Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường, ph và nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo

TRƯỜNG ĐAỊ HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN


CAO THỊ HỒNG NHUNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG
ĐƯỜNG, pH VÀ NHIỆT ĐỘ TỚI QUÁ TRÌNH
LÊN MEN VANG TÁO MÈO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC

Người hướng dẫn khoa học
Th.S Nguyễn Khắc Thanh

Hà Nội, tháng 5 năm 2010


MỤC LỤC
A. Lý do chọn đề tài

1

B. Mục tiêu nghiên cứu

3

C. Đối tƣợng nghiên cứu

3

D. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của công trình

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tìm hiểu chung về rƣợu vang

4

1.2.

Hệ vi sinh vật tham gia quá trình lên men vang

8

1.3.

Dinh dƣỡng nấn men

12

1.4.

Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trìn lên men vang

14

1.5.

Men giống trong sản xuất rƣợu vang

15

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị, hoá chất

18

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

19

2.3. Phạm vi nghiên cứu

20

2.4. Địa điểm nghiên cứu

20

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của nấm men lên men vang
táo mèo

21

3.2. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae M2 trên môi trƣờng nhân giống

26

3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của mộ số yếu tố tới sự phát triển của
chủng Saccharomyces cerevisiae M2
3.4. Nghiên cứu động thái của quá trình lên men vang táo mèo

28
31

3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố tới quá trình lên men
vang táo mèo
3.6. Ứng dụng lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm

33
38


3.7. Quy trình công nghệ lên men vang táo mèo

39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

44

DANH MỤC
Bảng 1.1. Thành phần chủ chốt trong dịch quả nho

6

Bảng 1.2. Thành phần hoá học của dịch quả táo mèo

7

Bảng 1.3. Vi sinh vật làm hỏng hoặc làm giảm chất lƣợng rƣợu vang
Bảng 1.4. Một số thành tựu trong nghiên cứu chủng giống và công

10
17

nghệ lên men rƣợu vang
Bảng 3.1. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của 3 chủng nấm men 22
Bảng 3.2. Khả năng lên men của 3 chủng nấm men

23

Bảng 3.3. Khả năng kết lắng của 3 chủng nấm men

23

Bảng 3.4. Khả năng tạo hƣơng thơm và độ trong của sản phẩm

24

Hình 3.1. Khuẩn lạc chủng M2

24

Hình 3.2. Chủng M2 trên kính hiển vi quang học độ phóng
đại 1000 lần
Hình 3.3. Chủng nấm men M2 trên trƣờng thạch nghiêng

25
25

Đồ thị 3.1. Động thái phát triển của chủng nấm men Saccharomyces
cerevisiae M2 trong môi trƣờng nhân giống

27

Đồ thị 3.2. Ảnh hƣởng của pH tới quá trình nhân giống chủng
Saccharomyces cerevisiae M2
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình nhân giống

29
30

Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ vô cơ tới quá trình nhân giống 30
Bảng 3.7. Sự biến đổi hàm lƣợng đƣờng và cồn trong quá trình
lên men vang táo mèo
Đồ thị 3.3. Động thái của quá trình lên men vang táo mèo

31

32

Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng tới quá trình lên men vang
táo mèo

34


Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của pH tới quá trình lên men vang táo mèo

35

Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình lên men
vang táo mèo
Bảng 3.11. Kết quả phân tích rƣợu thành phẩm

37
38


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

MỞ ĐẦU
A. Lí do chọn đề tài
Rượu là một trong những sản phẩm lên men đã được sủ dụng rất sớm ở
nhiều nơi trên thế giới. Con người đã biết nấu rượu trước khi Louis Paster
khám phá ra bản chất của quá trình lên men (1854 – 1864), trước khi biết
được chính vi sinh vật là tác nhân thực hiện quá trình biến đổi đường thành

rượu.
Khác với rượu trắng và các loại rượu pha chế, rượu vang là loại đồ uống
lên men trực tiếp từ hoa quả. Khi quá trình lên men kết thúc, người ta không
chưng cất mà để lắng trong tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm. Rượu
vang vốn có nguồn gốc từ nho, nên có tên gọi là “Vin” hoặc “Wine”, ngày
nay người ta mở rộng ý nghĩa của rượu vang là rượu không chưng cất từ các
loại nước quả. Mặc dù, nho là nguyên liệu chính nhưng một số nguyên liệu
khác như táo, đào, dâu… đôi khi cũng được sử dụng. Thông thường rượu
vang chứa 85-89% nước, khoảng 10-14% ethanol, dưới 1% acid (nguồn gốc
hoa, quả) và hàng trăm loại chất tạo hương khác nhau ở nồng độ rất thấp.
Khác với đa số các loại đồ uống khác, rượu vang rất khó hỏng và hầu như
không bao giờ là tác nhân truyền nhiễm bệnh tật. Nồng độ cồn có trong rượu
vang ở mức có thể diệt đa số các loại vi sinh vật gây bệnh và nhìn chung uống
rượu vang an toàn hơn nước, hoặc sữa (tất nhiên nếu không uống quá mức
cần thiết). Chính vì lí do này, nhiều nền văn minh đã coi rượu vang là quà của
Thượng đế ban tặng nhằm chống lại bệnh tật.
Mỗi nước đều có sản phẩm vang nổi tiếng và đã trở thành thương hiệu cả
thế giới biết đến như rượu vang của Pháp, Bồ Đào Nha, Mỹ, Hà Lan… với
các loại rượu nổi tiếng như Brandy, Port, Champagne, Venmouth. Ở Việt
Nam, ngành rượu vang mới thực sự bắt đầu từ những năm 80 của thế kỉ XX
Cao Thị Hồng Nhung

