Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của đậu xanh trong giai đoạn nảy mầm

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
**************************

PHẠM THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN
ĐOẠN CHIẾT HEXAN CỦA CÂY MẦN TƯỚI
(EUPATOLRIUM FORTUNEI)

1


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

.1 Giảng viên hướng dẫn khoa học:
Ts. Nguyễn Tiến Đạt

Hà Nội, 5 - 2011

MỞ ĐẦU

Xã hội ngày càng phát triển, kinh tế ngày càng phát triển, của cải vật
chất làm ra càng nhiều nhưng bên cạnh những mặt tốt đó thì làm cho môi
trường ngày càng bị ô nhiễm, tài nguyên cạn kiệt, sinh ra nhiều bệnh tật. Việc
tìm kiếm và sử dụng hợp lí, có hiệu quả các nguồn tài nguyên thiên nhiên là
yêu cầu trở nên cấp bách.
Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, độ
ẩm cao trên 80%, lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình 15-270C. Điều kiện khí

2


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

hậu thuận lợi đó khiến Việt Nam có một hệ thực vật phong phú đa dạng với
10585 loài, thuộc 2342 chi, 337 họ (trong đó có 24 họ có từ 100 loài trở lên).
Thực vật có vai trò hết sức quan trọng: Cung cấp thức ăn cho con người,
động vật, điều tiết khí hậu, cung cấp nguyên vật liệu cho các ngành xây dựng,
sản xuất giấy…và đặc biệt nhiều loại cây có tác dụng trị bệnh rất tốt dùng làm
thuốc. Thực tế cho thấy trong nguồn tài nguyên thực vật phong phú kể trên có
tới khoảng 4000 loài được nhân dân sử dụng làm thuốc. Các bài thuốc có
nguồn gốc thảo dược thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội trong điều trị bệnh đó
là: ít độc tính, ít tác dụng phụ và ít ảnh hưởng đến môi sinh. Vì vậy các nhà
khoa học trong và ngoài nước đã, đang tích cực nghiên cứu, tìm hiểu thành
phần hóa học và dược lí của các loại cây thuốc và tìm ra những bài thuốc giúp
điều trị những căn bệnh hiểm nghèo cho con người, cải thiện chất lượng cuộc
sống và kéo dài tuổi thọ. Ngày nay, khoa học kĩ thuật ngày càng phát triển
mạnh mẽ, việc nghiên cứu ngày càng gặp nhiều thuận lợi.
Lá, cây Mần tưới từ lâu đã được nhân dân sử dụng trong nhiều bài thuốc

giải nhiệt, giải cảm, sát trùng, lợi tiểu, kích thích tiêu hóa, mụn nhọt, sang lở,
kinh nguyệt không đều, các chứng sản hậu (chóng mặt, sốt, ho, mệt mỏi, kém
ăn, suy nhược, đau bụng, ứ huyết, rong huyết, bế kinh, hãn thương…). Ngoài
ra phụ nữ còn dùng để gội đầu cho sạch tóc, và dùng để trừ mạt gà, bọ chó.
Tuy nhiên việc nghiên cứu về lá, thân cây Mần tưới vẫn còn những hạn
chế nhất định. Vì vậy tôi đã chọn đề tài: “ Nghiên cứu thành phần hóa học
phân đoạn chiết hexane của cây Mần tưới” nhằm góp phần tìm kiếm các hợp
chất thiên nhiên, tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, từ đó tìm ra
những ứng dụng hợp lí cho cây Mần tưới, góp phần phát triển nền y học cổ
truyền dân tộc.
Nội dung khóa luận gồm:

3


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.Nghiên cứu tổng quan về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học có
trong cây Mần tưới.
2. Phân lập một số hợp chất từ cây Mần tưới bằng phương pháp chiết,
sắc kí.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập bằng các
phương pháp phổ.

Chương 1 : TỔNG QUAN
1.1. Sơ lược về họ cúc
Họ cúc (Asteraceae) bao gồm chủ yếu các cây thân cỏ, cây bụi và một số
rất ít cây thân gỗ với 1100 giống và gần 20.000 loài. Lá của họ này có thể

mọc đối, so le hoặc ít phổ biến hơn là kiểu mọc vòng. Lá có thể là đơn hình
lông chim hoặc lá kép hình chân vịt và không có lá kèm.

