Phân lập, tuyển chọn và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho chủng acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học

Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Quyên

trờng đại học s phạm hà nội 2
khoa sinh ktnn
**********

phạm thị quyên

phân lập, tuyển chọn và tối u
hóa điều kiện nuôi cấy cho
chủng Acetobacter xylinum,
chế tạo màng sinh học

khóa luận tốt nghiệp đại học
Chuyên ngành: Vi sinh học
Hà Nội - 2008

Vĩnh Phúc, tháng 4 năm 2008

1


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Quyên

Lời cảm ơn
Để có được thành công của đề tài này, em đã nhận được sự giúp đỡ
quý báu, tận tình của các thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN, đặc biệt là cô giáo,

PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung v thy giỏo, TS. Nguyn Khc Thanh.
Đề tài còn có sự đóng góp của các bạn cùng nhóm vi sinh, sự giúp đỡ
của Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
Em xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất đến các thầy cô giáo. Xin chân
thành cảm ơn sự phối hợp, giúp đỡ của các bạn cùng nhóm vi sinh!

H Nội, ngày 29 tháng 4 năm 2008.
Sinh viên

Phạm Thị Quyên

2


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Quyên

LờI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng em, các số
liệu, kết quả trong khoá luận là trung thực, không trùng lặp với bất kỳ công
trình nghiên cứu nào khác./.
Hà nội, ngày 29 tháng 4 năm 2008
Sinh viên:

Phạm Thị Quyên

3

Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

môc lôc
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………..……………………..……………..Trang 06
CHƯƠNG 1………………………………………………………..………….………….………………..Trang 07
1.1. Lược sử nghiên cứu…………………… …….……… ………………………………….Trang 07
1.2. Phân loại Acetobacter………………….…… …………………………… ……………Trang 08
1.3. Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter……………………………..Trang 11
1.4. Một số đặc điểm của các nhóm vi khuẩn Acetobacter………....Trang 14
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…...… Trang 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu………………… ………………………………..………………Trang 17
2.2 Trang thiết bị và hóa chất………………… ……… ……….………….……………...Trang 17
2.3 Phương pháp nghiên cứu………………………… ………….… …………………….Trang 18
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………..….. ..Trang 31
3.1 Phân lập vi khuẩn Acetobacter
từ các nguồn nguyên liệu………………………………………………………..…….Trang 31
3.2 Tuyển chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum…….……….…….…….…Trang 34
3.3 Nghiên cứu động thái phát triển
của chủng Acetobacter xylinum N1 ………………….... ………….…………………Trang 41
3.4 Khảo sát sự thay đổi pH trong dịch nuôi cấy
của chủng Acetobacter xylinum N1…………… … …………….… ………..Trang 43
3.5 Khảo sát khả năng tạo màng ở
các môi trường nuôi cấy khác nhau………………….….………………..Trang 44
3.6 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy……………………………...…….………………..Trang 45
3.7 Xử lý màng và bước đầu dùng màng
để đắp lên vết thương hở ở thỏ và thử
nghiệm đắp mặt nạ dưỡng da ở một số phụ nữ…………….………..Trang 50

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ………………………………………………..…………………..Trang 56
Tµi liÖu tham kh¶o………………………………………………………………………Trang 57

4


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn
Danh môc b¶ng vµ h×nh

B¶ng
Bảng 1.1. Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter so
sánh với Pseudomonas
Bảng 2.1. Các môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng
Bảng 2.2. Ma trận thực nghiệm với 2 yếu tố
Bảng 2.3. Cách xử lý màng
Bảng 3.1. Hàm lượng axit axetic của một số chủng vi khuẩn Acetobacter
Bảng 3.2. Quan sát thời gian, đặc điểm màng tạo thành và đặc điểm khuẩn
lạc của các chủng vi khuẩn Acetobacter phân lập được
Bảng 3.3. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
Bảng 3.4. Thời gian nuôi cấy, số lượng tế bào
Bảng 3.5. Tỷ lệ pH và axit axetic trong dịch lên men
Bảng 3.6. Khảo sát khả năng tạo màng của chủng Acetobacter xylinum N1
trên các môi trường khác nhau
Bảng 3.7. Các yếu tố và mức khảo sát ở chủng Acetobacter xylinum N1
Bảng 3.8. Ma trận thực nghiệm chủng Acetobacter xylinum N1
Bảng 3.9. Mô hình thí nghiệm của chủng Acetobacter xylinum N1
Bảng 3.10. Bảng ma trận với lược đồ tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy chủng
vi khuẩn Acetobacter xylinum

Bảng 3.11. Các bước xử lý màng sinh học
Bảng 3.12. Bảng theo dõi tình trạng vết thương (cm2)
Bảng 3.13. Tỉ lệ lành vết thương (tính theo %)
Bảng 3.14. Phiếu nhận xét cho điểm của một số người thử nghiệm dùng
màng sinh học đắp mặt

5


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

H×nh
Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum
Hình 3.1. Ảnh khuẩn lạc thuộc nhóm III
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn hàm lượng axit axetic của một số chủng vi
khuẩn Acetobacter
Hình 3.3. Một số hình ảnh mẫu thu được qua thí nghiệm
Hình 3.4. Ảnh tế bào một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm III khi nhuộm
Gram.
Hình 3.5. Đồ thị sinh trưởng của chủng Acetobacter xylinum N1
Hình 3.6. Phần trăm axit axetic trong dịch lên men
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương ở thỏ
Hình 3.8. Tiến trình lành vết thương ở thỏ thí nghiệm

