Phân lập, tuyển chọn, và tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho chủng acetobacter xylnum h6, chế tạo màng sinh học

Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

Trường đại học sư phạm hà nội 2
Khoa sinh - ktnn

---------Lô thị bảo khánh

Phân lập, tuyển chọn và tối ưu
hóa môi trường dinh dưỡng
cho chủng vi khuẩn
acetobacter xylinum h6,
chế tạo màng sinh học

Khóa luận tốt nghiệp đại học
Chuyên ngành: Vi sinh vật

Hà nội 2008

Lô Thị Bảo Khánh

1

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

MC LC
Li cm n
Bn cam oan
Mc lc

1

Danh mc bng v hỡnh

3

t vn

5

Ni dung

7

Chng 1. Tng quan ti liu

7

1.1. Lch s nghiờn cu v vi khun Acetobacter ...........................

7

1.2. Phõn loi Acetobacter.................................................................

8

1.2.1.Cỏc tiờu chun phõn loi vi khun.........................................

8

1.2.2. Lc s phõn loi Acetobacter.................................................

9

1.3. c im chung ca Acetobacter.................................................

11

1.3.1. c im khun lc Acetobacter..............................................

13

1.3.2. c im mng vi khun Acetobacter trờn mụi trng lng

13

1.3.3. Nhu cu dinh dng ca chng Acetobacter...........................

14

1.3.4. Con ng chuyn hoỏ Cacbon...............................................

14

1.3.5. c im ca mt s loi vi khun Acetobacter.......................

15

1.4. C s khoa hc ca quỏ trỡnh lờn men axetic..............................

18

1.5. Cỏc yu t iu kin v mụi trng nh hng............................

19

1.6. Mng sinh hc (Bacterial cellulose, Biocellulose BC)............

20

Chng 2. Nguyờn liu v phng phỏp nghiờn cu

22

2.1. i tng hoỏ cht................................................................

22

2.1.1. i tng.................................................................................

22

2.1.2. Thit b - hoỏ cht....................................................................

22

2.2. Phng phỏp nghiờn cu..............................................................

24

Lô Thị Bảo Khánh

2

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

2.2.1. Phõn lp chng vi khun Acetobacter ...................................

24

2.2.2. Tuyn chn Acetobacetr cho mng ........................................

25

2.2.3. Tuyn chn vi khun Acetobacter thun khit.........................

25

2.2.4. Phõn bit vi khun bng phng phỏp nhum Gram................

26

2.2.5. Phng phỏp xỏc nh kh nng tng hp axit....................

27

2.2.6. Phng phỏp xỏc nh s lng t bo vi khun.......................

28

2.2.7. Phng phỏp tuyn chn cỏc chng......................................

28

2.2.8. Phng phỏp xỏc nh s lng t bo vi khun ...................

29

2.2.9. Phng phỏp quy hoch hoỏ toỏn hc thc nghim..............

29

2.2.10. Phng phỏp to vt thng th.......................................

33

Chng 3. Kt qu v tho lun

35

3.1. Phõn lp v tuyn chn chng vi khun Acetobacter..................

35

3.2. Nghiờn cu mt s c tớnh hỡnh thỏi.....................................

39

3.2.1. Quan sỏt hỡnh dng t bo vi khun Acetobacter xylinum.........

39

3.2.2. Kho sỏt kh nng to axit axetic ca vi khun ................

39

3.2.3. Nghiờn cu mt s c tớnh sinh hc ca chng ...............

42

3.2.4. Kho sỏt kh nng to mng ca vi khun A.xylinum...........

43

3.3. Nghiờn cu ng thỏi sinh trng phỏt trin A. xylinum H6 .......

47

3.4. Ti u hoỏ mụi trng dinh dng cho chng vi khun H6 ........

51

3.4.1. Thit lp mụ hỡnh toỏn hc...................................................

52

3.4.2. Ti u hoỏ...........................................................................

56

3.5. Bc u dựng mng BC tr bng th....................................

58

Chng 4. Kt lun v kin ngh

62

4.1. Kt lun....................................................................................

62

4.2. Kin ngh.................................................................................

62

Ti liu tham kho

63

Lô Thị Bảo Khánh

3

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

DANH MC BNG V HèNH
Bng:
Bng 1.1. Nhng c im phõn bit, so sỏnh Acetobacter.. 12
Bng 2.1. Thnh phn mụi trng...23
Bng 2.2. Cỏch s lý mng......34
Bng 3.1. Quan sỏt thi gian dc im mng to thnh..37
Bng 3.2. Hm lng axit axetic ca mt s chng40
Bng 3.3. c im sinh hoỏ ca chng vi khun A. xylinum... 42
Bng 3.4. Kho sỏt kh nng to mng ca vi khun A. xylinum 43
Bng 3.5. Kho sỏt kh nng to mng ca H6...45
Bng 3.6. Tng quan gia nng pha loóng....... ..48
Bng 3.7. Thi gian nuụi cy v hm lng t bo 49
Bng 3.8. Cỏc yu t v mc kho sỏt53
Bng 3.9. Ma trn thc nhim.54
Bng 3.10. Kim tra s thớch ng ca mụ hỡnh...56
Bng 3.11. Ti u hoỏ mụi trng......57
Bng 3.12. Din tớch vt thng cũn li trong thc t59

Hỡnh:

Hỡnh 1.1. C ch ca quỏ trỡnh oxy hoỏ r etylic ...19
Hỡnh 3.1. Mu khun lc vi khun Acetobacter nhúm 138
Hỡnh 3.2. Mu khun lc vi khun Acetobacter nhúm 338
Hỡnh 3.3. T bo chng vi khun Acetobacter xylinum..................................39
Hỡnh 3.4. th biu din hm lng axit axetic ... 40
Hỡnh 3.5. Vũng phõn gii CaCO3 ca vi khun Acetobacter xylinum............41
Hỡnh 3.6. Mng mng, dch nuụi cy c...45
Hỡnh 3.7. Mng mng, dch nuụi cy trong