1

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

và được đánh dấu băng sự xuất hiện của nhà máy vang Thăng Long, sau đó là
vang Đà Lạt, vang Gia Lâm…
Đa số rượu vang trên thế giới được sản xuất từ nho. Tuy nhiên, Việt Nam
nằm trong khu vực nhiệt đới, không thích hợp cho cây nho phát triển, diện
tích nho ít, sản lượng thấp, vì vậy giá thành cao. Nhưng Việt Nam lại có rất
nhiều các loại quả khác, nhiều về số lượng, phong phú về chủng loại mà giá
thành lại rẻ nên việc sản xuất rượu vang từ các loại quả này là rất cần thiết.
Để tạo ra một loại rượu vang đặc trưng của Việt Nam, chúng tôi đã tiến
hành tìm kiếm nguồn nguyên liệu để lên men vang. Trong quá trình tìm kiếm,
chúng tôi nhận thấy, ở miền núi phía Tây Bắc nước ta có cây táo mèo cho quả
có hương vị rất thơm ngon và đặc trưng. Tổng diện tích cây táo mèo vẫn tiếp
tục tăng trong những năm gần đây nhưng chưa được sử dụng một cách triệt
để. Thông qua việc phân tích sơ bộ một số chỉ tiêu, chúng tôi nhận thấy quả
táo mèo rất có triển vọng trong việc sử dụng làm nguồn nguyên liệu để sản
xuất vang.
Hiện nay rượu vang táo mèo chưa được sản xuất rộng rãi do một số yêu
cầu kĩ thuật cũng như chất lượng của sản phẩm lên men. Nghiên cứu bản chất
sinh lí, sinh hoá của quá trình lên men vang táo mèo nhằm tuyển chọn được
chủng có khả năng lên men vang tốt, khảo sát các nhân tố ảnh hưởng tới quá
trình lên men vang táo mèo nhằm nâng cao hiệu suất lên men và chất lượng
sản phẩm phù hợp với tình hình sản xuất ở nước ta là một vấn đề rất cần thiết.
Với những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu trên quy mô
phòng thí nghiệm công trình mang tên: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm
lượng đường, pH, nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo”.

Cao Thị Hồng Nhung

2

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

B. Mục đích nghiên cứu
1. Phân lập và tuyển chọn được chủng nấm men có khả năng lên men
vang táo mèo từ dịch chiết táo mèo.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình nhân giống.
3. Xác định động thái lên men vang táo mèo.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường, pH và nhiệt độ tới quá
trình lên men vang táo mèo.
5. Lên men rượu vang táo mèo trên quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng
quy trình lên men.
C. Đối tƣợng nghiên cứu
+ Quả táo mèo (Docynia indica), họ hoa hồng (Rosaceae).
+ Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae phân lập từ dịch táo mèo
có khả năng lên men vang táo mèo.
D. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của công trình
+ Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu đặc tính sinh lí, sinh hoá của chủng
nấm men có khả năng lên men vang táo mèo. Đây là dẫn liệu góp phần bổ
sung cho các nghiên cứu về nấm men và ứng dụng của nấm men trong đời
sống.
+ Tận dụng nguồn nguyên liệu có sẵn trong địa phương, nâng cao thu
nhập cho đồng bào vùng cao, sản xuất một loại vang phù hợp với thị hiếu của
người tiêu dùng, góp phần làm phong phú thêm thị trường vang trong nước.

Cao Thị Hồng Nhung

3

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tìm hiểu chung về rƣợu vang

1.1.1. Khái niệm về rượu vang
Rượu vang là một loại sản phẩm lên men không qua chưng cất từ nước
ép các loại hoa quả như nho, dứa, mơ, dâu, vải…
Thành phần chủ yếu của rượu vang gồm có:
Tanin
Chất tanin trong rượu được chiết xuất từ hạt, vỏ và cuống nho. Đây là
một yếu tố quan trọng quyết định thời gian ủ rượu tuỳ theo hàm lượng tanin
có trong rượu nhiều hay ít. Nó là một chất bảo quản tự nhiên có trong nho.
Tanin làm nên kết cấu và là thành phần chính của rượu.
Axit
Nếu thành phần axit ở trong rượu quá ít nó sẽ làm cho người uống cảm
thấy chán đặc biệt là rượu ngọt. Còn nếu quá nhiều axit rượu sẽ trở nên chua
gắt và không thể uống được. Mức độ axit có thể cảm nhận được bằng miệng
bởi vị chua trong rượu.
Cồn