6


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn
ĐẶT VẤN ĐỀ

Acetobacter xylinum là một trong những chủng vi khuẩn mà con người
đã tìm ra và nhận thấy được ý nghĩa vô cùng to lớn của nó. Vi khuẩn
Acetobacter xylinum có khả năng tổng hợp polysacarit phân tử lớn cellulose.
Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng nó có thể hình thành lớp màng bao gồm
các sợi cellulose giống như sợi bông rất khỏe và hoàn toàn có thể co giãn
được trong môi trường nước nóng. Vì đặc tính đó mà màng này được sử dụng
chế tạo màng sinh học. Bản chất của màng sinh học được cấu tạo từ thành
phần chính là cellulose kết hợp với sinh khối của tế bào vi khuẩn Acetobacter
xylinum. Màng sinh học đảm bảo sự dẻo dai, độ bền, độ chắc khỏe bởi các sợi
cellulose được gắn kết với nhau hết sức chặt chẽ nhờ cầu nối là vi khuẩn
Acetobacter xylinum.
Từ những đặc tính quý giá của màng sinh học mà các nhà khoa học trên
thế giới đã tìm ra hàng loạt ứng dụng thực tiễn độc đáo trên rất nhiều các lĩnh
vực khác nhau: trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm ứng dụng làm thạch dừa,
trong y học ứng dụng làm màng thay thế da tạm thời, trong công nghệ mỹ
phẩm làm mặt nạ giúp tẩy trang, làm sáng da mặt, đặc biệt trong công nghệ
khoa học vật liệu mới đã ứng dụng sản xuất micro với độ chính xác cao, bảo
vệ môi trường… các ứng dụng này đã mang lại lợi ích thiết thực đối với con
người, bảo vệ sức khỏe cho con người. Đó được coi là một phát kiến mới cho
ngành vi sinh vật học, khẳng định vai trò, vị trí của ngành vi sinh vật học đối
với các ngành khoa học khác.
Với các ứng dụng thiết thực kể trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
“Phân lập, tuyển chọn và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho chủng
Acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học”.
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter từ các nguồn vật liệu khác nhau.

2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng sinh học
đạt yêu cầu: đủ mỏng, dai chắc, bề mặt nhẵn.
3. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum.
4. Chế tạo và ứng dụng màng sinh học để đắp lên vết thương hở ở thỏ
và dùng làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ.

7


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Lược sử nghiên cứu [6]
Từ rất lâu, con người đã biết cách làm giấm nhưng cơ sở khoa học của
quá trình làm giấm thế nào, giải thích ra sao thì lúc đó con người vẫn chưa
giải thích được, con người làm giấm chỉ đơn giản bằng kinh nghiệm thực tế
của mình.
Giấm (Vinaigre) là dung dịch nước chứa khoảng 3% axit axetic. Từ
Vinaigre bắt nguồn từ hai từ tiếng Pháp vin có nghĩa la vang, aigre là chua
nên có thể giả định rằng người đời xưa dùng giấm chỉ đơn giản là rượu vang
hỏng mà thôi. Nhưng đến những năm đầu của thế kỷ 19 thì con người đã biết
được giấm là sản phẩm của một nhóm vi sinh vật nhất định, xóa bỏ hoàn toàn
những nghi ngờ nêu trên. Ngày nay, người ta đã xác định nhóm vi sinh vật đó
là Acetobacter hay vi khuẩn axetic (vi khuẩn giấm).
Những công trình nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn axetic là của Person
1822. Ông đã chú ý đến lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và đã
chứng minh đó là một loại vi sinh vật có tên là Mycoderma aceti.

Đến năm 1837, Kiitzing làm thí nghiệm bằng cách loại bỏ hết các vi
sinh vật trong các bình giấm sẽ không được tạo thành. Từ đó, ông đã đi đến
kết luận: quá trình lên men giấm nhất thiết phải có vi sinh vật. Cũng trong
năm 1837 này, Hansen nhà bác học nổi tiếng người Đan Mạch đã tách được
từ màng giấm 2 loại vi khuẩn giấm thuần khiết là: Mycoderma aceti và
Mycoderma pasteurianum.
Đến năm 1862- 1868, Pasteur nhờ sự trợ giúp đắc lực của kính hiển vi
đã chứng minh sự đúng đắn trong nhận xét của Kiitzing và Hansen. Ông đã
dùng kính hiển vi nghiên cứu màng xuất hiện trên bia, rượu vang và khẳng
định màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn và ông cũng gọi nó là
Mycoderma aceti.

8


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

Những nghiên cứu sau này trên vi khuẩn Acetobacter, tiếp tục làm rõ
thêm quá trình lên men giấm. Hiện nay, người ta đang từng bước phân loại
Acetobacter thành các nhóm khác nhau, nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa
cũng như ứng dụng của từng nhóm đó.
1.2. Phân loại Acetobacter [6]
1.2.1. Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter
Để phân loại Acetobacter các tác giả dựa vào các tiêu chuẩn sau đây:
- Đặc điểm hình thái: đó là hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả
năng di động, màu sắc sự hình thành tiên mao, vỏ nhầy, màu sắc khi nhuộm
Gram…
- Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái, đặc điểm, đặc tính, tính chất,

