Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường và NaCl trong qúa trình lên men vang vải thiều (Litchi chinensis sonn

Khoá luận tốt nghiệp
Phần 1
Đặt vấn đề
1.1.Lí do chọn đề tài
Người ta đã biết làm rượu vang từ 3000 năm trước công nguyên. Đến
thời Trung cổ, nhu cầu về rượu vang 150 l/đầu người/năm[2] .Hàng năm trên
thế giới sản xuất khoảng 18 tỷ lít rượu vang. Trong đó 1/3 của Pháp và
Angiêri[14].
Đa số rượu vang (Wine, win ) trên thế giới được sản xuất từ nho, vì vậy
từ “rượu vang” gần đây đồng nghĩa với “rượu nho” [2]. Theo thời gian và kỹ
thuật sản xuất rượu vang ngày càng phong phú và hoàn thiện. Mỗi nước khác
nhau có phương thức sản xuất khác nhau và hàng trăm loại rượu vang ra đời
(độ rượu 9% - 14% ): Chianti, chablis, rượu Rhine, Granache rose,
Burskendy, sautesne, Zinfandet,[2].
Thực chất của rượu vang bắt nguồn từ sự biến đổi tự nhiên của các loại
hoa quả có đường, do hệ enzim có trong một loại vi sinh vật là nấm men
Sacharomyces mà chủ yếu là loài: Sacharomyces cerevisiae, ngoài ra còn có
các phụ phẩm khác: các chất thơm, tanin, axít hữu cơ, vitamin, chất khoáng,
muối và các este. Do đó, rượu vang không chỉ có đặc điểm nổi bật là gây say
êm dịu mà còn có giá trị dinh dưỡng cao, kích thích tiêu hoá, thần kinh, tim
mạch. Việt Nam là một nước nhiệt đới khí hậu nóng ẩm, hoa quả nhiều về số
lượng, phong phú về chủng loại, thuận lợi cho sản xuất rượu vang từ các
nguồn nguyên liệu khác nhau như: Dâu, dứa, vải, táo, chuối, mơ trong đó
phổ biến nhất là vang vải vì vang vải đã được sản xuất ở một số nước như:
Florida (Mỹ ), Trung Quốc [12, 17]. Bên cạnh đó, quả vải giá thành thấp lại
rất đa dạng, phong phú. Tổng số diện tích trồng khoảng 28.000 ha, sản lượng
cho thu hoạch khoảng 36.000 tấn/ năm. Nơi có diện tích trồng và thu hoạch
nhiều nhất là Lục Ngạn (Bắc Giang ) và Thanh Hà (Hưng Yên ) [12, 17]. Quả
Khoá luận tốt nghiệp
vải dùng chủ yếu để ăn (chiếm khoảng 30% - 35% sản lượng quả cho thu
hoạch, số còn lại buộc phải sấy khô hoặc bán thẩm lậu qua biên giới Việt –

Trung. Việc chế biến quả vải thiều ở dạng nước giải khát đóng hộp cũng chỉ
đáp ứng một phần nhỏ sản lượng thu hoạch hàng năm và sản phẩm rất khó
được thị trường chấp nhận [12, 17].
Ngành sản xuất rượu vang ở Việt Nam thực sự phát triển từ những năm
80 của thế kỷ XX được đánh dấu bằng sự xuất hiện của vang Thăng Long, sau
đó là một số cơ sở sản xuất khác hiện lên: vang Gia Lâm, vang Thanh Ba,
vang Đà Lạt, nhưng lại thiếu nguồn nguyên liệu. Do đó theo chúng tôi, việc
nghiên cứu sử dụng quả vải thiều để sản xuất rượu vang là rất cần thiết và phù
hợp với thực tiễn ở Việt Nam. Chúng tôi tiến hành lựa chọn và nghiên cứu đề
tài:
“Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường và NaCl trong qúa trình
lên men vang vải thiều (Litchi chinensis sonn )”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
- Từ nguồn nguyên liệu vài thiều phân lập và tuyển chọn chủng nấm men
có khả năng lên men vang vải thiều.
- Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường, KH
2
PO
4
, NaCl, pH, men giống
và nhiệt độ để lựa chọn mức thích hợp cuả các nhân tố này tới quá trình lên
men vang vải thiều với quy mô phòng thí nghiệm.
- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vang từ quả vải thiều.
1.3. Nhiệm vụ
Giúp sinh viên biết phương pháp sản xuất rượu vang ở Việt Nam tận dụng
nguồn nguyên liệu sẵn có
1.4. ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý,
sinh hoá của chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H
7

