Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn ACETOBATER XYLINUM cho màng mỏng

Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

TRNG I HC S PHM H NI 2
KHOA SINH KTNN
---------------------***---------------------

TRN TH THOA

PHN LP, TUYN CHN VI KHUN
ACETOBACTER XYLINUM CHO
MNG MNG

KHểA LUN TT NGHIP I HC
Chuyờn ngnh: Vi sinh vt hc

H NI - 2007

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

Lời cảm ơn
hon thnh ti nghiờn cu ny em ó nhn c s hng dn,
ch bo tn tỡnh ca TS. inh Th Kim Nhung, cỏc thy cụ ging dy b mụn

Vi sinh. ng thi em cng xin chõn thnh cm n cỏc thy cụ giỏo trong
Khoa Sinh - KTNN ó to iu kin thun li cho em hon thnh tt ti
nghiờn cu ny. Em xin chõn thnh cm n s giỳp quý bỏu ú.

H Ni, ngy 10 thỏng 5 nm 2007
Sinh viờn thc hin
Trn Th Thoa
Lp 29A Khoa Sinh KTNN

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

LI CAM OAN
Tụi xin khng nh õy l kt qu nghiờn cu ca riờng cỏ nhõn tụi,
ti nghiờn cu ny khụng trựng vi cụng trỡnh nghiờn cu ca cỏc tỏc gi
khỏc.

Tỏc gi
Trn Th Thoa

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN

Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

MC LC

Trang

Li cm n
Bn cam oan
Mc lc
Danh mc bng v hỡnh
t vn

5

Ni dung

7

Chng 1. Tng quan ti liu

7

1.1.

Lc s nghiờn cu v phõn loi vi khun Acetobacter ..................... 7

1.2.

c im chung ca vi khun Acetobacter ...................................... 10

1.3.

Mt s c im ca cỏc nhúm vi khun Acetobacter ...................... 14

Chng 2. i tng v phng phỏp nghiờn cu

18

2.1. i tng nghiờn cu ......................................................................

18

2.2. Trang thit b v húa cht ..................................................................... 18
2.3. Mụi trng ........................................................................................... 19
2.4. Phng phỏp nghiờn cu ...................................................................... 19
24

Chng 3. Kt qu nghiờn cu v tho lun

3.1. Phõn lp vi khun axetic t mt s ngun nguyờn liu ..................... 24
3.2. Tuyn chn chng vi khun Acetobacter xylinum

.......................... 29

cho mng mng
3.3. Quan sỏt hỡnh thỏi t bo vi khun Acetobacter xylinum 34
Chng 4. Kt lun v kin ngh

37

4.1. Kt lun

..37

4.2. Kin ngh

..37

Ti liu tham kho

Trần Thị Thoa

38

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

DANH MC BNG V HèNH

Trang

Bng:
Bng 1.1. Nhng c im phõn bit Acetobacter v ................................. 12

Gluconobacter so sỏnh vi Pseudomonas.
Bng 3.1. Kho sỏt kh nng to mng ca cỏc mu ................................. 29
vi khun axetic.
Bng 3.2. Kho sỏt kh nng to mng ca mt s .. 33
chng vi khun Acetobacter xylinum.

Hỡnh :
Hỡnh 1. Mu dch lờn men gim ..... 24
Hỡnh 2. Mu lờn men dch hoa qu .. 25
Hỡnh 3. Khun lc phõn lp t gim .......................................................... 27
Hỡnh 4. Khun lc phõn lp t dch hoa qu 28
Hỡnh 5. nh vi khun Acetobacter xylinum trờn . 35
kớnh hin vi quang hc vi phúng i 1000 ln.
Hỡnh 6. Vi khun Acetobacter xylinum G11 trờn mụi trng .. 36
thch

Trần Thị Thoa

nghiờng.

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

T VN
Ngy nay cựng vi s phỏt trin ca khoa hc k thut v cụng ngh,
cụng ngh sinh hc (CNSH) ó tr thnh mt ngnh kinh t ch o ca nhiu

quc gia trờn th gii. L mt b phn ca ngnh CNSH, cụng ngh vi sinh
vt hc ó v ang phỏt trin mnh m vi nhng ng dng thit thc vo
nhiu lnh vc ca cuc sng nh: cụng nghip, nụng nghip, y hc... Bng
vic ng dng cỏc quỏ trỡnh lờn men vi sinh vt vo sn xut cỏc ch phm
chỳng ta ó tn dng v tit kim c chi phớ trong vic gii quyt rt nhiu
vn vớ d nh nụng nghip, cụng nghip, bo v mụi trng Mt trong
nhng chng vi khun c ng dng rng rói trong cụng ngh lờn men vi
sinh vt hc l vi khun Acetobacter (cũn gi l vi khun gim).
Khi nuụi cy loi vi khun Acetobacter trờn b mt mụi trng lng nú
to thnh mt lp mng cú bn cht l hemixenluloza trờn b mt thoỏng ca
dung dch. Mng ny c dựng lm ra nhng si t khe v cú n hi
cao trong mụi trng nc núng. Mng ny c xem nh mt nguyờn liu
mi cú tim nng ng dng sn xut micro cú chớnh xỏc cao, sn xut
thch da, sn xut giy cht lng cao, trong cụng nghip sn xut n
kiờng v n trỏng ming [13]
Trong cụng nghip, nụng nghip vi khun ny c dựng sn xut
EM (Effective Micoorganisms) cú tỏc dng a hiu trờn nhiu lnh vc c
bit trong lnh vc x lý rỏc thi: EM giỳp kh mựi hụi v gim chi phớ 10 ln
so vi t rỏc. Trong cụng nghip sn xut giy cht lng cao ngi ta ó s
dng nguyờn liu l mng hemixenluloza to thnh trong quỏ trỡnh nuụi cy vi
khun gim. Trong cụng nghip thc phm, vi khun Acetobacter (chng
Acetobacter xylinum) c s dng sn xut thch da - mt mún n giu
dinh dng v khỏ ph bin hin nay.