màu sắc…đặc điểm của khuẩn lạc trên môi trường thạch, khi nuôi cấy trên
môi trường lỏng chú ý sự biến đổi của môi trường sau một thời gian nuôi cấy
(môi trường đục hay trong, có mùi thơm dễ chịu hay không mùi, màu sắc môi
trường vàng nâu hay vàng nhạt…)
- Các đặc điểm sinh hóa theo khóa phân loại của Frateur 1950:
+ Khả năng tạo catalase.
+ Khả năng tổng hợp các xeto từ các rượu bậc cao như: glierol,
manitol, sorbitol.
+ Khả năng oxi hóa axetat thành CO2 và H2O
+ Khả năng oxi hóa glucozơ thành gluconic
+ Khả năng sử dụng muối amôn làm nguồn nitơ trong môi trường
của hoyer và sử dụng rượu etylic làm nguồn cacbon.
+ Khả năng sử dụng sắc tố nâu.
+ Khả năng tổng hợp cellulose.
1.2.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter
Ngay từ thế kỷ XIX các tác giả đã tiến hành phân lập Acetobacter thành
các chủng thuần khiết và tiến hành phân loại chúng.

9


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

Trong đó khóa phân loại của Beijernck (1899) là đáng chú ý nhất, ông đã
chia vi khuẩn thành 4 nhóm cơ bản. Đến năm 1916, Janke đã kế tiếp công
trình của Beijerinck, Janke đã phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa trên hai dấu
hiệu cơ bản sau:
- Một là: khả năng sử dụng đạm amon để thực hiện quá trình sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn Acetobacter
- Hai là: có hay không có giai đoạn di động trong quá trình phát triển.
Khi nghiên cứu nơi sinh sống đặc trưng của vi khuẩn axetic năm 1926
Henenberg đã phân loại chúng thành 4 nhóm sau đây:
- Nhóm 1: vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa hublon có độc với chúng
- Nhóm 2 : vi khuẩn có khả năng phát triển trên bia
- Nhóm 3 : vi khuẩn phát triển trên dung dịch rượu vang
- Nhóm 4 : vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh
Đến năm 1934 theo nghiên cứu của các nhà vi khuẩn học Hoa kỳ vi
khuẩn Acetobacter có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của
cacbon và nitơ nên đã xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ Nitrobacteriaceae.
Đến năm 1936 các tác giả Kenyver, Wanneil, Staniel đã đề xuất ý kiến
ghép vi khuẩn Acetobacter vào học vi khuẩn Pseudomonas do chúng có hiện
tượng ghép cực xoắn ở phần di động.
Đến năm 1948, Vanghn đã công bố những kết quả thu được sau khi
quan sát sự di động của nhiều loại vi khuẩn: Acetobacter aceti, Acetobacter
pasteurianum, Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanognum.
Ông kết luận những loại trên cùng thuộc một loại có đơn mao ở cực và đã xác
định vị trí của vi khuẩn Acetobacter ở trong họ vi khuẩn Pseudomonadacae.
Cùng năm 1948, Krasilnicov với nghiên cứu về xạ khuẩn và vi khuẩn
cùng với tác giả người Mỹ trong các bài báo của mình đều thống nhất xếp vi
khuẩn Acetobacter vào họ vi khuẩn Pseudomonadaceae.

10


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

Năm1914, Bergeys đã phân chia các loài trong giống Acetobacter thành 2
loại:
- Loại 1 : có khả năng oxi hóa axit axetic thành CO2 và H2O loại này gồm:
+ Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch hoyer) đại
diện là vi khuẩn Acetobacter acetic.
+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất: trên bề mặt môi
trường dịch thể nuôi cấy có tạo màng nhầy chứa cellulose điển hình là vi
khuẩn Acetobacter xylinum; trên bề mặt môi trường dịch nuôi cấy không tạo
màng nhầy có chứa cellulose điển hình là Acetobacter rancenss, Acetobacter
pasteurianum, Acetobacter kneizgianus.
- Loại 2 : không có khả năng oxy hóa axit axetic
+ Tạo sắc tố trên môi trường glucozơ:


Sắc tố nâu đến đen nhạt: Acetobacter melanogeus



Sắc tố hồng: Acetobacter zancens

+ Không tạo sắc tố:


Nhiệt độ thích hợp nhất là giữa 30oCđến 35oC: Acetobacter
Suboxy dans



Nhiệt độ thích hợp nhất là giữa 18oCđến 21oC: Acetobacter
oxydans

Năm 1960, Shilwel và Car nghiên cứu về đặc trưng nuôi cấy sinh hóa
của vi khuẩn Acetobacter và đưa ra kết luận không có sự phân loại đồng nhất
vi khuẩn Acetobacter.
Những nghiên cứu đặc điểm về sự phân loại vi khuẩn Acetobacter này
đã tạo cở sở cho những nghiên cứu tiếp theo đồng thời là cơ sở cho việc ứng
dụng các chủng vi khuẩn này vào thực tiễn đời sống. Hiện nay, người ta đã sử
dụng vi khuẩn giấm một cách rộng rãi trên quy mô công nghiệp tạo ra nhiều
sản phẩm có ý nghĩa.

11


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

1.3. Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter
Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men axit
axetic. Dựa vào đặc điểm đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại học thấy rằng
chúng thuộc vào hai giống:
- Vi khuẩn Acetobacter có chu mao hoặc không có chu mao.
- Glucono bacter đơn mao.
Theo Bergey 1989 và Larpent et al 1990 Acetobacter và Gluconobacter là
2 giống vi khuẩn axetic quan trọng nhất của họ Acetobacteriacae. Hai giống
vi khuẩn trên gặp rất nhiều trong tự nhiên như ở trên bề mặt lá cây, hoa quả.
Cả 2 giống đó đều có khả năng tạo axit axetic từ rượu nhưng trong tế bào
Gluconobacter không có chu trình ATC nên không thể diễn ra quá trinh oxi
hóa axetat, thay vào đó có một số chu trình khác như chu trình Glyoxinat, quá
trình photphoril hóa, còn Acetobacter lại xảy ra các quá trình trên.