Cồn là sản phẩm của quá trình lên men đường tự nhiên trong nho. Hàm
lượng đường trong nho sẽ quyết định nồng độ cồn của rượu. Nếu nho không
chín, hàm lượng đường rất ít do vậy rượu chỉ có độ cồn từ 7-8o. Tuy nhiên, ở
những nơi có khí hậu ẩm, nồng độ cồn sẽ phụ thuộc không hoàn toàn vào
đường mà cả nấm men bởi vì khi rượu đạt tới 14o cồn thì nấm men sẽ ngưng
phát triển và chết.
Mùi vị
Vị của rượu rất đa dạng, nó tuỳ thuộc vào giống nho (được trồng ở đâu,
vụ thu hoạch, thời tiết năm đó thế nào, thời điểm thu hoạh, quy trình sản
xuất…)
Cao Thị Hồng Nhung

4

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.1.2. Phân loại rượu vang
Có rất nhiều cách để phân loại rượu vang:
- Căn cứ vào màu sắc, có thể chia rượu vang thành:
+ Vang trắng: lên men từ nước ép nho trắng hoặc nước ép nho đỏ
+ Vang đỏ: lên men từ nho đỏ có xác quả
+ Vang hồng: lên men từ nho đỏ và xác quả nhưng thời gian tiếp xúc
giữa xác quả và dịch ép ngắn hơn.
- Căn cứ vào lượng đường còn lại trong rượu có:
+ Vang chát hay vang khô (hết đường ): thường uống giữa bữa ăn, vừa

ăn vừa uống.
+ Vang ngọt (còn đường ): dùng uống sau bữa ăn.
Ngoài ra người ta còn chia rượu vang thành loại co gas và vang không có
gas.
1.1.3. Nguyên liệu sản xuất rượu vang
Nguyên liệu làm rượu vang là các loại quả. Quả chín (có thể chưa thật
chín) sau khi thu hoạch chọn loại quả tươi, chất lượng tốt đem ép lấy nước
hoặc ngâm với đường để thu được dịch nước quả dùng cho lên men.
Tất cả các loại quả đều có đường, nhiều vitamin, nhiều axit hữu cơ,
trong đó có nhiều vitamin C, có đầy đủ chất khoáng và một lượng protein
đáng kể. Ngoài ra, nước quả còn chứa tanin, pectin. Trong các loại quả dùng
làm rượu trước hết phải kể đến nho.
Nho: Trong số các loại quả, nho là loại quả lí tưởng nhất để chế rượu
vang.

Cao Thị Hồng Nhung

5

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Bảng 1.1. Thành phần chủ chốt trong dịch quả nho[12]
Thành phần

Nồng độ, đặc điểm

Nguồn cacbon
Glucose

75-150gl-1

Fructose

75-150gl-1

Sucrose

Vết

Pentose

Không lên men được bởi Saccharomyces

Pectins

cerevisiae
Lượng nhỏ

Nguồn nitơ
Axit amin tự do

0,2-2,5gl-1

Ion ammoni

Lượng nhỏ, thường thiếu cho nấm men

Protein

Lượng nhỏ

Acid hữu cơ
Acid tartaric

2-10gl-1

Acid malic

nấm men rượu vang không dùng được
1-8gl-1 : có thể sử dụng một phần bởi nấm men

Khoáng chất
P, K, Mg,S, nguyên tố vi Các yếu tố đa lượng và vi lượng đầy đủ
lượng
Vitamin

Nồng độ thấp nhưng đủ cho nấm men

Những thành fần khác

Nồng độ sulphite thường cao
Sterol và acid béo không no có thể là yếu tố
hạn chế

Cao Thị Hồng Nhung

6

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Dứa: cũng là nguyên liệu tốt để chế rượu vang, trong nước dứa lượng
đường cũng khá cao, khi lên men thêm ít đường. Vang dứa không giữ được
hương vị thơm ban đầu của nước quả.
Mơ: là loại quả sản xuất vang rất tốt. Vang mơ thơm ngon có thể là một
vị thuốc an thần và chữa bệnh đường ruột.
Táo mèo: có rất nhiều triển vọng trong sản xuất rượu vang
Bảng 1.2. Thành phần hoá học của dịch quả táo mèo[8]
Thành phần hoá học
Đường tổng số

4,82 (%)

Axit tổng số

1,48 (%)

Vitamin C

11,4 (mg/l)

Nước

85,1 (%)