và C
13
có khả năng
lên men vang vải thiều. Từ đó tìm hiểu quá trình sản xuất vang vải thiều trên
Khoá luận tốt nghiệp
quy mô phòng thí nghiệm để ứng dụng sản xuất vang trong gia đình tận dụng
nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam.
Khoá luận tốt nghiệp
Phần 2
Tổng quan tài liệu
2.1. Khái quát chung về rượu vang
2.1.1. Các loại rượu vang
Rượu vang là loại nước thơm ngon giàu chất bổ dưỡng với độ cồn nhẹ
và hương thơm trái cây còn giữ lại được trong rượu [1]. Rượu vang theo đúng
nghĩa là rượu lên men từ nước ép quả nho (không chưng cất ). Gần đây, người
ta mở rộng khái niệm rượu vang để chỉ các loại rượu lên men từ các loại hoa
quả khác nhau như: mơ, dứa, táo, vải, xoài, nhãn. Sự đa dạng về các loại rượu
vang đang là kết quả của sự biến đổi sinh hoá khi lên men. Trong rượu vang
người ta còn chia thành hai loại chính: Rượu vang không gaz và rượu vang có
gaz. Trong hai loại chính này rượu vang lại được chia thành nhiều loại theo
màu sắc, theo hàm lượng đường có trong rượu hoặc theo độ cồn.
Theo màu sắc có vang trắng, vang đỏ (màu đỏ Bordaux). Theo hàm lượng
đường có trong rượu vang thì có vang chát hay vang khô (ít đường ) và vang
ngọt (nhiều đường ), vang nửa khô[13]. Vang khô thường uống giữa bữa ăn,
vừa ăn, vừa uống. Vang ngọt dùng sau bữa ăn, vang nửa khô (vang
Vermouth ) có mùi rất thơm (chứa 21% độ rượu ) dùng để khai vị.
Champagne là loại rượu vang có qúa trình lên men phụ sinh CO
2
, nên khi
uống thường có bọt và được dùng nhiều trong đại tiệc, phụ nữ thường ưa thích

loại vang này[2].
2.1.2. Nguyên liệu sản xuất rượu vang
Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa không thuận lợi cho nho phát
triển, nhưng lại là xứ sở của nhiều loại hoa thơm, quả ngọt bốn mùa. Tất cả
các loại quả nếu chứa đường, prôtêin, muối khoáng và không chứa chất độc
hại với nấm men đều có thể chế biến lên men rượu vang. Như vậy, nguồn
nguyên liệu sản xuất rượu vang chủ yếu là các loại quả trồng (mận, mơ, táo,
dâu, dứa, chuối, vải, nhãn).
Khoá luận tốt nghiệp
Nói chung thành phần hoá học của quả có ảnh hưởng rất lớn đến chất
lượng rượu vang. Điều kiện khí hậu, đất đai, nông hoá thổ nhưỡng, kỹ thuật
canh tác cũng ảnh hưởng lớn đến chất lượng rượu vang, bởi chúng ảnh hưởng
tới sự có mặt của các hợp chất hữu cơ có mặt trong quả.
Khoá luận tốt nghiệp
Bảng 1. Thành phần hoá học của các loại quả. [7, 16].
Tên quả Thành phần hoá học
Nước Đường Axít tổng số Pectin Talin
Nho ngọt
Dâu
Vải
Dứa
Mơ
73,1
84,74
84,28
54,3
73,8
9,88
9,19
1610,39