Lô Thị Bảo Khánh

4

45

Lớp K30b- Sinh


Kho¸ luËn tèt nghiÖp

Chuyªn nghµnh vi sinh vËt

Hình 3.8. Màng BC dày…………………………………………………… 46
Hình 3.9. Màng BC của chủng H6...................................................................46
Hình 3.10. Đồ thị tương quan giữa số lượng tế bào của chủng H6 .................49
Hình 3.11. Đồ thị sinh trưởng phát triển của chủng H6…………………….. 50
H ình 3.12. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương...........................................59
Hình 3.13. Vết thương sử dụng màng trị bỏng………………………………60
Hình 3.14.Vết thương sử dụng màng BC tẩm dầu mù u sau 9 ngày………...60
Hình 3.15. Vết thương sử dụng màng BC tẩm dầu mù u sau 15 ngày………61

Hình 3.16. Vết thương không dùng màng BC, bôi dầu mù u sau 15 ngày…..61

L« ThÞ B¶o Kh¸nh

5

Líp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

T VN
Ngy nay, i vi cỏc quc gia trờn th gii cụng ngh sinh hc
(CNSH) khụng cũn l mt nghnh mi m m nú ó tr thnh mt nghnh
kinh t ch o trong s phỏt trin khoa hc k thut v cụng ngh. L mt b
phn ca CNSH, cụng ngh vi sinh ó v ang ngy cng phỏt trin mnh m
v ngy cng cú nhng ng dng thit thc vo cuc sng. Bng vic ng
dng cỏc quỏ trỡnh lờn men vi sinh vt ó to ra ch phm giỳp chỳng ta tn
dng v tit kim chi phớ trong vic gii quyt nhiu vn vớ d nh trong
nụng nghip, cụng nghip, bo v mụi trng... Mt trong cỏc chng vi khun
c s dng rng rói nht trong cụng ngh lờn men vi sinh l vi khun
Acetobacter (cũn gi l vi khun gim).
Vi khun Acetobacter xylinum khi nuụi cy trờn mụi trng dch lng,
trong iu kin nuụi cy tnh s hỡnh thnh mt lp mt lp mng trờn b mt
thoỏng ca dung dch, mng ny cú bn cht l cellulose kt hp vi t bo vi
khun Acetobacter xylium. Cụng thc cellulose do vi khun sn xut ra cng
ging nh cellulose ca t bo thc vt nhng nú cú mt s tớnh cht u vit
hn: do dai, bn c hc, kh nng polymer hoỏ cao

Nh vo mt s c tớnh lý hoỏ vt tri m mng BC ngy nay c
coi nh mt ngun polymer sinh hc mi, mt ngun nguyờn liu cú tim
nng. Hin nay, cỏc nh khoa hc ó tỡm ra thờm mt s tớnh nng c bit
ca mng nh : bỏm chc vo b mt khi nc bc hi li cú th di chuyyn
qua, ngn cn c s xõm nhp ca vi khun [7], [8]. Nh ú m mng
BC c ng dng trong rt nhiu cỏc lnh vc khỏc nhau: cụng ngh thc
phm lm thch da l n trỏng ming khỏ ph bin, trong cụng ngh sn
xut giy cht lng cao, trong y hc lm mng thay th cho da tm thi
cỏc bnh nhõn bng, mt loi mng siờu thm, trong khoa hc vt liu mi

Lô Thị Bảo Khánh

6

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

vi vic sn xut micro cht lng cao, tỏc dng trong bo v mụi trng do
sn xut ra EM (Effective Micorgamisms)... [11].
Vit Nam vic nghiờn cu, s dng mng BC mi ch c quan tõm
trong thi gian gn õy v mi thu c nhng kt qu bc u (dựng mng
p lờn vt thng h, dựng mng p mt n dng da cho ph n) [7], [8].
Vic nghiờn cu ra mt mụi trng dinh dng ti u nht cho chng vi
khun Acetobacter xylinum phỏt trin, ch to mng sinh hc trờn quy mụ
cụng nghip vn ang l hng nghiờn cu c nhiu tỏc gi quan tõm.
Vi mong mun c tỡm hiu rừ hn, tỡm ra mụi trng dinh dng

ti u cho chng vi khun Acetobacter xylinum v nhng ng dng hu ớch
ca mng BC trờn c s k tha nhng kt qu thu c ca cỏc tỏc gi ó
nghiờn cu trc m tụi quyt nh chn ti: Phõn lp, tuyn chn v
ti u hoỏ mụi trng dinh dng cho chng Acetobacter xylinum H6, ch
to mng sinh hc.

Lô Thị Bảo Khánh

7

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

NI DUNG
Chng 1
TNG QUAN TI LIU
1.1. Lch s nghiờn cu vi khun Acetobacter ( vi khun gim)
Gim l mt sn phm rt quen thuc cú t lõu i m cho n ngy
nay vn c s dng rng rói trong cụng nghip v i sng hng ngy. T
xa xa con ngi ó bit lm gim da vo kinh nghim thc t ca mỡnh m
h cha hiu gỡ v c s khoa hc, cng khụng gii thớch l bng cỏch no
ru loóng cú th bin thnh gim n. Cho n u th k XIX, khi khoa hc
k thut phỏt trin, c bit vi s ra i ca kớnh hin vi, th gii vi sinh vt
dn c khỏm phỏ. Con ngi cng gii thớch c c ch ca quỏ trỡnh lờn
men to gim (Vinnnegar) nh mt nhúm vi sinh vt m ngy nay cỏc nh
khoa hc gi chỳng l vi khun Acetobacter hay vi khun axetic, vi khun