4


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Họ cúc chia làm ba bộ lớn:
- Heliantheceae
- Lactuceae
- Senecionceae
Chi Eupatorium có khoảng 400 loài trên thế giới, phân bố tập trung ở
vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở Việt Nam có khoảng 10 loài.
Có 10 loài trong chi này [2]:
* Eupatorium cannabinum: Yên bạch lá gai, Hoa nốt, Trạch lan lá gai
mèo, Thạch lam, Bạch sơn.
* Eupatorium capillifolium: Yên bạch lá kim
* Eupatorium chinense: Tổ mạ, Trạch lan Trung Quốc, Yên bạch Trung
Quốc.
* Eupatorium coelestinum: Mỹ sơn, cỏ lào tím.
* Eupatorium fortunei: Mần tưới, lan, hương thảo.
* Eupatorium heterophyllum: Thạch lam, Trạch lan khác lá.
* Eupatorium japonicum: Sơn lan, Trạch lan, Yên bạch nhật.
* Eupatorium lindleyanum: Bội lan, Yên bạch, lindley.
* Eupatorium odoratum: Cỏ lào, Chó đẻ, Bớp bớp, Yên bạch.
* Eupatorium triplinerve: Bả dột, Mần tưới, cà dốt, ba dót.
1.2. Sơ lược về cây mần tưới

1.2.1. Giới thiệu chung
Tên khoa học là : Eupatorium fortunei Turcz
Tên đồng nghĩa : Eupatorium staechadosmum Hance
Phân lớp thực vật :
Ngành : Magnoliophyta
Lớp Magnoliopsida

5


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Bộ Asterales
Họ Asteraceae
Chi Eupatorium
Tên khác : Trạch lan, Lan thảo, Co phất phử (Thái), Eupatoire (Pháp).

1.2.2. Hình thái thực vật và phân bố [1],[4],[5]
Mần tưới:
Mô tả: Cây thuộc thảo, cao trung bình 50cm có thể đến 1m. Thân trụ
tròn, thân và cành nhẵn, cành phân nhiều nhánh. Lá mọc đối thuôn, hình dải
rộng, dài 7-11 cm, rộng 1,2-2,5 cm, nhọn ở đầu, thon hẹp ở gốc, mép lá có
răng cưa nhỏ, gân lá hình lông chim, gân chính nổi ở giữa, có nhiều gân phụ
phân nhánh và khi vò lá có mùi thơm đặc biệt.
Toàn thân: cành, cây, cuống lá có màu hơi tím, lá bắc nhỏ, tù và tròn;
cụm hoa là ngù kép, hoa tím hồng, đôi khi có màu hơi trắng hồng, màu ở đầu
cành hay kẽ lá, tràng hoa loe dần về phía đầu, mào lông dài 3cm, bao phấn
không có tai ở gốc. Quả bế, màu đen, có năm cánh lồi. Mùa hoa vào tháng 711, mùa quả vào khoảng tháng 9-12.

Phân bố: Cây mọc hoang ở nhiều nơi, cây được trồng rải rác trong một
số vườn ở nông thôn các tỉnh Miền Bắc. Ở Trung Quốc Mần tưới mọc nhiều ở
các tỉnh: Giang Tô, Tô Châu, Nam Kinh, Phúc Kiến.

6


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.1: Cây Mần tưới Eupatorium fortunei

Bộ phận sử dụng: Toàn thân, hay dùng là cành lá, ngọn là chủ yếu và
dùng tươi tốt hơn dùng khô. Có thể thu toàn cây khi cây mới ra hoa, loại bỏ
tạp chất cắt 3-4 cm phơi khô trong bóng râm hoặc sấy ở 45-500C đến khô rồi
dùng dần.
Cách trồng:
+ Cây mọc hoang và rộng khắp nơi do cánh hoa bay và mang theo hạt.
+ Cách trồng đơn giản, cắt từng đoạn dài khoảng 20-30cm cắm xuống
đất, để 2-3 đốt chìm dưới đất, cành hơi nghiêng. Sau một tuần là cây bén rễ.

7


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.3. Công dụng y học dân tộc.

- Công năng: Vị cay, tính bình, hơi ấm, vào hai kinh: can, tì tác dụng
hoạt huyết, phá ứ huyết, thông kinh, lợi tiểu, sát trùng.