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

Hin nay, khi nghiờn cu v nhng tớnh nng c bit ca mng
hemixenluloza cho thy nú cũn cú th thay th da tm thi. Cụng ngh y hc
hin i ó cụng nhn nghiờn cu ng dng mng hemixenluloza lm da nhõn
to l mt hng nghiờn cu trin vng v cú giỏ tr. Nú cú th thay th da tm
thi cho nhng bnh nhõn bng t cp 1 n cp 4. Cỏc bỏc s phu
thut to hỡnh, cha bng cho cỏc bnh nhõn bng cp 2 ; 3 ; ghộp da khi b
nhim trựng ó s dng da nhõn to ny v thy cú kt qu tt nh: mng bỏm
chc lờn b mt ngay khi nc bc hi, nú khụng cho nc lng thm qua
nhng li cho hi nc v khớ di chuyn qua, mng cú trong giỳp d dng
quan sỏt s bin chuyn ca vt thng. õy l nhng c im quan trng
trong ng dng y hc [13].
Cú th núi vi khun gim ó v ang c ng dng nhiu hn trong
cuc sng. Vi mong mun c tỡm hiu thờm v chng vi khun
Acetobacter v nhng ng dng hu ớch ca nú c bit l ng dng lm da
nhõn to trong iu tr bng, tụi tin hnh nghiờn cu ti: Phõn lp, tuyn
chn vi khun Acetobacter xylinum cho mng mng.

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

NI DUNG

Chng 1
TNG QUAN TI LIU
1.1. Lc s nghiờn cu v phõn loi vi khun gim
T rt lõu trong lch s con ngi ó bit cỏch lm gim song cha h
nm c c s khoa hc, cng khụng th gii thớch c bng cỏch no ru
loóng li cú th bin thnh gim n. Cho n u th k XIX, khi khoa hc k
thut phỏt trin, c bit vi s ra i ca kớnh hin vi, th gii vi sinh vt
c khỏm phỏ, con ngi mi bit c gim l sn phm ca quỏ trỡnh lờn
men nh mt nhúm vi sinh vt m ngy nay ngi ta gi chỳng l vi khun
Acetobacter hay vi khun axetic [4,5].
Nm 1822, Person ó tin hnh nhng nghiờn cu u tiờn v vi khun
Acetobacter t lp mng thu c trờn b mt cỏc bỡnh sn xut gim. ễng
khng nh ú l mt loi vi sinh vt v gi l Mycoderma aceti [7].
Nm 18, Kỹtzing sau khi loi b ht vi sinh vt trong chum lm gim v
thy rng gim khụng c to thnh na. ễng ó a ra nhn xột: quỏ trỡnh
lờn men gim nht thit phi cú mt vi sinh vt nu khụng s khụng din ra s
chuyn húa ru thnh gim. Cng trong nm 18, Hansen (ngi an Mch)
ó tỏch c t mng gim ra hai loi vi khun thun khit l Mycoderma
aceti v Mycoderma pasteurianum.
T nm 1862 n nm 1868, Pasteur nh s tr giỳp c lc ca kớnh
hin vi ó chng minh s ỳng n trong nhn xột ca Kỹtzing v Hansen v
khng nh bn cht ca quỏ trỡnh lờn men gim. ễng nghiờn cu lp mng
nhy xut hin trờn b mt bia, ru vang v i n kt lun: mng ú c
to thnh do mt loi trc khun, v ụng cng gi trc khun ú l
Mycoderma aceti.

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN

Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

Cựng vi nhng nghiờn cu trờn v vi khun Acetobacter, cỏc nghiờn
cu khỏc cng nh nhng nghiờn cu sau ny u nhm tỡm hiu rừ thờm v
tỡm cỏch ci thin quỏ trỡnh lờn men gim. Hin nay, ngi ta ang i vo
nghiờn cu nhng ng dng mi ca vi khun Acetobacter bng cỏch phõn lp
cỏc chng vi khun thun khit, nghiờn cu cỏc c im cu to, sinh lý, sinh
húa ca chỳng nhm tỡm ra nhng chng tt nht cho tng ng dng trờn c s
i chiu vi cỏc tiờu chun phõn loi ó c a ra.
1.1.1. Cỏc tiờu chun phõn loi vi khun Acetobacter
+ a im ni phõn lp: l ni c trỳ cú liờn quan n iu kin mụi
trng sng.
+ c im hỡnh thỏi: ú l hỡnh dng t bo, cỏch sp xp t bo, kh
nng di ng, mu sc, s hỡnh thnh tiờm mao, v nhy, mu sc khi nhum
Gram
+ c im nuụi cy: da vo trng thỏi vt mc, c im vt mc, c
tớnh vt mc (trn, xự xỡ), tớnh cht vt mc (c, trong), mu sc vt
mc trờn mụi trng thch... Trờn mụi trng lng cn lu ý tỡnh trng mụi
trng sau thi gian nuụi cy (c hay trong, cú mựi hay khụng cú mựi).
+ c im sinh lý: mi quan h vi cỏc yu t nhit , pH ca mụi
trng, kh nng hỡnh thnh sc t, quan h vi oxy (thuc loi hiu khớ hay
k khớ), kh nng lờn men axetic, kh nng s dng cỏc hp cht vụ c v
hu c.
1.1.2. Phõn loi vi khun Acetobacter
Vic tin hnh phõn loi vi khun Acetobacter c thc hin t th k
XIX. T nm 1898 Rothenback ó tin hnh phõn loi, tip theo l Hoyer
(1899). Cng trong nm 1899, Beijerink ó phõn loi vi khun Acetobacter

