptidase tuyến tuỵ. Ngoài ra

a-

chymotrypsin còn được chỉ định trong các trường hợp chống phù nề, kháng
viêm trong chấn thương, viêm nhiễm, dùng tại chỗ hoặc tiêm bắp trong các
khoa: nội, tai mũi họng, phụ, ngoại (chấn thương và chỉnh hình), da liễu...
[ 12].

13


PHẦN ĨĨI: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM
1. Nguyên vật ỉiệu và phương pháp thực nghiệm:
1.1. Nguyên vật liệu:
1.1.1. Enzym:
] .1.1.1. Papain đông khô: dạng tinh thể đã sơ bộ tinh chế bằng phương pháp
đông khô thu được từ nhựa mủ quả đu đủ xanh (Carica papaya L. Papayaceae)
lấy ở Gia Lâm - Hà Nội.
Ll.1.2. a-chymotrypsin dạng kết tinh 21 JU katal (450 E.A.Ư) của hãng
Leurquin.
1.1.2. Cơ chất:
1.1.2.1. Lòng trắng trứng.
Cân 2g ỉòng trắng trứng sống, cho 1 ít NaCl 0,9% vào hoà tan, cho
nước vừa đủ 100ml. Khuấy đều thu được cơ chất lòng trắng trứng sốns 2%.
Đun sôi cách thuỷ lọc qua gạc thu được lòng trắng trứng chín 2%.

1.1.2.2. Cơ chất thịt lợn.
Câu 2g thịt lợn sống, nghiền trong cối vói nước cho mịn, đổng thể, thêm
nước đủ 100ml, lọc qua gạc thu được dịch thịt lợn sống 2%.

Đun sôi cách thuỷ, đổng thể, lọc qua gạc được dịch thịt lợn chính 2%.
1.1.3. Thuốc thử:
1.1.3.1.Dung dịch acid Tricloacetic 10%
Acid tricloacetic

10g

Nước cất vừa đủ

100 ml

ỉ .1.3.2. Dung dịch đệm phosphat 0,03M (pH = 7,5)
Na2HP04.12H20

10,7451 g

KH2P 04

4,0827 g

Nước cất vừa đủ

1000.0 mỉ

14

1.1.3.3. Dung dịch NaCl 0,9%
NaCl

9g

Nước cất vừa đủ

100 ml

1.1.3.4. Dung dịch Gomall:
Hoà tan l,5g CuS04.5H20 và 6,0 g NaKC4H40 6.4H20 trong 500 mi
nước cất. Thêm 300ml dung dịch NaOH 10% (30g NaOH/300ml H20 ) vừa
thêm vừa lắc đều. Thêm lg KI rồi thêm nước cất vừa đủ 1000 ml lắc kỹ, bảo
quản trong lọ kín.
Chú ý: Bỏ đi khi có cặn.
1.1.4. Súc vật thí nghiêm:
Chuột nhắt trắng thuần chủng giếng Swiss, đực và cái, nuôi trong cùng
điều kiện, cân nặng 20-22 gram, do viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp.
1.1.5. Dụng cụ máy móc:
- Máy đo quang (UV-Vis) Trung Quốc 752
-

Máy li tâm Hettich

- Máy điều nhiệt Mtakutesz
- Tủ lạnh, Tủ sấy.
1.2. Phương pháp nghiên cứu:
1.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzym:
1.2.1.1. Nguyên tắc xác định:

Dưới tác dụng của enzym, protein bị thuỷ phân giải phóng ra các peptid
có các acid amin. Xác đinh lượng protein còn lại bằng cách tủa với acid
tricloacetic. Tủa này phản ứng với thuốc thử Gomall tạo màu tím hổng. Đo
quang phổ hấp thụ, ở bước sóng À,=530 nm, cuvet lcm
1.2.1.2. Kỹ thuật tiến hành:
*Pha loãng men đến độ pha loãng thích hợp:
- Đối với papain: pha loãng trong đệm phosphat pH =7,5.
- Đối với a - chymotrypsin: pha loãng trona dung dịch NaCl 0,9%

15


* Xác đinh khả năng thuỷ phân của papain.
Thuốc thử

Ống cơ chất (ml )

Ong thử (ml)

Lòng trắng trứng

2,0

2,0

A. tricloacetic 10%

2,5

0

Ị

0

0,1

1

0,5

0,5

Ị

Dịch men đã pha loãng
Cystein 0,04M

Lắc đều, ủ ấm 37° trong thời gian theo dõi thích hợp. Sau thời gian ủ ấm
cần thiết, cho vào ống thử: 2,5ml acid tricloacetic 10% lắc đều để ở nhiệt độ
phòng 10 phút. Đem ly tâm lấy tủa, rồi thực hiện phản ứng với 4ml thuốc thử
Gomall. Lắc đều cho tan hoàn toàn tủa. Để nhiệt độ phòng 30 phút.
Đo mật độ quang ở Ằ, = 530 nm, cuvet lem
Chú ý: dùng cystein để hoạt hoá papain.
* Xác định khả năng thuỷ phân protein của a - Chymotrypsin.
Thuốc thử