- Công dụng:
+ Chữa sốt, chữa mụn nhọt. lở ngứa.
+ Nhân dân ta thường dùng lá Mần tưới non ăn sống, ăn gỏi như các
loại rau thơm. Cũng dùng lá nấu canh ăn cho mát, giải cảm, giải nhiệt. Lá
cũng dùng hãm nước uống lợi tiêu hóa, kích thích ăn ngon miệng và làm rau
thơm.
+ Người ta dùng Mần tưới để trừ ho gà, mạt gà, rệp, bọ chó. Đặt cành lá
Mần tưới vào hũ đựng đậu xanh, đậu đen, cau khô để trừ mọt và sâu, hái cành
lá Mần tưới cho vào ổ gà, ổ chó sau khi đã làm vệ sinh sẽ trừ được bọ gà, bọ
chó có trong ổ, cứ vài ngày lại làm vệ sinh và thay lá một lần. Giường có rệp
sau khi giũ và diệt rệp, rải cành lá Mần tưới vài lần sẽ diệt hết rệp.
+ Người ta dùng lá Mần tưới giã nhỏ cho vào túi vải và xát trực tiếp lên
tay hay chân để xoa muỗi và dĩn (con bộ mát) có hiệu quả tốt trong vòng hai
ba giờ. Phụ nữ nông thôn cũng dùng Mần tưới nấu nước gội đầu cho sạch tóc
[1],[5].

-Bài thuốc [2]:
+ Chữa máu hôi không ra sau khi đẻ: Mần tưới (cả gốc và lá), Ngải
tím, Quế chi, đều nhau. Tán thành bột, lấy chừng 80g, chia làm 2 lần uống với
rượu.
+ Chữa phù thũng sau khi đẻ: Mần tưới, Phòng kỉ, đều bằng nhau tán
nhỏ, mỗi lần uống 8g với giấm làm thang.
+ Chữa mụn nhọt, vết thương ứ huyết: Mần tưới, Huyết giác đều 20g.
Sắc uống. Ngoài thì dùng lá Mần tưới giã nhỏ và đắp lên vết thương.

8

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

+ Chữa sốt, tiêu hóa kém: Mần tưới khô 20g, sắc với 600ml còn
200ml, chia làm 2 lần uống 15 phút trước hai bữa ăn chính.
+ Chữa bệnh phụ nữ (thiếu máu, suy nhược, đau bụng kinh, kinh
nguyệt không đều): Mần tưới phối hợp với củ Gấu, Ích mẫu, Ngải cứu, Nhọ
nồi (mỗi thứ 120g) phơi khô, tán nhỏ, rây thành bột min, trộn với bột gạo và
đường kính (nấu thành sirô), làm thành viên to bằng hạt ngô. Ngày uống hai
lần, mỗi lần 25-30 viên.
+ Chữa rong huyết: Mần tưới, Ké hoa vàng, Chỉ thiên, Mã đề mỗi loại
20g thái nhỏ sao vàng sắc với 400ml còn lại 100ml, uống làm hai lần trong
ngày, dùng 3-5 ngày.
+ Chữa bệnh phụ nữ sau khi đẻ (bị sốt, ho, kém ăn, mệt mỏi): Mần tưới
20g, Mạch môn 20g, Ngải cứu 10g, Nhân trần 6g, Rẻ quạt 4g, vỏ quả bưởi
đào khô 4g, sắc uống trong ngày, dùng 10 ngày liền.
+ Chữa bệnh ra máu sau khi đẻ: Đan sâm, Mần tưới mỗi thứ 9gam,
Xuyên khung 12gam, Kinh giới 6gam. Sắc uống.
+ Đẻ xong huyết hư: Mần tưới 9gam, lá Ngải (sao) 6gam, đường đỏ
30gam. Sắc đặc, uống hết một tuần.
+ Đau bụng sau khi đẻ: Diên hồ sách, lá Mần tưới mỗi thứ 9gam. Sắc
thêm rượu vào uống.
+ Trúng phong sau khi đẻ: Kinh giới, lá Mần tưới mỗi thứ 9gam,
Xuyên khung 4,5gam, Đẳng sâm 18gam. Sắc uống.
1.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học có trong cây Mần tưới
1.3.1. Vài nét về hợp chất Phenolic
1.3.1.1. Giới thiệu chung