3,9
9,0
0,56
0,49
5,16 0,01
0,6
1,1
0,92
0,31
0,25
-
-
0,07
0,035
0,83
-
-
2.1.3.Tàng trữ rượu vang
Vang truyền thống được tàng trữ từ 1ữ5 năm hoặc nhiều năm, hàng thế
kỷ hoặc lâu hơn nữa. Trong thời gian này xảy ra sự oxi hoá khử màu tím sang
màu đỏ tía. Vang trắng trở nên vàng, thậm chí đỏ nâu. Thành phần axít tăng,
độ cồn giảm, este và hương vị tăng lên. [13], [14]. Cho nên, công nghệ cổ
truyền người ta cho rằng cần tránh can thiệp nhân tạo khi bắt buộc điều chỉnh
ở mức độ tối thiểu một số chỉ tiêu lý hoá. Ngược lại trong thực tế cơ chế thị
trường đã thúc đẩy nhà sản xuất phải xử lý tăng tốc độ tàng trữ bằng các
phương pháp công nghệ học, ly tâm, nạp khí CO
2
, làm lạnh.
2.2. Nấm men trong sản xuất rượu vang
Nấm men đóng vai trò quyết định trong sản xuất rượu vang vì quá trình

trao đổi chất của tế bào nấm men là quá trình chuyển hoá nguyên liệu thành
sản phẩm. Nấm men sản xuất rượu vang gồm nấm men thuần chủng và nấm
men tự nhiên.
2.2.1. Sơ lược về nấm men
Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào,
thường sinh sản bằng nảy chồi . Từ năm 1680 Levenhuc đã quan sát thấy
Nấm men, và từ 1857 Pasteur đã nghiên cứu khá tỉ mỉ về men rượu. Nấm men
phân bố rộng rãi trong tự nhiên. (Trong đất, trong nước, trong không khí,
trong lương thực, thực phẩm, trong hoa quả). Nhiều loài nấm men có khả
năng lên men rượu do đó từ lâu con người đã biết sử dụng nấm men để nấu
Khoá luận tốt nghiệp
rượu, bia, sản xuất cồn. Nấm men sinh sản theo lối nảy chồi, sinh sản nhanh
chóng, sinh khối của nấm men giàu prôtêin – vitamin. Vì vậy chúng còn được
sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp sản xuất thức ăn bổ sung cho
người, gia súc và gia cầm. Nấm men còn được sử dụng làm nở bột mì, gây
hương cho nước chấm, sản xuất một số dược phẩm khác. Tuy nhiên bên cạnh
đó có một số nấm men có hại cho người và gia súc, làm hư hỏng lương thực,
thực phẩm [3].
2.2.2. Hình thái, kích thước và cấu tạo của tế bào nấm men Sacharomyces
cerevisiae
Hình thái: Đa số nấm men có hình ovan, hình trứng. Hình dạng và kích
thước điển hình của tế bào nấm men chỉ tạo được trong điều kiện nhất định.
Nếu thay đổi thì hình dạng tế bào cũng thay đổi.
Kích thước của tế bào nấm men vào khoảng 4- 10 àm x 2- 8àm. Tế bào
nấm men lớn gấp 10 lần tế bào vi khuẩn, cấu tạo tế bào nấm men phức tạp
hơn tế bào vi khuẩn. Về mặt hoá học, có sự phân bố rõ ràng, tế bào nấm men
Sacharomyces cerevisiae được bao bởi lớp thành tế bào.
Cấu tạo chủ yếu của thành tế bào là Hêmixenlulô chiếm 70% trọng lượng
khô (trong đó 31% manan, 29% glucan ). Ngoài ra còn chứa 1%- 3% kitin,
6% - 10% prôtêin, 8% - 8,5% lipit, 7% chất khoáng. Thành tế bào có cấu tạo