Protein toàn phần

0,92 (%)

pH

3,0

1.1.4. Tàng trữ rượu vang [10]
Nếu bảo quản đúng cách rượu vang có thể được tàng trữ trong nhiều năm
mà không bị hỏng và mất phẩm chất. Yếu tố quan trọng nhất là hạn chế tiếp
xúc với không khí. Sự có mặt của oxy trong không khí có thể khiến vi sinh
vật phát triển trên bề mặt và tạo những hương vị không mong muốn, như tạo
vị chua của dấm. Oxy cũng khiến rượu vang mất màu và mùi. Nhằm tránh
những biến đổi không mong muốn kể trên, khả năng tiếp xúc của vang với
không khí cần được hạn chế tối đa. Thông thường vang được chứa đầy kín
trong các thùng chứa nhằm hạn chế khoảng trống trong thùng. Trong quá
trình tàng trữ người ta thường bổ sung rượu vang vào những thùng chứa nhằm
bù nấp khoảng trống xuất hiện khi rượu vang bị bay hơi. Thông thường chai
Cao Thị Hồng Nhung

7

K32D - Sinh KTNN

Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

rượu vang được bảo quản ở trạng thái nằm ngang nhằm đảm bảo tiếp xúc trực
tiếp giữa rượu vang và nút. Điều này sẽ hạn chế việc nút bị khô và khả năng
thẩm thấu của không khí qua các khe hở tạo ra trên nút khô nứt. Vang đóng
chai có thể bảo quản hàng chục năm trong hầm chứa ở nhiệt độ thấp (khoảng
160C).
1.2. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang
1.2.1. Nấm men
1.2.1.1. Cấu tạo và hình thái tế bào nấm men
Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào và
thường sinh sôi nảy nở bằng lối nảy chồi. Nấm men phân bố rộng rãi trong tự
nhiên như đất, nước, không khí, hoa quả, thực phẩm. Nấm men được sử dụng
trong các ngành công nghiệp thực phẩm do sinh khối của chúng giàu protein
và vitamin…nấm men được sử dụng làm nở bột mì, gây hương nước chấm,
sản xuất một số dược phẩm.
Nấm men thuộc loài Saccharomyces là đối tượng chính tham gia vào
quá trình chuyển hoá đường thành rượu. Nấm men có cấu tạo đơn bào nhưng
phức tạp hơn vi khuẩn. Tế bào Saccharomyces được bao bọc bởi một lớp
thành tế bào, là cơ quan bảo vệ và duy trì hình dạng tế bào. Thành tế bào còn
có khả năng kết dính, có ý nghĩa lớn trong công nghiệp sản xuất bia rượu.
Thành có thành phần hoá học chủ yếu là hemixenluloza chiếm 70% trọng
lượng khô (31% manman, 29% glucan), ngoài ra còn chứa 1-3% kitin, 6-10%
protein, 8-8,5% lipit, 7% chất khoáng.
Thành phần nội bào quan trọng của nấm men là ty thể, không bào và
nhân. Ty thể của nấm men có dạng hạt, có thể thay đổi tuỳ điều kiện nuôi cấy
cũng như trạng thái sinh lí của tế bào. Số lượng ty thể khoảng 10-20 ty thể/ 1
tế bào. Kích thước ty thể khoảng 0,2-0,6µm, có màng bao bọc trong suốt,

mỏng 60-80Ao, có tình thấm cao. Không bào được hình thành từ thể Golgi
Cao Thị Hồng Nhung

8

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

hay mạng lưới nội chất. Không bào có tính thấm cao và là nơi tích luỹ các sản
phẩm trao đổi chất. Không bào chứa một hệ thống keo bao gồm cả điện tử,
enzym, protein, hydrocacbon, các muối canxi, kali, phenolflavin, ribofalvin,
axit nucleic và các chất dự trữ khác. Hình dạng của không bào thường thay
đổi do sự co rút của chất nguyên sinh. Trong không bào thường xảy ra các
phản ứng oxi hoá khử nhờ hệ thống xitocrommoxidaze. Nhân của tế bào nấm
men có hình ovan, hình tròn, nằm gần không bào trung tâm với kích thước
khoảng 2-4μm. Nhân tế bào được bao bọc bởi 2 lớp màng, mỗi màng có cấu
trúc như màng cơ sở. Những lớp này có liên hệ với nhau ở gần lỗ màng nhân.
Nhân chứa toàn bộ hệ gen tham gia điều khiển quá trình sinh tổng hợp của tế
bào nấm men.
Tế bào nấm men đa số có cấu tạo hình cầu, hình trứng hoặc hình ovan.
Kích thước tế bào khoảng 3-10μm x 5-12μm. Hình dạng và kích thước tế bào
điển hình chỉ được tạo ra trong điều kiện môi trường phù hợp. Khi điều kiện
bất lợi thì hình dạng, kích thước tế báo sẽ bị biến dạng (khi môi trường nghèo
dinh dưỡng, tế bào nấm men có hình đế giày).
1.2.1.2. Sinh sản của tế bào nấm men
Trong điều kiện bình thường, tế bào nấm men sinh sản bằng lối nảy chồi.