da vo hai du hiu [6]:

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

- Mt l: Kh nng s dng m amoni thc hin quỏ trỡnh sinh
trng v phỏt trin ca vi khun Acetobacter.
- Hai l: Cú hay khụng cú giai on di ng trong quỏ trỡnh phỏt trin.
Cũn Heneberg (1926) li chia cỏc vi khun axetic thnh 4 nhúm da vo
ni sng c trng ca chỳng:
- Nhúm 1: vi khun khụng phỏt trin trờn bia vỡ hoa Hublon c vi
chỳng.
- Nhúm 2: vi khun phỏt trin trờn bia.
- Nhúm 3: vi khun phỏt trin trong dung dch ru vang.
- Nhúm 4: vi khun dựng sn xut gim theo phng phỏp nhanh.
Nm 1934, theo nghiờn cu ca cỏc nh vi khun hc ngi Hoa K, vi
khun axetic cú kh nng s dng cỏc hp cht tng i n gin ca cacbon
v nit nờn ó kt hp chỳng vo h Nitrobacteriaceae. T ú vi khun axetic
c gi l Acetobacter.
Nm 1936, Kenyver v Wanniel cựng Staniel ó xut ý kin ghộp vi
khun Acetobacter vo h Pseudomonas do chỳng cú hin tng ghộp cc
xon phn di ng.
Nm 1948, Vaught ó cụng b nhng kt qu thu c khi quan sỏt s
di ng ca nhiu loi vi khun: Acetobacter aceti, Acetobacter oxydans,

Acetobacter zancens, Acetobacter melanognum, Acetobacter pasteurianum.
ễng kt lun nhng loi trờn cựng thuc mt loi cú n mao cc v ó xỏc
nhn v trớ ca vi khun Acetobacter trong h Pseudomonas.
Ngy nay, theo khúa phõn loi ca Bergeys (1914) v nhiu tỏc gi khỏc
vi khun Acetobacter v Gluconobacter cỏc vi khun acetic - c xp vo
mt h riờng l Acetobacteriaceae. Trong khúa phõn loi ca Bergeys, ỏng
chỳ ý nht l khúa phõn loi cỏc loi thuc ging Acetobacter, ụng ó phõn
ging Acetobacter thnh hai loi:

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

Loi 1: Oxy húa axit axetic thnh CO2 v H2O. Loi ny gm:
+ S dng mui amoni lm ngun nit duy nht (dung dch Hoyer), i
din l vi khun Acetobacter aceti.
+ Khụng s dng mui amoni lm ngun nit duy nht: trờn b mt mụi
trng dch th nuụi cy cú to mng nhy cha xenluloza, in hỡnh vi khun
Acetobacter xylinum; trờn b mt mụi trng dch th nuụi cy khụng to
mng nhy cú cha xenluloza, in hỡnh: Acetobacter zancens, Acetobacter
pasteurianum, Acetobacter kneizianus.
Loi 2: Khụng cú kh nng oxy húa axit axetic.
+ To sc t nõu trờn mụi trng glucoza:
- Sc t nõu n en nht: Acetobacter melanogenus.
- Sc t hng: Acetobacter zancens.

+ Khụng to sc t:
- Nhit thớch hp nht l gia 30oC n 35oC: Acetobacter
suboxydan.
- Nhit thớch hp nht l gia 18oC n 21oC: Acetobacter
oxydans.
Nm 1960, Shilwel v Carr nghiờn cu v c trng nuụi cy sinh húa
ca vi khun Acetobacter v a ra kt lun khụng th cú s phõn loi ng
nht vi khun Acetobacter.
Nhng nghiờn cu v c im, v s phõn loi vi khun Acetobacter
ny ó to c s cho nhng nghiờn cu tip theo, ng thi to thun li cho
vic ng dng cỏc chng vi khun ú vo i sng thc tin sau ny. Hin nay
ngi ta ó s dng vi khun gim mt cỏch rng rói trờn quy mụ cụng nghip
to ra rt nhiu sn phm cú ý ngha thc tin ln.