gim [4], [5].
Nm 1822, Person tin hnh nhng nghiờn cu u tiờn v vi khun
Acetobacter t lp mng thu c trờn b mt cỏc bỡnh sn xut gim. ễng
khng nh ú l mt loi vi sinh vt, gi l Mycoderma aceti [7].
n nm 1837, Kiitzing tip tc tỡm hiu sau khi loi b ht cỏc vi sinh
vt trong chum lm gim v thy rng gim khụng c to thnh. ễng ó
a ra nhn xột: quỏ trỡnh lờn men gim nht thit phi cú vi sinh vt nu
khụng s khụng din ra s chuyn hoỏ ru thnh gim. Cng trong nm
1837, Hansen (ngi an Mch) ó tỏch c t mng gim hai loi vi khun
thun khit l: Mycoderma aceti v Mycoderma pastuerianum.
T nm 1862 n nm 1868, Pasteur vi s tr giỳp c lc ca kớnh
hin vi ó chng minh c s ỳng n trong nhn xột ca Kiitzing, Hansen
v khng nh bn cht ca quỏ trỡnh lờn men gim. ễng tip tc tin hnh

Lô Thị Bảo Khánh

8

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

nghiờn cu lp mng nhy xut hin trờn b mt bia, ru vang v a n
kt lun: mng ú c to thnh do mt loi trc khun m ụng gi tờn l
Mycoderma aceti.
Cựng vi nhng nghiờn cu trờn v vi khun Acetobacter, cỏc nghiờn
cu tip theo cng nh nhng nghiờn cu sau ny u nhm mc ớch tỡm

hiu rừ thờm v tỡm cỏch ci thin quỏ trỡnh lờn men gim. Tng bc nghiờn
cu nhng ng dng mi ca vi khun Acetobacter bng cỏch phõn lp cỏc
chng vi khun thun khit, nghiờn cu cỏc c im cu to, sinh lý, sinh
hoỏ ca chỳng tỡm ra nhng chng tt nht cho tng ng dng da trờn c
s l cỏc tiờu chun phõn loi ó c a ra.
1.2. Phõn loi Acetobacter
1.2.1. Cỏc tiờu chun phõn loi vi khun Acetobacter
phõn loi vi khun Acetobacter cú mt s tiờu chun phõn loi :
+ c im phõn lp: l ni c trỳ cú liờn quan n iu kin mụi
trng sng.
+ c im hỡnh thỏi: hỡnh dng t bo, cỏch sp xp t bo, kh nng
di ng, v nhy, mu sc khi t bo nhum Gram
+ c im nuụi cy: da vo trng thỏi, c im, c tớnh (trn, xự
xỡ), tớnh cht (c, trong), mu scca vt mc (khun lc) trờn mụi
trng thch. Khi nuụi cy trờn mụi trng lng cn lu ý n s bin i ca
mụi trng sau mt thi gian nuụi cy (mụi trng c hay trong, cú mựi
thm hay khụng mựi, cú mu vng nõu hay vng nht).
+ c im sinh hoỏ (theo khoỏ phõn loi ca Pasteur, 1950)
- Kh nng to catalase
- Kh nng tng hp cỏc xeto t cỏc ru bc cao nh: glyxerol,
manitol, sorbitol.
- Kh nng oxi hoỏ axetat thnh CO2 v H2O.

Lô Thị Bảo Khánh

9

Lớp K30b- Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

- Kh nng oxi hoỏ glucoz thnh axit gluconic.
- Kh nng s dng mui amon lm ngun nit trong mụi trng
Hoyer v s dng ru etylic lm ngun cacbon.
- Kh nng to sc t nõu.
- Kh nng tng hp cellulose.
Ngoi cỏc tiờu chun trờn, hin nay khi phõn loi Acetobacter, cỏc tỏc
gi cũn s dng sinh hc phõn t gii trỡnh t rARN 16S.
1.2.2. Lc s phõn loi Acetobacter
Ngay t th k XIX, cỏc tỏc gi ó tin hnh phõn lp Acetobacter
thnh cỏc chng thun khit v tin hnh phõn loi chỳng.
Trong ú, khúa phõn loi ca Beijerinck (1899) ó thu hỳt c s
quan tõm ca nhiu tỏc gi. ễng ó chia vi khun axetic thnh 4 nhúm c bn.
Nm 1916 k tip nghiờn cu ca Beijerinck, Janke ó phõn loi vi khun
axetic thnh 4 nhúm da trờn 2 du hiu sau:
- Mt l: kh nng s dng m amoni thc hin quỏ trỡnh sinh
trng v phỏt trin ca mỡnh.
- Hai l: cú hay khụng giai on di ng trong quỏ trỡnh phỏt trin.
Da vo ni sng c trng ca vi khun axetic m nm 1926,
Heneberg ó chia chỳng thnh 4 nhúm khỏc nhau:
- Nhúm 1: vi khun khụng phỏt trin trờn bia vỡ hoa hublon c vi
chỳng.
- Nhúm 2: vi khun cú kh nng phỏt trin trờn bia.
- Nhúm 3: vi khun phỏt trin trong dung dch ru vang.
- Nhúm 4: vi khun sn xut gim theo phng phỏp nhanh.
Nm 1934, theo cỏc nh vi khun hc Hoa K, vi khun axetic cú kh
nng s dng cỏc hp cht tng i n gin ca C v N t ú vi khun

axetic cú tờn l vi khun Acetobacter.