Trong điều kiện không thuận lợi một số có thể chuyển sang sinh sản bằng bào
tử. Sinh sản nảy chồi ở nấm men là hình thức phổ biến nhất. Khi tế bào phát
triển đến một mức độ nhất định thì trên cơ thể của nó đâm ra một chồi nhỏ gọi
là mầm. Mầm (tế bào con) đâm ra ở vị trí lệch tâm, trên đầu của tế bào mẹ .
Cùng lúc đó, tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều chồi ở nhiều phía khác nhau, ở
mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất nhân và chất nguyên sinh của tế bào
mẹ. Sau khi nảy mần, tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ sống độc lập,
cũng có thể không tách khỏi tế bào mẹ để tạo ra một tập hợp tế bào nấm men

Cao Thị Hồng Nhung

9

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

hình cành cây. Trong điều kiện thuận lợi, chỉ 20-30 phút có một thế hệ tế bào
con được hoàn chỉnh.
Nấm men Saccharomyces có khả năng hình thành bào tử. Bào tử túi
được sinh ra trong các túi nhỏ gọi là túi nang, mỗi túi nang chỉ chứa 1-8 bào
tử. Nấm men Saccharomyces được hình thành theo lối sinh sản vô tính. Đó là
quá trình tạo bào tử trực tiếp từ một tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào
tử túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành một tế bào
nấm men. Tiếp theo, tế bào này lại sinh sản theo lối nảy chồi.
1.2.2. Vi khuẩn
Trong dịch siro và trong rượu vang có thể phát triển những dạng vi

khuẩn có tính ổn định lớn với rượu và axit hữu cơ.
Chúng có thể là nguyên nhân gây nên những biến đổi sâu sắc trong rượu
vang về vị chua, mùi, có loại còn gây đục vang. Đó thường là các loại vi
khuẩn: Acetobacter xylium, Acetobacter aceti. Louis Paster đã tìm ra cơ chế
làm hỏng vang khi rượu vang tiếp xúc với không khí có vi khuẩn Bacillus. Do
vậy, để bảo quản rượu vang người ta có thể thanh trùng Pasteur. Nhưng
phương pháp này có thể làm mất chất lượng của rượu vang. Ngoài ra, người
ta còn dùng phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản như SO2
[10].
1.2.3. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở quả chát bã của rượu vang, thùng thiết bị hoặc
trong không khí. Một số loaị nấm mốc hay gặp thuộc chi: Rhizopus,
Aspergillus.
1.2.4. Vi sinh vật làm hỏng vang
Có không ít các vi sinh vật làm cho vang bị đục, bị chua gắt, có mùi khó
chịu, làm cho vang bị hỏng.
Bảng 1.3. Vi sinh vật làm hỏng hoặc làm giảm chất lƣợng rƣợu vang[12]
Cao Thị Hồng Nhung

10

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Vi sinh vật

Hiệu ứng gây hỏng

Nấm men nội sinh

Biến chất theo hướng este, tạo quá nhiều etyl axetat và
metybutyl.
Tạo màng trên bề mặt và làm hỏng rượu vang.

Nấm men từ bên ngoài
Zygosaccharomyces bailii

Phát triển và lên men đường sót trong vang tàng trữ,
gây đục và mất hương

Brettanomyces spp

Gây đục, mùi axit, tạo mùi hôi khó chịu trong vang tàng
trữ.
Đôi khi gây nổ chai vang ga bởi khí CO 2

Schizosacchromyces pombe

Nấm men chịu áp suất thẩm thấu cao, gây đục rượu bảo
quản

Saccharomyces cerevisiae

Tái lên men đường sót

Vi khuẩn

Vi khuẩn axetic:

Mùi dấm khi nồng độ axit axetic >1,2g/l

Gluconobacter oxydans,

Một số este và axit khác sinh ra trong quá trình sinh

Acetobacter pasteurianus,

trưởng hiếu khí.

Acebacter aceti

Làm quánh nhớt vang

Vi khuẩn lactic

Những vi kuẩn này tương đối mẫn cảm với etanol
nhưng cũng có thể làm tăng độ axit (axetic và lactic)
(chủ yếu bởi nhóm lên men dị hình Lactobacillus và
Leuconostoc spp).
Tạo vị mannitol (chủ yếu bởi Lactobacillus brevis).
Quánh nhớt (Pediococcus cerevisiae).
Sinh diacetyl (Pediococus và Lactobacillus spp).
Mùi hôi (Lactobacillus spp).

Clostridium spp

Ít khi làm hỏng vang nhưng đôi khi có thể tạo mùi axit

n-butyric trong rượu có độ axit thấp.

Bacillus spp

Một số loài có thể mọc trong vang và sinh axit

Actinomyces spp,

Sinh mùi đất ẩm

Streptomyces spp

Cao Thị Hồng Nhung

11

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Bacteriophages

Ngăn cản lên men malolactic

Nấm mốc

Mùi đất ẩm do nấm mọc trên thùng gỗ hoặc trên nút.

