Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dưỡng da

Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

Lời cảm ơn
Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, em đã nhận đợc sự hớng dẫn, chỉ
bảo tận tình của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung, các thầy cô giáo bộ môn Vi
sinh. Đồng thời em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Sinh
KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, anh, chị đang học tập và làm
việc tại phòng thí nghiệm trờng Đại học S phạm Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình
và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng em xin chân thành đợc cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm,
động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội , ngày.thángnăm 2009
Sinh viên thực hiên

Hoàng Thị Hạnh

Mục lục
Hong Thị Hạnh

-1-

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học
Trang

Mở Đầu

Chơng 1. Tổng quan tài liệu

4

1.1. Lợc sử nghiên cứu và phân loại vi khuẩn Acetobacter

4

1.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter

7

1.3. Một số đặc điểm của các nhóm vi khuẩn Acetobacter

11

Chơng 2. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng nghiên cứu

15

2.2. Trang thiết bị và hoá chất

15

2.3. Môi trờng

16

2.4. Phơng pháp nghiên cứu

17

Chơng 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

26

3.1. Phân lập vi khuẩn axetic từ một số nguồn nguyên liệu

26

3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn A. xylinum cho màng mỏng

31

3.3. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum

36

3.4. Khảo sát khả năng tạo màng của chủng A. xylinum C5 ở
các môi trờng nuôi cấy khác nhau

39

3.5. Khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn A. xylinum C5 ở

các thời gian nuôi cấy khác nhau

40

3.6. Xử lý màng BC và bớc đầu thử nghiệm làm mặt
nạ dỡng da ở một số phụ nữ

41

Kết luận V kiến nghị
1. Kết luận

47

2. Kiến nghị

47

Ti liệu tham khảo

48

Hong Thị Hạnh

-2-

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

Lời cam đoan
Tôi xin khẳng định đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân tôi, tất
cả những số liệu đều đợc thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn
toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt. đề tài nghiên cứu này không trùng với
công trình nghiên cứu của các tác giả khác.

Tác giả
Hoàng Thị Hạnh

Danh mục từ viết tắt

Hong Thị Hạnh

-3-

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

Từ viết tắt

Từ đầy đủ

A. xylinum

Acetobacter xylinum

BC

Bacterial Cellulose

CNSH

Công nghệ sinh học

C5

Acetobacter xylinum C5

EM

Effective Micorgamisms

MPA

Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm
định

Hong Thị Hạnh

-4-

Lớp 31b Sinh- KTNN

Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

Danh mục bảng v hình
Bảng

Trang

Bảng 1.1. Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter

9

so sánh với Pseudomonas.
Bảng 3.1. Hàm lợng axit axetic của một số chủng Acetobacter.

30

Bảng 3.2. Quan sát thời gian, đặc điểm màng tạo thành và đặc điểm
khuẩn lạc của các chủng Acetobacter phân lập đợc.

32

Bảng 3.3. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum.

33

Bảng 3.4. Khảo sát khả năng tạo màng vi khuẩn Acetobacter xylinum.

35

Bảng 3.5. Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trờng khác nhau.

39

Bảng 3.6. Khảo sát khả năng tạo màng ở các thời gian khác nhau.

40

Bảng 3.7. Phiếu nhận xét cho điểm của một số ngời thử nghiệm
dùng màng BC đắp mặt.

45

Hình
Hình 2.1. Tế bào một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm III 21
Hình 3.2. Mẫu dịch lên men giấm

27

Hình 3.3. Khuẩn lạc vi khuẩn axetic của 3 mẫu phân lập 28
Hình 3.4. Khả năng phân oxy hoá axetat của vi khuẩn axetic

30

Hình 3.5. Khuẩn lạc C5 37
Hình 3.6. Vòng phân giải CaCO3 của C5
Hình 3.7. Màng BC của C5

37

37

Hình3.8. Tế bào C5 nhuộm Gram

37

Hình 3.9. Khả sát khả năng tạo màng ở các môi trờng lên men 38
Hình 3.10. Khả năng kháng khuẩn của màng BC tẩm mật ong

Hong Thị Hạnh

-5-

42

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

Mở Đầu
1. Lý do chọn đề tài
Ngy nay cùng vi s phát trin ca khoa hc k thut v công ngh,
công ngh sinh hc (CNSH) ã tr thnh mt ngnh kinh t ch o ca nhiu
quc gia trên th gii. L mt b phn ca ngnh CNSH, công ngh vi sinh
hc ã v ang phát trin mnh m vi nhng ng dng thit thc vo cuc

sng nh: công nghip, nông nghip, y hc . Bng vic ng dng các quá
trình lên men vi sinh vt vo sn xut các ch phm, chúng ta ã tn dng v
tit kim c chi phí trong vic gii quyt rt nhiu vn nh nông nghip,
công nghip, bo v môi trng. Vì vậy, việc nghiên cứu các quá trình lên
men, các đặc tính hoá, sinh học của các chủng vi khuẩn đang đợc nhiều
ngời quan tâm. Một trong những chủng vi khuẩn đang đợc nghiên cứu là vi
khuẩn Acetobacter (còn gọi là vi khuẩn giấm).
Khi nuôi cy loi vi khun Acetobacter trên b mt môi trng lng nó
to thnh mt lp mng có bn cht l hemixenluloza trên b mt thoáng ca
dung dch còn gọi là màng BC (màng sinh học, bacterial cellulose, BC).
Mng ny c dùng lm ra nhng si t to kho v có n hi cao
trong môi trng nc nóng. Mng ny c xem nh mt nguyên liu mi
có tim nng ng dng sn xut n kiêng v tráng ming
Trong công nghip, nông nghip vi khun ny c dùng sn xut
EM (Effective Micorgamisms) có tác dng a hiu trên nhiu lnh vc c
bit trong lnh vc x lý rác thi: EM giúp kh mùi hôi v gim chi phí 10 ln
so vi t rác. Trong công nghip sn xut giy cht lng cao ngi ta ã s
dng nguyên liu là mng BC to thnh trong quá trình nuôi cy vi khun
gim. Trong công nghip thc phm, vi khuẩn Acetobacter (chng vi khun
Acetobacter xylinum) c s dng sn xut thch da - mt món n giu
dinh dng v khá ph bin hin nay.