Lô Thị Bảo Khánh

10

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

n nm 1936, cỏc tỏc gi Kenyver, Wanneil, Staniel cựng xut ý
kin ghộp vi khun Acetobacter vo h Pseudomonas do chỳng co hin tng
ghộp cc xon phn di ng.
Nm 1948, Vanghn tip tc nghiờn cu v cụng b kt qu thu c
khi quan sỏt s di ng ca nhiu loi vi khun: Acetobacter aceti,
Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanoginum,
Acetobacter pasteurianum. ễng kt lun nhng loi trờn u thuc mt loi
cú n mao cc v ó xỏc nhn v trớ ca vi khun Acetobacter trong h
Pseudomonadacae.
Cựng nm 1948, Krassilhicov cng nh cỏc tỏc gi M nghiờn cu v
x khun v vi khun u thng nht xp vi khun Acetobacter vo h
Pseudomonadacae.
Nm 1914, Bergeys ó a ra khoỏ phõn loi. Trong ú ụng phõn
Acetobacter thnh 2 loi:
Loi 1: cú kh nng oxi hoỏ axit axetic thnh CO2 v H2O bao gm:
a/ S dng mui amoni lm ngun N duy nht (dung dch Hoyer) i
din l vi khun Acetobacter aceti.

b/ Khụng s dng mui amoni lm ngun N duy nht
+ Trờn mụi trng dch th to thnh mng nhy cha cellulose, i
din l : Acetobacter xylinum.
+ Trờn mụi trng dch th khụng to mng nhy cha cellulose, i
din l: Acetobacter pasteurianum, Acetobacter kneiziiganus, Acetobacter
rancens
Loi 2: khụng cú kh nng oxi hoỏ axit axetic.
a/ To sc t nõu trờn mụi trng glucoz.
- Sc t nõu ti ti en nht i din l: Acetobacter melanogenus.
- Sc t hng, i din l: Acetobacter rasens.

Lô Thị Bảo Khánh

11

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

b/ Khụng to sc t
- Nhit thớch hp nht l 30 - 350C: Acetobacter suboxydans.
- Nhit thớch hp nht l 18 - 210C: Acetobacter oxydans.
Khoỏ phõn loi ca Frateur c nhiu ngi ng h vi 4 nhúm vi
khun axetic l:
Acetobacter subosydans
Acetobacter mezoxydans
Acetobacter oxydans

Acetobacter peroxydans
Cho n nay, khoỏ phõn loi ca Bergey v nhiu tỏc gi khỏc xp vi
khun Acetobacter v vi khun Glucobacter thuc vo mt h riờng tờn l:
Acetobacteriaceae.
Sau ny rt nhiu nh khoa hc vn tip tc nghiờn cu v vn cũn
nhiu tranh lun khỏc nhau v s phõn loi ng nht vi khun Acetobacter
nhng tt c cỏc nghiờn cu trờn u to c s cho nhng nghiờn cu tip
theo, ng thi ó to iu kin thun li cho vic ng dng vi khun
Acetobacter vo i sng thc tin.
1.3. c im chng ca Acetobacter [4], [6], [7], [8]
Vi khun Acetobacter l tỏc nhõn chớnh ca quỏ trỡnh lờn men axit
axetic. Da vo c im v tiờu chun phõn loi hc m xp chỳng thuc 2
ging:
- Acetobacter cú chu mao hoc khụng cú chu mao.
- Gluconobacter n mao.
Bergey (1989), Lapent et al (1990) thỡ Acetobacter v Gluconobacter l
2 ging vi khun quan trng nht ca h Acetobacteriaceae. Hai ging ny
ging rt ph bin trong t nhiờn nh trờn b mt lỏ, hoa quChỳng u cú
kh nng to axetic t ru etylic. t bo Gluconobacter khụng cú chu trỡnh

Lô Thị Bảo Khánh

12

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

Tricacboxylic (ATC) nờn khụng th din ra quỏ trỡnh oxi hoỏ axetat song li
cú mt chu trỡnh khỏc thay th (chu trỡnh Glyoxylat). Ngc li, t bo
Acetobacter xy ra cỏc quỏ trỡnh trờn.
Khi so sỏnh hai ging trờn vi nhng vi khun thuc ging
Pseudomonas thy chỳng cú nhng im tng ng. Cng cú mt s im
m hai ging trờn khỏc Pseudomonas nh: chu c nng axit cao hn,
kh nng chuyn hoỏ pepton yu hn, khụng sinh sc t, ớt di ng hn. Mt
s loi vi khun axetic khi phỏt trin trờn mụi trng nghốo cht dinh dng
hay thi gian nuụi cy lõu ngy (mụi trng gi) hỡnh thỏi d b bin i (t
bo phỡnh to, kộo di hoc phõn nhỏnh) [1].
Khi tip tc nghiờn cu hai ging vi cỏc vi khun thuc Pseudomonas
xp chỳng thnh cỏc nhúm c lp v thu c mt s kt qu.
Bng 1.1. Nhng c im phõn bit, so sỏnh Acetobacter,
Gluconobacter vi Pseudomonas
c im so sỏnh
Gluconobacte
1. V trớ tiờn mao
+
2. Phỏt trin pH = 4.5
+
3.Oxi húa etanol pH= 4.5
+
4. Oxi húa axit axetic
5. Oxi húa lactat
6. Glucoz gluconate
+
7.S dng tinh bt, lactoz
8. S dng gelatin
9. Sc t hunh quang

Ghi chỳ: Du (+): cú

Du (-): khụng

Acetobacter
Chu mao +/+
+
+
+
+/
-

Pseudomonas
Tiờn mao cc
+
+
+/
+/
+/
+/

Du (+/-): cú hoc khụng

Vi khun Acetobacter l nhng trc khun hỡnh que hay hỡnh elip, ng
c lp hay xp thnh chui, kớch thc khong 0,6 0,8 m, cú hoc khụng
cú tiờn mao, sng v phỏt trin trong iu kin hiu khớ bt buc hoỏ d dng
hu c, khụng sinh bo t, bt mu Gram õm, thớch hp vi pH = 5,4 6,8,