Phenolic là nhóm các hợp chất trong cây mà chứa ít nhất một vòng thơm
bị thế ít nhất một nhóm hydroxyl, nhóm này tự do hay liên kết với các nhóm
chức khác như: este, ester hoặc glycoside. Các hợp chất phenol có màu sắc tự

9


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

nhiên nên có thể lợi dụng màu sắc của chúng để theo dõi quá trình chiết suất
và phân lập.
Có hai hướng chính thơm hóa để sinh ra các phenolic thực vật:
- Hướng phổ biến nhất là đi qua Shikimate (axit Shikimic), từ các
monosaccarit tạo thành các aminoaxit (Phenyl amin và Tyrosime), sau đó loại
nhóm amin cho các axit Cinnamic và các dẫn xuất của chúng gồm: Axit
benzoic, Acetophenone, Lignan, Lignin và Caumarin.
- Con đường thứ hai là đi từ axetat và dẫn đến tạo thành các Poly-βketoester của các Polyketit dài bằng các phản ứng đóng vòng (phản ứng
ngưng tụ Claisen hoặc Andol). Các sản phẩm thường là polycyclic gồm:
Choromen, Isocaumarin, Orcinol, Depside, Depsidoen, Xanthone, Quinone.
Cấu trúc đa dạng của các hợp chất phenol có được là do quá trình sinh
tổng hợp và bởi sự tăng dần tần số kết hợp giữa hai con đường Shikimate và
acetate đối với các hợp chất được tạo thành trong hỗn hợp. Khả năng tham gia
các thành tố thứ ba là hoàn toàn có thể mặc dù với tần số thấp hơn. Sự kết hợp
này được tạo bởi các thành tố tạo bởi hai con đường Shikimate và
Mevalonate, ví dụ như một số loại Quinone hoặc khung Furano và Polycoumarin.
1.3.1.2. Một vài đặc điểm của hợp chất Phenol
Một vài hợp chất của Phenol có thể dễ dàng nhận biết bằng mắt thường
như các Anthocyanin từ hoa, các hợp chất khác có thể nhận biết dưới ánh

sáng đèn UV hoặc bởi các phản ứng màu đặc trưng. Các phản ứng màu này
được sử dụng trong quá trình sắc kí, phân lập các hợp chất Phenolic. Tuy
nhiên, việc sử dụng các phản ứng màu trên các dịch chiết thường khó phát
hiện và không nhạy bởi các tương tác của các yếu tố gây nhiễu kết quả thực
nghiệm. Các hóa chất thường được sử dụng phát hiện các chất phenol đó là:
Clorit sắt, Vanllinin, Phosphomolybdate-phosphotungstate. Đối với một vài

10


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

hóa chất, việc sử dụng các hợp chất có cấu trúc phenol được thực hiện theo
tính đặc hiệu như thời gian phản ứng, sự chuyển màu, những điều này góp
phần làm tăng khả năng nhận biết các hợp chất phenol.
1.3.1.3. Các nhóm phenolic:
1, Phenolic và axit phenolic
2, Flavonoid
3, Lignin
4, Lignan
5, Coumarin
6, Plikatit
7, Melanin
8, Thymol
1.3.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Mần tưới
1.3.2.1. Thành phần hóa học
Ở Việt Nam, hiện chưa có một công trình nghiên cứu khoa học nào được
công bố về loài Mần tưới (Eupatorium fortunei). Mới chỉ có một công trình

nghiên cứu về loài Mần tưới trắng (Eupatorium staechadosmum Hance) được
nhóm nghiên cứu của Lê Văn Hạc công bố vào tháng 10 năm 2004. Trong
công trình này, nhóm nghiên cứu đã tách được tinh dầu của cây Mần tưới
trắng với hàm lượng 0,02% và xác định được thành phần hóa học của tinh dầu
này có 67 hợp chất, trong đó 40 hợp chất đã được xác định danh, thành phần
chính của tinh dầu là β-caryophylen (21,2%), methylthymyl ether (13,7%),
thymohydroquinondiethyl ether (10,2%). [3]
Năm 1986, Mitsumasa Haruna cùng các cộng sự đã xác định được cấu
trúc và lập thể của Eupafortunin, một Germacrane mới thuộc loại
Sesquiterpene lactone phân lập từ loài Mần tưới (Eupatorium fortunei).