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

1.2. c im chung ca vi khun Acetobacter
Nh ó nờu trờn, tỏc nhõn chớnh ca quỏ trỡnh lờn men axetic l vi
khun Acetobacter. Da vo c im i chiu vi cỏc tiờu chun phõn loi
hc thy rng chỳng thuc vo hai ging vi khun Acetobacter cú chu mao
hoc khụng v Gluconobacter n mao, ú l hai ging vi khun quan trng
nht ca h Acetobacteriaceae (Lapent et al 1990, Bergeys 1989), chỳng
sng ph bin trong t nhiờn, trờn b mt lỏ, hoa qu, cú kh nng to ra

axit axetic t ru etylic. Trong t bo Gluconobacter khụng cú chu trỡnh
Tricacbonxylic (ATC) hot ng nờn nú khụng th oxy húa axit axetic song li
cú mt chu trỡnh khỏc thay th (chu trỡnh Glyoxylat), khụng oxy húa axit
axetic nhng vn cú chu trỡnh photphoril húa. Ngc li trong t bo
Acetobacter xy ra cỏc quỏ trỡnh trờn. Khi so sỏnh vi khun ny vi vi khun
thuc ging Pseudomonas thy chỳng cú nhng c im tng t. Chỳng ch
khỏc Pseudomonas ch chu c nng axit cao hn, kh nng chuyn
húa pepton yu, ớt di ng v khụng sinh sc t. Nhiu loi vi khun
Acetobacter khi phỏt trin trờn mụi trng thiu thc n hoc mụi trng ó
nuụi cy lõu ngy (mụi trng gi) d b bin i hỡnh thỏi (t bo phỡnh to,
kộo di hoc phõn nhỏnh).
Tuy nhiờn, c s xp vi khun axetic vo nhúm c lp l kh nng
oxy húa ru etylic thnh axit axetic pH = 4,5. Ngoi ra, chỳng cũn thc
hin quỏ trỡnh oxy húa khụng hon ton cỏc hp cht hu c khỏc (cỏc loi
ng v dn xut ca chỳng) to thnh cỏc hp cht xeton hoc cỏc axit
hu c tng ng. Vi khun axetic ch phỏt trin tt trong iu kin hiu khớ;
nhit thớch hp t 25oC 30oC; pH thớch hp t 4,5 6,8; húa d dng
hu c.

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

Bng 1.1. Nhng c im phõn bit Acetobacter v Gluconobacter
so sỏnh vi Pseudomonas.

Gluconobacter

c im so sỏnh
1. V trớ tiờm mao

Acetobacter

Pseudomonas

n mao cc Chu mao hoc Chu mao cc
hoc khụng

khụng cú

2. Phỏt trin pH: 4,5

+

+

_

3. Oxy húa etanol

+

+

_

4. Oxy húa axit axetic

_

+

+

5. Oxy húa Lactat

_

+

+

6. GlucozaGluconate

+





7. S dng Gelatin

_

_

8. S dng tinh bt

_

_



_

_



Lactose
9. Sc t hunh quang
Ghi chỳ:

Du (+)

: cú

Du (-)

: khụng

Du ()

: cú hoc khụng

V hỡnh dng t bo, vi khun Acetobacter l nhng trc khun hỡnh
que n elip, kớch thc t 0,6 0,8 àm. Cỏc t bo ng riờng r hoc xp
thnh chui hoc cú loi t bo hỡnh cu, cú loi hỡnh ch. Tựy thuc vo iu
kin mụi trng, nhit nuụi cy mt s loi cú hỡnh bỏn nguyt. Vi khun
Acetobacter khụng cú kh nng sinh bo t, to mng nhy, mt s cú kh
nng di ng nh tiờm mao, mt s khụng cú kh nng ny [1], [2], [3].
Qua nhiu nghiờn cu v khun lc v mng vi khun Acetobacter trờn
mụi trng nuụi cy cho thy vi khun Acetobacter phỏt trin tt nht trờn mụi
trng nc bia, mụi trng cú cha cao nm men, glucoza, ru etylic hoc
manitol. Trờn mụi trng c chỳng phỏt trin thnh nhng khun lc trũn,

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

u n, ng kớnh trung bỡnh l 3 mm. Mt s loi nh Acetobacter aceti,
Acetobacter xylinum cú khun lc rt nh (d = 1 mm), b mt trn búng, phn
gia khun lc li lờn, dy v sm mu hn cỏc vựng xung quanh. Mt s loi
khỏc cú khun lc ln hn (d = 4 5 mm), khụng cú mu, mng nh nhng
ht sng nh, d dng dựng que cy gt ra khi mụi trng. Cú loi to thnh
khun lc n sõu vo mụi trng, khú ly ra bng que cy. Trờn mụi trng
lng vi khun Acetobacter ch phỏt trin trờn b mt mụi trng to thnh
nhng mng dy nhn v trn, khi lc thỡ chỡm xung ỏy bỡnh v thay vo ú

l mt lp mng mi c hỡnh thnh, dch di mng ny thng trong sut.
Khi nghiờn cu mng ny thy cú si xenluloza ging nh si bụng. Loi th
hai mng mng nh giy xelofan, mt s khỏc trờn b mt ca mng khụng
nhn m nhn nheo, mt s na thỡ to mng mng d v, bỏm trờn thnh bỡnh
v dch nuụi cy khụng trong [8].
Trong quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin, nhu cu dinh dng ca vi
khun Acetobacter i vi ngun cacbon, nit v cỏc cht kớch thớch sinh
trng l rt a dng. Chỳng s dng ch yu ng glucoza hoc saccaroza,
ru etylic v cỏc axit hu c khỏc lm ngun cacbon; mui amoni lm ngun
nit; mui photphat lm ngun photpho. Ngoi ra, trong quỏ trỡnh phỏt trin
chỳng cũn cú nhu cu vi mt s loi axit amin nh: valin, alanin, prolin, v
mt s cht kớch thớch sinh trng nh: para-aminobenzoic, axit nicotinic, axit
pantoneic, biotin, cỏc cht ny cú vai trũ quan trng trong sinh trng ca vi
khun Acetobacter [9].
Mt s vi khun Acetobacter cú kh nng t tng hp polisaccarit phõn
t ln nh: xenluloza, extran v ngi ta ng dng kh nng ny trong cụng
nghip. Mt s ớt loi vi khun Acetobacter cú th tng hp c nhng si
xenluloza ging nh bụng, in hỡnh l Acetobacter xylinum. Mt s loi tng

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

hp c extran ging nh Leuconostoc mesenteroides khi mụi trng thiu
extran hoc xenluloza.