Lô Thị Bảo Khánh

13

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

nhit 25 300C, cú kh nng oxi hoỏ ru etylic thnh axit axetic, kh
nng oxi hoỏ hon ton cỏc hp cht hu c (cỏc loi ng v dn xut ca
chỳng) to thnh cỏc hp cht xeton hoc cỏc axit hu c tng ng.
1.3.1. c im khun lc Acetobacter
Khi nghiờn cu v khun lc ca vi khun axetic trờn mụi trng c,
ngi ta thy rng: khun lc u n, ng kớnh khun lc trung bỡnh 3mm
riờng 1 s loi nh: Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum cú khun lc nh
hn ng kớnh d = 1mm, b mt trn búng, phn gia khun lc li lờn dy
v sm mu hn xung quanh.
Nhng mt s loi khỏc thỡ khun lc cú ng kớnh nh hn (d = 4 -5
mm), b mt trn nhn khụng mu, mng nh ht sng nh, cú th dựng que
nuụi cy tỏch ra khi mụi trng d dng. Tuy nhiờn cng cú nhng khun lc
n sõu vo mụi trng, khú cú th gt ra bng que nuụi cy.
1.3.2. c im mng ca vi khun Acetobacter trờn mụi trng lng
mụi trng lng vi khun Acetobacter cú s hỡnh thnh mng trờn
mt thoỏng, mng to thnh cú dy mng khỏc nhau v c im ca cỏc
loi mng cng khỏc nhau.
Cú loi mng dy nh sa, nhn v trn búng, khi lc nh s chỡm
xung ỏy bỡnh v cú th tip tc hỡnh thnh 1 lp mng mi.
Cú loi mng mng nh t giy celophen, dai, nhn, khi lc cng chỡm
xung ỏy bỡnh v hỡnh thnh nờn 1 lp mng mi, dch nuụi cy trong v cú

mựi thm d chu. Khi nghiờn cu mng ny thy cú nhiu si cellulose ging
nh si bụng, chc kho c an kt vi nhau bi chớnh cỏc vi khun
Acetobacter to nờn do dai, n hi tt v tớnh chc kho ca mng.
Cú nhng mng li rt mng, d v, khụng nhn m nhn nheo, bỏm
theo thnh bỡnh, dch nuụi cy thng cú mu vng nõu, khụng trong va
khụng cú mựi thm d chu.

Lô Thị Bảo Khánh

14

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

T nhng quan sỏt v c im ca khun lc v c im ca cỏc loi
mng c hỡnh thnh nú cng gúp phn s b v nh dng cỏc loi mng
ca vi khun Acetobacter.
1.3.3. Nhu cu dinh dng ca vi khun Acetobacter [1]
Trong quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin, nhu cu dinh dng ca vi
khun Acetobacter l rt phong phỳ. Ngun C, N v cỏc cht kớch thớch sinh
trng cung cp cho quỏ trỡnh ny l ht sc a dng: ngun C cú th cung
cp t cỏc hp cht ng: glucoz, saccaroz, ru etylic v axit hu c.
Mui amon lm ngun cung cp N, mui photphat lm ngun P . Ngoi ra,
cỏc cht sinh trng nh: cỏc axit amin (Izoloxin, alanin, prolin, valin), axit
nicotinic, axit pantoneic, axit folic, biotin nicotinamid u cú vai trũ quan
trng trong sinh trng v phỏt trin ca vi khun Acetobacter.

Mt s loi vi khun cú kh nng t tng hp polysaccarit phõn t ln
nh cellulose, dextran (Acetobacter xylium, Acetobacter aceti, Acetobacter
kiitzingianum). in hỡnh l vi khun Acetobacter xylinum cú th tng hp
c nhng si cellulose ging nh nhng si bụng.
1.3.4.Con ng chuyn hoỏ cacbon
Nghiờn cu v kh nng chuyn húa C cỏc tỏc gi ó i n kt lun: vi
khun axetic cú th oxi húa cỏc bon theo nhng con ng sau:
+ Con ng th nht: khụng cú s photphoril húa c cht v s tham
gia ca cỏc enzym c hiu.
+ Con ng th hai: oxy húa c cht ó c photphoril húa trong
con ng pentozophotphat.
+ Con ng th ba: Entner Doudoroff (ED).
+ Con ng th t: chu trỡnh Krebs hoc Glyoxinat

Lô Thị Bảo Khánh

15

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

1.3.5. c im mt s loi vi khun Acetobacter
1.3.5.1. Acetobacter aceti
Trc khun ngn, kớch thc 0,4 0,8 x 1 1,2 m, khụng di ng
c, thng xp thnh chui di, bt mu Gram õm, mu vng vi thuc
nhum iot. Khun lc to, sỏng trờn gelatin vi dch lờn men cha 10 % ng

saccaroz to thnh mng nhy, nhn. Chỳng cú kh nng phỏt trin trờn mụi
trng cú nng ru cao (11 %) v cú th tớch lu n 6 % axit axetic
trong mụi trng. Chỳng thng phỏt trin trờn mụi trng bia vi nhit
thớch hp l 300C.
1.3.5.2. Acetobacter xylinum
Trc khun hỡnh que, kớch thc khong 2 m, t bo ng riờng r
hoc xp thnh tng chui, khụng di ng c, thuc nhúm vi khun Gram
õm, cỏc t bo c bao bi cht nhy to vỏng nhn v dy khi gp H2SO4
v thuc nhum it s bt mu xanh (do phn ng ca cellulose), chỳng cú
th tớch lu 4,5 % axit axetic trong mụi trng.
Khi nuụi cy vi khun Acetobacter xylinum trờn mụi trng lng s
hỡnh thnh trờn b mt lp mng , mng l tp hp cỏc t bo vi khun liờn
kt vi phõn t cellulose. Trong t bo xy ra quỏ trỡnh trao i cht núi
chung cũn mng cellulose xy ra quỏ trỡnh trao i oxy v cỏc cht dinh
dng [9].
Vi khun Acetobacter xylinum thng sng chung vi nm men trong
nm chố cũn gi l thu hoi sõm, hi bo, hay v bo mt loi
nc chua cú v thm dựng pha nc gii khỏt trong gia ỡnh, trờn b mt
cú mt vỏng vi sinh vt c nuụi cy bng nc chố ng.
1.3.5.3. Acetobacter pasteurianum
Cú hỡnh dng tng t nh Acetobacter aceti nhng vỏng vi khun cú
dng khụ v nhn nheo, bt mu xanh ca thuc nhum it, t bo xp di