11


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Eupafortunin là một Sesquiterpene lactone mới, được phân lập từ Mần
tưới (Eupatorium fortunei), cấu trúc hóa học lập thể của nó được xác định
bằng cách kết hợp các phương pháp hóa lý.
Các hợp chất phân lập được: Eupatofortunin, Eupatoriopicrin. [7]

Hình 1.3. Eupatoriopicrin

Hình 1.2. Eupatofortunin

Năm 1992, K.Liu và các cộng sự đã phân lập được 3 alkaloid
pyrrolizidine từ loài Mần tưới, cấu trúc của 3 hợp chất này được xác định
bằng các phương pháp phổ. Một trong số chúng là chất mới và cấu trúc của

hợp chất này được chứng minh bằng phổ hai chiều NMR. [8]
Sau đây là cấu trúc của 3 alkaloid này:

Hình 1.5. Rinderine

Hình 1.4. Supinine

12


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.6. O-7-acetylrinderine
Năm 2001, Motoo Tori cùng các cộng sự đã xác định và phân lập được
cấu trúc của 16 dẫn xuất thymol mới từ cây Mần tưới. Những hợp chất này
được phân thành 3 nhóm phụ thuộc vào mức độ oxi hóa: một nhóm chức oxi
hóa ở vị trí 9, hai nhóm chức oxi hóa ở các vị trí 8 và 9, ba nhóm chức oxi hóa
ở các vị trí 8,9,10.[6]
Sau đây là cấu trúc của 16 hợp chất phân lập được này:

13


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

14

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học một số dẫn xuất thymol từ cây Mần tưới
Năm 2005, Hai Xia Jiang và Kun Gao đã phân lập được hai
monotecpen từ loài Mần tưới (Eupatorium fortunei) và đã xác định được cấu
trúc của hai hợp chất này là [9]. Dưới đây là cấu trúc của hai monotecpen này:

15


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.9.

Hình 1.8. (1R*,2S*,3R*,4R*,6S*)

(1S*,2S*,3S*,4R*,6R*)-1,2,3,6-

-1,2,3,6-tetrehydroxy-p-

tetrehydroxy-p-menthane

menthane

Năm 2006, Hai Xia Jiang cùng các cộng sự đã công bố công trình phân
lập các tecpenoid từ loài Mần tưới (Eupatorium fortunei). Theo đó bốn
tecpenoid mới có tên là rel-(1R,2S,3R,4R,6S)-p-menthane-1,2,3,6-tetrol, rel(1R,2R,3R,4S,6S)-p-menthane-1,2,3,6,tetrol, 9-hydroxythymol 3-O-angelate
và (3β,20R)-20-hydroxylanost-25-en-3-yl-palminate cùng với 14 hợp chất đã
biết được phân lập từ phần AcOEt của dịch chiết MeOH của Eupatorium
fortunei. Thêm vào đó, 2 monotecpenoid khác là axetone thymol-8,9-diyl
ketal và 8-methoxy-9-hydroxythymol 3-O-angelate cũng được xác định [10].
Dưới đây là một số cấu trúc của một số hợp chất được công bố trong công
trình này:

16


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất từ cây Mần tưới
1.3.2.2. Hoạt tính sinh học
Mần tưới (Eupatorium fortunei) là một loại thuốc truyền thống của
người Trung Hoa, loài này mọc phổ biến ở Trung Quốc và được sử dụng để
chữa trị bệnh phù thũng, các chứng cản lạnh, giảm sốt, được dùng như một
loại thuốc lợi tiểu [9]. Một nhóm nghiên cứu người Nhật đã tìm thấy một loạt