1.3. Dinh dƣỡng nấm men
1.3.1. Nguồn dinh dưỡng cacbon
Nguồn dinh dưỡng đối với nấm mem gồm có: đường và dẫn xuất, các
loại rượu, axit hữu cơ, axit amin, pectin, hydratcacbon… Đa số các loài nấm
men rượu vang lên men được đường glucoza, fructoza, saccarozo, galactoza.
Các axit hữu cơ chiếm vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm men:
chúng có thể ức chế hoặc kích thích sinh trưởng, cũng có thể là nguồn cacbon
và năng lượng duy nhất trong hoạt động sống của nấm mem.
Tất cả các sản phẩm trung gian của chu trình Krebs nấm men có thể sử
dụng như là nguồn cacbon duy nhất. Song tốc độ sinh trưởng ở các môi
trường này thấp hơn so với môi trường glucoza.
1.3.2. Dinh dưỡng nitơ
Nguồn dinh dưỡng nitơ như axit amin, protein, các nucleôtit purin và
pyrimidin và một số vitamin, cần phải có mặt ở trong môi trường ở dạng hữu
cơ hoặc vô cơ. Phần lớn nấm men không đồng hoá được nitrat. Nguồn nitơ vô
cơ được nấm men đồng hoá tốt là amoni sunfat. Để có thể thu được một lượng
lớn sinh khối Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện hiếu khí cần phải có
nguồn hữu cơ cũng như vô cơ. Một tỉ tế bào nấm men có thể đồng hoá 4-7 mg
nitơ. Nguồn nitơ rất cần thiết cho cấu tạo tế bào, sinh sản và sinh trưởng của
nấm men.
1.3.3. Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ
* Photpho: có trong thành phần những hợp chất quan trọng nhất của tế
bào: nucleotit, axit nucleic, polyphotphat, photpholipit. Hợp chất photpho
đóng một vai trò xác định trong các chuyển hoá vật chất đặc biệt là trong trao
đổi chất cacbon và vận chuyển năng lượng. nấm men sử dụng tốt nguồn
Cao Thị Hồng Nhung

12

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

photpho vô cơ là ortophotphat. Nguồn này có thể biến thành polyphotphat và
sau khi hoạt hoá được sử dụng cho các quá trình sinh tổng hợp. Thiếu
photphat trong môi trường dẫn đến sự thay đổi đáng kể trao đổi chất ở nấm
men liên quan đến sự phá hỏng nhu cầu và hấp thụ cacbon cũng như nitơ.
* Lưu huỳnh: có trong thành phần của protein và nhóm phụ (trừ SH)
của một số enzym, coenzym A. Do vậy, nếu thiếu lưu huỳnh trong môi trường
sẽ phá hỏng sự trao đổi chất và tổng hợp protein. Những hợp chât chứa lưu
huỳnh đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của nấm men: các aa
(sixtein, sixtin, metionilin), các vitamin (tiamin và biotin) và những hợp chất
khác.
Một lượng nhỏ lưu huỳnh cũng làm tăng lực nảy chồi của nấm men,
nhưng tới 1mg/l đã làm cho quá trình này bị ngừng trệ, do vậy lưu huỳnh
nguyên tố còn lại trong vang non là điều đặc biệt nguy hiểm, vì nó được dùng
cho lên mem thứ cấp.
* Canxi và kali cần thiết cho sự hoạt động của một số enzym. Ca và K
tham gia vào trung tâm hoạt động của các enzym này và đồng thời có mặt ở
các chất ức chế các enzym.
* Các nguyên tố vi lượng có ảnh hưởng đến sinh trưởng và lên men.
Mangan với nồng độ 1mg/l làm tăng lực hô hấp, ở 45-90mg/l làm tăng lực lên
mem, tăng sinh tổng hợp enzym esteaza của nấm men. Mo tăng khả năng sinh
sản, Bo tăng khả năng lên men. Hỗn hợp nguyên tố vi lượng Li, Rb, Ni và Co
làm tăng lượng sinh khối đáng kể.
1.3.4. Các nhân tố sinh trưởng

Đây là các chất kích thích sinh trưởng, gồm có vitamin, các axit amin,
các bazo purin và pirimidin. Có 6 vitamin nhóm B là nhân tố cơ bản kích
thích sinh trưởng các nấm men không màu (những nấm men không sinh ra sắc

Cao Thị Hồng Nhung

13

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

tố): inozit (vitamin B8 ), biotin (vitamin B7), axit pantotenic (vitamin B3),
tiamin (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6 ), axit nicotinic (vitamin B5, PP).
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình lên men vang
1.4.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ có tác dụng rõ rệt đến khả năng lên men của chủng nấm men
và chất lượng của vang (độ rượu, đường sót, chất thơm). Lên men rượu vang
thường thực hiện ở nhiệt độ 10-300C. Chúng ta cũng xác định được rằng, ở
nhiệt độ cao lên men bắt đầu sớm, xảy ra mạnh mẽ nhưng dễ bị ngừng lại
ngang chừng và kết thúc lên men khi đường sót còn lại ở dịch lên men là khá
lớn. Nhiệt độ có ảnh hưởng không những đến cường độ lên men, tốc độ sinh
sản của men giống mà còn đến sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp.
Giữa nhiệt độ và độ hiếu khí có mối liên quan. Sinh trưởng nấm men xảy
ra nhanh ở những ngày đầu tiên với điều kiện hiếu khí và nhiệt độ 25-300C.
Nấm men chịu lạnh rất tốt. Nếu cấy chuyền với nhiệt độ thấp dần chúng
có thể sống ở nhiệt độ -2000C. Ở 00C một số loài còn sinh sản chậm và gây