Hong Thị Hạnh

-6-

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

Các nh khoa hc khi nghiên cu nhng tính nng c bit nh: bám
chc trên b mt ngay khi nc bc hi, không cho nc thm qua nhng li
cho hi nc di chuyn, có kh nng ngn cn vi khun, thay th da tm thi.
Vì vy, mng BC c coi l nguyên liu quý trong y hc dùng lm da
nhân to, mng mch máu, mt n dng da cho ph n. Nó có th thay th
da tm thi cho nhng bnh nhân bng t cp 1 n cp 4. Ch riêng
Vin bng Quc gia H Ni mi nm phi tip nhn hn 4.000 ca bng. Vi
các bnh nhân b bng nng thì chi phí cho các tm mng p lên vt bng rt
cao. Ngoi ra, các loi mng dùng p lên vt thng h v mng dùng
p mt n dng da cho ph n u phi nhp ngoi vi giá t 30.00045.000 ng /1 chic. Trong khi đó mng BC ny hon ton có th sn xut ở
trong nc bng quá trình lên men nhờ vi khun Acetobacter xylinum.
Xã hi cng phát trin thì nhu cu lm p cng c quan tâm v mt
n dng da c ch to bng quá trình lên men ca vi khun vi rt nhiu
u im l s la chn ca nhiu ch em phụ n. Vì vy, xut phát t thc
tin v nhu cầu s dng mng BC trong nc, hp vi lý lun c tìm hiểu ở
trên, trên c s k tha các kt qu nghiên cu ca mt s tác gi trong v
ngoi nc, ng thi cn c vo iu kin c s nghiên cu chúng tôi tin
hnh nghiên cu ti: Phân lp, tuyn chn vi khun Acetobacter
xylinum, chế tạo mt n dng da.
2. Mục tiêu của đề tài
+ Phân lập vi khuẩn axetic từ một số nguồn nguyên liệu
+ Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng
+ Xử lý màng BC và bớc đầu thử nghiệm làm mặt nạ dỡng da
3. Nội dung của đề tài
Nội dung của đề tài Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum,
chế tạo mặt nạ dỡng da để tìm hiểu đặc điểm, hình thái của vi khuẩn

Hong Thị Hạnh

-7-

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

Acetobacter, từ đó phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
cho màng mỏng theo hớng chế tạo mặt nạ dỡng da.
4. ý nghĩa của đề tài
Đề tài cho phép phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả
năng tạo màng mỏng, từ đó chế tạo mặt nạ dỡng da cho phụ nữ.

Hong Thị Hạnh

-8-

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

Chơng 1
Tổng quan tI liệu

1.1. Lợc sử nghiên cứu và phân loại vi khuẩn giấm
Từ rất lâu trong lịch sử con ngời đã biết cách làm giấm song cha nắm
đợc cơ sở khoa học, càng không thể giải thích đợc bằng cách nào rợu
loãng lại có thể biến thành giấm ăn. Cho đến đầu thế kỷ XIX, khi khoa học kĩ
thuật phát triển, đặc biệt với sự ra đời của kính hiển vi, thế giới vi sinh vật
đợc khám phá, con ngời mới biết đợc giấm là sản phẩm của quá trình lên
men nhờ một nhóm vi sinh vật mà ngày nay ngời ta gọi chúng là vi khuẩn
Acetobacter hay vi khuẩn axetic [4,5].
Năm 1822, Peson đã tiến hành những nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn
Acetobacter từ lớp màng thu đợc trên bề mặt các bình sản xuất giấm. Ông
khẳng định đó là một loại vi sinh vật và gọi là Mycoderma aceti [7].
Năm 1837, Kiitzing sau khi loại bỏ hết vi sinh vật trong chum làm giấm
và thấy rằng giấm không đợc tạo thành nữa. Ông đã đa ra nhận xét: quá
trình lên men giấm nhất thiết phải có mặt vi sinh vật nếu không sẽ không diễn
ra chuyển hoá rợu thành giấm. Cũng năm 1837, Hansen (ngời Đan Mạch)
đã tách đợc từ màng giấm ra hai loại vi khuẩn thuần khiết là Mycoderma
aceti và Mycoderma pasteurianum.
Từ năm 1862 đến năm 1868, Pasteur nhờ sự trợ giúp đắc lực của kính
hiển vi đã chứng minh sự đúng đắn trong nhận xét của Kiitzing và Hansen và
khẳng định bản chất của quá trình lên men giấm. Ông nghiên cứu lớp màng
nhầy xuất hiện trên bề mặt bia, rợu vang và đi đến kết luận: màng đó đợc
tạo thành do một loại trực khuẩn và ông cũng gọi trực khuẩn đó là Mycoderma
aceti.

Hong Thị Hạnh

-9-

Lớp 31b Sinh- KTNN

Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

Cùng với những nghiên cứu trên về vi khuẩn Acetobacter, các nghiên
cứu khác cũng nh những nghiên cứu sau này đều nhằm tìm hiểu rõ thêm và
tìm cách cải thiện qua trình lên men giấm. Hiện nay, ngời ta đang đi vào
nghiên cứu những ứng dụng mới của vi khuẩn Acetobacter bằng cách phân lập
các chủng vi khuẩn thuần khiết, nghiên cứu các đặc điểm cấu tạo, sinh lý, sinh
hoá của chúng nhằm tìm ra những chủng tốt nhất cho từng ứng dụng trên cơ
sở đối chiếu các tiêu chuẩn phân loại đã đợc đa ra.
1.1.1. Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn Acetobacter
+ Địa điểm nơi phân lập: là nơi c trú có liên quan đến điều kiện môi
trờng sống.
+ Đặc điểm hình thái: đó là hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả
năng di động, màu sắc, sự hình thành tiêm mao, vỏ nhày, màu sắc khi nhuộm
Gram
+ Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái vết mọc, đặc điểm vết mọc,
đặc tính vết mọc (trơn, xu xì), tính chất vết mọc (đục, trong), màu sắc vết
mọc trên môi trờng thạch Trên môi trờng lỏng cần la ý tình trạng môi
trờng sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay không có mùi).
+ Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố nhiệt độ, pH của môi
trờng, khả năng hình thành sắc tố, quan hệ với oxy (thuộc loại hiếu khí hay
kỵ khí), khả năng lên men axetic, khả năng sử dụng các hợp chất vô cơ và
hữu cơ.
1.1.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter
Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter đợc thực hiện từ thế kỷ
XIX. Từ năm 1898 Rothenback đã tiến hành phân loại, tiếp theo là Hoyer
(1899), Beijerink đã phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa vào hai dấu hiệu [6]:

* Một là: Khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện quá trình sinh
trởng và phát triển của vi khuẩn Acetobacter.

Hong Thị Hạnh

- 10 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

* Hai là: Có hay không có giai đoạn di động trong qua trình phát triển.
Còn Heneberg (1926) lại chia các vi khuẩn axetic thành 4 nhóm dựa
vào nơi sống đặc trng của chúng:
* Nhóm 1: vi khuẩn không phát triển bia vì hoa Hulon độc với chúng.
* Nhóm 2: vi khuẩn phát triển trên bia.
* Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trong dung dịch rợu vang.
* Nhóm 4: vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phơng pháp nhanh.
Năm 1934, theo nghiên cứu của các nhà vi khuẩn học ngời Hoa Kỳ, vi
khuẩn axetic có khả năng sử dụng các hợp chất tơng đối đơn giản của cacbon
và nitơ nên đã kết hợp chúng vào họ Nitrobacteriaceae. Từ đó vi khuẩn axetic
đợc gọi là Acetobacter.
Năm 1936, Kenyver và Wanniel cùng Staniel đã đề xuất ý kiến ghép vi
khuẩn Acetobacter vào họ Pseudomonas do chúng có hiện tợng ghép cực
xoắn ở phần di động.
Năm 1948, Vaught đã công bố những kết quả khi quan sát sự di động
của nhiều loại vi khuẩn: Acetobacter aceti, Acetobacter oxydans, Acetobacter

zancens, Acetobacter melanognum, Acetobacter pasteurianum. Ông kết luận
những loài trên cùng thuộc một loài có đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí
của vi khuẩn Acetobacter ở trong họ Pseudomonas.
Ngày nay, theo khoá phân loại của Bergeys (1914) và nhiều tác giả
khác, vi khuẩn Acetobacter và Gluconbacter - các vi khuẩn axetic đợc xếp
vào một họ riêng là Acetobacteriaceae. Trong khoá phân loại của Bergeys,
đáng chú ý nhất là khoá phân loại các loài thuộc giống Acetobacter, ông đã
phân giống Acetobacter thành hai loại :
Loại 1: Oxy hoá axit axetic thành CO2 và H2O. Loại này gồm:
+ Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch Hoyer), đại
diện là vi khuẩn Acetobacter aceti.

Hong Thị Hạnh

- 11 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất: trên bề mặt
môi trờng dịch thể nuôi cấy có tạo màng nhầy chứa xenluloza, điển hình vi
khuẩn Acetobacter xylinum. Trên bề mặt môi trờng dịch thể nuôi cấy không
tạo màng nhầy có chứa xeluloza, điển hình vi khuẩn: Acetobacter zances,
Acetobacter pasteurianum, Acetobacter kneizigianus.
Loại 2: Không có khả năng oxy hoá axit axetic
+ Tạo sắc tố nâu trên môi trờng glucoza:

* Sắc tố nâu đến đen nhạt : Acetobacter melanogenus.
* Sắc tố hồng: Acetobacter recens
+ Không tạo sắc tố:
* Nhiệt độ thích hợp nhất là giữa 30C-35c: Acetobacter
subxydan.
* Nhiệt độ thích hợp nhất giữa 18C-21C: Acetobacter oxydans.
Năm 1960, Shilwel và Carr nghiên cứu về đặc trng nuôi cấy sinh hoá
của vi khuẩn Acetobacter và đa ra kết luận không thể có sự phân loại đồng
nhất vi khuẩn Acetobacter.
Những nghiên cứu về đặc điểm, về sự phân loại vi khuẩn Acetobacter
này đã tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, đồng thời tạo thuận lợi cho
việc ứng dụng các vi khuẩn đó vào đời sống thực tiễn sau này. Hiện nay ngời
ta đã ứng dụng vi khuẩn giấm một cách rộng rãi trên quy mô công nghiệp tạo
ra rất nhiều sản phẩm có ý nghĩa thực tiễn lớn.
1.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter
Nh đã nêu ở trên, tác nhân của quá trình lên men axetic là vi khuẩn
Acetobacter. Dựa vào đặc điểm đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại học
thấy rằng chúng thuộc vào hai giống vi khuẩn Acetobacter có chu mao hoặc
không có chu mao và Gluconobacter đơn mao, đó là hai giống vi khuẩn quan
trọng nhất của họ Acetobacteriaceae (Lapent et al-1989), chúng sống phổ

Hong Thị Hạnh

- 12 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

biến trong tự nhiên, trên bề mặt lá, hoa quả có khả năng tạo ra axit axetic từ
rợu etylic. Trong tế bào Gluconobacter không có chu trình Tricacbonxylic
(ATC) hoạt động nên nó không thể oxy hoá axit axetic song lại có một chu
trình khác thay thế (chu trình Glyoxylat), không oxy hoá axit axetic nhng
vẫn có chu trình photphoril hoá. Ngợc lại trong tế bào Acetobacter xảy ra
quá trình trên. Khi so sánh vi khuẩn này với vi khuẩn thuộc giống
Pseudomonas thấy chúng có những đặc điểm tơng tự. Chúng chỉ khác
Pseudomonas ở chỗ chịu đợc nồng độ axit cao hơn, khả năng chuyển hoá
pepton yếu, ít di động và không sinh sắc tố. Nhiều loài vi khuẩn Acetobacter
khi phát triển trên môi trờng thiếu thức ăn hoặc môi trờng đã nuôi cấy lâu
ngày (môi trờng già) dễ bị biến đổi hình thái (tế bào phình to, kéo dài hoặc
phân nhánh).
Tuy nhiên, cơ sở để xếp vi khuẩn axetic vào nhóm độc lập là khả năng
oxy hoá rợu etylic thành axit axetic ở pH = 4,5. Ngoài ra, chúng còn thực
hiện quá trình oxy hoá không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại
đờng và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit
hữu cơ tơng ứng. Vi khuẩn axetic chỉ phát triển tốt nhất trong điều kiện hiếu
khí; nhiệt độ thích hợp từ 25C - 30C; pH thích hợp từ 4,5 - 6,8; hoá dị dỡng
hữu cơ.

Hong Thị Hạnh

- 13 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

Bảng 1.1. Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconbacter
so sánh với Pseudomons

Đặc điểm so sánh

Gluconobacter Acetobacter

1. Vị trí tiêm mao

Đơn mao ở cực Chu mao hoặc Chu mao ở cực
hoặc không

Pseudomonas

không có

2. Phát triển ở pH = 4,5

+

+

-

3. Oxy hoá ethanol

+

+

-

4. Oxy hoá axit axetic

-

+

+

5. Oxy hoá Lactat

-

+

+

6.Glucoza

+





7. Sử dụng Gelatin

-

-



8.Sử dụng tinh bột Lactose

-

-



9. Sắc tố huỳnh quang

-

-



Gluconate

Ghi chú:
Dấu (+): có
Dấu (-): không
Dấu (): có hoặc không
Về hình dạng tế bào, vi khuẩn Acetobacter là những trực khuẩn hình

que đến elip, kích thớc từ 0,6 - 0,8m. Các tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp
thành chuỗi hoặc có loại tế bào hình cầu, có loại hình chỉ. Tuỳ thuộc vào điều
kiện môi trờng, nhiệt độ nuôi cấy một số loại có hình bán nguyệt. Vi khuẩn
Acetobacter không có khả năng sinh bào tử, tạo màng nhày, một số có khả
năng di động nhờ tiêm mao, một số không có khả năng này [1], [2], [3].
Qua nhiều nghiên cứu về khuẩn lạc và màng vi khuẩn Acetobacter trên
môi trờng nuôi cấy cho thấy vi khuẩn Acetobacter phát triển tốt nhất trên
môi trờng nớc bia, môi trờng có chứa nấm men, glucoza, rợu etylic hoặc

Hong Thị Hạnh

- 14 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

manitol. Trên môi trờng đặc chúng phát triển thành những khuẩn lạc tròn,
đều đặn, đờng kính trung bình là 3 mm.
Một số loại nh Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum có khuẩn lạc
rất nhỏ (d = 1mm), bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày và sẫm
hơn các vùng xung quanh. Một số loại khác có khuẩn lạc lớn hơn (d = 4-5
mm), không có màu, mỏng nh những hạt sơng nhỏ, dễ dàng dùng que cấy
gạt ra khỏi môi trờng. Có loại tạo thành khuẩn lạc ăn sâu vào môi trờng,
khó lấy ra băng que cấy. Trên môi trờng lỏng vi khuẩn Acetobacter chỉ phát
triển trên bề mặt môi trờng tạo thành màng dày nhẵn và trơn, khi lắc thì chìm
xuống đáy bình và thay vào đó là mội lớp màng mới đợc tạo thành, dịch dới

màng này thờng trong suốt. Khi nghiên cứu màng này thấy có sợi xenluloza
giống nh sợi bông. Loại thứ hai màng mỏng nh giấy xefan, một số nữa thì
tạo thành màng mỏng dễ vỡ, bám trên thành bình và dịch nuôi cấy không
trong [8].
Trong quá trình sinh trởng và phát triển, nhu cầu dinh dỡng của vi
khuẩn Acetobacter đối với nguồn cacbon, nitơ và các chất kích thích sinh
trởng là rất đa dạng. Chúng sử dụng chủ yếu đờng glucoza hoặc saccaroza,
rợu etylic và các axit hữu cơ khác làm nguồn cacbon; muối amoni làm nguồn
nitơ; muối photphat làm nguồn photpho. Ngoài ra, trong quá trình phát triển
chúng còn có nhu cầu với một số chất kích thích sinh trởng khác nh: paraaminobenzoic, axit nicotinic, axit pantoneic, biotin các chất này có vai trò
quan trọng trong sinh trởng của vi khuẩn Acetobacter [9].
Một số vi khuẩn Acetobacter có khả năng tự tổng hợp polisaccarit phân
tử lớn nh: xenluloza, dextran và ngời ta ứng dụng khả năng này trong công
nghiệp. Một số ít vi khuẩn Acetobacter có thể tổng hợp đợc những sợi
xenluloza giống nh bông, điển hình nh là Acetobacter xylinum. Một số loài
tổng hợp đợc dextran giống nh Leuconostoc mesenteroides khi môi trờng
thiếu dextran hoặc xenluloza.

Hong Thị Hạnh

- 15 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

Vi khuẩn Acetobacter có khả năng oxy hoá gluxit theo 4 hớng sau:

* Hớng thứ nhất: không có sự photphorit hoá cơ chất với sự tham gia
của các enzim đặc hiệu.
* Hớng thứ hai: oxy hoá các hợp chất đã đợc photphorit hoá trong
con đờng Pentose phosphate.
* Hớng thứ ba: theo sơ đồ Enter - Doudroff.
* Hớng thứ t: theo chu trình Crep (Krebs) hoặc Glyoxlat.
1.3. Một số đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter
1.3.1. Acetobacter aceti
Trực khuẩn ngắn, kích thớc 0,4 - 0,8 ì 1 -1,2 m không di động đợc,
xếp thành chuỗi dài, bắt màu hồng khi nhuộm Gram, màu vàng với thuốc
nhuộm iốt. Khuẩn lạc to, sáng trên Gelatin với dịch lên men chứa 10% đờng
saccaroza tạo thành màng nhầy, nhẵn. Chúng có khả năng phát triển trên môi
trờng có nồng độ rơụ cao (11%) và có thể tích luỹ đến 6% axit axetic trong
môi trờng bia với nhiệt độ thích hợp là 30C.
1.3.2. Acetobacter xylinum
Trực khuẩn hình que, kích thớc khoảng 2 m tế bào đứng riêng rẽ
hoặc xếp thành từng chuỗi, không di động đợc, các tế bào đợc bao bởi chất
nhầy tạo váng nhăn và dày: váng có chứa hemixenluloza nên khi gặp H2SO4
thuốc nhuộm iốt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemixenluloza), chúng có
thể tích luỹ 4,5% axit axetic trong môi trờng. Chúng thờng sống chung với
nấm men trong nấm chè còn gọi là thuỷ hoài sâm, hải bảo hay vị bảomột loại nớc chua có vị thơm dùng để pha nớc giải khát trong gia đình, trên
bề mặt nớc có một váng vi sinh vật dày đợc nuôi sống bằng nớc chè
đờng.

Hong Thị Hạnh

- 16 -

Lớp 31b Sinh- KTNN

Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

1.3.3. Acetobacter pasteurianum
Có hình dạng tơng tự nh Acetobacter aceti nhng váng vi khuẩn có
dạng khô và nhăn nheo, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iôt, tế bào xếp dời
nhau thành chuỗi, đôi khi bắt gặp tế bào có dạng hình chuỳ phồng lên, di động
không thờng xuyên. Khuẩn lạc trên Genlatin nhỏ, tròn. Nhiệt độ thích hợp để
phát triển là 30C.
1.3.4. Acetobacter acetosum
Trực khuẩn có kích thớc 0,4 - 0,8 ì 1 m. Các tế bào xếp riêng rẽ
thành từng chuỗi, không di động đợc. Nhiệt độ thích hợp nhất cho chúng
phát triển là 30C - 36C.
1.3.5. Acetobacter kiitzingianum
Có màng nhầy, nhẵn ở mép và đợc nâng cao lên theo thành bình. Tế
bào dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động. Khuẩn lạc trên Gelatin với
dịch lên men nhớt, nhỏ tạo thành màng xếp nếp to trên môi trờng ẩm. Thích
hợp phát triển ở 30C.
1.3.6. Acetobacter shiitzenbacchii
Trực khuẩn khá dài, kích thớc khoảng 0,3 - 0,4 ì 1,0 - 3,6 m, thờng
xếp đôi hoặc đứng riêng rẽ, có thể tạo váng nhày và không bền vững. Có khả
năng tích luỹ trong môi trờng đến 11,5% axit axetic do đó thờng đợc sử
dụng để chuyển hoá rợu thành giấm theo phơng pháp Đức (phơng pháp
nhanh).
1.3.7. Acetobacter lindreni
Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo chuỗi, thỉnh thoảng có tế bào phồng to nh
hình cầu, không di động. Khuẩn lạc trên Gelatin với dịch lên men tròn, nhỏ,
màu vàng, trên môi trờng lỏng tạo váng màu nâu, nhớt. Thích hợp phát triển

ở 25C.

Hong Thị Hạnh

- 17 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

1.3.8. Acetobactere orleanense
Trực khuẩn dài trung bình, không di động, gặp điều kiện nhiệt độ cao
có thể sinh ra tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra. Tạo váng vi khuẩn rất
dày trên môi trờng lỏng. Có thể phát triển trong môi trờng có nồng độ rợu
cao (10% - 12%) và tích luỹ đến 9,5% axit axetic. Thờng đợc dùng để
chuyển hoá rợu vang thành giấm theo phơng pháp Pháp (phơng pháp chậm
hay phơng pháp Orleans). Thích hợp phát triển ở 25C - 30C.
1.3.9. Acetobacter suboxydans
Có hình que ngắn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi ngắn, không có
khả năng di động, tạo thành những váng mỏng, dễ vỡ, có khả năng chuyển hoá
glucoza thành axit gluconic, oxy hoá rợu sobit thành socboza-dùng để sản
xuất axit ascorbic-vitamin C. Loại vi khuẩn này muốn phát triển bình thờng
cần đợc cung cấp một số chất sinh trởng: axit para - aminobenzoic, axit
patoneic, axit nicotinic.
1.3.10.Acetobacter hoshigakii
Trực khuẩn có kích thớc 0,7 - 0,9 ì 1,5 - 1,8 m, thờng xếp riêng rẽ
không di động. Khuẩn lạc trên thạch với chất chiết rút từ đậu nành nhỏ, tròn,

dạng hạt xám sau đó chuyển thành màu nâu. Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên
men tròn, màu trắng sữa, về sau phần giữa khuẩn lạc hoá nâu, phía ngoài màu
vàng nhạt. Có khả năng tạo thành axit gluconic. Nhiệt độ thích hợp cho sự
phát triển là từ 30C - 35C.
1.3.11. Acetobacter ascendens
Trực khuẩn không di động, các khuẩn lạc trên glucoza, genlatin khô
trắng với vành sáng chói. Trên môi trờng lỏng tạo thành màng nhày chắc,
nâng lên theo thành bình. Thích hợp phát triển ở 25C.

Hong Thị Hạnh

- 18 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

1.3.12.Acetobacter oxydans
Trực khuẩn có kích thớc 0,8 - 1,2 ì 2,4 - 2,7 m, các tế bào rời nhau
hoặc xếp thành chuỗi. Quan sát trong chuỗi thấy có tế bào phồng to lên, di
động. Khuẩn lạc trên gelatin tròn sau trở thành dạng không cân đối với sự
phân nhánh đặc trng. Nhiệt độ thích hợp từ 18C - 21C.
1.3.13. Acetobacter plicatum
Trực khuẩn có khích thớc 0,4 - 0,6 ì 1,4 - 1,6 m không di động.
Khuẩn lạc trên gelatin rợu vang tròn trịa, hơi nhô lên, sáng, ẩm ớt, nhớt.
Nhiệt độ thích hợp từ 25C - 30C [4].
Hầu hết các loài Acetobacter thờng phát triển tốt nhất ở 25C - 30C

đều có khả năng sử dụng muối photphat, đa số đòi hỏi cung cấp thêm vitamin,
chúng có khả năng oxy hoá rợu thành axit và trong quá trình sinh trởng phát
triển chúng tạo ra một lớp màng dày có bản chất hemixenluloza trên bề mặt
môi trờng nuôi cấy. Với những nghiên cứu hiện nay cho thấy lớp màng này
có thể đợc ứng dụng vào rất nhiều ngành quan trọng có ý nghĩa thực tiễn
cuộc sống. Đồng thời khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn trên rất khác
nhau vì vậy cần phải tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn có khả năng tạo
màng tốt nhất và phù hợp với mục đích sử dụng của từng loại màng.

Hong Thị Hạnh

- 19 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học
Chơng 2

Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng nghiên cứu
Đối tợng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật thuần khiết đợc phân
lập ở màng các nguồn nguyên liệu nhờ quá trình lên men giấm: bia, rợu
vang, dịch hoa quả, giấm làm theo phơng pháp cổ truyền.
2.2. Trang thiết bị và hoá chất
2.2.1. Trang thiết bị
Dụng cụ : hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thuỷ tinh, phễu thuỷ
tinh, que cấy, đèn cồn, cốc thuỷ tinh.

Thiết bị lên men: bình cầu, bình tam giác, nồi hấp Tommy (Nhật), máy
lắc Orbital Shakergallenkump (Anh), buồng vô trùng, tủ sấy, cân phân tích,
kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần và nhiều dụng cụ khác.
2.2.2.Hoá chất
+ Các loại đờng chuẩn: glucoza, saccaroza, fuctoza, mantoza, manitol.
+ Một số hợp chất hữu cơ: rợu etylic (C2H5OH), axit axetic
(CH3COOH), pepoton, agar-agar, dịch chiết nấm men (cao nấm men), axit
xucxinic, axit lactic, phenolphtalein
+ Một số hợp chất vô cơ: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4,
Na2HPO4.12H2O, CaCO3, NaOH chuẩn
+ Một số loại thuốc nhuộm: tím Gentian, dung dịch Fucshin, dung dịch
Lugol, thuốc nhuộm iốt và H2SO4

Hong Thị Hạnh

- 20 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

2.3. Môi trờng
2.3.1. Môi trờng phân lập vi khun gim (MT1) (g/l)
Glucose : 20g

(NH4)2SO4 :

KH2PO4 : 2g

3g

Axit axetic: 2%

MgSO4.7H2O: 2g

Rợu etylic: 2%

Thạch Agar: 20g
2.3.2. Môi trờng nhân ging c bn (MT2) (g/l)
Glucose : 20g

(NH4)2SO4:

KH2SO4 : 2g

MgSO4.7H2O: 2g

Pepton :

Axit axetic :

2%

Ru etylic :

2%

6g

Nc máy : 1000 ml

3g

2.3.3. Các môi trờng nghiên cứu khả năng tạo màng (g/l)
(MT3; MT4; MT5; MT6)

TT

Thnh phn

MT3

MT4

MT5

MT6

1

Glucose

20g

20g

0g

20g

2

(NH4)2SO4

3

3

5

4

3

KH2PO4

2

2

2

1

4

MgSO4.7H2O

2

2

0

0

5

Axit axetic

2%

2%

5ml

2,5ml

6

Ru etylic

2%

2%

0

0

7

Cao nấm men

0

5g

3g

0

8

Pepton

0

6g

2g

0

9

Nc mía ép

0

0

200ml

0

10

Nc da

0

0

0

1000ml

11

Nc máy

1000ml

1000ml

1000ml

0

Chú ý: Axit axetic (CH3COOH) và rợu etylic (C2H5OH) bổ sung sau
khi hấp môi trờng lần thứ 3 [6], [8],[9].

Hong Thị Hạnh

- 21 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

2.3.4. Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm định (MPA)
Cao thịt: 5g

Pepton:

5g

NaCl:

5g

Thạch agar: 20g

Nớc:

1000 ml

2.4. Phơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phơng pháp của Vinogradski
Nguồn nguyên liệu là: bia, dịch hoa quả loãng và rợu vang, chúng tôi
tiến hành phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phơng pháp của Vinogradski.
Trớc hết, chúng tôi thực hiện lên men giấm trên các vật liệu trên.Vi khuẩn
axetic là loại vi khuẩn hiếu khí nên chúng phát triển trên môi trờng lỏng tạo
thành lớp màng dai, màu trắng. Màng đó bao gồm tập hợp các vi khuẩn axetic,
lấy màng đó đa vào môi trờng số 2. Môi trờng số 2 đợc pha chế đầy đủ
các thành phần, khử trùng trong nồi hấp Autoclave ở áp xuất 1 atm, trong thời
gian 15 phút, để nguội, bổ sung rợu etylic và axit axetic, chia vào các bình
cầu hoặc bình tam giác. Sau khi thả màng vào giữa trong tủ ấm 28C - 30C
trong thời gian 4 - 7 ngày (chú ý khi nút bông các bình không qua chặt cũng
không quá lỏng) trên bề mặt môi trờng xuất hiện một lớp màng mới. Từ
màng này tiến hành phân lập để thu nhận vi khuẩn Acetobacter.
Phơng pháp pha loãng của Pasteur: Việc pha loãng đợc thực hiện với
dung dịch NaCl 0,5% vô trùng hoặc nớc cất vô trùng. Chuẩn bị dung dịch
pha loãng rồi khử trùng ở 1atm, ở 121oC, thời gian 15 phút, dùng 10 ống
nghiệm định mức 10ml (đậy nút bông, đã khử trùng). Sử dụng pipet vô trùng
chia vào các ống nghiệm vô trùng mỗi ống 9ml dung dịch NaCl hoặc nớc cất,
sau đó dùng pipet lấy 1ml dịch lên men cho vào một ống nghiệm có chữa sẵn
9ml nớc cất hoặc dung dịch NaCl trên, đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách
vontex trong 5 phút sẽ thu đợc dung dịch pha loãng với nồng độ 10-1. Dùng
pipet lấy 1ml dung dịch ở ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-1 nhỏ vào

Hong Thị Hạnh

- 22 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

ống nghiệm thứ 2 (cũng có 9 ml nớc), đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách
vontex trong 5 phút thu đợc dung dịch pha loãng với nồng độ 10-2. Tiếp tục
pha loãng nh vậy đến nồng độ 10-10 ta đợc 10 ống nghiệm chứa dung dịch
lên men với các nồng độ từ 10-1 đến 10-10. Căn cứ vào số lợng vi khuẩn có
trong mẫu, chúng tôi chọn mẫu ở mức độ pha loãng 10-4 đến 10-7 để tiến hành
phân lập lại trên môi trờng thạch đĩa.
Phơng pháp thạch đĩa: Chuẩn bị môi trờng 1 hấp khử trùng ở 121oC
và 1atm, để nguội, bổ sung rợu và axit, tiếp theo đổ vào hộp peri đã vô trùng,
để nguội khi đó bề mặt thạch sẽ đông lại. Dùng pipét vô trùng hút 100 l dịch
màng đã chuẩn bị ở trên (có độ pha loãng 10-4 đến 10-7) nhỏ vào hộp peri, sau
đó dùng que trang dàn đều trên khắp bề mặt thạch. Đặt ngợc các hộp lồng,
bao gói cẩn thận, cất trong tủ ấm ở 28C - 30C. Sau 3 - 4 ngày lấy ra quan sát
khuẩn lạc (các đặc điểm về hình dạng, kích thớc, màu sắc, độ trơn bóng, viền
mép quanh khuẩn lạc), vòng phân giải CaCO3 quanh khuẩn lạc.
Chú ý: tất cả các dụng cụ thí nghiệm, dung dịch và môi trờng nuôi cấy
trớc khi sử dụng đều phải hoàn toàn vô trùng, các thao tác thí nghiệm đều
đợc làm trong box cấy vô trùng.
2.4.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng xenluloza
theo phơng pháp của Graxinop
Trớc khi tuyển chọn cần phải nhân giống các chủng vi khuẩn bằng
cách: từ mỗi khuẩn lạc đã chọn trên dùng que cấy đầu tròn (đã khử trùng trên

ngọn lửa đèn cồn) gợi lấy khuẩn lạc cấy vào một ống nghiệm đã đợc đổ môi
trờng thạch (môi trờng số 2, đặt nghiêng, để nguội ) theo đờng ziczăc. Mỗi
ống là một ký hiệu riêng. Để vào tủ ấm 4 - 6 ngày các vi khuẩn sẽ phát triển
theo đờng cấy. Tiếp theo là tuyển chọn các chủng vi khuẩn sẽ phát triển theo
đờng cấy. Sau đó, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter trong môi
trờng oxy hoá (MT2) để kiểm tra khả năng tạo màng. Cho 1 ml nớc cất

Hong Thị Hạnh

- 23 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

thanh trùng vào ống giống (ống nghiệm thạch nghiêng chứa các tế bào vi
khuẩn đã đợc hoạt hoá bằng cách cấy chuyển ống giống đợc bảo quản trong
tủ lạnh sang ống thạch nghiêng khác, khi tế bào vi khuẩn đã phát triển theo
đờng cấy sẽ đợc kiểm tra khả năng tạo màng), dùng que cấy vô trùng gợt
các tế bào ra khỏi đờng cấy hoà tan vào nớc, dùng pipet vô trùng hút dịch vi
khuẩn đa sang môi trờng oxi hoá để thử khả năng tạo màng. Dựa vào khả
năng tạo màng của các mẫu vi khuẩn trên môi trờng dịch thể tuyển chọn sau
ba lần liên tiếp chọn ra những chủng có khả năng tạo màng dai, mỏng, trong
thời gian ngắn.
Để giữ giống cần tiến hành cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng này
sang ống thạch nghiêng khác với chu kỳ 2 tháng một lần.
2.4.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter thuần khiết

2.4.3.1. Phơng pháp quan sát tế bào
Sau khi sơ tuyển, chúng tôi đã chọn ra một số chủng, các chủng này tiếp
tục đợc xác định bằng phơng pháp quan sát hình thái tế bào dới kính hiển
vi quang học để xác định xem chúng có đúng là chủng vi khuẩn cần tìm
không. Quan sát hình dạng tế bào bằng phơng pháp nhuộm Gram: phơng
pháp này gồm các bớc sau:
+ Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa bằng HCl hoặc H2SO4.
+ Rồi rửa lại bằng cồn, nớc cất và lau khô.
+ Nhỏ một giọt nớc vô trùng lên lam kính, dùng que cấy khử trùng
trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy một ít màng màu trắng hoặc dịch nuôi
cấy hoặc giống vi khuẩn hoà vào giọt nớc vô trùng đó, hơ qua trên ngọn lửa
đèn cồn để cố định vết bôi (cách ngọn lửa đèn cồn 10 - 15 cm).
+ Đặt lên trên vết bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tím Gentian giữ
trong 1 - 2 phút.

Hong Thị Hạnh

- 24 -

Lớp 31b Sinh- KTNN


Khoá luận tốt nghiêp

Chuyên ngnh Vi sinh vật học

+ Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho thuốc nhuộm chảy xuống chậu
hứng, nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi, giữ trong vòng 5 phút.
+ Rửa tiêu bản bằng nớc, rửa bằng cồn (20 giây) sau đó rửa tiếp bằng nớc.
+ Nhỏ dung dịch Fucshin lên giữa trong 1 - 2 phút.

+ Rửa lại tiêu bản bằng nớc, hong khô tự nhiên.
Mục đích của phơng pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn gram
âm (Gr-) với vi khuẩn Gram dơng (Gr+). Nếu sau khi nhuộm kép mà tế bào
bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr-. Ngợc lại nếu bắt màu tím thì đó là vi
khuẩn Gr+. Khả năng bắt màu của vi khuẩn Gr+ và vi khuẩn Gr- khác nhau là
do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gr+ đợc cấu tạo từ một loại protein
đặc biệt chứa muối nucleatmagie có khả năng tạo với tím Gentian và Lugol
một phức chất bề khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế
bào của vi khuẩn Gr+ bắt màu tím Gentian. Trong khi đó những vi khuẩn Grkhông có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm Gentian và Lugol nên
dễ bị rửa trôi bởi cồn. Do đó, khi nhỏ Fucshin lên tế bào vi khuẩn Gr- bắt màu
hồng màu của Fucshin.

a

Hong Thị Hạnh

b

- 25 -

Lớp 31b Sinh- KTNN