nhiều lớp là cơ quan bảo vệ và duy trì hình dạng tế bào. Thành tế bào nấm
men có khả năng kết dính, có ý nghĩa lớn trong công nghiệp sản xuất rượu
vang và bia. Bên ngoài chất nguyên sinh là màng sinh chất (màng chất nguyên
sinh ) có chức năng quan trọng là hấp phụ các chất dinh dưỡng và thải các các
sản phẩm trao đổi chất. Màng chất nguyên sinh là lipoprotêin chứa nhiều hợp
chất canxi. Màng chất nguyên sinh ăn sâu vào trong tạo thành mạng lưới nội
chất gồm 2 lớp và dày khoảng 30- 40A
0
và có ty thể. Ty thể của nấm men có
dạng hình hạt và có thể thay đổi tuỳ thuộc điều kiện của môi trường cũng như
trạng thái sinh lý của tế bào, kích thước khoảng 0,2 – 0,6 cm, ty thể có màng
trong suốt, mỏng (60 – 80 A
0
), có tính thấm cao, màng ty thể có cấu tạo 2
Khoá luận tốt nghiệp
lớp, lớp trong hình thành nếp gấp hoặc ống nhỏ hình răng lược. Lớp ngoài
được cấu tạo bằng nhiều đơn vị hình thái. Ty thể được cấu tạo chủ yếu bằng
hợp chất prôtêin, lipit trong đó chiếm một lượng lớn nuclêoprôtêin,
photpholipit. Số lượng ty thể trong tế bào nấm men từ 10 đến 20. Chúng tham
gia vào quá trình sinh trưởng của tế bào, sự hình thành và nảy mầm của bào
tử. [1, 3, 9 ].
Trong tế bào nấm men có chứa một hoặc một hệ thống không bào được
hình thành từ thể glogi hay mạng lưới nội chất, không bào có tính chất thẩm
thấu cao và là nơi tích luỹ các sản phẩm của trao đổi chất. Không bào chứa
một hệ thống keo, trong đó gồm các điện tử, enzim, protit, hiđrat cacbon, các
muối canxi, photpho, kali, axit nuclêic. Hình dạng của không bào thường thay
đổi do sự co rút của chất nguyên sinh. Trong không bào thường xảy ra các
phản ứng oxi hoá - khử nhờ vào hệ thống enzim xitocromoxidaza trong không
bào. Một dạng dự trữ của tế bào là glucogen trong môi trường giàu hiđrat
cacbon, glicogen của tế bào nấm men được tích luỹ khá nhiều.

Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật, nhân có hình
tròn, hình ôvan nằm gần không bào trung tâm có kích thước 1- 2,4 àm. Nhân
tế bào được bao bọc bởi 2 lớp màng tế bào, mỗi màng có cấu trúc như màng
cơ sở, gồm 3 lớp phân tử, những lớp này được liên hệ với nhau ở gần lỗ màng
nhân. Lỗ màng nhân tham gia việc kiểm tra quá trình trao đổi chất tế bào. [6,
9].
2.2.3. Sinh sản của tế bào nấm men
Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữu
tính,).
Bình thường tế bào nấm men sinh sản nảy chồi khi gặp điều kiện không
thuận lợi một số có thể sinh sản theo cách tạo bào tử. [1, 12 ].
Sinh sản vô tính: Sinh sản nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất.
Khi tế bào phát triển đến mức độ nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một chồi
nhỏ gọi là mầm (hay chồi ). Mầm sinh ra ở vị trí lệch tâm trên đầu của tế bào
Khoá luận tốt nghiệp
mẹ. Cùng một lúc tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều những chồi ở nhiều phía
khác nhau. ở mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất nhân và chất nguyên sinh
ở tế bào mẹ. Sau khi nảy mầm tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ sống độc
lập, cũng có thể không tách khỏi tế bào mẹ mà tiếp tục nảy mầm tạo ra một
lớp tế bào nấm men giống hình cành cây. Trong điều kiện thuận lợi một tế bào
được hình thành điều chỉnh và tách khỏi tế bào mẹ với thời gian 20- 30 phút.
Nấm men còn có khả năng hình thành bào tử. Bào tử túi được sinh ra
trong những túi nhỏ gọi là túi nang. Mỗi túi nang chứa từ 1 – 8 bào tử.
(Thường từ 4 bào tử ). Nấm men được tạo thành từ 1 tế bào riêng rẽ không
qua tiếp hợp. Bào tử túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm
men. Tế bào này sinh sản theo lối nảy chồi (Lodder.J.1971 ).
Sinh sản hữu tính là hình thức hợp nhất 2 tế bào nấm men thành hợp tử.
Tế bào này phát triển thành túi trong đó có giảm nhiễm để hình thành các bào
tử. Nhờ kính hiển vi điện tử khoa học đã thấy được sự khác nhau về thời gian
hình thành thoi vô sắc trong sinh sản vô tính ở nấm men phân đôi và nấm men