17


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

các dẫn xuất của Thymol phân lập từ Eupatorium fortunei, các dẫn xuất
Thymol đó kháng được 8 loại vi khuẩn theo phương pháp pha loãng agar [1].
Năm 2005 Hai Xia Jiang và Kun Gao có một công trình công bố 2
monotecpen có tính oxi hóa cao, được phân lập từ phần EtOAc của dịch chiết
MeOH của mẫu cây này. Phần EtOAc cho thấy cytotoxicity yếu: IC50 = 69,5
và 86,1 µg/ml chống lại các tế bào HL-60 và SMMC-7721 bằng phương pháp
SRB [9]. 4tecpenoid mới có tên là rel-(1R,2S,3R,4R,6S)-p-menthane-1,2,3,6tetrol, rel-(1R,2R,3R,4S,6S)-p-menthane-1,2,3,6,tetrol, 9-hydroxythymol 3O-angelate và (3β,20R)-20-hydroxylanost-25-en-3-yl-palminate, chúng có
hoạt tính xitotoxic chống lại các dòng tế bào HL-60, SMMC-7721 và LO2
[10].
Các loài thực vật trong chi Eupatorium thể hiện nhiều hoạt tính sinh học
thú vị, đặc biệt các dẫn xuất thymol có khả năng kháng được 8 loại vi khuẩn.
Việc nghiên cứu thành phần hóa học của các loài trong chi này còn mới nên
còn nhiều hạn chế, phần lớn mới tập trung vào loài Eupatorium
staechadosmum Hance. Việc tiếp tục đi sâu nghiên cứu thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học của các chất có trong loài thuộc chi Eupatorium có tác
dụng làm thuốc là một vấn đề thú vị đang cần các nhà khoa học quan tâm.

18


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Chương 2 :
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mẫu thực vật
Cây Mần tưới được thu hái vào tháng 06 năm 2010 tại Hòa Bình. Mẫu
cây được TS. Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện

Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định. Mẫu tiêu bản được giữ tại Viện
Hóa sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.1. Phương pháp chiết
2.2.1.1. Đặc điểm chung
Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình
chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không
hòa tan với nó.
Mục đích: Sử dụng phương pháp chiết để chuyển một lượng nhỏ chất
nghiên cứu trong một lượng lớn thể tích dung môi này vào một thể tích nhỏ
dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất nghiên cứu và được gọi là
chiết làm giàu. Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay
phân ly các chất ra khỏi một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp.
Phương pháp này thường được dùng để phân tách các hợp chất tự nhiên có
trong thực vật.
2.2.1.2. Cơ sở của quá trình chiết
Cơ sở của quá trình chiết là dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất
trong hai chất lỏng không tan lẫn với nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính
tan khác nhau của các chất trong pha lỏng.
Quá trình chiết dựa trên định luật phân bố Nerst:

KA = CA/CB

19


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Với KA là hằng số phân bố.
CA, CB: nồng độ chất hòa tan trong hai pha lỏng A, B không tan lẫn.
2.2.1.3. Quá trình chiết thực vật
2.2.1.3.1. Hợp chất tự nhiên trong cây
Dựa vào chức năng sinh học, người ta chia các hợp chất trong cây thành
hai nhóm lớn:
- Chất chuyển hóa sơ cấp (primary metabolite).
- Chất chuyển hóa thứ cấp (secondary metabolite).
Chất chuyển hóa sơ cấp là chất tham gia vào quá trình sinh trưởng của
cây như hydrat cacbon, lipit, axit amin. Nói chung là chúng không thể thiếu
trong cây cỏ.
Chất chuyển hóa thứ cấp là những chất mà vai trò chủ yếu của chúng
không phải để nuôi sống và phát triển cây cỏ, chúng có thể có ở cây này và
vắng mặt ở cây kia. Có rất nhiều giả thiết về vai trò của chúng trong thực vật.
Có ý kiến cho rằng chúng là những chất thải, góp phần giải độc cho cây
(ancaloid, tinh dầu), góp phần bảo vệ chống các tác nhân làm hại cây
(flavonoid, saponin, tinh dầu, terpenoid…), hoặc góp phần tạo màu sắc, quyến
rũ ong bướm giúp cho sự phát triển nòi giống (flavonoid, carotenoid…)v.v…
Do có tác dụng sinh lý và dược lý như tác dụng kháng sinh, diệt nấm, tác
dụng ức chế hoặc tác dụng gây độc đối với tế bào, tác dụng kích thích hoặc ức
chế sinh trưởng và các tác dụng khác mà các chất trao đổi bậc hai là đối tượng
nghiên cứu quan trọng trong các lĩnh vực như y dược học, nông nghiệp.
Trong cây các hợp chất hữu cơ có tính chất hóa lý rất khác nhau, chúng
tồn tại ở dạng hòa tan trong nước, dầu béo hoặc tinh dầu. Các chất hòa tan
trong nước (dịch tế bào) là các hydrat cacbon phân tử bé (monosaccarit,
oligosaccarit), một số polysacarit (pectin, gôm), các glycozit (saponin,
flavonoid…), muối ancaloid của các axit hữu cơ, axit vô cơ, axit amin, muối