Vi khun Acetobacter cú kh nng oxy húa gluxit theo 4 hng sau:
- Hng th nht: khụng cú s photphoril húa c cht vi s tham gia
ca cỏc enzym c hiu.
- Hng th hai: oxy húa cỏc hp cht ó c photphoril húa trong con
ng Pentose phosphate
- Hng th ba: theo s Enter Doudroff.
- Hng th t: theo chu trỡnh Crep ( Krebs) hoc Glyoxylat.

1.3. Mt s c im ca cỏc nhúm vi khun Acetobacter
1.3.1. Acetobacter aceti
Trc khun ngn, kớch thc 0,4 - 0,8 x 1 1,2 àm, khụng di ng
c, thng xp thnh chui di, bt mu Gram õm, mu vng vi thuc
nhum iụt. Khun lc to, sỏng trờn Gelatin vi dch lờn men cha 10% ng
saccaroza to thnh mng nhy, nhn. Chỳng cú kh nng phỏt trin trờn mụi
trng cú nng ru cao (11%) v cú th tớch ly n 6% axit axetic trong
mụi trng. Chỳng thng phỏt trin trờn mụi trng bia vi nhit thớch
hp l 30oC.
1.3.2. Acetobacter xylinum
Trc khun hỡnh que, kớch thc khong 2 àm, t bo ng riờng r
hoc xp thnh tng chui, khụng di ng c, cỏc t bo c bao bi cht
nhy to vỏng nhn v dy: vỏng cú cha hemixenluloza nờn khi gp H2SO4
v thuc nhum iụt s bt mu xanh (do phn ng ca hemixenluloza), chỳng
cú th tớch ly 4,5% axit axetic trong mụi trng. Chỳng thng sng chung
vi nm men trong nm chố cũn gi l thy hoi sõm, hi bo hay v
bo - mt loi nc chua cú v thm dựng pha nc gii khỏt trong gia

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN

Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

ỡnh, trờn b mt nc cú mt vỏng vi sinh vt dy c nuụi sng bng nc
chố ng.
1.3.3. Acetobacter pasteurianum
Cú hỡnh dng tng t nh Acetobacter aceti nhng vỏng vi khun cú
dng khụ v nhn nheo, bt mu xanh vi thuc nhum iụt, t bo xp di
nhau thnh chui, ụi khi bt gp t bo cú dng hỡnh chựy phng lờn, di dng
khụng thng xuyờn. Khun lc trờn Genlatin nh, trũn. Nhit thớch hp
phỏt trin l 30oC.
1.3.4. Acetobacter acetosum
Trc khun cú khớch thc 0,4 0,8 x 1 àm. Cỏc t bo xp riờng r
thnh tng chui, khụng di ng c. Nhit thớch hp nht cho chỳng phỏt
trin l 30oC 36oC.
1.3.5. Acetobacter kỹtzingianum
Cú mng nhy, nhn mộp v c nõng cao lờn theo thnh bỡnh. T
bo dng trc khun, ngn, to, thụ, khụng di ng. Khun lc trờn Gelatin vi
dch lờn men nht, nh to thnh mng xp np to trờn mụi trng m. Thớch
hp phỏt trin 30oC.
1.3.6. Acetobacter shiitzenbacchii
Trc khun khỏ di, kớch thc khong 0,3 0,4 x 1,0 3,6 àm, thng
xp ụi hoc ng riờng r, cú th to vỏng nhy v khụng bn vng. Cú kh
nng tớch ly trong mụi trng n 11,5% axit axetic do ú thng c s
dng chuyn húa ru thnh gim theo phng phỏp c (phng phỏp
nhanh).
1.3.7. Acetobacter lindreni
Trc khun xp riờng r to chui, thnh thong cú t bo phng to nh