nảy chồi.
Nấm men sinh sản vô tính bằng nảy chồi hoặc phân đôi. Giữa quá trình
này có thể sinh sản hữu tính.
2.2.4. Nấm men thuần chủng
Trong thiên nhiên tồn tại một số lượng lớn các chủng nấm men khác nhau,
chúng có những đặc tính đặc biệt và được sử dụng trong sản xuất. Tế bào nấm
men có thể tìm thấy ở khắp mọi nơi đặc biệt trên bề mặt trái cây. Tuy nhiên
trên bề mặt trái cây tồn tại cả những nấm men dại, vi khuẩn, nấm mốc. Để
tránh ảnh hưởng cuả nấm dại, vi khuẩn, nấm mốc,.. mà ngày nay xu thế lên
men với chủng thuần khiết đang được phổ biến rộng rãi.
Nấm men thuần chủng là nấm men được phát triển từ cùng một tế bào đã
được phân lập và tuyển chọn trên môi trường Hansen.
Nấm men được phổ biến và sử dụng nhiều trong sản xuất là loài
Sacharomyces cerevisiae – loài này đôi khi được gọi là Sacharomyces
Khoá luận tốt nghiệp
ellípsoideus hoặc Sacharomyces vini nhưng những tên này được coi là lỗi thời,
nó được đặt tên bởi Hoyer (1837 ), được mô tả từ đầu bởi Schwann trong
cùng một năm.
* Một số chủng hay dùng trong sản xuất rượu vang:
Sacharomyces vini trước đây gọi là Sacharomyces cerevisiae vaxini
nấm men này chiếm tới 80% Saccharomyces. Trong khi lên men loại này có
khả năng lên men glucza, fructoza, mantoza, glactoza, lactoza, peptoza,
dextrin.
Saccharomyces oriformis được tách từ nước nho lên men tự nhiên, đặc
biệt loại này chịu được đường cao, tạo độ rượu cao (10% V) trong qúa trình
lên men. Trong quá trình lên men giống nhau tạo thành màng trên bề mặt dịch
quả, có khả năng lên men glucoza, fructoza, mantoza.
Saccharomyces cerevisiae dùng sản xuất bánh mỳ, bia rượu vang, trước
đây gọi là Saccharomyces ellipsoides khi lên men đạt 10 – 20% V cồn.
* Khả năng lên men đường của Saccharomyces

Sự lên men rượu xảy ra qua một số giai đoạn trong thời kỳ đầu khi môi
trường còn chứa nhiều hàm lượng oxy đã hoà tan, nấm men chủ yếu oxy hoá
đường đến CO
2
và H
2
O, và sinh sôi nảy nở một cách mạnh mẽ. Năng lượng
của sự lên men không đảm bảo cho mức độ phát triển cao của tế bào thời kỳ
này. Trong giai đoạn cuối cùng của sự lên men, vì đường còn lại ít trong môi
trường nấm men sẽ sử dụng các glicogen đã được tích luỹ trong đó, do đó
hàm lượng glicogen trong tế bào giảm dần.
Tốc độ lên men của các chủng Saccharomyces lên men rượu bia là khác
nhau đối với mỗi loại đường. Tốc độ lên men đường glucoza và fructoza
nhanh hơn xaccaroza. Tốc độ lên men được xác định lượng CO
2
bay ra từ một
thể tích môi trường nhất định trong một đơn vị thời gian (Nelte và cộng sự,
1976 ).
* Có nhiều ý kiến khác nhau về việc sử dụng chủng nấm men thuần
chủng cho sản xuất rượu vang [7]. Nhưng chỉ từ khi có những hãng rượu sản
Khoá luận tốt nghiệp
xuất được vang ngon từ giống thuần chủng thì vấn đề này mới được quan tâm,
phát triển.
Nấm men sử dụng rộng rãi trong sản xuất là giống Saccharomyces
cerevisiae. Chúng có sự luân phiên thế hệ n và 2n. Thành phần hoá học của
nấm men dao động mạnh phụ thuộc vào dạng của chúng và môi trường nuôi
cấy. Trung bình nấm men chứa 75% nước, 25% chất khô.
Theo quan điểm kinh tế, người ta chia nấm men ra thành các chủng như
sau:
+ Chủng lên men với hiệu suất cồn cao, ở thời gian tối ưu sản xuất thì