Lô Thị Bảo Khánh

16

Lớp K30b- Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

nhau thnh chui, ụi khi bt gp t bo cú dng hỡnh chu phng lờn, di ng
khụng thung xuyờn. Khun lc trờn gelatin nh, trũn. Nhit thớch hp
phỏt trin l 300C.
1.3.5.4. Acetobacter acetosum
Trc khun cú kớch thc 0,4 0,8 x 1 m. Cỏc t bo xp riờng r
thnh tng chui, khụng di ng c. Nhit thớch hp nht cho chỳng
phỏt trin l 300C 360C.
1.3.5.5. Acetobacter kiitzingianum
Cú mng nhy, nhn mộp v c nõng cao lờn thnh bỡnh. T bo
dng trc khun, ngn, to, thụ, khụng di ng. Khun lc trờn Gelatin vi dch
lờn men nht, nh, to thnh mng xp np trờn mụi trng m. Thớch hp
phỏt trin 300C.
1.3.5.6. Acetobacter shiitzenbacchii
Trc khun khỏ di, kớch thc khong 0,3 0,4 x 1,0 3,6 m,
thng xp ụi hoc ng riờng r, cú th to vỏng nhy v khụng bn vng.
Cú kh nng tớch lu trong mụi trng n 11,5 % axit axetic, do ú thng
c s dng chyn hoỏ ru thnh gim theo phng phỏp c
(phng phỏp nhanh).
1.3.5.7. Acetobacter lindreni
Trc khun xp riờng r to chui, thnh thong cú t bo phng to hỡnh
cu, khụng di ng. Khun lc trờn gelatin vi dch lờn men trũn, nh, mu
vng, trờn mụi trng lng to vỏng mu nõu, nht. Thớch hp phỏt trin
250C.
1.3.5.8. Acetobacter orleanense
Trc khun di trung bỡnh, khụng di ng, gp iu kin nhit cao
cú th sinh ra t bo d hỡnh kộo di hoc phỡnh to.To vỏng vi khun rt dy

trờn mụi trng lng. Cú th phỏt trin trong mụi trng cú nng ru cao

Lô Thị Bảo Khánh

17

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

(10 % - 12%) v tớch lu n 9,5% axit axetic. Thng c dựng chuyn
hoỏ ru vang thnh gim theo phng phỏp Phỏp (phng phỏp chm hay
phng phỏp Orleans). Thớch hp phỏt trin 250C 300C.
1.3.5.9. Acetobacter suboxydans
Cú dng hỡnh que ngn, ng riờng r hoc xp thnh chui ngn,
khụng cú kh nng di ng, to thnh nhng vỏng mng, d v. Cú kh nng
chuyn hoỏ glucoz thnh axit gluconic, oxy hoỏ ru sobit thnh socboza
- dựng sn xut axit ascorbic vitamin C. Loi vi khun ny mun phỏt
trin bỡnh thng cn c cung cp mt s cht sinh trng: axit para
aminobenzoic, axit pantoneic, axit nicotinic.
1.3.5.10. Acetobacter hoshigakii
Trc khun cú kớch thc 0,7 0,9 x 1,5 1,8 m, thng xp riờng r,
khụng di ng. Khun lc trờn thch vi cht chit rỳt t u nnh nh, trũn,
dng ht xỏm sau ú chuyn thnh mu nõu. Khun lc trờn thch vi dch lờn
men trũn, mu trng sa, v sau phn gia khun lc hoỏ nõu, phớa ngoi mu
vng nht. Cú kh nng to thnh axit gluconic. Nhit thớch hp cho s
phỏt trin l t 300C 350C.

1.3.5.11. Acetobacter ascendens
Trc khun khụng di ng, cỏc khun lc trờn glucoz, genlatin khụ
trng vi vnh sỏng chúi. Trờn mụi trng lng to thnh mng nhy chc,
nõng lờn theo thnh bỡnh. Thớch hp phỏt trin 250C.
1.3.5.12. Acetobacter oxydans
Trc khun cú kớch thc 0,8 1,2 x 2,4 2,7 m, cỏc t bo ri nhau
hoc xp thnh chui. Quan sỏt trong chui thy cú t bo phng to lờn, di
ng. Khun lc trờn gelatin trũn sau tr thnh dng khụng cõn i vi s
phõn nhỏnh c trng. Nhit thớch hp t 180C 210C.