Ị

Ống cơ chất (mi)

Ống thư (mi)

Lòng trắng trứng

2,0

A.tricloacetic 10%

2,5

Dung dịch NaHC03 2%

2,0

°
1,9

Dịch men đã pha loãng

0

0,1

Ị

2,0

I

I

Lắc đều, ủ ấm 40° trong thời gian theo dõi thích hợp. San thời gian ủ
cần thiết cho vào ống thử: 2,5ml acid tricloaccetic 10%. Lắc đều cỉể ở nhiệt độ
phòng 10 phút. Đem ly tâm lấy tủa rổi thực hiện phản ứng với 4mỉ thuốc thử
Gomall. Lắc đều cho tan hoàn toàn tủa. Để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Đo mật độ quang ở X = 530 nm, cuvet lcm.
1.2.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng tiêu protein biến tính của a chymotrypsin và papain:

lồ


! .2.2.1. In vitro: Tác dụng của a - chymotrvpsin và napain thuỷ phân các ioai
protein gâv biến tính bằng nhiệt, acid, kiểm:

Lòng trắng trứng, nhũ dịch thịt ỉợn được gâv biến tích ở nhiệt độ khác
nhau, nồng độ acid, nồng độ kiềm ở thời gian khác nhau. Sau đó xác đinh tv ỉệ
rìhần trăm protein bị thuv phân 30 với lượng protein lúc đầu. Kỹ thuật tiến
hành như phươns pháp đã nêu ở trên.
1.2.2.2. In vivo : Chuột được gây biến tính bằng Formol, Dextran, Kaolin.
a. Gâv viêm bằng Formol:
Chuột nhắt trắng được tiêm vào một bên đùi bởi 0,05ml dung dịch
Formol 2%. Đùi bên kia

không tiêm để đối chứng. Sau khi tiêm 24 giờ, giết

chuột, lấy thịt đùi chân tiêm và chân khòns tiêm chế tạo cơ chất và xác định
sự chênh lệch tỷ lệ phần trăm tiêu protein.
b. Gây viêm bằng Dẽxtran.
Chuột nhắt trắng đượe tiêm vào một bèn đùi bởi 0,05 ml dung dịch

Dextran 6%. Đùi bèn kia không tiêm đê đối chứng, Sau khi tiêm 24 giờ, giết
chuột, rồi tiến hành như ỏ' chuột gây viêm bằng Formol.
c. Gâv viêm bằng Kaolin.
Chuột nhắt trắnạ được tiêm vào một bên đùi bởi 0,05 rai hỗn dich
•

o

*

•

Kaolin 10%. Đùi bên kia không tiêm để đối chứng, Sau khi tiêm 24 giờ. giết
chuột, rồi tiến hành như ở chuột gây viêm bằng Formol.

2. Kết quá thực nghiệm và nhận xét:
2.1. Khả năng tiêu proteỉn của a - chymotrypsin:
2.1.1. Cơ chất lòng trắng trứng:
2.1.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ gâv biến tính cơ chất lòng trắng trứng đối với
khả năng thuv phàn của a - chymotrypsin.
Để nghièn cứu ảnh hưởng của nhiệt độ gây biến tính cơ chất lòng trắng
trứns đối với khả năng thuỷ phủn của a - chvmotrypsin, thí nghiệm được tiến
\
.

li Q Oĩ
17

v KL
\

'

\

bfĩ~.y


hành như sau: sây biến tính cơ chất lòng trắna trứng ở các nhiệt đỏ khác nhau:
50°c, 70°c, 87°c, 100°c trong thời gian 10 phút. Sau đó xác định khá năn 2
thuỷ phân protein của a-chymotrypsin đối với cơ chất đã biến tính trong cùng
điều kiện ở 40°c trong 30 phút. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 1.
Bảug 1; Ảnh huởíig của nhiệt độ gây biến tính cơ chất ỉòng tráng trứng
đối với khả năng thuỷ phàn của a - chymoírypsin.

% protein bi thuỷ phản

iỊ

Ghi chú:

50

0,98

70

5,5

87

61,8

100

72.7

1

ị

Kết quả trên là trung bình của 3 lần thí nghiệm
a - Chymotrypsin sử dụng có hàm lượnơ lmg.

Nhận xét: Qua bảng trên cho thấy: Nhiệt độ gây biến tính càng cao, khả
năng thuỷ phân protein lòng trắng trứng biến tính của cc - Chymotrypsin càng
lớn. ở nhiệt độ 50°c, protein lòng trắng trứng biến tính của a - Chymotrypsin

hầu như không bị thuỷ phân, ở nhiệt độ 100°c, protein lòng trắng trứng biến
tính bị thuỷ phân cao nhất là 72,7%.
2.1.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ acid gây biến tính cơ chất lòng trắng trứng
đối vói khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin.

Với mục đích tìm hiểu ảnh hưởng của nồng độ acid gây biến tính cơ
chất lòng trắng trứng đối với khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin. Chúng

tòi đả tiến hành thí nghiệm: gây biến tính cơ chất lòng trăng trứng bằng acid
HC1 15% để đạt nồng độ gây biến tính là 5% trong thời gian khác nhau: 10
phút. 20 phút: 40 phút, 60 phút. Sau đó xác đinh khả năng thuv phân protein
lòng trắng trứng biến tính của a - Chymotrypsin trong cùng điều kiện.

18


Kết quả thu được thể hiện ở hảng 2.
Báng 2: Ảnh hưởng của nồng độ acid gây biến tính cơ chất lòng trắng
trứng đối với khả năng thuỷphân của a - Chymotrypsin.
Thời gian gây biến tính (phút)

Ị

% Protein bị thìiỷ phân

10

Ị

24,8

Ghi chú:

20

25,3

40

26,8

60

37,1

1

Kết quả trên là trung bình của 3 lần thí nghiệm,
cc - Chymotrypsin sử dụng có hàm lượng Img.

Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy: Thời gian gây biến tính càng lâu,
protein bị biến tính càng nhiều thì khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin

càng tăng, ở thời gian 10 phút, khả năng thuỷ phân protein lòng trắng trứng
biến tính của a - Chymotrypsin thấp nhất là 24,8%. ơ thời gian 60 phút, khả
năng thuỷ phân protein lòng trắng trứng biến tính của GC - Chymotrypsin cao

nhất là 37,1%.
2.ỉ. 1.3. Anh hưởng của nồng độ kiểm gây biến tính cơ chất lòng trăn2 trứng
đối với khả năng thuỷ phàn của a - Chymotrypsin.

Để tìm hiểu ảnh hưởng của nồng độ kiềm gây biến tính cơ chất lòng
trắng trứng đối với khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin, ơ iú n g tôi tiến

hành thí nghiệm như sau: Gây biến tính cơ chất lòng trắng trứng bằng dung
dịch NaOH 30% để đạt nồng độ gây biến tính là 5% trong thòi gian 10 phút,
20 phút, 40 phút, 60 phút. Sau đó xác định khả năng thuv phân protein của a Chymotrypsin đối với cơ chất lòng trắng trứng đã biến tính trong cùng điều
kiện.
Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.

19

Bang 3: Ảnh hirởng của nồng độ kiềm gày biến tính cơ chất lòng tráng
trứng đối vói khả năng thuỷ phán của a - Chymotrypsin.

Thời giaa gây bỉếtt tính (phút)

% proteỉn bi thuỷ phản

10

56.4

20

68,8

40

74,6

60

84,2

Ghi chú:

i

Kết quả trên là trung bình của 3 lần thí nghiệm,
a - chvmotrypsin sử dụng có hàm lượng lĩĩis.

Nhận xét: Từ kết quả trên chúng ta thấy: Cơ chất lòng tráng trứng bị
biến tính bằng kiềm mạnh hơn bằng acid ở cùng một nồng độ gây tác động và
thời gian biến tính như nhau. Thời gian gây biến tính càng lâu, khả năng thuỷ
phân protein của a - Chymotrypsin càng tăn2. Khả năng thuv phân protein

lòng trắng trứng biến tính của a - Chymotrypsin thấp nhất là 56,4% ở thời gian
biến tính 10 phút. Khả năng thuỷ phân protein lòng trắng trứng biến tính của a
- Chymotrypsin cao nhất ỉà 84,2% ở thời gian biến tính 60 phút.

2.1.2. Cơ chất thịt lợn:
2.1.2.1. Anh hưởng của nhiệt độ thay đổi theo thời gian gây biến tính cơ chất
thịt lợn đối với khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin và papain.

Tiến hành khảo sát khả năng thuỷ phân protein của cc - Chymotrypsin và
papain đối với cơ chất thịt lợn biến tính ở nhiệt độ 50°c trong thời dan khác
nhau: 10 phút, 20 phút, 30 phút. Từ đó so sánh khả năng tiêu protein thịt lợn
biến tính giữa oc - Chymotrypsin và papain. Kết quả thu được thể hiện ở bảng

4.