Khi so sánh hai giống trên với những vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas
thấy có nhiều nét tương đồng. Tuy nhiên chúng cũng khác với Pseudomonas
có những đặc điểm sau: có thể chịu độ axit cao hơn, khả năng chuyển hóa
pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di động hơn. Một số loài vi khuẩn axetic
khi sống trên môi trường nghèo dinh dưỡng hay thời gian nuôi cấy lâu ngày tế
bào dễ bị biến đổi hình thái (tế bào phình to, kéo dài hoặc phân nhánh).
Tuy nhiên, cơ sở để xếp vi khuẩn axetic vào nhóm độc lập là khả năng oxi
hóa rượu etylic thành axit axetic ở pH = 4,5. Ngoài ra chúng còn thực hiện
quá trình oxi hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường
và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit hữu cơ
tương ứng.Vi khuẩn axetic chỉ phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ
thích hợp từ 25oC-30oC, pH thích hợp từ 4,5- 6,8, hóa dị dưỡng hữu cơ.

12


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

Bảng 1.1. Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter
so sánh với Pseudomonas
Đặc điểm so sánh
1.Vị trí tiên mao
2. Phát triển ở pH =4,5
3.Oxi hóa etanol pH =4.5
4.Oxi hóa axit axetic
5.Oxi hóa lactac
6.GlucozaGluconate
7.Sử dụng tinh bột

lactose
8.Sử dụng gelatin
9. Sắc tố huỳng quang

Gluconobacter
Đơn mao ở cực
hoặc không
+
+
+

Acetobacter
Chu mao hoặc
không có
+
+
+
+
+/-

Pseudomonas

-

-

+/-

-

-

+/+/-

Chu mao
+
+
+/-

Ghi chú: dấu (+): có
dấu (-) : không
dấu(+/-): có hoặc không
Về hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter là những trực khuẩn hình que
hay hình elip, kích thước từ 0,6 - 0,8μm. Các tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp
thành chuỗi hoặc có loại tế bào hình cầu, có loại hình chỉ.
Tùy thuộc vào điều kiện môi trường, nhiệt độ nuôi cấy một số loại có
hình bán nguyệt. Vi khuẩn Acetobacter không có khả năng sinh bào tử, tạo
màng nhầy, một số có khả năng di động nhờ tiên mao, một số không có khả
năng này.
1.3.1. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter
Có rất nhiều nghiên cứu về khuẩn lạc, trên môi trường đặc vi khuẩn
axetic phát triển thành các khuẩn lạc tròn đều đặn, đường kính khuẩn lạc
trung bình là 3mm, riêng có một số loài như: Acetobacteraceti, Acetobacter
xylinum có khuẩn lạc nhỏ hơn (đường kính d = 1mm), bề mặt trơn bóng, ở
giữa khuẩn lạc dày hơn và màu sắc đậm hơn các phần xung quanh.

13


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

Nhưng với một số loài khác khuẩn lạc lại lớn hơn (đường kính d = 4,5)
bề mặt trơn nhẵn không màu, mỏng, như những hạt sương nhỏ, có thể dùng
que cấy tách ra khỏi môi trường dễ dàng. Tuy nhiên cũng có khuẩn lạc ăn sâu
vào môi trường khó có thể gạt ra bằng que cấy.
1.3.2. Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng
Sự hình thành màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường dịch rất
đa dạng, trên bề mặt môi trường dịch có thể tạo nên các loại màng có độ dày
mỏng khác nhau.
Có loại màng dày như sứa, nhẵn và trơn, khi lắc nhẹ sẽ chìm xuống đáy
bình và có thể tiếp tục hình thành nên lớp màng mới, có loại màng mỏng như
các tờ giấy xelofan, dai, nhẵn, khi lắc cũng chìm xuống đáy bình và tiếp tục
hình thành nên lớp màng mới, dịch nuôi cấy trong, có mùi thơm dễ chịu. Khi
nghiên cứu các màng này thấy có nhiều sợi cellulose giống như các sợi bông,
chắc khỏe được đan với nhau bởi chính các vi khuẩn Acetobacter tạo nên độ
dẻo dai, tính đàn hồi tốt và độ chắc khỏe của màng.
Có những loại màng lại rất mỏng, dễ vỡ, không nhẵn hoặc nhăn nheo,
bám theo thành bình, dịch nuôi cấy thường đục có màu vàng nâu, không
trong, không có mùi thơm dễ chịu, từ những quan sát về khuẩn lạc và các loại
màng ở trên cũng góp phần sơ bộ định loại các loài của vi khuẩn Acetobacter.
1.3.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi khuẩn Acetobacter có nhu
cầu đối với một số chất dinh dưỡng và sinh trưởng rất phong phú. Nguồn
cacbon có thể được cung cấp từ các hợp chất đường, rượu etylic và các axit
hữu cơ. Vi khuẩn Acetobacter có thể sử dụng các muối amon làm nguồn cung
cấp nitơ. Các chất kích thích sinh trưởng như: axitamin (izoloxin, alanin,
prolin, valin), β-aminobenzoic, axit nicotinic, axit pantotenic, axit folic,
biiotin, nicotinamid…đều có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn Acetobacter.