Lô Thị Bảo Khánh

18

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

1.3.5.13. Acetobacter plancatum
Trc khun cú kớch thc 0,4 0.6 x 1,4 1,6 m, khụng di ng.
Khun lc ru vang trờn gelatin trũn tra, hi nhụ lờn, sỏng, m t, nht.
Nhit thớch hp t 250C 300C [4]. Hu ht cỏc loi Acetobacter thng
phỏt trin tt nht 250C 300C, u cú kh nng s dng mui phophat, a
s ũi hi cung cp thờm vitamin, chỳng cú kh nng oxy hoỏ ru thnh axit
v trong quỏ trỡnh sinh trng, phỏt trin chỳng to ra mt lp mng dy cú
bn cht cellulose trờn b mt mụi trng nuụi cy. Vi nhng nghiờn cu
hin nay cho thy lp mng ny cú th c ng dng vo rt nhiu nghnh

quan trng cú ý ngha thc tin trong cuc sng. ng thi kh nng to
mng ca cỏc chng vi khun trờn rt khỏc nhau vỡ vy cn phi tuyn chn ra
nhng chng vi khun cú kh nng to mng tt nht v phự hp vi mc
ớch s dng ca tng loi mng.
1.4. C s khoa hc ca quỏ trỡnh lờn men axetic
Quỏ trỡnh lờn men axetic l quỏ trỡnh oxi hoỏ ru etylic thnh axit
axetic trong mụi trng khỏc nhau di tỏc dng ca Acetobacter.
S chuyn hoỏ ru etylic thnh axit axetic bao gm 2 giai on:
+ Giai on 1: ru chuyn hoỏ thnh axetaldehyt
+ Giai on 2: axetaldehyt chuyn hoỏ thnh axit axetic
Quỏ trỡnh lờn men ny c mụ t c th nh sau:

Lô Thị Bảo Khánh

19

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

Hỡnh 1.1. C ch quỏ trỡnh oxy hoỏ ru etylic thnh axit axetic
1.5. Cỏc yu t iu kin v mụi trng nh hng n lờn men axetic [4]
Ebner v Hromatka (1949 1953) cho rng: axit axetic c to thnh
bi chớnh t bo sinh sn. Di tỏc dng ca vi khun Acetobacter m nh
quỏ trỡnh lờn men ru etylic to thnh axit axetic. Bi vy cỏc yu t nh:
thnh phn mụi trng, nhit , ch thụng khớu nh hng n quỏ
trỡnh lờn men.

Lô Thị Bảo Khánh

20

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

Vi khun Acetobacter l loi vi khun a m, nhit thớch hp l
250C 320C, sng hiu khớ do vy cn cung cp mt lng ln oxi cho quỏ
trỡnh lờn men. Theo nghiờn cu ngi ta thy rng: oxi hoỏ 1 mol ru cn
s dng n 1 mol O2 nhng trong thc t lng O2 cn phi dựng gp ụi.
quỏ trỡnh lờn men tin hnh nhanh hn trong dch lờn men cn cung
cp thờm mt s cht nh: ru etylic, axit axetic, cỏc cht khoỏng, cỏc mui
(NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, CaH2PO4, FeCl3, vitamin v mt s cht kớch
thớch khỏc nh: peptụn, cao nm men, cao tht, nc st c chua
1.6. Mng sinh hc (Bacterial cellulose, Biocellulose- BC)
Mng BC cú th c tng hp t nhiu nhúm vi khun nh:
Pseudomonas, Azotobacter, Argrobacterium, Acetobacternhng ch vi vi
khun Acetobacter xylium cellulose mi c tng hp mnh. Bn cht ca
mng BC l s kt hp gia cellulose v t bo vi khun Acetobacter xylinum.
Celluloz ny c hỡnh thnh t rt nhiu si nh, cỏc si ny c kt hp
vi nhau da trờn liờn kt hidro v lc vandecvan do vy cỏc si nh liờn kt
vi nhau rt cht, mt phn quy nh tớnh cht ca mng BC.
So vi cellulose ca t bo thc vt thỡ cellulose cú trong BC cú cựng
cụng thc hoỏ hc (l mt loi polysaccarit cao phõn t, cú cu trỳc bn vng,

c cu to t rt nhiu n phõn l cỏc gc 1,4 glucozit. Mi cellulose
thng cha khong t 140 1000 gc glucoz) [12]. Tuy nhiờn, do quỏ trỡnh
tng hp cellulose khỏc nhau nờn chỳng cú s khỏc bit v tớnh cht lý hoỏ
nh: bn c hc, kh nng polymer hoỏ, tinh schu vit hn hn t
bo thc vt. Riờng tớnh n hi v bn c hc ca cellulose trong mng
BC ó c so sỏnh tng ng vi nhụm.
Nh nhng thuc tớnh c bit trờn m mng BC c s dng rt
nhiu cỏc nc phỏt trin, ng dng rng rói trong cỏc lnh vc nh: thc
phm, cụng nghip, nụng nghip, bo v mụi trng, cụng ngh vt liu mi

Lô Thị Bảo Khánh

21

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

v c bit vi y hc, mng BC cỏc nc trờn th gii c nghiờn cu
v ng dng trong tr bng, lm mt n dng da
Vit Nam, t nhng nm 2000 nhúm nghiờn cu Hunh Th Ngc
Lan v cng s, b mụn vi sinh, khoa Duc ca i hc Y Duc Thnh Ph
H Chớ Minh ó cú mt cụng trỡnh nghiờn cu v mng BC t Acetobacter
xylium. Bc u nghiờn cu c mt s cỏc tớnh cht c bit ca mng BC
nh: kh nng thm hỳt tt, thụng thoỏng cao, cú kh nng ngn cn vi
khun xõm nhp l c s cho vic ch to mng sinh hc dựng trong tr
bng Vit Nam. c bit, vi nhng tớnh cht quý ca mng BC ó v ang

ha hn nhng ng dng trong y hc v cụng nghip m phm, c coi l
mt vt liu polymer cú trin vng.