20

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

amin. Các chất tan trong dầu béo và tinh dầu là các hydro cacbon,
monoterpen, secquiterpen, sterol, carotenoid và các dẫn xuất phenyl
propanoid. Dầu béo và tinh dầu được khu trú trong các bộ phận riêng biệt của
cây như ở hạt (dầu béo), ở hạch tiết của lá, vỏ thân (tinh dầu).
Ngoài ra trong cây còn chứa các muối vô cơ. Các muối vô cơ này ít
tham gia vào tác dụng sinh lý của dược liệu, tuy nhiên đây chính là các nguồn
nguyên tố vi lượng không thể thiếu đối với cây cỏ. Ở một số loài các muối vô
cơ cũng có một số tác dụng như tác dụng lợi tiểu của muối kali (natri) trong
râu ngô, tác dụng trị vi khuẩn của lưu huỳnh trong họ cải, tác dụng trị bướu cổ
của các hợp chất Iot của các loại tảo biển.
Mặt khác trong cây cũng có các loại enzyme, do đó trong quá trình
nghiên cứu, nếu không khống chế sự hoạt động các enzyme này thì các
glycozit có thể bị thủy phân một phần hoặc toàn phần làm thay đổi tính phân
cực, do đó thay đổi độ hòa tan của hợp chất trong dung môi.
2.2.1.3.2. Chọn dung môi chiết
Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau,
dung môi thường cho các quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận với
các đặc điểm là cần hòa tan tốt những chất đang nghiên cứu, dễ dàng được
loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với các chất nghiên cứu), những dung
môi này cần được chưng cất trước khi sử dụng vì nếu lẫn các chất khác sẽ làm
ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Một số chất dẻo lẫn
trong

dung

môi

như

diankylphtalat,

tri-n-butyl-axetylcitrat,

tributylphosphat…do trong quá trình sản xuất hay bảo quản, sẽ làm sai lệch
kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật. Clorofom,
metanol và etanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chiết sơ bộ một bộ phận của cây như lá, thân, rễ, hoa…

21


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng
tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được triệt để hơn các
thành phần có trong tế bào. Ngược lại, khả năng phân cực của Clorofom thấp
hơn, có thể rửa các chất nằm ngoài tế bào.
Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng các chất
phân cực trung bình và thấp, vì vậy khi chiết với ancol thì các chất này sẽ bị
hòa tan đồng thời. Thường thì dung môi cồn trong nước dường như có đặc
tính tốt nhất trong quá trình chiết sơ bộ.
Sau khi chiết, dung môi được tách ra bằng máy cô quay ở nhiệt độ không
quá 450C, với các chất chịu nhiệt thì có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.

2.2.1.3.3. Quá trình chiết
Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau:
- Quá trình chiết sử dụng bình chiết Soxhlet:
Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với
chất rắn một thời gian rồi rút ra, dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục
và để tiết kiệm dung môi.
- Chiết ngâm:
Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra
(chiết nguội). Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình
chiết thực vật vì nó không đòi hỏi nhiều công sức. Thông thường bình chiết
ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục vì mẫu được ngâm
trong dung môi khoảng 24h sau đó lấy chất chiết ra. Việc kết thúc quá trình
chiết được xác định bằng một số cách sau:
+ Với ancaloid, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các hợp chất này bằng sự
tạo thành kết tủa với các chất đặc trưng như: Dragendorff, Mayer…

22


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

+ Với flavonoid, do chúng thường là các chất màu nên khi dịch chảy ra
không còn màu cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết.
+ Trong trường hợp các lacton của secquiterpen và các glycozit trợ tim
phản ứng Kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi
cho phản ứng với aniline axetat cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon
và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.

Như vậy tùy thuộc vào mục đích cần lấy chất gì để lựa chọn dung môi
thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý để đạt hiệu quả cao nhất.