14


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

Một số vi khuẩn Acetobacter (Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti…)
có khả năng tự tổng hợp các polisaccarit phân tử lớn như cellulose, dextran…
điển hình là vi khuẩn Acetobacter xylinum có thể tổng hợp được những sợi
cellulose giống như những sợi bông.
1.3.4. Con đường chuyển hóa cacbon
Nghiên cứu về khả năng chuyển hóa cacbon các tác giả đã đi đến kết
luận vi khuẩn axetic có thể oxi hóa cacbon theo những con đường sau:
- Con đường thứ nhất: không có sự photphoril hóa cơ chất và sự tham
gia của các enzim đặc hiệu.
- Con đường thứ hai: oxi hóa cơ chất đã được photphoril hóa trong con
đường pentozo photphat.
- Con đường thứ ba: Entner-Doudoroff( ED).
- Con đường thứ tư: chu trình krebs hoặc glyoxinat.
1.4. Một số đặc điểm của các nhóm vi khuẩn Acetobacter
1.4.1. Acetobacter aceti
Trực khuẩn ngắn hình que, xếp thành chuỗi dài, kích thước 0,4 - 0,8 x
1,0 - 1,2μm không di động, bắt màu gram âm, bắt màu hồng với thuốc nhuộm
iot, khuẩn lạc sáng, trên nền gelatin, dịch lên men chứa 10% đường saccarozơ
tạo thành màng nhầy nhẵn, chúng có khả năng phát triển trên môi trường có
nồng độ rượu cao (11%) và có thể tích lũy đến 6% axit axetic trong môi
trường, chúng thường phát triển là bia với nhiệt độ thích hợp là 30oC.

1.4.2. Acetobacter xylinum
Trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2μm, tế bào đứng riêng rẽ hoặc
xếp thành từng chuỗi, không di động được. Các tế bào được bao bọc bởi chất
nhầy tạo màng nhẵn và khá dai, màng này bắt màu xanh với thuốc nhuộm iot
vì màng này có chứa cellulose tích lũy được khoảng 4% axit axetic trong môi
trường, Acetobacter xylinum thường sống chung với nấm men trong một loại

15


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

nước giải khát dân gian làm bằng nước chè đường loãng gọi là “thủy hoài
sâm”, người Trung Quốc gọi là “hải bảo” hay “ vị bảo”, người Nga gọi là
“nấm chè”.

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum
1.4.3. Acetobacter Suboxydans
Có dạng hình que ngắn, không có khả năng di động, đứng riêng lẻ hay
xếp thành chuỗi ngắn, tạo thành những váng mỏng dễ vỡ. Có khả năng
chuyển hóa glucozơ thành axit gluconic, sobit thành socboza. Để phát triển tốt
cần được cung cấp paraamino benzoic, axit pantotelic và axit nicotilic.
1.4.4. Acetobacter acetosum
Trực khuẩn có kích thước từ 0,7- 0,9 x 1,5- 1,8μm, hay đứng riêng rẽ,
không di động. Khuẩn lạc trên môi trường nước chiết đậu nành dạng hạt nhỏ,
tròn, màu sáng, sau đó chuyển thành màu nâu. Khuẩn lạc trên thạch với dịch
lên men: tròn, màu trắng sữa về sau chuyển thành màu nâu, phía mép ngoài
khuẩn lạc màu vàng nhạt có thể chuyển hóa axit gluconic từ dextroza, nhiệt

độ thích hợp cho sự phát triển là 30oC-35oC.
1.4.6. Acetobacter orleanense
Trực khuẩn dài vừa phải, không di động, khi gặp nhiệt độ cao có thể sinh
ra các tế bào dị hình: tế bào kéo dài hay phình to hơn. Có khả năng phát triển
được trên môi trường có nồng độ rượu cao từ 10%- 12% và tích lũy được
9,5% axit axetic, nhiệt độ thích hợp 25oC- 30oC.

16


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

1.4.7. Acetobacter plancatum
Trực khuẩn kích thước 0,4 - 0,6 x 1,4- 1,6μm, tế bào có thể tạo thành
những dạng phình to, kéo dài, không di động. Khuẩn lạc tròn đều, hơi lồi lên,
sáng, ẩm ướt, nhớt, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 25oC- 30oC.
1.4.8. Acetobacter asendens
Trực khuẩn không di động, khuẩn lạc trên glucozơ, gelatin khô trắng, có
vầng sáng chói. Trên môi trường lỏng tạo thành màng dầy, chắc, hướng lên
thành bình, nhiệt độ thích hợp là 25oC.
1.4.9. Acetobacter lindrenii
Trực khuẩn đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, không di động, một số tế
bào phồng to như hình cầu. Khuẩn lạc trên gelatin với dịch lên men: nhỏ,
tròn, màu vàng. Ở trên môi trường lỏng váng màu vàng nâu, nhớt, nhiệt độ
thích hợp cho phát triển là 25oC.
1.4.10. Acetobacter Shiitzenbachii
Tế bào hình que: 0,3 - 0,4 x 1,0 - 3,6μm, đứng riêng lẻ hay xếp thành đôi,
có thể tạo thành những tế bào đặc biệt. Ở môi trường già có thể tạo thành váng

dày, không bền vững, axit axetic tích lũy được trong môi trường khoảng 11,5%.
1.4.11. Acetobacter kiitzingianum
Có màng nhầy, nhẵn ở mép và được nâng lên theo thành bình. Tế bào
dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động. Khuẩn lạc trên gelatin với dịch
lên men nhớt, nhỏ, tạo thành màng xếp nếp to trên môi trường ẩm, thích hợp
phát triển ở 30oC.

17


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn
CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật thuần khiết được phân
lập ở màng các nguồn nguyên liệu nhờ quá trình lên men giấm từ: bia, rượu
vang, dịch hoa quả. Từ các chủng này chúng tôi đã tiến hành tuyển chọn ra
được một chủng vi khuẩn có khả năng cho màng mỏng nhất: chủng
Acetobacter xylinum N1, sau đó tối ưu điều kiện nuôi cấy cho vi khuẩn này,
ứng dụng vi khuẩn trong chế tạo màng sinh học.
2.2. Trang thiết bị và hóa chất
2.2.1. Trang thiết bị [1] [2] [3]
Khi tiến hành nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng những thiết bị và dụng
cụ hộp lồng, ống nghiệm, bàn trang thủy tinh, phễu thủy tinh, cốc thủy tinh,
que cấy, đèn cồn, lam kính, lamen, bình cầu, bình tam giác, pipet, nồi hấp,
Autovlave, buồng vô trùng, tủ sấy, cân phân tích, kính hiển vi quang học có
độ phóng đại 1000 lần, máy lắc, máy li tâm, máy Vontex… và một số thiết bị

khác.
2.2.2. Hóa chất [1] [2] [3]
Các chất thông dụng: Glucozơ (C6H12O6), cao nấm men, cao thịt,
pepton, axit axetic, rượu etylic, NaOH, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, KH2PO4,
KHPO4, CaCO3, agar, phenolphtalein, thuốc nhuộm tím gentian, dung dịch
fucshin, dung dịch lugol…
2.2.3. Môi trường[5]
2.2.3.1. Môi trường phân lập vi khuẩn giấm (MT1)
Glucozơ: 20g
KH2PO4: 2g
CaCO3: 7g

18


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

Axit axetic: 2% (bổ sung sau khử trùng)
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khử trùng)
Nước máy: 1000 ml
(NH4)2SO4: 3g
MgSO4.7H2O: 2g
Agar: 20g
2.2.3.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)
Glucozơ: 20g

(NH)4SO4:

KH2PO4: 2g

MgSO4.7H2O: 2g

Pepton:

Axit axetic:

2% (bổ sung sau khi khử trùng)

Rượu etylic:

2% (bổ sung sau khi khử trùng)

6g

Nước máy: 1000ml

3g

2.2.3.3. Các môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng (MT3, MT4,
MT5, MT6)
Bảng 2.1. Các môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng
TT
01

Thành phần
Glucozơ

MT3

MT4

MT5

MT6

20g

20g

0

20g

02

(NH)4SO4

3g

3g

5g

4g

03

KH2PO4

2g

2g

2g

1g

04

MgSO4.7H2O

2g

2g

0

0

05

Axit axetic

2%

2%

5ml

2,5ml

06

Rượu etylic

2%

2%

0

0

07

Cao nấm men

0

5g

3g

0

08

Pepton

0

6g

2g

0

09

Nước mía ép

0

0

200ml

0

10

Nước dừa

0

0

0

100ml

11

Nước máy

1000ml

1000ml

800ml

0

19


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phương pháp của Vino Gradski
[1] [2] [3]
Để thu được những chủng vi khuẩn Acetobacter chúng tôi tiến hành
phân lập từ các nguồn nguyên liệu là bia hơi, rượu vang, dịch hoa quả theo
phương pháp phân lập của VinoGradski.
Trước khi tiến hành phân lập cần thực hiện quá trình lên men giấm từ các
nguồn nguyên liệu trên, các nguồn nguyên liệu này được đựng trong các hình

tam giác khác nhau, tiến hành lên men giấm sau 4 đến 5 ngày thì xuất hiện một
lớp màng màu trắng trên bề mặt. Tiếp theo, lấy màng đó đưa vào môi trường số
3. Môi trường này được pha chế đầy đủ các thành phần, khử trùng trong nồi
hấp Autolave ở 0,5atm, để nguội, chia vào các hình cầu hoặc hình tam giác.
Sau khi thả màng vào giữ ở tủ ấm 28oC đến 300C trong 4 đến 5 ngày,
trên môi trường xuất hiện một lớp màng mới. Tiến hành vớt màng này rửa qua
bằng nước cất, sau đó lấy một chút màng đã được rửa cho vào các ống nghiệm
chứa nước cất thanh trùng rồi đưa vào máy Vôntex lắc đều trong một phút thu
được các ống nghiệm chứa mẫu màng gốc. Từ các ống nghiệm chứa mẫu màng
gốc, chúng tôi tiến hành phân lập để thu nhận vi khuẩn Acetobacter.
Khi tiến hành phân lập cần pha loãng nồng độ vi sinh vật bằng phương
pháp pha loãng của Pasteur: chuẩn bị 10 ống nghiệm đậy nút bông đã sấy khử
trùng, nước cất 2 lần, tiến hành thao tác pha loãng ở trong bốc cấy vô trùng. Sử
dụng pipet vô trùng chia vào các ống nghiệm đã vô trùng mỗi ống nghiệm
9ml dung dịch nước cất 2 lần, sau đó lấy pipet vô trùng hút 1ml dịch từ ống
nghiệm chứa mẫu màng gốc cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nút bông lại
rồi lắc đều bằng máy Vôntex trong 1 phút sẽ thu được ống nghiệm chứa dịch
pha loãng mức 10-1. Tiếp theo, lại hút 1ml dịch ở ống có độ pha loãng 10-1
cho vào ống nghiệm thứ hai với các thao tác lặp lại như trên sẽ thu được dịch

20


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

pha loãng mức 10-2, cứ như vậy sẽ thu được các dịch pha loãng từ 10-1 đến
10-10 Căn cứ vào số lượng vi khuẩn có trong mẫu chúng tôi chọn mẫu có độ
pha loãng 10-4 - 10-6 để tiến hành các bước tiếp theo. Sau đó phân lập trên môi

trường thạch đĩa: chuẩn bị môi trường 1 hấp khử trùng và đổ vào các hộp
petri để nguội, dùng pipet vô trùng hút 100µl dịch màng đã chuẩn ở trên( có
độ pha loãng 10-4- 10-6) nhỏ vào hộp petri, sau đó dùng que trang dàn đều trên
khắp bề mặt thạch. Bao gói cẩn thận, cất trong tủ ấm ở 28oC - 30oC. Sau 3-4
ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc các đặc điểm về hình dạng, kích thước, màu
sắc, độ trơn bóng.
Tách các khuẩn lạc đứng riêng rẽ cấy vào ống thạch nghiêng (môi
trường 1 đã loại CaCO3) đã được vô trùng, sau đó chuyển các ống nghiệm đã
được cấy khuẩn lạc vào tủ ấm 28oC-30oC. Sau 3- 4 ngày lấy các khuẩn lạc ở
ống nghiệm đó quan sát và làm tiêu bản nhuộm tế bào bằng phương pháp
nhuộm Gram.
2.3.2. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter cho
màng mỏng theo phương pháp của Graixnôp [1] [2] [3]
Trước khi tuyển chọn cần phải nhân giống các chủng vi khuẩn bằng cách:
từ các khuẩn lạc đã chọn trên môi trường thạch đĩa, dùng que cấy đầu tròn (đã
khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn) gợt lấy khuẩn lạc cấy trên môi trường thạch
nghiêng (môi trường 1) theo đường ziczắc. Mỗi ống nghiệm là một mẫu riêng
biệt tương ứng với từng khuẩn lạc và được mã hóa bằng kí hiệu riêng. Để vào
tủ ấm 4-5 ngày các vi khuẩn sẽ phát triển theo đường cấy. Tiếp theo là tuyển
chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter trong môi trường oxi hóa. Môi trường
oxi hóa dùng để tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter là môi trường lỏng.
Dựa trên khả năng tạo màng của các mẫu vi khuẩn trên môi trường dịch
thể tuyển chọn sau 3 lần liên tiếp chúng tôi chọn ra những chủng có khả năng
tạo màng tốt nhất.

21


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

Để giữ giống cần tiến hành chuyển giống từ ống thạch nghiêng này sang
ống thạch nghiêng khác với chu kì là 2 tháng.
2.3.3. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter
thuần khiết
2.3.3.1 Tuyển chọn vi khuẩn theo phương pháp thử khả năng ôxy
hóa etanol trên 2 môi trường A và B [9]
Sau khi đã có các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng mỏng, dai,
chắc trên môi trường oxi hóa chúng tôi tiến hành tuyển chọn vi khuẩn
Acetobacter thuần khiết dựa trên những đối chiếu định loại đặc điểm khuẩn
lạc trên hai môi trường A và B
Môi trường A
Môi trường B
- Dịch chiết nấm men 3%
- Dịch chiết nấm men 3%
- Rượu etylic 15% - 2ml
- Rượu etylic 15%- 2ml
- CaCO3 2%
- Xanh lục bromocresol 2,2% - 1ml
- Agar 20g
- Agar 20g
Môi trường A: nuôi cấy vi khuẩn axetic nếu là Gluconobacter thì có một
vòng sáng xung quanh khuẩn lạc nếu là Acetobacter thì vòng sáng rõ hơn và
có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc hướng về phía vòng sáng.
Môi trường B: nuôi cấy vi khuẩn axetic nếu là Gluconobacter làm môi
trường biến đổi thành màu vàng, nếu là Acetobacter cũng làm môi trường
biến đổi thành màu vàng nhưng có một màu xanh lơ do quá trình oxi hóa axit.
2.3.3.2. Phân biệt tế bào vi khuẩn Acetobacter bằng phương pháp
nhuộm Gram [1] [2] [3]

Vi khuẩn Acetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể phân biệt tế
bào vi khuẩn Acetobacter nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép), lấy
màng mỏng, dai, màu trắng hoặc dịch nuôi cấy trong môi trường thạch
nghiêng làm tiêu bản.
Phương pháp nhuộm Gram gồm các bước sau:

22


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

- Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa bằng HCl hoặc H2SO4 rồi
rửa lại bằng cồn, nước cất và lau khô.
- Nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy khử trùng trên
ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy một ít màng mỏng ,dai, màu trắng hoặc dịch
nuôi cấy hoăc giống vi khuẩn hòa vào giọt nước vô trùng đó, hơ qua trên
ngọn lửa đèn cồn để cố định vết bôi (cách ngọn lửa đèn cồn 10- 15cm).
- Đặt lên trên vết bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tím Gentian giữ
trong 1-2 phút.
- Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho thuốc nhuộm chảy xuống, nhỏ
dung dịch lugol lên trên vết bôi, giữ trong vòng 5 phút.
- Rửa tiêu bản bằng nước, rửa bằng cồn (20 giây) sau đó rửa tiếp bằng nước.
- Nhỏ dung dịch fucschin nên giữ trong 1-2 phút.
- Rửa tiêu bản bằng nước hong khô tự nhiên.
Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn Gram
âm( Gr-) với vi khuẩn Gram dương( Gr+). Nếu sau khi nhuộm kép mà tế bào
bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr-. Ngược lại nếu bắt màu tím thì đó là vi
khuẩn Gr+. Khả năng bắt màu của vi khuẩn Gr- và Gr+ khác nhau là do chất

nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gr+ được cấu tạo từ một loại prôtêin đặc biệt
chứa muối nuclêatmagiê có khả năng tạo tím với Gentian và lugol một phức
chất bền khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế bào vi
khuẩn Gr+ bắt màu tím của Gentian trong khi đó những vi khuẩn Gr- không có
khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm Gentian và lugol nên dễ bị rửa
trôi bởi cồn. Do đó khi nhỏ Fucshin lên tế bào vi khuẩn Gr- bắt màu hồngmàu của Fucshin.
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
cho màng mỏng [5]
Mục đích nghiên cứu là tuyển chọn được những chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai để chế tạo màng sinh học dùng cho
trị bỏng và dùng đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ. Do vậy tuyển chọn chủng
vi khuẩn Acetobacter xylinum thông qua các chỉ tiêu sau:

23


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

- Kích thước và hình dạng tế bào qua nhuộm Gram.
- Kiểm tra các đặc tính sinh hóa.
- Quan sát quá trình tạo màng.
- Kiểm tra tính chịu lực của màng tạo thành.
2.3.5. Phương pháp xác định số lượng tế bào của các chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum bằng phương pháp đo mật độ quang (Optical Density- OD)
Lấy 1ml dịch nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum cho vào ependof,
li tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút để loại bỏ dịch. Phần cặn là các tế bào
lắng xuống, ta giữ lại và bổ sung 1ml nước cất vô trùng rồi lắc đều bằng máy
Vontex, tiếp tục li tâm 10000 vòng/ phút, lặp lại liên tiếp 3 lần. Sau đó ta thu

phần cặn tế bào rồi hòa tan vào 1ml nước cất vô trùng, lắc đều bằng máy
Vontex thu được dung dịch huyền phù vi khuẩn Acetobacter xylinum. Pha
loãng dịch huyền phù đó ở các độ pha loãng khác nhau. Ở nồng độ pha loãng
10-4-10-7 hút 100μl dịch huyền phù trên trang đều vào các hộp petri có đổ môi
trường đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm sau 4 ngày đếm số lượng khuẩn lạc.
Phần dịch ở mỗi độ pha loãng khác nhau đó đem đo OD610, mỗi thí nghiệm
lặp lại 3 lần. Từ đó thiết lập mối tương quan giữa giá trị OD với số lượng tế
bào vi khuẩn (thông qua đếm số lượng khuẩn lạc).
2.3.6. Xác định khả năng tổng hợp axit axetic của vi khuẩn
Acetobacter bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenol phtalein làm chất chỉ
thị màu (phương pháp Therme)[6]
Cho vào cốc thủy tinh (loại 100ml hoặc 200ml) 10ml dịch lên men,
thêm vào đó 1-2 giọt phenol phtalein chuẩn độ bằng NaOH 0,1N. Chú ý khi
chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhẹ là
được. Sau đó tính số gam axit axetic trong 100ml dung dịch lên men theo
công thức:

X=

V.K.100
(g/ml)
10

24


Khãa luËn tèt nghiÖp

Ph¹m ThÞ Quyªn

Trong đó: X: số gam axit axetic trong 100ml dung dịch lên men
V: số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 10ml dung dịch
lên men.
K: lượng axit axetic tương ứng với 1ml NaOH 0,1 N
10: số ml dịch lên men đem chuẩn độ
2.3.7. Phương pháp quy hoạch toán học thực nghiệm (phương pháp
Box- Wilson) [4] [6] [8]
Phương pháp Box- Wilson là phương pháp dẫn dắt các yếu tố đến vùng
tối ưu hóa khi các biến số thay đổi cùng một lúc. Phương pháp này cho phép
xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình lên men axetic, sự phát
triển của vi khuẩn Acetobacter xylinum đồng thời tạo màng sinh học. Phương
pháp này gồm 2 bước:
2.3.7.1. Thiết lập mô hình toán học
Thiết lập mô hình toán học cho phép thấy được mối liên hệ giữa hàm liên
tục với các kiến thức dưới dạng mặt đồng mức.
Mặt đồng mức có thể được biểu diễn bằng phương trình hồi quy có dạng:
y = b0 + b11 + b22 + … + bin
Trong đó:

y:

Hàm mục tiêu

n:

Biến số mã (kod)

bi:

Các hệ số

(1)

Phương pháp Box-Wilson chỉ có hiệu quả khi mô hình tuyến tính, các
hệ số của phương trình đều có nghĩa. Nếu hệ số nào không có nghĩa thì cần
loại khỏi mô hình.
Để thiết lập mô hình toán học bằng phương pháp toán học thực nghiệm
thì phải tiến hành các bước sau: (6 bước)
- Xác định các chỉ tiêu để tối ưu.
- Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiêu tối ưu.

25