hỡnh cu, khụng di ng. Khun lc trờn Gelatin vi dch lờn men trũn, nh,

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

mu vng; trờn mụi trng lng to vỏng mu nõu, nht. Thớch hp phỏt trin
25oC.
1.3.8. Acetobacter orleanense
Trc khun di trung bỡnh, khụng di ng, gp iu kin nhit cao cú
th sinh ra t bo d hỡnh kộo di hoc phỡnh to ra. To vỏng vi khun rt dy
trờn mụi trng lng. Cú th phỏt trin trong mụi trng cú nng ru cao
(10% - 12%) v tớch ly n 9,5% axit axetic. Thng c dựng chuyn
húa ru vang thnh gim theo phng phỏp Phỏp (phng phỏp chm hay
phng phỏp Orleans). Thớch hp phỏt trin 25oC 30oC.
1.3.9. Acetobacter suboxydans
Cú dng hỡnh que ngn, ng riờng r hoc xp thnh chui ngn,
khụng cú kh nng di ng, to thnh nhng vỏng mng ,d v. Cú kh nng
chuyn húa glucoza thnh axit gluconic, oxy húa ru sobit thnh socboza
dựng sn xut axit ascorbic vitamin C. Loi vi khun ny mun phỏt trin
bỡnh thng cn c cung cp mt s cht sinh trng: axit paraaminobenzoic, axit patoneic, axit nicotinic.
1.3.10. Acetobacter hoshigakii
Trc khun cú kớch thc 0,7 0,9 x 1,5 1,8 àm, thng xp riờng r
khụng di ng. Khun lc trờn thch vi cht chit rỳt t u nnh nh, trũn,
dng ht xỏm sau ú chuyn thnh mu nõu. Khun lc trờn thch vi dch lờn

men trũn, mu trng sa, v sau phn gia khun lc húa nõu, phớa ngoi mu
vng nht. Cú kh nng to thnh axit gluconic. Nhit thớch hp cho s
phỏt trin l t 30oC 35oC.
1.3.11. Acetobacter ascendens
Trc khun khụng di ng, cỏc khun lc trờn glucoza, genlatin khụ
trng vi vnh sỏng chúi. Trờn mụi trng lng to thnh mng nhy chc,
nõng lờn theo thnh bỡnh. Thớch hp phỏt trin 25oC.

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

1.3.12. Acetobacter oxydans
Trc khun cú kớch thc 0,8 1,2 x 2,4 2,7 àm, cỏc t bo ri nhau
hoc xp thnh chui. Quan sỏt trong chui thy cú t bo phng to lờn, di
ng. Khun lc trờn gelatin trũn sau tr thnh dng khụng cõn i vi s
phõn nhỏnh c trng. Nhit thớch hp t 18oC 21oC.
1.3.13. Acetobacter plicatum
Trc khun cú kớch thc 0,4 0,6 x 1,4 1,6 àm, khụng di ng.
Khun lc trờn gelatin ru vang trũn tra, hi nhụ lờn, sỏng, m t, nht.
Nhit thớch hp t 25oC 30oC [4].
Hu ht cỏc loi Acetobacter thng phỏt trin tt nht 25oC 30oC,
u cú kh nng s dng mui photphat, a s ũi hi cung cp thờm vitamin,
chỳng cú kh nng oxy húa ru thnh axit v trong quỏ trỡnh sinh trng,
phỏt trin chỳng to ra mt lp mng dy cú bn cht hemixenluloza trờn b

mt mụi trng nuụi cy. Vi nhng nghiờn cu hin nay cho thy lp mng
ny cú th c ng dng vo rt nhiu nghnh quan trng cú ý ngha thc
tin trong cuc sng. ng thi kh nng to mng ca cỏc chng vi khun
trờn rt khỏc nhau vỡ vy cn phi tuyn chn ra nhng chng vi khun cú kh
nng to mng tt nht v phự hp vi mc ớch s dng ca tng loi mng.

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

Chng 2
I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU
2.1. i tng nghiờn cu
i tng nghiờn cu l cỏc chng vi khun thun khit c phõn lp
t mng cỏc ngun nguyờn liu l gim, dch hoa qu loóng trong phũng thớ
nghim Vi sinh, Trng i hc S phm H Ni 2. T cỏc chng phõn lp
c tuyn chn ra nhng chng cú kh nng cho mng dai, mng, trong.

2.2. Trang thit b v húa cht
2.2.1. Trang thit b
Khi tin hnh nghiờn cu cn cú nhng thit b v dng c nh: hp
lng, ng nghim, bn trang thy tinh, phu thy tinh, cc thy tinh, que cy,
ốn cn, lam kớnh, lamen, bỡnh cu, bỡnh thy tinh, bỡnh tam giỏc, pipet, ni
hp cao ỏp Autoclave, bung cy vụ trựng, t sy, cõn phõn tớch, kớnh hin vi
quang hc

2.2.2. Húa cht
- Cỏc loi ng chun: glucoza, saccaroza, fructoza, mantoza, manitol.
- Mt s hp cht hu c: ru etylic (C2H5OH), axit axetic
(CH3COOH), pepton, agar-agar, dch chit nm men (cao nm men), axit
xucxinic, axit lactic, phenolphtalein.
- Mt s hp cht vụ c: K2HPO4,

KH2PO4,

MgSO4.7H2O,

(NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, Na2HPO4.12H2O, CaCO3, NaOH chun.
- Mt s loi thuc nhum: tớm Gentian, dung dch Fucshin, dung dch
Lugol, thuc nhum iụt v H2SO4.

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

2.3. Mụi trng
Chỳng tụi ó s dng mt s mụi trng cú thnh phn nh sau:
Thnh phn

Mụi trng

Mụi trng

Mụi trng
s 3

Mụi trng

s 1

s 2

s 4

Nc mỏy

1000ml

1000ml

1000ml

0

(NH4)2SO4

8g

8g

0

0

(NH4)2HPO4

2g

2g

0

0

K2HPO4

5g

5g

0

0

KH2PO4

2g

2g

0

0

C6H12O6

20g

20g

20g

0

MgSO4.7H2O

2g

2g

0

0

CaCO3

10g

0

0

0

Agar-agar

20g

20g

0

0

Pepton

0

5g

5g

0

Na2HPO4.12H2O

0

0

5g

0

Dch chit nm

0

0

5g

0

0

2ml

4ml

0

C2H5OH

2ml

2ml

2ml

0

Nc da

0

0

0

1000ml

men
CH3COOH

Chỳ ý: Axit axetic (CH3COOH) v ru etylic (C2H5OH) b sung sau
khi hp mụi trng ln th ba [6], [8], [9].