lên men [10].
1.4.2.Oxy của không khí
Oxy cần cho tế bào nấm men sinh sản. Nếu trong môi trường chỉ có 1mg
oxy trong 1lít thì sự sinh sản bị ngừng lại. Oxy là một trong những nhân tố cơ
bản xác định sự sinh sản của nấm men. Trong môi trường càng nhiều tế bào
nấm men càng lên men mạnh. Sinh trưởng và phát triển của nấm men trong
thời gian lên men rượu vang phụ thuộc vào số lượng oxy của không khí. Oxy
cần cho lên men vang ở một vài giai đoạn, đặc biệt ở giai đoạn sinh trưởng
logarit, đưa không khí vào môi trường sẽ nâng cao được nồng độ tế bào và
phần trăm đường đầu lên men.
1.4.3. Đường
Cao Thị Hồng Nhung

14

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Trong dịch quả hàm lượng đường không lên men tới 20% tổng lượng
đường. Như vậy, nồng độ đường còn sót lại là khá cao trong lên men và làm
chất ức chế cho việc tạo thành rượu.
1.4.4. Độ axit của môi trường
Trong quá trình lên men pH môi trường luôn biến đổi. Ở giai đoạn cuối
pH hơi tăng do nấm men tự phân huỷ giải phóng NH3.
1.4.5. Các chất phenol
Các loài thuộc giống Saccharomyces chịu được polyphenol tương đối

cao. Trong dịch có hàm lượng cồn cao (11%V) tất cả các axit phenolcacbonic
kìm hãm quá trinh lên men và gây thoái hoá tế bào nấm men.
1.4.6. Khí CO2.
Dưới áp suất của khí CO2 sinh trưởng của nấm men và lên men hầu như
không bị ảnh hưởng. Dưới áp lực dư của CO2 những tế bào nấm men rượu
vang tăng kích thước là đáng kể và ngả sang hình tròn. CO2 như là một chất
trao đổi, trong nồng độ xác định nó có tác dụng kìm hãm hoặc làm ngừng sinh
sản của nấm men. Lượng CO2 khi hoà tan vào môi trường có ảnh hưởng đến
phát triển của nấm men. Trên cơ sở này người ta đã dự trữ dịch quả trong các
thùng kín dưới áp suất CO2. Một lít dịch quả cần có 15g CO2 hoà tan.
1.5. Men giống trong sản xuất rƣợu vang [10]
* Giống ban đầu hay giống khởi động dùng ở quy mô nông trại thường
được lưu trữ từ các mẻ lên men truyền thống từ nhiều năm. Qua sàng lọc và
tuyển chọn nhiều nông trại đã có giống ban đầu tương đối thuần khiết của
chủng Saccharomyces cerevisiae. Trước khi sử dụng làm giống khởi động cần
phải hoạt hoá. Giống khởi động cần có những đặc tính sau:
-

Di truyền: đồng hình nhị bội (thường là đa bội)

-

Phát triển: pha khởi động ngắn hoặc không có; chịu SO2

Cao Thị Hồng Nhung

15

K32D - Sinh KTNN

Khóa luận tốt nghiệp
-

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Trao đổi chất: lên men nhanh và ổn định, hiệu suất chuyển hoá

đường thành ethanol cao
-

Hương vị: nồng độ axit bay hơi hợp lí; thành phần hương vị phù

hợp; axetaldehit thấp; thành phần các hợp chất chứa lưu huỳnh cân đối.
-

Đặc điểm khác: bài tiết ure ngoại bào thấp (nhằm hạn chế khả năng

sinh hợp chất ethyl carbamate có khả năng gây ung thư).
* Nhân giống từ giống thuần chủng:
Giống thuần chủng được giữ ở các ống thạch nghiêng.Giống men được
cấy truyền vào môi trường lỏng là dịch quả như trên vài lần, rồi nhân tăng dần
để có đủ lượng giống đưa vào sản xuất.
* Cũng có thể dùng lại giống sau thời gian lên men chính. Các tế bào
nấm men lắng xuống đáy thùng được lấy ra và xử lí.
* Dùng hệ nấm men tự nhiên bám vào vỏ quả khi thu hoạch để lên men.
Quả thu hai về, giữ sạch sẽ, không rửa, ép lấy dịch. Trước khi lên men cần
sunfit hoá dịch quả để diệt men dại, nấm mốc và các tạp khuẩn khác. Trong
điều kiện thích hợp giống men rượu vang sẽ phát triển vượt trội và cho các mẻ
lên men tốt.

Ở các nước có nghề làm rượu vang truyền thống từ lâu đời hệ vi sinh vật
rượu vang rất phong phú, nhất là các men rượu vang có thể phát tán rất rộng,
bám vào trên bề mặt vỏ quả, lưu trữ trong đất, cũng như trên bề mặt dụng cụ
chứa đựng và thiết bị sản xuất. Côn trùng (nhất là ruồi giấm) cùng với gió làm
phát tán nấm men. Thành tựu của công nghệ sinh học và công nghệ lên men
đã ảnh hưởng lớn tới lên men rượu vang. Công nghệ tái tổ hợp ADN có ý
nghĩa đặc biệt quan trọng và có triển vọng to lớn đối với việc nâng cao chất
lượng chủng giống và chất lượng sản phẩm.

Cao Thị Hồng Nhung

16

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Bảng 1.4. Một số thành tựu trong nghiên cứu chủng giống
và công nghệ lên men rƣợu vang [12]
Hƣớng nghiên cứu

Thành tựu cụ thể
Đánh giá đa hình di truyền sử dụng RFLP, RAPD-PCR

Xác

định

chủng và karyo (PFGE) được ứng dụng trong việc phân biệt

giống

các chủng S. cerevisiae

Lai giống

Khả năng kết lắng của chủng giống được cải thiện

ADN tái tổ hợp

Nhiều gen từ các vi sinh vật khác hoặc các chủng
khácđược chuyển vào nấm men S. cerevisiae, trong đó
có các gen mã hoá:
K1 (killer) toxin, nhằm đối phó với các chủng hoang
dại
Pectinase nhằm cải thiện khả năng lọc trong rượu vang
Glucoanaase nhằm giải phóng các hợp chất thơm
terpenes từ dạng gluside
Lactate dehydrogenase nhằm cải thiện lên men hỗn
hợp và axit hoá
Glycerol phosphatase nhằm tăng nồng độ glycerol

Cao Thị Hồng Nhung

17

K32D - Sinh KTNN

Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị và hoá chất
2.1.1. Nguyên liệu chính
- Quả táo mèo thu nhận từ hai tỉnh Yên Bái và Sơn La.
- Chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch siro quả táo mèo có
vị trí phân loại:
+ Lớp: Hemiascomycetes
+ Bộ: Endomycetales
+ Họ: Saccharomycetaceae
+ Giống: Saccharomyces
+ Loài: cerevisiae
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
2.1.2.1. Hoá chất
Một số hoá chất được sử dụng: MgSO4, KH2PO4, (NH4)2SO4,
(NH4)2 HPO4, axit xitric, K2S2O5, các loại muối nitrat, các loại đường.
2.1.2.2. Thiết bị
2.1.3. Các loại môi trường
2.1.3.1. Môi trường Hansen (môi trường 1) g/l
1. Đường glucoza:

50g

2. Pepton:

5g

3. MgSO4.7H2O:

0,5g

4. KH2PO4:

1g

Cao Thị Hồng Nhung

18

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

5. (NH4)2SO4:

1g

6. Thạch aga:

20g

7. Nước:

1000ml

2.1.3.2. Môi trường nhân giống (môi trường 2) g/l
1. Đường glucoza: 50g
2. Pepton:

5g

3. MgSO4.7H2O:

0,5g

4. KH2PO4:

1g

5. (NH4)2SO4:

1g

6. Nước:

1000ml

2.1.3.3. Môi trường lên men (môi trường 3)`
1. Dịch siro táo mèo pha loãng với nước cất để đạt hàm lượng đường
ban đầu là 220g/l.
2. MgSO4.7H2O

0,5 g

3. KH2PO4:

1g

4. (NH4)2SO4:

1g

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh: phân lập, tuyển chọn chủng nấm men dựa
trên việc nghiên cứu hình thái tế bào nấm men, xác định số lượng tế bào nấm
men, hoạt lực lên men.
2.2.2. Phương pháp hoá sinh: xác định hàm lượng acid bằng chuẩn
độ với NaOH có chỉ thị là phenolphtalein, hàm lượng đường theo phương
pháp Bectơrand và đo trên đường kế, hàm lượng rượu xác định bằng đo độ
rượu alcol kế.
2.2.3. Phương pháp phân tích cảm quan

Cao Thị Hồng Nhung

19

K32D - Sinh KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.2.4. Phương pháp xử lí các kết quả thu được bằng phần mền Excel
và thống kê toán học

Giá trị trung bình số học:
n

Xi
X

i 1

n

Độ lệch chuẩn:
n

(Xi

X)

2

i 1

; (n 30)

n 1

Sai số trung bình:
m

n

Trong đó:
n: Số lần thí nghiệm
Xi : chỉ số thực nghiệm của lần thứ i (1 i n)
Phạm vi nghiên cứu.

2.3.

- Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae tuyển chọn trên đối
tượng là quả táo mèo.
Nghiên cứu động thái của quá trình lên men vang và ảnh hưởng của hàm
lượng đuờng, pH và nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo.
- Tiến hành thử nghiệm sản xuất rượu vang táo mèo trên quy mô phòng
thí nghiệm.
2.4.

Địa điểm nghiên cứu

Cao Thị Hồng Nhung

20

K32D - Sinh KTNN