2.2.2. Các phương pháp sắc kí
2.2.2.1. Đặc điểm chung của các phương pháp sắc kí
Sắc kí là một phương pháp vật lý dùng để tách riêng các thành phần ra
khỏi hỗn hợp bằng cách phân bố chúng ra hai pha: một pha có bề mặt rộng
gọi là pha tĩnh (hay là pha cố định) và pha kia là một chất lỏng hoặc khí gọi là
pha động (hay là pha di động), di chuyển đi qua pha tĩnh. Trong quá trình sắc
kí, pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha
tĩnh khác, quá trình hấp phụ và giải hấp phụ lặp đi lặp lại. Kết quả là các chất
có ái lực lớn hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn so với chất tương tác
yếu hơn. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc
kí.
2.2.2.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha
động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ dung dịch gọi là
định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

n = n∞bC/(1+bC)
Với:

23


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

• n: lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
• n∞: lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào
đó.
• b: Hằng số.
• C: nồng độ của dung dịch.
2.2.2.3. Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong phương pháp sắc kí, pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái
khí hay lỏng), còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào
trạng thái tập hợp của pha động người ta chia sắc kí thành hai nhóm: sắc kí
khí và sắc kí lỏng.
2.2.2.3.1. Sắc kí lỏng
Đây là sắc kí khí dùng chất lỏng làm pha động. Trong sắc kí lỏng có các
loại cụ thể sau:
a, Sắc kí giấy:
Sắc kí giấy là phương pháp phân tách với pha tĩnh là một loại giấy đặc
hiệu dùng trong sắc kí. Chất thử được chấm lên giấy rồi triển khai sắc kí bằng
dung môi thích hợp trong một bình triển khai kín. Sau khi đã triển khai xong,
giấy được làm khô rồi làm hiện màu để xác định các vết chất có trong hỗn
hợp chất thử. Trừ các chất có màu có thể phát hiện ngay bằng mắt thường, các
chất không màu có thể được phát hiện bằng hai phương pháp: hóa học và vật
lí.
Với phương pháp hóa học, người ta dùng các thuốc thử hiện màu đặc
trưng cho từng loại hợp chất. Thuốc thử được pha thành dung dịch có nồng độ
thích hợp rồi cho tác dụng lên giấy bằng cách phun lên bề mặt giấy hoặc
nhúng giấy vào thuốc thử.
Với phương pháp vật lí, có thể hiện màu bằng cách soi vào đèn UV vì
nhiều hợp chất hữu cơ hấp phụ được các tia cực tím.

24

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

b, Sắc kí lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) là phương pháp phân tách các dung dịch chất
phân tách di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo
một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch
với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở các
vị trí khác nhau.
Chất hấp phụ thường được sử dụng trong SKLM là silicagel tráng trên
đế nhôm hay đế thủy tinh. Trong quá trình hấp phụ, sẽ xảy ra sự tranh giành
giữa dung môi và chất tan để chiếm chỗ trên bề mặt chất hấp phụ, và khi đạt
được cân bằng, mỗi chất tan sẽ chiếm ở mỗi vị trí khác nhau trên bản mỏng.
Để tiến hành sắc kí, chất tan được chấm lên bản thành từng vết chấm
nhỏ, sấy cho dung môi bay hơi hết rồi triển khai với hệ dung môi thích hợp
trong một bình triển khai kín. Để kiểm tra vết chất có thể sử dụng thuốc thử
hiện màu hoặc soi trên đèn UV. Thuốc thử hiện màu có thể là hơi ammoniac
hoặc dung dịch axit sunfuric 10%. Để hiện vết người ta nhúng bản vào thuốc
thử hoặc phun lên bản mỏng sau đó hơ bản trên bếp điện hoặc sấy nóng để vết
xuất hiện từ từ. Phương pháp này thường được sử dụng để kiểm tra và định
hướng cho sắc kí cột.
Một hình thức SKLM khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu hợp
chất tự nhiên là SKLM điều chế, dùng để điều chế, thu chất trực tiếp. Ở
phương pháp này, quá trình thực hiện tương tự SKLM và sau khi triển khai
xong, soi UV để xác định vết rồi cạo lấy lớp silicagel chứa chất cần điều chế,
tiến hành rửa giải để thu chất.
Ký hiệu DC-Alufolien 60 F254 có nghĩa là bản mỏng được tráng silicagel
có kích cỡ rỗng là 60 A0 (đọc là ăng-s-trông) và có trộn với chất phát huỳnh

quang ở bước sóng 254nm.

25