2.4. Phng phỏp nghiờn cu
2.4.1. Phõn lp vi khun Acetobacter theo phng phỏp ca Vinogradski
cú c nhng chng vi khun Acetobacter, chỳng tụi tin hnh
phõn lp t cỏc ngun nguyờn liu l gim, dch hoa qu theo phng phỏp
phõn lp ca Vinogradski. Trc ht thc hin quỏ trỡnh lờn men gim trờn cỏc

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

ngun nguyờn liu trờn. Vi khun axetic l loi vi khun hiu khớ nờn chỳng
phỏt trin trờn mụi trng lng to thnh mt lp mng dai, mu trng, mng
ú bao gm tp hp cỏc vi khun axetic, ly mng ú a vo mụi trng s
3. Mụi trng s 3 c pha ch y cỏc thnh phn, kh trựng trong ni
hp Autoclave ỏp sut 0,5 atm, trong ba ngy liờn tip, ngui, b sung
ru etylic v axit axetic, chia v cỏc bỡnh cu hoc bỡnh tam giỏc. Sau khi th
mng vo gi trong t m 28oC 30oC trong thi gian 7 10 ngy (chỳ ý khi
nỳt bụng cỏc bỡnh khụng nỳt quỏ cht cng khụng quỏ lng) trờn b mt mụi
trng xut hin mt lp mng mi. T mng ny tin hnh phõn lp thu
nhn vi khun Acetobacter.
Khi phõn lp cn pha loóng nng sinh vt. Chỳng tụi s dng
phng phỏp pha loóng ca Pasteur. Dựng dung dch NaCl 0,5% vụ trựng
hoc nc ct pha loóng. S dng pipet vụ trựng chia vo cỏc ng nghim
vụ trựng mi ng 9 ml dung dch NaCl hoc nc ct, sau ú dựng pipet ly
1ml dch lờn men cho vo mt ng nghim cú cha sn 9 ml nc ct trờn, lc
u ta c dung dch pha loóng vi nng 10-1. Dựng pipet ly 1 ml dung
dch ng cú pha loóng vi nng 10-1 nh vo ng nghim th hai
(cng cú 9 ml nc), lc u ta c dung dch pha loóng vi nng 10-2.
Tip tc pha loóng nh vy n nng 10-10 ta c 10 ng nghim cha
dung dch lờn men hay dung dch vi khun vi cỏc nng t 10-1 n 10-10.
Sau ú phõn lp trờn mụi trng thch a (mụi trng 1 ó hp tit trựng v
vo cỏc hp lng hay hp petri, ngui); nh mt git dung dch vi khun
ó pha loóng lờn b mt mụi trng thch, dựng bn trang thy tinh (vụ trựng)
trang u mt ln khp mt thch. Bao gúi cn thn v gi nhit 28oC
30oC, khong 5 7 ngy sau trờn b mt mụi trng thch xut hin cỏc khun
lc riờng r. Da trờn nhng c im khun lc ca vi khun Acetobacter so
sỏnh i chiu chn ra nhng khun lc ca vi khun Acetobacter.

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

2.4.2. Tuyn chn cỏc chng vi khun Acetobacter cho mng xenluloza theo
phng phỏp ca Graxinop
Trc khi tuyn chn cn phi nhõn ging cỏc chng vi khun bng
cỏch: t mi khun lc ó chn trờn dựng que cy u trũn (ó kh trựng trờn
ngn la ốn cn) gt ly khun lc cy vo mt ng nghim ó c mụi
trng thch (mụi trng s 2, t nghiờng, ngui) theo ng ziczc. Mi
ng l mt mu riờng bit tng ng vi tng khun lc v c mó húa bng
mt ký hiu riờng. vo t m 5 6 ngy cỏc vi khun s phỏt trin theo
ng cy. Tip theo l tuyn chn cỏc chng vi khun Acetobacter trong mụi
trng oxy húa. Mụi trng oxy húa dựng tuyn chn Acetobacter l mụi
trng lng.
Da vo kh nng to mng ca cỏc mu vi khun trờn mụi trng dch
th tuyn chn sau ba ln liờn tip chn ra nhng chng cú kh nng to mng
dai, mng, trong thi gian ngn.
gi ging cn tin hnh cy chuyn ging t ng thch nghiờng ny
sang ng thch nghiờng khỏc vi chu kỡ 2 thỏng mt ln.
2.4.3. Tuyn chn cỏc chng vi khun Acetobacter thun khit
Sau khi ó cú cỏc chng vi khun Acetobacter cho mng xenluloza trờn
mụi trng oxy húa chỳng tụi tin hnh tuyn chn cỏc chng vi khun
Acetobacter thun khit da trờn nhng i chiu nh loi c im khun lc
trờn hai mụi trng A v B.

Mụi trng A: dch chit nm men 3%, CaCO3 2% , Agar-agar 2%,
ru etylic 15% - 2 ml. Khi nuụi cy ging vi khun axetic trờn mụi trng
ny nu l Gluconobacter thỡ cú mt vũng sỏng xung quanh khun lc, nu l
Acetobacter thỡ vũng sỏng rừ hn v cú mt lp cn c vin khun lc
hng v phớa vũng sỏng.