đạt 20,5% V cồn.
+ Chủng lên men trong thời gian ngắn, sản sinh 8 – 12% V cồn, thậm
chí ở nhiệt độ thấp 4 – 10
0
c không bị kìm hãm.
+ Chủng chịu được nông độ đường cao, lên men được rượu vang gần
30% đường với hàm lượng cồn 10 -13% V.
2.3. Các biến động sinh lý, sinh hoá vi sinh khi lên men rượu vang, khả
năng lên men đường của Saccharomyces cerevisiae
Quá trình sản xuất rượu vang bắt đầu bằng công đoạn: đầu tiên nấm
men sinh sản trong môi trường dịch quả. Lúc đầu cần nhiều oxy kích thích
sinh trưởng của nấm men. Sau đó tạo điều kiện lên men rượu etylic yếm khí
nhanh chóng, chiếm toàn bộ khoảng không cho quá trình lên men tạo thành
CO
2
và rượu etylic xảy ra mạnh mẽ, sự lên men rượu etylic được biểu diễn
theo phương trình sau: [1, 12].
C
6
H
12
O
6
2C
2
H
5
OH + 2CO
2
+ Q

Năng lượng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của tế bào nấm men và
tích luỹ trong sản phẩm rượu. Quá trình lên men rượu xảy ra qua 5 giai đoạn:
• Giai đoạn 1: Giai đoạn hoạt hoá phân tử glucoza gồm 3 phản ứng.
Phân tử glucoza nhở enzim: hexotrinaza chuyển một gốc photphat từ
ATP sang tạo ra glucoza 6 -  là dạng hoạt động.
Khoá luận tốt nghiệp
ch
2
oh
oh
oh
oh
oh
O
ATP
ADP
m
g
2
+
oh
oh
oh
oh
O
ch
2
O
p
O

Glucoza 6 - bị tác dụng của enzim iromeza chuyển thành fructoza 6 -  có
cấu tạo kém bền vững hơn.
O
ch
2
o
p
o
oh
oh
oh
oh
izomera
O
ch
2
o
p
o
oh
oh
oh
ch
2
oh
Fructoza 6 –  bị photphoril hoá 2 lần nhờ enzim photphorictokinaza
với sự tham gia của phân tử ATP lần 2 tạo ra fructoza 1,6 đi photphoglyxeric
O
ch
2

o
p
o
oh
oh
ch
2
oh
ATP
ADP
O
ch
2
o
p
oh
oh
F.6.P
F.1.6.§.P
o
ch
2
o
p
o
* Giai đoạn 2: Giai đoạn cắt mạch.
Fructo 1,6 đi  dễ dàng biến đổi thành 3 – Photphoglyxeralđehyt và
đioxyhiđrooxy axeton photphat nhờ xúc tác của enzim aldolaza.
O
ch

2
o
p
o
oh
oh
oh
ch
2
o
o
p
C
o
ch
2
oh
ch
2
o
p
C
o
ch
2
oh
ch
2
o
o

p
+
ch
oh
cho
F.1.6.§.P
D.A.P
A.3.P.G
ch
2
o
p
o