Lô Thị Bảo Khánh

22

Lớp K30b- Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

Chng 2
NGUYấN LIU V PHNG PHP NGHIấN CU
2.1. i tng - hoỏ cht
2.1.1. i tng
i tng nghiờn cu l cỏc chng vi khun thun khit c phõn lp
t mng cỏc ngun nguyờn liu nh quỏ trỡnh lờn men gim nh: bia, gim,
dch hoa qu trong phũng thớ nghim vi sinh, trng i hc S phm H Ni
2. T cỏc chng phõn lp c tuyn chn cỏc chng cho mng dai, mng,
trong.
Th nh kho mnh trng lng 1,4- 1,6 kg.
2.1.2 Thit b- hoỏ cht
2.1.2.1. Thit b
T m, t sy Binder (c)
Ni hp Autolave
Cõn (Precisa XT 320M- Thy S)
Mỏy li tõm Sorvall (M)

Mỏy o mu UV- vis (Nht)
Mỏy o pH (MP 200 R - Thy S)
Mỏy lc Orbital Shakergallenkump (Anh)
Bung cy vụ trựng, kớnh hin vi quang hc, kớnh hin vi in t, hp
lng, ng nghim, bỡnh tam giỏc, lamen, ốn cn v mt s dng c hoỏ
sinh thụng dng khỏc.
2.1.2.2. Hoỏ cht
Cỏc loi hoỏ cht thụng dng: glucoz, axit axetic, ru etylic, pepton,
cao nm men, cao tht, agar agar, NaOH, MgSO4.7H2O, KH2PO4,
(NH4)2SO4, CaCO3, thuc nhum tớm gentian, dung dch fucshin, dung dch
lugolc mua t Trung Quc hoc sn xut ti Vit Nam.

Lô Thị Bảo Khánh

23

Lớp K30b- Sinh


Kho¸ luËn tèt nghiÖp

Chuyªn nghµnh vi sinh vËt

Nước dừa nguyên chất, nước mía ép nguyên chất, nước dừa, dầu mù u
(mua từ viện bỏng Quốc gia).
2.1.2.3. Môi trường [6]
Các môi trường sử dụng có thành phần như sau:
Bảng 2.1. Thành phần môi trường
Thành phần

MT1

MT2

MT3

MT4

MT5

MT6

1. Glucozơ

20g

20g

20g

20g

20g

20g

2.(NH4)2SO4

3g

3g

3g

3g

5g

4g

3. KH2PO4

2g

2g

2g

2g

2g

1g

4. MgSO4.7H2O

2g

2g

2g

2g

0g

0g

5. CaCO3

7g

0g

0g

0g

0g

0g

6. Axit axetic

2%

2%

2%

2%

5ml

2,5ml

7. Rượu etylic

2%

2%

2%

2%

0

0

8. Nước mía ép

0

0

0

200ml

0

0

9. Cao nấm men

0

0

0

5g

3g

0

10. Pepton

0

6g

0

6g

2g

0

11. Nước máy

1000ml 1000ml 1000ml 1000ml 800ml

12. Agar

0

20g

0

0

0

0

0

13. Nicotinamid

0

0

7,5mg

0

7,5mg

0

14. Nước dừa

0

0

0

0

0

1000ml

Chú ý: axit axetic, rượu etylic được bổ sung sau khi đã khử trùng môi trường
Trong đó: MT1 là môi trường phân lập vi khuẩn giấm.
MT2 là môi trường nhân giống cơ bản
MT3 …MT6 là môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng.

L« ThÞ B¶o Kh¸nh

24

Líp K30b- Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Chuyên nghành vi sinh vật

2.2.Phng phỏp nghiờn cu
2.2.1. Phõn lp chng vi khun Acetobacter (vi khun gim) theo phng
phỏp Vinogradski [1], [2], [3]
cú c chng vi khun Acetobacter chỳng tụi tin hnh phõn lp t
ngun nguyờn liu l bia hi H Ni, gim lm theo phng phỏp c truyn.
Trc ht cn thc hin quỏ trỡnh lờn men t ngun nguyờn liu trờn. Vi
khun Acetobacter l loi vi khun hiu khớ sau mt thi gian chỳng s hỡnh
thnh mt lp mng trng, dai trờn mụi trng dch th, ú chớnh l tp hp
cỏc t bo vi khun axetic. T cỏc mu mng trờn chỳng tụi tin hnh ra
sch, cho vo ng nghim ng nc ct thanh trựng, lc u bng mỏy
vontex thu c ng nghim ng mu mng gc.
Khi phõn lp cn pha loóng nng vi sinh vt. Chỳng tụi s dng
phng phỏp pha loóng Pasteur. Ban u chun b 10 ng nghim cú nh
mc 10ml, cú y nỳt bụng v ó sy kh trựng. ỏnh s th t v cho vo
mi ng nghim trờn 9ml nc ct bng pipet vụ trựng. Sau ú, dựng pipet vụ
trựng hỳt 1ml dch t ng nghim ng mu mng gc cho vo ng nghim
th nht, y nỳt bụng v lc u ng nghim bng mỏy vontex ( vi sinh
vt phõn b u trong ng nghim) ta c dung dch pha loóng nng
10-1. Tip tc dựng pipet ly 1ml dung dch ca ng nghim th nht cho vo
ng nghim th 2, y nỳt, lc u ta thu c dung dch cú nng 10-2.
Vi cỏc thao tỏc lp li nh trờn ta s thu c dung dch pha loóng cỏc
nng 10-3, 10-4 10-10. Mc pha loóng ny s phn ỏnh s lng vi
khun cú trong mu ng nghim. Chỳng tụi la chn mu cú pha loóng
10-4 n 10-6 tin hnh cỏc bc tip theo.

Phng phỏp thch a: chun b MT1 ó hp kh trựng, vo cỏc hp
petri v ngui. Dựng pipet vụ trựng hỳt v nh mt git dung dch (cú
pha loóng 10-4 n 10-6) vo hp petri d chun b trờn. Dựng bn trang thu

Lô Thị Bảo Khánh

25

Lớp K30b- Sinh