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

Mụi trng B: dch chit nm men 3%, Agar-agar 2%, ru etylic
15% - 1 ml, xanh lc bromocresol 2,2% - 1ml. Khi cy ging vi khun axetic,
nu l Gluconobacter s lm cho mụi trng bin i thnh mu vng, nu l
Acetobacter cng lm mụi trng bin i thnh mu vng nhng cú mt vnh
mu xanh l do quỏ trỡnh oxy húa cỏc axit.
2.4.4. Phõn bit t bo vi khun Acetobacter bng phng phỏp nhum
gram
Vi khun Acetobacter l cỏc vi khun Gram õm, do ú cú th phõn bit
t bo vi khun Acetobacter nh phng phỏp nhum Gram (nhum kộp). Ly
mng dai mu trng hoc dch nuụi cy hoc cỏc chng ó cy trong mụi
trng thch nghiờng lm tiờu bn.
Phng phỏp nhum Gram gm cỏc bc sau:
- Ra sch lam kớnh bng NaOH sau ú ra bng HCl hoc H2SO4, ri
ra li bng cn, nc ct v lau khụ.
- Nh mt git nc vụ trựng lờn lam kớnh, dựng que cy kh trựng trờn

ngn la ốn cn, ngui, ly mt ớt mng mu trng hoc dch nuụi cy
hoc ging vi khun hũa vo git nc vụ trựng ú, h qua trờn ngn la ốn
cn c nh vt bụi (cỏch ngn la ốn cn 10 15 cm).
- t lờn trờn vt bụi ming giy lc, nh dung dch tớm Gentian gi
trong 1 2 phỳt.
- Ly ming giy lc ra, nghiờng cho thuc nhum chy xung chu
hng, nh dung dch Lugol lờn trờn vt bụi, gi trong vũng 5 phỳt.
- Ra tiờu bn bng nc, ra bng cn (20 giõy) sau ú ra tip bng
nc.
- Nh dung dch Fucshin lờn gi trong 1 2 phỳt.
- Ra li tiờu bn bng nc, hong khụ t nhiờn.

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

Mc ớch ca phng phỏp nhum Gram l phõn bit vi khun gram
õm (Gr -) vi vi khun Gram dng (Gr +). Nu sau khi nhum kộp m t bo
bt mu hng thỡ ú l vi khun Gr -. Ngc li, nu bt mu tớm thỡ ú l vi
khun Gr +. Kh nng bt mu ca vi khun Gr v Gr + khỏc nhau l do cht
nguyờn sinh ca t bo vi khun Gr + c cu to t mt loi protein c bit
cha mui Nucleatmagie cú kh nng to vi tớm Gentian v Lugol mt phc
cht b khú b ra trụi bi cn nờn khi quan sỏt trờn tiờu bn thy t bo ca vi
khun Gr + bt mu tớm Gentian. Trong khi ú nhng vi khun Gr khụng cú
kh nng to phc cht bn vi thuc nhum Gentian v Lugol nờn d b ra

trụi bi cn. Do ú, khi nh Fucshin lờn t bo vi khun Gr - bt mu hng
mu ca Fucshin.
2.4.5. Phng phỏp tuyn chn cỏc chng vi khun Acetobacter cho mng
mng
Mc ớch khi tin hnh nghiờn cu ny l chn ra nhng chng vi
khun Acetobacter cho mng mng, vỡ vy chỳng tụi tin hnh tuyn chn cỏc
chng cho mng mng nht da trờn nhng quan sỏt c th sau:
- Quan sỏt quỏ trỡnh hỡnh thnh mng.
- Quan sỏt c im mng to thnh trờn mụi trng lng (dy,
mng, trn, cú n theo thnh bỡnh hay khụng).
- Dựng thc o dy mng.
- Quan sỏt c im mụi trng nuụi cy ca cỏc mu vi khun
Acetobacter xylinum (c hay trong).
- Quan sỏt hỡnh dng t bo trờn kớnh hin vi quang hc v trờn
kớnh hin vi.

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi sinh vật học

Chng 3
KT QU NGHIấN CU V THO LUN
3.1. Phõn lp vi khun axetic t mt s ngun nguyờn liu
tuyn chn c cỏc chng vi khun axetic khỏc nhau, chỳng tụi tin
hnh phõn lp t cỏc ngun nguyờn liu khỏc nhau: dch hoa qu loóng, gim.

Trc tiờn, cn chun b dch lờn men gim v dch hoa qu loóng. Cho
vo bỡnh tam giỏc hoc bỡnh cu cú dung tớch 500 ml khong 200 ml gim,
hoc dch hoa qu, thờm vo ú mt vi lỏt chui tiờu ó búc v cung cp
thờm ngun gluxit, vitamin cho vi khun axetic phỏt trin. y bng nỳt bụng,
cho vo t m nuụi 28oC 32oC. Sau 5 7 ngy trờn b mt thoỏng ca bỡnh
cu s xut hin lp mng mu trng, mng ú chớnh l tp hp t bo vi
khun axetic cú trong dch lờn men t hai ngun nguyờn liu trờn (Hỡnh 1,2).

Hỡnh 1. Mu dch lờn men gim

Trần Thị Thoa

Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN