Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase

Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme
phytase

Phan Thị Thu Mai

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Lương
Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tổng quan về axit phytic, phytate, phytase. Trình bày các phương pháp xác
định hoạt tính enzyme phytase; Tuyển chọn chủng; Phương pháp xác định khả năng
sinh trưởng; Phương pháp phân loại; Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả
năng sinh phytase của chủng vi sinh vật nghiên cứu; Thu hồi enzyme; Nghiên cứu
enzyme phytase. Kết quả: Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng trình tự đa gen (gyrA,
rpoB, purH, polC, groEL và ADNr 16S) để phân loại chính xác đến dưới loài của chi
Bacillus; Là đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phytase bền nhiệt ở loài Bacillus
amyloliquefaciens. Chủng vi khuẩn nghiên cứu là chủng an toàn, nên có thể được sử
dụng trực tiếp trong thức ăn chăn nuôi để cung cấp phytase và là nguồn probiotic cho
động vật.

Keywords: Vi sinh vật; Chủng vi khuẩn; Sinh học; Axit

Content
MỞ ĐẦU
Phospho (P) là một nguyên tố thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật,
phospho chủ yếu được tìm thấy trong các loại đá phốtphat vô cơ và trong các cơ thể sống.
Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng dự trữ chủ yếu của phospho trong tự
nhiên, có mặt nhiều trong các loại ngũ cốc, hạt của các cây họ đậu và hạt lấy dầu (axit phytic
chiếm hơn 80% lượng P trong các thực vật này) và đây là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho
người và động vật. Axit phytic có khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại tạo nên các

muối (phytate: muối của axit phytic với Na
+
, phytin: muối của axit phytic với Ca
2+
, Mg
2+
) và
các hợp chất khác như axit amin, protein, làm ức chế các enzyme tiêu hóa, ngăn cản sự hấp
thu các chất này của các cơ thể sống. Vì thế axit phytic được coi là một yếu tố kháng dinh
dưỡng (an anti-nutrient compound) trong thức ăn và thực phẩm.
Phytase là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp chế biến thực phẩm
và thức ăn chăn nuôi. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân các muối của axit phytic
(phytate, phytin) giải phóng ra orthophosphate và myo-inositol-6-phosphate và các cấp độ

2
thấp hơn của phản ứng phosphoyl hóa. Việc sử dụng phytase không chỉ làm tăng khả năng
hấp thu phospho vô cơ mà còn tăng khả năng hấp thu các nguyên tố khoáng và khả năng tiêu
hóa các hợp chất khác. Do đó dùng phytase để thủy phân, loại bỏ axit phytic trong thành phần
thức ăn là rất cần thiết.
Ở các động vật nhai lại, axit phytic được phân giải bởi các phytase do khu hệ vi sinh vật
kị khí như nấm và vi khuẩn sống trong dạ cỏ sinh ra. Nhưng những động vật dạ dày đơn như
gia cầm và cá không thể sử dụng muối phytate vì trong đường tiêu hóa của chúng thiếu hụt
enzyme quan trọng này. Bởi vậy, người ta thường bổ sung phốt pho vô cơ (Pi) vào trong thức
ăn để đáp ứng nhu cầu P cho cơ thể, nhằm đảm bảo cho động vật sinh trưởng, phát triển bình
thường. Tuy nhiên, bổ sung Pi không làm giảm được hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit
phytic mà còn gây ô nhiễm môi trường do P dư thừa thải qua phân động vật. Đồng thời làm
tăng chi phí khẩu phần thức ăn. Vì vậy, giải pháp tốt nhất thay thế cho việc bổ sung Pi là thêm
phytase vào thức ăn của vật nuôi, nhằm phân giải phytate thực vật sẵn có trong thức ăn, giải
phóng Pi dễ hấp thụ cho vật nuôi cũng như các yếu tố dinh dưỡng và khoáng khác. Ngoài ứng
dụng vào trong thức ăn chăn nuôi, phytase còn được sử dụng cho thực phẩm ở người, trong

điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dược phẩm, ứng dụng trong công
nghiệp giấy và cải tạo đất trồng. Bởi thế, việc nghiên cứu sản xuất phytase đã và hiện đang là
mối quan tâm của nhiều nhà khoa học.
Với đặc điểm là một đất nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có sự đa dạng lớn về địa
hình và hệ sinh thái tạo nên sự đa dạng phong phú của các loài vi sinh vật, cũng như do nhu
cầu và tầm quan trọng của các sản phẩm phytase thương mại, chúng tôi đã tiến hành đề tài
nghiên cứu “Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase” nhằm tìm kiếm các loài
vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase cao và là các chủng an toàn, đáp ứng nhu cầu
trong công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi và thực phẩm.
Những đóng góp của đề tài
- Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng trình tự đa gen (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và
ADNr 16S) để phân loại chính xác đến dưới loài của chi Bacillus.
- Là đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phytase bền nhiệt ở loài Bacillus
amyloliquefaciens.
- Chủng vi khuẩn nghiên cứu là chủng an toàn, nên có thể được sử dụng trực tiếp trong
thức ăn chăn nuôi để cung cấp phytase và là nguồn probiotic cho động vật.


3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE
Axit phytic lần đầu tiên được Hartig tìm thấy năm 1855-1856 ở dạng hạt nhỏ, không
phải là tinh bột trong các hạt của một số loài thực vật. Sau Hartig, cũng đã có nhiều nhà
nghiên cứu tìm thấy phytate dưới dạng ―globoid‖ (dạng cầu) và khẳng định thành phần hóa
học chính của nó là C, P và các ion kim loại. Năm 1897 Winterstein đưa ra tên là axit inositol-
phosphoic và sau đó năm 1968 được duyệt lại là ‗myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 hexakis
(dihydrogen) phosphate (IP
6
) bởi IUPAC-IUB. Phytate là một hợp chất có mặt ở nhiều loại
thực vật khác nhau, chúng chiếm đến 1-5% khối lượng các cây họ đậu, ngũ cốc, các hạt chứa

dầu và hạnh nhân. IP
6
có thể được tìm thấy trong nhân hồng cầu ở các loài chim, cá nước ngọt
và rùa, cũng như được tìm thấy trong các loại đất hữu cơ.
Axit phytic được coi là một hợp chất kháng dinh dưỡng (an anti-nutritional compound)
do khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại và các hợp chất khác như tinh bột, protein
làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu các chất này.
1.2 PHYTASE
Phytase (myo-inositol hexakisphosphate hydrolases) là một nhóm enzyme đặc biệt trong
số các enzyme phosphatase, có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân từng bước axit
phytic thành myo-inositol, các nhóm phosphate (P
i
) và các myo-inositol phosphate trung gian
(IP
5
, IP
4
, IP
3
, IP
2
, IP
1
). Khối lượng phân tử phytase của vi khuẩn biến thiên từ 35-50 kDa trừ
phytase từ Klebsiella aerogenes có 2 dạng phân tử cảm ứng. Phytase từ eukaryote như nấm
men, nấm sợi, thực vật và động vật thường được glycosyl hóa và có khối lượng phân tử cao
hơn, nằm trong khoảng từ 85-150 kDa đối với nấm, khoảng 500 kDa đối với phytase của nấm
men và từ 50-150 kDa đối với phytase của thực vật và động vật. Phytase được phân bố rộng
rãi trong tự nhiên bao gồm ở thực vật, động vật và các loài vi sinh vật. Phytase có mặt ở nhiều
loài vi sinh vật bao gồm cả vi khuẩn, nấm, nấm men và động vật nguyên sinh.

Theo hiệp hội hóa sinh quốc tế (The International Union of Biochemists) hiện nay
phytase được chia ra làm 2 loại chính là 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26),
dựa trên vị trí cắt nhóm phosphate đầu tiên của vòng inositol. Dựa trên pH hoạt động tối ưu,
phytase được chia thành 3 loại: phytase ưa axit, ưa kiềm và trung tính. Ngoài ra, dựa vào cấu
hình trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác, phytase được phân thành 3 loại khác nhau là:
histidine axit phosphatase (HAP) phytases, ß-propeller phytase (BPP) và purple axit
phosphatase (PAP) phytase.

4
Dựa trên những đặc tính hóa lý và chức năng, phytase có rất nhiều ứng dụng khác nhau
tập trung chính vào 2 lĩnh vực sau: sản xuất thực phẩm và thức ăn động vật trên quy mô công
nghiệp, là công cụ trong các nghiên cứu hóa sinh. Ngoài ra phytase còn được sử dụng nhiều
trong việc phục hồi đất và bán tổng hợp peroxydase.
1.3 LÊN MEN XỐP
Lên men xốp (Solid-state fermentation) là quá trình lên men của vi sinh vật trên cơ chất
không tan ở độ ẩm nhất định, cơ chất này vừa đóng vai trò là chất hỗ trợ cơ học (giá thể) và
vừa là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật. Với đặc điểm độ ẩm thấp, lên men xốp chỉ thích hợp
với một lượng giới hạn các loại vi sinh vật, chủ yếu là nấm, nấm men và một số vi khuẩn.
Lên men xốp có 2 lĩnh vực ứng dụng rất quan trọng, đầu tiên đó là ứng dụng trong quá
trình xử lý sinh học môi trường như phân hủy sinh học các hợp chất nguy hại, các hợp chất
độc từ chất thải của công nghiệp chế biến, sản xuất phân bón, thức ăn động vật từ các chất
thải rắn…Một ứng dụng khác của lên men xốp đó là sản xuất các hợp chất làm phụ gia rất có
giá trị như enzyme, nấm, aminoaxit, thuốc trừ sâu sinh học, nhiên liệu sinh học, chất hoạt
động bề mặt sinh học, hương liệu, chất tạo màu, tạo mùi, chất chuyển hóa thứ sinh có hoạt
tính sinh học, và các loại cơ chất khác cần thiết cho công nghiệp thực phẩm.


1.4 CHI BACILLUS VÀ PHÂN LOẠI TRONG CHI BACILLUS
Bacillus là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que thuộc ngành
Firmicutes, có khả năng sinh nội bào tử với nhiều hình dạng khác nhau như bầu dục, tròn hay

cầu hoặc khúc xạ trụ bên trong tế bào, để chống chịu các điều kiện bất thường của môi trường
sống, đa số các loài vi khuẩn Bacillus là không gây bệnh, tuy nhiên có một số loài được biết
đến bởi khả năng gây bệnh cho vật nuôi (như Bacillus anthracis và Bacillus cereus) và gây
bệnh cho côn trùng (như Bacillus thuringiensis). Nhiều loài vi khuẩn Bacillus, đặc biệt là
nhóm B. subtilis, có tiềm năng sản xuất các sản phẩm thương mại ứng dụng trong y học, trong
nông nghiệp và trong công nghiệp thực phẩm.
Hệ thống phân loại Bacillus dựa trên phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA bắt đầu từ
những năm 1990. Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên hình thái tế bào, bào tử cũng
như các đặc tính sinh hóa không có khả năng phân tách các loài thuộc nhóm Bacillus. Gần
đây, xây dựng cây phát sinh chủng loại trên trình tự đa gen (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL
và ADNr 16S) đã được ứng dụng trong phân loại các loài hoặc dưới loài B. subtilis.

5
Bacillus amyloliquefaciens là một vi sinh vật an toàn (GRAS) do đó B.
amyloliquefaciens được biết đến với nhiều ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm thương mại
như sản xuất enzyme công nghiệp. Enzyme từ Bacillus như amylase, cellulose, protease và
lipase có nhiều đặc tính quý như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và bền nhiệt. Do
đó, enzyme từ Bacillus đã được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công
nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa. B. amyloliquefaciens
là những vi sinh vật an toàn (GRAS) và có thể dùng như probiotics để bổ sung vào thức ăn
hoă
̣
c nươ
́
c uống nhằm cân bằng hê
̣
vi sinh đươ
̀
ng ruô
̣

t . Phytase của các chủng thuộc loài
Bacillus amyloliquefaciens là β propeller phytase với trung tâm hoạt động có vị trí ái lực cao
với Ca
2+
. Đây là loại phytase khá bền nhiệt, có tính đặc hiệu cơ chất rất cao với phytate nhưng
lại biểu hiện rất ít hoặc không có hoạt tính đối với các loại cơ chất esters phosphate khác. Sự
có mặt của Ca
2+
cũng làm tăng tính bền nhiệt của phytase loại này.
1.5 THU HỒI ENZYME
Trong quá trình sản xuất enzyme bằng lên men chìm hay lên men pha rắn sinh ra hàng
trăm loại enzyme khác nhau, đặc biệt là lên men pha rắn lượng tạp chất trong enzyme còn lớn
hơn rất nhiều và enzyme gắn bám vào các cơ chất xốp gây khó khăn cho việc nghiên cứu.
Quá trình thu hồi enzyme nhằm chiết rút được những enzyme nhất định, giữ lại được tối đa
hoạt tính enzyme và loại bỏ các hợp chất không tan, cô đặc enzyme nhằm phục vụ cho quá
trình tinh sạch enzyme hoặc sản xuất các chế phẩm enzyme. Đặc tính tự nhiên của enzyme,
nguồn gốc enzyme (từ nấm sợi hay vi khuẩn) và loại cơ chất sử dụng là 3 yếu tố chính ban
đầu đóng vai trò quan trọng trong việc chiết xuất enzyme từ cơ chất rắn (cách lựa chọn dung
dịch chiết và phương pháp chiết rút), ngoài ra quá trình chiết xuất thu hồi enzyme trong lên
men xốp còn phụ thuộc vào yếu tố như thời gian ngâm chiết, dung dịch chiết, nhiệt độ ngâm
chiết và tốc độ khuấy.

6




CHƢƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƢỜNG NGHIÊN CỨU
- Các chủng vi sinh vật được nghiên cứu là các chủng thuộc 3 bộ giống phân lập được từ
Sapa (đất rừng Hòang Liên và đất canh tác nông nghiệp xung quanh rừng thuộc Sapa), tỉnh
Lào Cai (274 chủng), từ đất nông nghiệp Ba Vì (34 chủng) và từ Phú Quốc (38 chủng), hiện
đang được lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học- Đại học
quốc gia Hà Nội.
- Môi trường sàng lọc chủng ưa nhiệt: môi trường thạch dinh dưỡng NA (g/l): cao thịt- 3;
peptone-5; agar-16; pH 6,8± 0,2; khử trùng 121
o
C trong 15 phút.
- Môi trường dịch thể: môi trường NA (g/l): cao thịt-3; pepton-10; NaCl- 5; pH 6,8± 0,2, môi
trường thạch thường (g/l): cao thịt- 3; pepton- 5, môi trường thạch thường cải tiến (g/l):
pepton- 10g; nước mắm đạm trên 40%- 10ml, môi trường Trypticase soy (hãng BBL), môi
trường Jorquera (2008) (g/l): Glucose- 10; Na-phytate- 2; CaCl
2
- 2; NH
4
NO
3
- 5; KCl- 0,5;
MgSO
4
.7H

2
O- 0,5; FeSO
4
- 0,01; MnSO
4
- 0,01; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần
100
o
C 15 phút.
- Môi trường sàng lọc chủng sinh phytase (PSM – phytase screening media) (g/l): Glucose-
10; Na-phytate- 4; CaCl
2
- 2; NH
4
NO
3
- 5; KCl- 0,5; MgSO
4
.7H
2
O- 0,5; FeSO
4
- 0,01; MnSO
4
-
0,01; agar- 16, khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100
o
C/15 phút.
- Môi trường dịch thể kích thích sinh phytase: các môi trường dịch thể sàng lọc vi sinh vật
sinh phytase được ký hiệu lần lượt là: K1, K2, G, J, H có công thức lần lượt:

+ Môi trường K (g/l): cám gạo-50; (NH
4
)
2
SO
4
- 0,4; MgSO
4
.7H
2
O- 0,2; CaCl
2
– 2,2; pH 6;
khử trùng 121
o
C/15 phút.
+ Môi trường K2 (g/l): cám gạo-50; (NH
4
)
2
SO
4
-0,4; MgSO
4
.7H
2
O-0,2; CaCl
2
-2,2; cao men-
7,5; methanol-7,5; pH 6, khử trùng 121

o
C/15 phút.
+ Môi trường G (g/l): bột đậu tương- 5; sucrose-1; Asparagin-0,5; KCl-0,5; FeSO
4
- 0,01;
MnSO
4
- 0,01; pH 5, khử trùng 121
o
C/15 phút.

7
+ Môi trường J (g/l): Glucose-10; CaCl
2
- 2; NH
4
NO
3
- 5; KCl- 0,5; MgSO
4
.7H
2
O- 0,5; FeSO
4
-
0,01; MnSO
4
- 0,01; Na-phytate- 0,2%; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100
o
C/15

phút.
+ Môi trường H (g/l): Glucose- 3; tryptone- 1; CaCl
2
- 0,3; MgSO
4
.7H
2
O- 0,5; MnCl
2
.4H
2
O-
0,04; FeSO
4
.7H
2
O- 0,0025; Na-phytate- 1; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100
o
C/15
phút.
- Môi trường nuôi xốp với cơ chất là ngô vỡ, gạo lức, bột đỗ tương, cám, dung dịch làm ẩm là
môi trường dịch thể Jorquera không bổ sung cơ chất Na- phytate).
2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase theo phương pháp của Shimizu và cộng sự,
1992
- Tuyển chọn chủng
+ Sàng lọc các chủng ưa nhiệt: cấy chấm các chủng vi khuẩn trong 3 bộ giống lên đĩa thạch
NA và nuôi trong tủ ấm ở 40
o
C trong 48 - 72h.

+ Sàng lọc các chủng có sinh tổng hợp phytase
Định tính: Cấy zic zắc các chủng vi khuẩn ưa nhiệt lên môi trường sàng lọc phytase (môi
trường PSM) và nuôi ở tủ ấm 37
o
C trong 5 ngày, sau khi các khuẩn lạc xuất hiện, tiến hành
lấy các khuẩn lạc xuất hiện vòng trong xung quanh. Đây là các khuẩn lạc vi khuẩn sinh
enzyme phân giải Na-phytate.
Định lượng:
+ Chủng nghiên cứu được nuôi lắc trong các môi trường dịch thể có bổ sung Na-phytate kích
thích sinh phytase là G, H, J, K1, K2 ở 40
o
C, 200 vòng/phút, sau 3 ngày dịch nuôi cấy được ly
tâm loại bỏ sinh khối và phần dịch trong được dùng để xác định hoạt tính phytase
+ Tiến hành nuôi xốp các chủng vi khuẩn có sinh enzyme phytase trên môi trường gạo lức +
dung dịch làm ẩm, sau đó tách chiết dịch enzyme và xác định hoạt độ enzyme để lựa chọn
chủng có hoạt độ phytase cao nhất.
- Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng: khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
được xác định bằng số lượng tế bào trên ml(g).
+ Phương pháp phân loại dựa vào đọc trình tự ADN r16S và 5 gen chức năng gyrA, rpoB,
purH, polC, groEL.

8
- Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng sinh trưởng ở chủng nghiên
cứu: lựa chọn môi trường nuôi cấy, lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy, pH thích hợp, lựa chọn thời
gian nuôi cấy, lựa chọn chế độ thông khí
- Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp phytase ở chủng
nghiên cứu: lựa chọn cơ chất, lựa chọn thời gian nuôi cấy, lựa chọn độ ẩm, lựa chọn tỷ lệ cấy
giống, lựa chọn nguồn cacbon bổ sung, lựa chọn nguồn nitơ bổ sung, lựa chọn các ion kim
loại bổ sung, ảnh hưởng của Ca
2+

ở các nồng độ khác nhau.
- Thu hồi enzyme: chiết xuất enzyme sử dụng các loại dung dịch chiết khác nhau: Triton
X100 1%, NaCl 50mM, SDS 1%, Tween 20 1%, Tris HCl pH 7, nước cất, nước máy. Tủa
enzyme bằng amoniumsulphate và dung môi hữu cơ (cồn, acetone).
- Nghiên cứu enzyme phytase
+ Giải trình tự gen mã hóa phytase và so sánh mức độ tương đồng của gen mã hóa phytase
chủng SP1901 với gen mã hóa phytase của các loài khác trên genbank sử dụng chương trình
Blast và xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen mã hóa phytase.
+ Các đặc tính của enzyme: khả năng bền nhiệt của enzyme, pH thích hợp cho hoạt động của
enzyme, nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme, ảnh hưởng của các ion kim loại đến
hoạt độ của enzyme, sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme trên cơ chất sấy
khô, ảnh hưởng của enyme tiêu hóa đến hoạt độ của enzyme.

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN
3.1.1 Lựa chọn chủng ƣa nhiệt
Từ tổng số 346 chủng vi sinh vật thuộc 3 bộ giống đã chọn được 91 chủng- trong đó bộ
giống từ Sa Pa có 46/274 chủng, bộ giống từ Ba Vì có 29/34 chủng và bộ giống từ Phú Quốc
có 16/38 chủng có khả năng sinh trưởng được ở 40
o
C.
3.1.2 Lựa chọn chủng có hoạt tính phytase cao
Định tính: Từ 91 chủng ưa nhiệt được nuôi trên đĩa thạch sàng lọc phytase (PSM) sau 5
ngày, lựa chọn được 2 chủng xuất hiện vùng phân giải trong là SP1901 và D15 (hình 1).

9

Hìn
h 1.
Sinh
trƣởng và vùng phân giải của phytase chủng SP1901 (trái) và D15 (phải) trên PSM
Định lượng trên môi trường lên dịch thể và lên men xốp: chúng tôi đã tiến hành lên men
dịch thể chủng SP1901, D15 để sản xuất phytase trên 5 loại môi trường khác nhau, sau 3 ngày
xác định hoạt tính phytase và lên men xốp trên môi trường chứa gạo lức và bột đỗ tương, sau
3,5 ngày mẫu được chiết xuất để xác định hoạt tính phytase.
Bảng 1. Hoạt tính phytase của 2 chủng SP1901 và D15 trong lên dịch thể và lên
men xốp
Chủng
Hoạt tính phytase
Môi trường lên men dịch thể
(U/ml)
Môi trường lên
men xốp (U/g)
G
H
J
K1
K2
SP1901
0
0
0,63
0,35
0,26

3,9
D15
0
0
0,5
0,34
0,19
3,1

Với các kết quả thu được ở bảng 5 môi trường J cho hoạt tính phytase cao nhất ở cả 2
chủng, tuy nhiên lại thấp hơn nhiều khi so sánh với hoạt tính phytase được sinh ra trên môi
trường lên men xốp. Mặt khác, môi trường J bổ sung cơ chất Na-phytate tinh khiết rất đắt
tiền, trong khi đó môi trường lên men xốp sử dụng các cơ chất tự nhiên, dễ kiếm, rẻ tiền do đó
chúng tôi quyết định sử dụng lên men xốp cho các nghiên cứu tiếp theo.
Như vậy từ 91 chủng vi sinh vật ưa nhiệt, chúng tôi đã chọn ra 2 chủng vi khuẩn là:
SP1901 và D15 có sinh tổng hợp phytase trên môi trường lên men xốp. Dịch enzyme của 2
chủng này được dùng để xác định khả năng bền nhiệt.

10
3.1.3 Lựa chọn chủng sinh tổng hợp phytase bền nhiệt
Dịch chiết enzyme thô của 2 chủng vi khuẩn SP1901 và D15 được xử lý ở 60
o
C trong
các khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút. Sau đó, tiến hành xác định hoạt tính phytase
bằng định lượng, thu được kết quả như sau:

Bảng 2. Độ bền nhiệt của 2 chủng SP1901 và D15 ở 60
o
C
STT
Chủng
Nhiệt độ
Thời gian xử lý (phút)
Hoạt độ tƣơng đối (%)
1
SP1901
60
o
C
Đối chứng (0)
100
10
95,3
20
93,95
30
90
2
D15
60
o
C
Đối chứng (0)
100

10
71,3
20
45,7
30
18,8

Như vậy, chủng SP1901 bền ở 60
o
C sau 30 phút xử lý, hoạt tính còn 90%, trong khi đó
chủng D15 hoạt tính chỉ còn 45,7%. Vì thế chúng tôi lựa chọn chủng SP1901 cho các nghiên
cứu tiếp theo.

11
3.2 PHÂN LOẠI

Hình 2. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài Bacillus có
quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen 16S rRNA
Quan sát trên cây phân loại cho thấy: chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với Bacillus
amyloliquefaciens_NR041455 (giá trị lặp lại 77%) với mức độ tương đồng ở trình tự ADNr
16S là 99,9%.
Để phân loại chính xác đến dưới loài của chủng SP1901, chúng tôi đã thực hiện phản
ứng khuếch đại và giải trình tự 6 đoạn gen: gyrase subunit A (gyrA), RNA polymerase
subunit B (rpoB), phosphoibosylaminoimidazolecarbox-amide formyltransferase (purH),
DNA polymerase III subunit alpha (polC), 60 kDa heat-shock protein groEL (groEL) và 16S
rRNA, sử dụng các cặp mồi theo mô tả của Rooney và cộng sự, (2009).
Staphylococcus aureus_X68417
Bacillus cibi_AY550276
Bacillus indicus_AJ583158
Bacillus idriensis_AY904033

100
Bacillus isabeliae_AM503357
100
Bacillus aerophilus_AJ831844
Bacillus stratosphericus_AJ831841
Bacillus altitudinis_AJ831842
100
Bacillus safensis_AF234854
Bacillus pumilus_AY876289
100
99
Bacillus aerius_AJ831843
Bacillus licheniformis_X68416
Bacillus sonorensis_AF302118
89
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus axarquiensis_AY603657
Bacillus mojavensis_AB021191
Bacillus malacitensis_AY603656
69
Bacillus subtilis_AB042061
54
Bacillus vallismortis_AB021198
66
SP 1901
Bacillus methylotrophicus_EU194897
Bacillus amyloliquefaciens_NR041455
77
Bacillus nematotocita_AY820954
65

77
71
81
100
99
100
97
54
94
0.01

12

Hình 3. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài thuộc nhóm
Bacillus subtilis dựa vào trình tự kết nối 6 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S
rRNA
Quan sát trên cây phân loại cho thấy: chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với Bacillus
amyloliquefaciens subsp. plantarum; trong đó SP1901 sai khác 54 bp với Bacillus
amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 (tương đương 99%) và sai khác 162 bp với
Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7 (tương đương 97%). Kết quả
phân tích cho thấy chủng nghiên cứu được xếp vào nhóm loài B. amyloliquefaciens subsp.
plantarum và phân tách rõ ràng với nhóm loài B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens
cũng như những loài khác trong nhóm B. subtilis.
Đặc điểm hình thái

Hình 4. Hình thái tế bào (trái) và khuẩn lạc (phải) của chủng SP1901
Bacillus cereus ATCC 14579
Bacillus pumilus NRRL NRS-272
Bacillus sonorensis NRRL-B-23154
Bacillus licheniformis DMS 13
SP
1901
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42
Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7
100
Bacillus atrophaeus NRRL NRS-213
Bacillus mojavensis NRRL B-14698
Bacillus vallismortis NRRL B-14890
Bacillus tequilensis NRRL B-41771
Bacillus subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum NRRL B-23052
Bacillus subtilis subsp. subtilis NRRL NRS-744
96
80
73
100
100
100
98
100
100
100
0.02

13

3.3 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
3.3.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống


Hình 5. Môi trƣờng nhân giống thích hợp
chủng SP1901
Hình 6. pH thích hợp cho sinh trƣởng
chủng SP1901

Hình 9. Chế độ thông khí thích hợp cho sinh trƣởng chủng SP1901
Giống khởi động được dùng để cấy vào các môi trường lên men xốp, đóng vai trò rất
quan trọng đối với quá trình lên men xốp sau đó đặc biệt là lượng sinh khối và chất lượng
giống. Các yếu tố này được quyết định bởi các điều kiện nhân giống như môi trường, pH,
nhiệt chế độ thông khí và thời gian (quyết định tuổi của giống) tạo điều kiện tối đa cho sự
phát triển sinh khối. Với các kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy điều kiện nhân giống thích


Hình 7. Nhiệt độ thích hợp cho sinh
trƣởng chủng SP1901
Hình 8. Thời gian thích hợp cho sinh
trƣởng chủng SP1901

14
hợp nhất cho chủng SP1901 là nhân giống trên môi trường dịch thể NA ở 40
o
C, pH 6 và nuôi
trong điều kiện lắc 200 vòng/ phút. Số lượng tế bào đạt được cao nhất sau 16-24 h nuôi cấy.
3.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp

Hình 10. Cơ chất thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901

Hình 11. Độ ẩm thích hợp cho lên men
xốp của chủng SP1901
Hình 12. Tỷ lệ cấy giống thích hợp cho
lên men xốp của chủng SP1901

Hình 13. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên sinh khối và hoạt tính phytase của
chủng SP1901

15


Hình 14. Nguồn các bon thích hợp cho lên
men xốp của chủng SP1901
Hình 15. Nguồn nitơ thích hợp cho lên
men xốp của chủng SP1901



Hình 16. Ảnh hƣởng của các ion kim loại đến
khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng
SP1901
Hình 17. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng
Ca
2+
đến khả năng sinh tổng hợp
phytase của chủng SP1901
Với những kết quả thu được khi tối ưu hóa các điều kiện lên men xốp của chủng
SP1901, ngô vỡ là cơ chất thích hợp nhất cho quá trình sản xuất phytase, độ ẩm 50% và tỷ lệ

cấy giống từ 10-20% tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp phytase và
hoạt tính phytase đạt được cao nhất sau 84 h nuôi cấy. Chủng SP1901 có thể sử dụng nguồn
cacbon và nitơ sẵn có trong cơ chất tuy nhiên khi có mặt lactose, glycerol, ure và NH
4
NO
3

cũng làm tăng nhẹ hoạt tính phytase thu được. Ion Ca
2+
có vai trò quyết định đối với quá trình
sản sinh phytase ở nồng độ thích hợp từ 0,1-1%, các môi trường không có mặt Ca
2+
đều
không có sự sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901.

16
3.4 THU HỒI ENZYME
3.4.1 Thu hồi enzyme bằng các dung dịch chiết khác nhau


Hình 18. Chiết xuất enzyme bằng
các dung môi khác nhau
Hình 19. Tủa enzyme bằng cồn và
acetone

3.4.2 Tủa enzyme bằng các dung môi khác nhau
Khi tủa enzyme bằng các phân đoạn khác nhau với muối (NH
4
)
2

SO
4
, hoạt tính phytase
mất hoàn toàn ở tất cả các phân đoạn. Do đó không thể sử dụng muối (NH
4
)
2
SO
4
khi tủa
phytase trong trường hợp này. Khi tủa bằng cồn và acetone (hình 19) phytase tủa nhiều nhất ở
nồng độ cồn và acetone 70%.
3.5 NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901
3.5.1 Phân tích trình tự gen phytase và so sánh với các loài có quan hệ gần gũi
Trình tự gen phytase chủng SP1901 gồm 1175 bp, được so sánh độ tương đồng với các
chủng thuộc nhóm Bacillus substilis khác đã được công bố trên Genbank. Cây phân loại được
xây dựng dựa vào trình tự của gen phytase của chủng SP1901 và 33 chủng khác thuộc nhóm
Bacillus substilis được thể hiện trong hình 28.
Kết quả ở hình 20 cho thấy chủng SP1901 có độ tương đồng 97% với trình tự gen
phytase của chủng Bacillus amyloliquefaciens FZB42, 97% với trình tự gen phytase của
chủng Bacillus sp. B13, 96% với trình tự gen phytase của chủng Bacillus sp. DS11, 90% với
trình tự gen phytase của Bacillus amyloliquefaciens DSM7. Trong cây phát sinh được xây
dựng dựa trên trình tự gen phytase, các loài Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus subtilis
nằm xen kẽ lẫn nhau. Khi so sánh vị trí của chủng SP1901 trong 2 cây phát sinh chủng loại

17
được xây dựng dựa trên trình tự gen phytase và 6 gen cho thấy: trong cây xây dựng dựa trên 6
gen, vị trí của chủng SP1901 rất gần với 2 chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp.
amyloliquefaciens DSM7 và Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42, tuy nhiên
trong cây dựa trên trình tự gen phytase, vị trí chủng SP1901 chỉ gần với Bacillus

amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 và xa so với chủng Bacillus amyloliquefaciens
subsp. amyloliquefaciens DSM7. Như vậy, có thể thấy rằng trình tự gen phytase của các
chủng trong cùng loài Bacillus amyloliquefaciens rất đa dạng và khẳng định thêm kết quả
định danh chủng SP1901 đến mức dưới loài là Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum.

Hình 20. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài Bacillus
có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen mã hóa phytase



Bacillus subtilis E20_FJ541287
B. amyloliquefaciens subsp plantarum CAU B946_HE617159
Bacillus subtilis_AJ584664
64
Bacillus sp. MD2_GU143090
Bacillus sp. DS11_U85968
72
Bacillus subtilis_WYCQ02_FJ986327
79
Bacillus subtilis_ARRMK33 _EF092835
Bacillus subtilis_AF292103
Bacillus subtilis IDCC 1102_DQ346197
86
Bacillus amyloliquefaciens FZB42_CP000560
100
Bacillus sp. HQ730912_B13
62
SP 19.01

89

Bacillus sp. SDBZ4_GU198969
Bacillus subtilis_AF298179
Bacillus subtilis B9601-Y2 _EU624118
Bacillus amyloliquefaciens_FZB45_ AY055220
B.amyloliquefaciens subsp plantarum YAU B9601-Y2_HE774679
Bacillus amyloliquefaciens Y2_CP00333
Bacillus subtilis WHNB02_AY220075
Bacillus sp. SD01N_AY518208
48
74
64
61
62
82
98
68
57
Bacillus amyloliquefaciens LL3_CP002634
Bacillus amyloliquefaciens TA208_CP002627
Bacillus amyloliquefaciens XH7_CP002927
93
Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 HM747163
92
Bacillus amyloliquefaciens_AF453255
93
Bacillus amyloliquefaciens DSM7_FN597644
Bacillus amyloliquefaciens BAP_AY836773
Bacillus subtilis ATCC 12711_JQ437256
100
Bacillus subtilis McCoyRa_JN886002

100
Bacillus subtilis_AF029053
100
Bacillus subtilis_AJ277890
100
Bacillus subtilis US417 _AM501550
100
Bacillus subtilis XF-8_HM070997
99
97
100
100
0.01

18






3.5.2 Đặc tính enzyme phytase thô


Hình 21. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ
bền của phytase chủng SP1901
Hình 22. Khả năng bền nhiệt của
phytase trên cơ chất đƣợc sấy khô ở 50
o
C

trong 24h



Hình 23. pH hoạt động thích hợp của
phytase chủng SP1901
Hình 24. Nhiệt độ hoạt động thích hợp
của phytase chủng SP1901


19


Hình 25. Ảnh hƣởng của các ion kim loại
đến hoạt tính của phytase chủng SP1901
Hình 26. Ảnh hƣởng của enzyme
tiêu hóa đến hoạt động của phytase
chủng SP1901

Hình 27. Ảnh hƣởng của Ca
2+
đến độ bền nhiệt của phytase chủng SP1901 xử lý ở 60
o
C
(phải), xử lý ở 70
o
C (trái)
Như vậy với các kết quả nghiên cứu đặc tính enzyme phytase của chủng SP1901 cho
thấy rằng: phytase của chủng bền ở 60
o

C (vẫn giữ được 90% hoạt tính sau 30 phút xử lý ở
60
o
C), hoạt động tối ưu ở pH 5,6-7,2 và 50
o
C. Sự có mặt của Ca
2+
và Cu
2+
làm tăng nhẹ hoạt
tính phytase và sự có mặt EDTA từ 2mM trở lên làm ức chế hoàn toàn hoạt tính phytase. Ca
2+

làm tăng độ bền nhiệt của phytase ở 60 và 70
o
C, khi không có mặt Ca
2+
ở 70
o
C sau 30 phút
xử lý hoạt tính chỉ còn 28% tuy nhiên khi có mặt Ca
2+
, sau khi xử lý 30 phút ở 70
o
C hoạt tính
vẫn giữ được 95% hoạt tính. Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất sấy khô tăng đáng
kể, sau 30 phút xử lý ở lần lượt 60, 70 và 80
o
C hoạt tính phytase giữ được 90, 77 và 49%, sau
10 phút xử lý ở 90

o
C hoạt tính phytase chỉ còn 31%. Phytase của chủng SP1901 bền với

20
enzyme tiêu hóa trypsinee 0,1mg/ml pH 8 khi được ủ với trypsinee trong 30 phút và bị giảm
dần hoạt tính khi tăng dần thời gian ủ với pepsine 10 mg/ml pH 3.
















KẾT LUẬN
- Từ 346 chủng, đã sàng lọc được 91 chủng chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng được ở
40
o
C. Các chủng này được nuôi trên môi trường PSM, định lượng trên môi trường dịch thể,
lên men xốp và kiểm tra khả năng bền nhiệt đã chọn được chủng SP1901 có hoạt tính phytase
cao và bền nhiệt.
- Chủng SP1901 được định danh là loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum dựa trên

phân tích trình tự ADNr 16S và trình tự kết nối của 6 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL,
16S rRNA.
- Điều kiện nhân giống thích hợp của chủng SP1901: môi trường thạch thường ở 40
o
C,
pH 6, điều kiện hiếu khí sau 16-24 h nuôi cấy.
- Điều kiện lên men xốp thích hợp của chủng SP1901 cho hoạt tính phytase cao nhất: cơ
chất là ngô vỡ (đạt 4,68U/g), độ ẩm là 50%, tỷ lệ cấy giống phù hợp nhất là từ 10-20% và sau
84 h nuôi cấy, nguồn cacbon là lactose, glycerol, sucro, CMC và nguồn nitơ là ure. Ion Ca
2+

có vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp phytase ở nồng độ 0,2-0,8%.
- Thu hồi enzyme bằng dung dịch chiết SDS 1% và nước máy cho hiệu quả chiết xuất
cao nhất (5,74 và 5,54 U/g). Phytase bị mất hoạt tính hoàn toàn ở tất cả các phân đoạn khi tủa

21
bằng (NH
4
)
2
SO
4
, khi tủa bằng cồn và acetone phytase tủa nhiều nhất ở nồng độ 70% đạt 91-
95%.
- Phytase của chủng SP1901 bền ở 60
o
C, hoạt động tối ưu ở pH 5,6-7,2 và 50
o
C. Sự có
mặt của Ca

2+
và Cu
2+
làm tăng hoạt tính phytase và sự có mặt EDTA từ 2 mM làm ức chế
hoàn toàn hoạt tính phytase. Ca
2+
làm tăng độ bền nhiệt của phytase ở 60
o
C và 70
o
C. Khả
năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất sấy khô tăng đáng kể, phytase của chủng SP1901 mẫn
cảm với pepsine và không mẫn cảm với trypsine.

References
TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Thị Ngọc Huyền (2007), Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên và tái tổ hợp của vi
khuẩn Bacillus subtilis, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
2. Ngô Thanh Xuân (2011), Nghiên cứu phytase tái tổ hợp từ Aspergillus niger XP trong
Pichia pastoris và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi. Luận án tiến sĩ, Đại học sư
phạm Hà Nôi.
3. Nguyễn Thùy Châu (2009), Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp. Báo cáo dự án khoa học
kỹ thuật - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công
nghệ sau thu hoạch.

TIẾNG ANH
4. Anderson RJ (1914), A contribution to the chemistry of phytin. I. Composition of
barium phytate and phytic acid. II. A study of the properties of phytic acid and its

decomposition products. Eighth paper on phytin. Journal Biological Chemistry 17: 171-
190.
5. Angel R, Tamim NM, Applegate TJ, Dhandu AS, Ellestad LE (2002), Phytic acid
chemistry: influence on phytin-phosphous availability and phytase efficacy. Journal
Applied Poultry Research 11: 471-480.
6. Alvarez F, Castro M, Principe A, Borioli G, Fischer S, Mori G & Jofre E (2012), The
plant-associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP2 18 and ARP2 3 capable of
producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in
biocontrol of sclerotinia stem rot disease. Journal of applied microbiology 112(1): 159-
174.
7. Arguelles-Arias A, Ongena M, Halimi B, Lara Y, Brans A, Joris B & Fickers P (2009),
Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary
metabolites for biocontrol of plant pathogens. Microbial Cell Factories 8: 63.
8. Ash C, Farow JAE, Wallbanks S & Collins MD (1991), Phylogenetic heterogeneity of
the genus Bacillus revealed by comparative analysis of small-subunit-ribosomal RNA
sequences. Letters in Applied Microbiology 13(4): 202-206.
9. Bae HD, Yanke LJ, Cheng KJ, Selinger LB. (1999), A novel staining method for
detecting phytase activity. Journal of Microbiological Methods - Elsevier 39(1):17-22.

22
10. Baldi BG, Franceschi VR, Loewus FA (1987), Localization of phosphous and cation
reserves in Lilium longiflorum pollen. Plant Physiology 83(4): 1018-1021.
11. Billington DC, editor (1993), The inositol phosphates: chemical synthesis and biological
significance. Weinheim Verlag Chemic: 153.
12. Bogar B, Szakacs G, Linden JC, Pandey A, Tengerdy RP. 2003, Optimization of
phytase production by solid substrate fermentation. Journal of industrial microbiology
and biotechnology 30(3):183-9.
13. Borriss R, Chen XH, Rueckert C, Blom J, Becker A, Baumgarth B, Fan B, Pukall R,
Schumann P, Spröer C, Junge H, Vater J, Pühler A, Klenk HP. (2011), Relationship of
Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42T: a

proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens subsp. nov. and
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum subsp. nov. based on complete genome
sequence comparisons. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology 61(8): 1786-1801.
14. Bourdillon J (1951), A crystalline bean seed protein in combination with phytic acid.
Journal Biological Chemistry 189(1): 65-72.
15. Byrd CA, Matrone G (1965), Investigations of chemical basis of zinc-calcium-phytate
interaction in biological systems. Proceedings of the Society for Experimental Biology
and Medicine 119: 347-349.
16. Cao H, He S, Wei R, Diong M & Lu L (2011), Bacillus amyloliquefaciens G1: A
Potential Antagonistic Bacterium against Eel-Pathogenic Aeromonas hydrophila. Evid
Based Complement Alternat Med 2011: 7.
17. Caldwell AG, Black CA (1958), Inositol hexaphosphate. III. Content in soils. Soil
Science Society of America Journal 22: 290-293.
18. Cheryan M (1980), Phytic acid interaction in food systems. CRC critical reviews in food
science and nutrition 13: 297-335.
19. Chen XH, Koumoutsi A, Scholz R, Eisenreich A, Schneider K, Heinemeyer I,
Morgenstern B, Voss B, Hess WR, Reva O, Junge H, Voigt B, Jungblut PR, Vater J,
Süssmuth R, Liesegang H, Strittmatter A, Gottschalk G, Borriss R. (2007), Comparative
analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium
Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nature Biotechnol 25(9): 1007-1014.
20. Choi YM, Suh HJ, Kim JM (2001), Purification and properties of extracellular phytase
from Bacillus sp KHU-10. Journal of Protein Chemistry 20(4): 287-292.
21. Chun J & Bae KS (2000), Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa
based on partial gyrA gene sequences. Antonie Van Leeuwenhoek 78(2): 123-127.
22. Cosgrove DJ, Irving GCJ, editors (1980), Inositol Phosphates: Their chemistry,
Biochemistry and Physiology. North Holland, Inc., New York: Elsevie: 191.
23. Davies NT, Nightingale R (1975), The effects of phytate on intestinal absorption and
secretion of zinc,and whole body retention of zinc, copper, iron, and manganese in rats.
Bristish Journal of Nutriton 34(2): 243-258.

24. Davies NT, A. FA (1978), The similarity between alkaline phosphatase (EC.3.1.3.1) and
phytase (EC.3.1.3.8) activity in rat intestine and their importance in phytate induced zinc
deficiency. Bristish Journal of Nutriton 39(2): 307-316.

23
25. David B, Mitchell, Kurt Vogel, Bernd J, Weimann, Luis Pasamontes, Adolphus P G M,
van Loon (1997), The phytase subfamily of histidine acid phosphatases: Isolation of
genes for two novel phytases from the fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora
thermophila. Microbiology 143: 245-252.
26. Dvoráková J (1998), Phytase: sources, preparation and exploitation. Folia
Microbiologica 43(4): 323-338.
27. Dyer WJ, Wrenshall CL, Smith GR (1940), The isolation of phytin from soil. Science
91(2361): 319–321.
28. Earl AM, Losick R, Kolter R. 2008, Ecology and genomics of Bacillus subtilis. Trends
in Microbiology 16(6): 269-75.
29. Farhat A., Chouayekh H., Mounira B., Bouchaala K., Bejar S. (2008), Gene Cloning and
Characterization of a Thermostable Phytasefrom Bacillus subtilis US417 and
Assessment of its Potentialas a Feed Additive in Comparison with a Commercial
Enzyme. Molecular Biotechnology 40(2): 127–135.
30. Ferguson EL, Gibson RS, Thompson LU, Ounpuu S (1989), Dietary calcium, phytate,
and zinc and the calcium, phytate and zinc molar ratios of the diets of East-African
children. The American Journal of Clinical Nutrition 50(6): 1450-1456.
31. Fontaine TD, Pons WA, Irving GW (1946), Protein-phytic acid relationship in peanuts
and cottonseed. Journal Biological Chemistry 164(2): 487-507.
32. Fu SJ, Sun JY, Qian LC, Li ZY (2008), Bacillus phytases: Present scenario and future
perspectives. Applied Biochemistry and Biotechnology 151(1): 1-8.
33. Graf E, Eaton JW (1993), Suppression of colonic cancer by dietary phytic acid.
Nutrition and Cancer 19(1): 11-19.
34. Greiner R, Konietzny U, Jany KD (1993), Purification and characterization of two
phytases from Escherichia coli. Archives Biochemistry and Biophysics 303(1): 107-113.

35. Greiner R, Konietzny U (2006), Phytase for food application. Food Technology and
Biotechnology 44: 125-140.
36. Greiner E, Konietzny U (1996), Construction of a bioreactor to produce special
breakdown products of phytate. Journal Biotechnology 48(1-2): 153-159.
37. Gulati H. K., Chadha B. S., Saini H. S. (2007), Production and characterization of
thermostable alkaline phytase from Bacillus laevolacticus isolated from rhizosphere soil.
Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34(1): 91–98.
38. Gupta R, Beg QK & Lorenz P (2002), Bacterial alkaline proteases: molecular
approaches and industrial applications. Applied Microbiology and Biotechnology 59(1):
15-32.
39. Gupta SK, Venkatasubramanian TA (1975), Production of aflatoxyn on soybeans.
Applied Microbiology 29(6): 834-836.
40. Ha NC, Oh BC, Shin S, Kim HJ, Oh TK, Kim YO, Choi KY, Oh BH. (2000), Crystal
structures of a novel, thermostable phytase in partially and fully calcium-loaded states.
Nature Structural & Molecular Biology 7(2): 147-153.
41. Harland BF, Morris ER (1995), Phytin: A good or a bad food component. Nutrition
Research 15: 733-754.
42. Harland BF, Oberleas D (1987), Phytate in Foods. World Review of Nutrition &
Dietetics 52: 235-259.

24
43. Hartig T (1855), Über das Klebermehl. Bot Ztg 13: 881-882.
44. Hartig T (1856), Weitere mittheilungen das klebermehl (Aleuron) betreffend. Bot Ztg
14: 257-268.
45. Hawkins PT, Poyner DR, Jackson TR, Letcher AJ, Lander DA, Irvine RF (1993),
Inhibition of ironcatalysed hydroxyl radical formation by inositol polyphosphates: a
possible physiological function for myo-inositol hexakisphosphate. Biochemical Journal
294(3): 929-934.
46. Honke J, Kozlowska H, Vidal-Valverde C, Frias J, Gorecki R (1998), Changes in
quantities of inositol phosphates during maturation and germination of legume seeds. Z

Lebensm Unters Forsch A 206: 279-283.
47. Idriss EE, Makarewicz O, Farouk A, Rosner K, Greiner R, Bochow H, Richter T,
Borriss R. (2002), Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45
contributes to its plant-growth-promoting effect. Microbiology 148(7): 2097-2109.
48. Igbal TH, Lewis KO, T. CB (1994), Phytase activity in the human and rat small
intestine. Gut 35(9): 1233-1236.
49. Igbasan FA, Männer K, Miksch G, Borriss R, Farouk A SO (2000), Comparative studies
on the in vitro properties of phytases from various microbial origins. Archives of Animal
Nutrition 53(4): 353-373.
50. IUB (1979), Enzyme nomenclature. In: Recommendations of the Nomenclature
Committee of the International Union of Biochemistry. New York: Academic Press: 247.
51. Jackson JF, Jones G, Linskens HF (1982), Phytic acid in pollen. Phytochemistry 21(6):
1255-1258.
52. Jacobsen T, Slotfeldt DE (1983), Phytic acid and metal availability: a study of Ca and
Cu binding. Cereal Chemistry 60: 392-395.
53. Katayama T (1995), Effect of dietary sodium phytate on the hepatic and serum levels of
lipids and on the hepatic activities of NADPH-generating enzymes in rats fed on
sucrose. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59(6): 1159-1160.
54. Kerovuo J, Lauraeus M, Nurminen P, Kalkkinen N, Apajalahti J (1998), Isolation,
characterization, molecular gene cloning and sequencing of novel phytase from Bacillus
subtillis. Applied Environmental Microbiology 64(6): 2079-2085.
55. Kerovuo J (2000), A Novel Phytase from Bacillus. Characterization and Production of
the Enzyme, PhD thesis, Faculty of Science, University of Helsinki, Finland.
56. Kerovuo J, Lappalainen I, Reinikainen T (2000), The metal dependence of Bacillus
subtilis phytase. Biochemical and Biophysical Research Communications 268(2): 365-
369.
57. Kim YO, Kim HK, Bae KS, Yu JH, Oh TK (1998), Purification and properties of a
thermostable phytase from Bacillus sp. DS11. Enzyme and Microbial Technology 22(1):
2-7.
58. Knuckles BE (1985), Effect of phytate and partially hydrolyzed phytate on in vitro

protein Digestibility. Journal of Food Science 50(4) : 1080–1082.
59. Konietzny U, Greiner R, editors (2003), Phytic acid and nutritional impact. 2 ed.
Amsterdam: Elsevier Science: 4546-4563.

25
60. Kostrewa D, Wyss M, D'Arcy A, van Loon APGM (1999), Crystal structure of
Aspergillus niger pH 2.5 acid phosphatase at 2.4 A resolution. Journal Molecular
Biology 288(5): 965-974.
61. Koumoutsi A, Chen XH, Vater J & Borriss R (2007), DegU and YczE positively
regulate the synthesis of bacillomycin D by Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42.
Applied Environmental Microbiology 73(21): 6953-6964.
62. Kubo Y, Rooney AP, Tsukakoshi Y, Nakagawa R, Hasegawa H & Kimura K (2011),
Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis strains applicable to natto (fermented soybean)
production. Applied and Environmental Microbiology 77(18): 6463-6469.
63. Lei XG, Ku PK, Miller ER, Yokoyama MY (1993), Supplementing corn-soybean meal
diets with microbial phytase linearly improveshytate phosphous utilization by weanling
pigs. Journal Animal Science 71: 3359-3367.
64. Lei XG, Porres JM (2003), Phytase enzymology, applications, and biotechnology.
Biotechnology Letters 25(21): 1787-1794.
65. Lei Xin Gen, Porres Jesus M., Edward J. Mullaney and Henrik, Brinch-Pedersen,
Phytase: Source, structure and application. Industrial Enzymes: 505–529.
66. Lott JA, Ockenden I, Raboy V, Batten GD (2002), A global estimate of phytic acid and
phosphous in crop grains, seeds, and fruits. In: Reddy NR, Sathe SK, editors. Food
Phytates. Boca Raton, FL: CRC Press: 6-23.
67. Lott JNA, Buttrose MS (1978), Globoids in protein bodies of legume seed cotyledons.
Australian Journal of Plant Physiology 5: 89-111.
68. Lönnerdal B (2000), Dietary factors influencing zinc absorption. Journal Nutrition 130:
1378-1383.
69. Maddaiah VT, Kurnick AA, Riel BL (1964), Phytic acid study. Proceedings of the
Society for Experimental Biology and Medicine 115: 391-393.

70. Maddiaah VT, Kurnick AA, Hulett BJ, Reid BL (1964), Nature of intestinal phytase
activity. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 115: 1054-
1057.
71. Maenz DD, Engele-Schaan CM, Newkirk RW, Classen HL (1999), The effect of
minerals and mineral chelators on the formation of phytase-resistant and phytase-
susceptible forms of phytic acid in solution and in a slurry of canola meal. Animal Feed
Science and Technology 81(3-4): 177-192.
72. Mallin MA (2000), Impact of industrial animal production on river and estuaries.
American Sciences 88(1): 26-73.
73. Maria I.; Aneli M.; Ana F.D. ; Asae S. (2002), Xylanase production by Trichoderma
hazianum Rifai by solid state fermentation on sugarcane bagasse. Brazilian Journal of
Microbiology 33(1): 67-72.
74. Marshall J. John 1980, Preservation of enzymes by conjugation with dextran. Chemical
Deterioration of Proteins 123: 125–143.
75. Martin CJ, Evans WJ (1989), Phvtic acid-enhanced metal ion exchange reactions: the
effect on carboxypeptidase A. Journal of Inorganic Biochemistry 35(4): 267-288.
76. Maugenest S, Martinez I, Lescure A M (1997), Cloning and characterization of a cDNA
encoding maize seedling phytase. Biochemistry J 322(2): 511-517.