20


Báng 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ thay đổi theo thòi gian gây biến tính cư
chất thịt lợn đối với khả năng thủy phân của a - Chymotrypsin và papain.
% protein bị thuỷ phân

Thời gian gây biến tính (phút)

a-chymotrỵpsm

papain

10

33,0

6,5

20

41,0

15,3

30

47,1

21,2

Ghi chú:

Kết quả trên là trung bình của 3 lần thí nghiệm.
a - Chymotrypsin sử dụng có hàm lượng 1 mg
Papain sử dụng có hàm lượng lOms.

Ta có đồ thị:
% protein bị thuỷ phân

— Papain -8—oc-Chymotrypsin
Hình 1: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ thay đổi theo thời gian
gây biến tính cơ chất thịt lợn đối với khả năng thuỷ phân của a Chymotrypsin và papaỉn.

Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy: Khả năng thuv phân protein thịt lợn
biến tính của a - chvmotrypsin tốt hơn papain. Thời gian 2;âv biến rinh càng

21


lâu, khả năng thủv phân của a - Chymotrypsin và papain càng tăng. Đối với cả
2 enzym, protein bị biên tính nhiều nhất ớ 30 phút và ít nhất ở 10 phút.
2.1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ acid gâv biến tính cơ chất thịt lợn đối với khả
năng thuỷ phân của (X - Chymotrypsin.

Với mục đích tìm hiếu ảnh hưởng của nồng độ acid gây biến tính cơ
chất thịt lợn đối với khả năng thuỷ phân của a - chvmotrypsin, chúng tôi tiến

hành thí nghiệm như sau: gâv biến tính cơ chất thịt lợn bằng acid HCl 15% để
đạt nồng độ gây biến tính là 5% trong thời gian 10 phút, 20 phút, 40 phút, 60
phút. Sau đó xác đinh khả năng thuỷ phân protein của a-chymotrypsin đối với
cơ chất thịt lợn đã biến tính trong cùng điều kiện. Kết quả thu được thể hiện ở
bảng 5.
Báng 5: Ảnh hưởng của nồng độ acid gây biến tính cơ chất thịt lợn đối
với khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin.

Thòi gian gày biến tính (phút)

1

Ghi chú:

1

% proteil* bỉ thuỷ phân

10

20,8

20

22,1

I

40

27,6

j

60

29,3

1

Kết quả trên là trung bình của 3 lần thí nghiệm;

a - Chymotrypsin sử dụng có hàm lượng img.

Từ kết quả trên cho thấy: Thời gian gây biến tính càng lâu, protein bị
biên tính càng nhiều thì khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin càng tăng,

ớ thời gian 10 phút, protein bị thuỷ phàn thấp nhất là 20,8%. ở thời gian 60
phút protein bị thuỷ phân cao nhất là 29,3%.
2.1.2.3. Anh hưởng của nồng độ kiềm gây biến tính cơ chất thịt lợn đối với
khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin.


Sử dụng dung dịch NaOH 30% để đạt nồng độ gây biến tính cơ chất thịt
lợn là 5% trong thời gian khác nhau 10 phút, 20 phút, 40 phút, 60 phút. Sau đó
xác định khả năng thuỷ phân protein thịt lợn biến tính của a-chymotrypsin
trong cùng điều kiện. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 6.
Báng 6: Ảnh hưởng của nồng độ kiểm gây biến tính cơ chất thịt lợn đối
với khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin.
Thòi gian gây biến tính (phứt)

% proteỉa bi thuỷ phản

10

31,3

20
40
60
Ghi chú:

ị
1
1
ỉ

44,8
47,1
52,8

Kết quả trên là trung bình của ba lần thí nghiệm;
oc - chymotrypsin sử dụng có hàm lượng lmg.

Qua bảng trên cho thấv cơ chất thịt lợn bị biến tính bằng kiềm mạnh
hơn bằng acid ở cùng một nồng độ gây biến tính và thời gian biến tính như
nhau. Thời gian gây biến tính càng lâu, khả năng thuỷ phân protein của a chymotrvpsin càng tăng, ở thời dan 10 phút, protein bị thuỷ phân thấp nhất là
31,3%. ở thời gian 60 phút, protein bị thuỷ phân cao nhất là 52,8%.
2.2. Khả năng tiêu protein của Papain đông khô:
2.2.1. Cơ chất lòng trắng trứng:
2-2.1.1. Anh hưởng của nhiệt độ gây biến tính cơ chất lòng trắng Irứns đối với
khả năng thuỷ phân của Papain:
Thí nghiệm đựơc tiến hành như sau: Gây biến tính cơ chất lòng trắng
trứng ở các nhiệt độ khác nhau 50°c, 70°c, 87°c, 100°c trong thời dan 10
phút. Sau đó xác định khả nãns thuỷ phân protein của Papain đối với cơ chất
cỉã biến tính trong cùniĩ điều kiện ở 37°c trong 30 phút.

23

1

í