Nghiên cứu phân lập genistein va lanceolarin từ cây dalbergia tonkinesis

Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HOÁ HỌC

NGUYỄN THỊ TRÀ ANH

Nghiên cứu, phân lập genistein và lanceolarin
từ cây Dalbergia tonkinesis

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Hà Nội - 2010

Nguyễn Thị Trà Anh

1

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HOÁ HỌC

NGUYỄN THỊ TRÀ ANH

Nghiên cứu, phân lập genistein và lanceolarin
từ cây Dalbergia tonkinesis

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hoá hữu cơ
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS.TS Phan Văn Kiệm

Hà Nội - 2010

Nguyễn Thị Trà Anh

2

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Lời cám ơn
Với lòng biết ơn chân thành, em xin cám ơn sự giúp đỡ quí báu của
PGS.TS Phan Văn Kiệm, Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên - Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người đã trực tiếp hướng dẫn em hoàn
thành khoá luận tốt nghiệp này.
Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới lãnh đạo và các cán bộ Phòng hữu cơ,
Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam đã ủng hộ và nhiệt tình chỉ bảo, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành khoá luận này.
Qua đây, em cũng xin gửi lời cám ơn tới người thầy kính yêu
TS.Nguyễn Văn Bằng và các thầy cô trong khoa Hoá học - Trường ĐHSP
Hà Nội 2 đã tận tình dạy dỗ và chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập tại
trường.
Khoá luận tốt nghiệp không tránh khỏi một số thiếu sót vì vậy em rất
mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo của các thầy cô và các bạn sinh viên quan
tâm.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2010
Sinh viên
Nguyễn Thị Trà Anh

Nguyễn Thị Trà Anh

3

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Đề tài “ Nghiên cứu, phân lập genistein và lanceolarin từ cây
Dalbergia tonkinesis” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng

dẫn khoa học của PGS.TS Phan Văn Kiệm. Các số liệu nêu trong khoá luận
này là trung thực được làm từ thực nghiệm tại phòng Hữu cơ , Viện Hoá học
các Hợp chất Thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, không
trùng với kết quả của các tác giả khác.

Sinh viên
Nguyễn Thị Trà Anh

Nguyễn Thị Trà Anh

4

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các hình vẽ và bảng biểu
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………...1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN………………………………………………...3
1.1. Những nghiên cứu tổng quan về cây Sưa (Dalbergia tonkinesis)………..3
1.1.1. Đặc điểm thực vật………………………………………………………3
1.1.2. Sinh thái và phân bố………………………………………………….... 4

1.1.3. Công dụng……………………………………………………………...4
1.2. Giới thiệu về hoá học và hoạt tính sinh học……………………………...5
1.3. Tổng quan về các phương pháp chiết…………………………………….7
1.3.1. Đặc điểm chung của chiết………………………………………………7
1.3.2. Cơ sở của quá trì nh chiết……………………………………………….7
1.3.3. Quá trình chiết thực vật………………………………………………...8
1.3.3.1. Chọn dung môi chiết…………………………………………………8
1.3.3.2. Quá trình chiết………………………………………………………10
1.4. Tổng quan về các phương pháp sắc ký……………………………….... 11
1.4.1. Sắc ký cột (CC)………………………………………………………. 12
1.4.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC)……………………………………………….14
1.5. Tổng quan về phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ………...14
1.5.1. Điểm nóng chảy (Mp)………………………………………………... 14
1.5.2. Độ quay cực ([α]D)…………………………………………………… 15

Nguyễn Thị Trà Anh

5

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
spectroscopy, NMR)…………………………………………………………15
1.5.4. Phổ khối lượng (Mass spectrocopy, MS)……………………………..17
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…….18

2.1. Mẫu thực vật…………………………………………………………….18
2.2. Các phương pháp phân lập các hợp chất từ cây Sưa……………………18
2.2.1. Các phương pháp được sử dụng………………………………………18
2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng…………………………………………………….18
2.2.1.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC)………………………………….18
2.2.1.3. Sắc ký cột…………………………………………………………...18
2.3. Các phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất……………...19
2.3.1. Điểm nóng chảy……………………………………………………….19
2.3.2. Độ quay cực…………………………………………………………...19
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân…………………………………………..19
2.3.4. Phổ khối lượng………………………………………………………..19
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………...20
3.1. Quy trình phân lập……………………………………………................20
3.1. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất……………………21
3.1.1. Hợp chất 1: Genistein…………………………………………………21
3.1.2. Hợp chất 2: Lanceolarin……………………………………................22
3.2. Kết quả xác định cấu trúc……………………………………………….22
3.2.1. Hợp chất 1: Genistein ………………………………………………...22
3.2.2. Hợp chất 2: Lanceolarin ……………………………………………..27
KẾT LUẬN…………………………………………………………………32
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………33

Nguyễn Thị Trà Anh

6

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

  D

Độ quay cực Specific Optical Rotation

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

C NMR

Carbon – 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
1

H NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H - 1H COSY 1H – 1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D – NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

Two – Dimensional NMR

CC
DEPT
ESI – MS

Sắc ký cột Column Chromatography
Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
Phổ khối lượng phun mù điện tử
Electron Spray Ionization Mass Spectrometry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

IR

Phổ hồng ngoại
Infrared spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY

Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

Nguyễn Thị Trà Anh

7

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌ NH VẼ VÀ BẢNG BIỂU
Hình 1.1.a. Cây Sưa…………………………………………………………...3
Hình 1.1.b. Hoa của cây Sưa………………………………………………….4
Hình 1.1.c. Quả của cây Sưa………………………………………………….4
Hình 1.4. Độ phân cực của một số dung môi………………………………..12
Sơ đồ 2.2.2.a. Chiết phân đoạn và phân lập chất từ cặn chiết nước…………20
Sơ đồ 2.2.2.b. Phân lập các hoạt chất từ cặn chiết clorofooc………………..21
Bảng 3.3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1……………………………….23
Hình 3.3.1.a. Phổ 1H - NMR của 1..................................................................24
Hình 3.3.1.b. Cấu trúc hóa học của 1………………………………………..24
Hình 3.3.1.c. Phổ 13C - NMR của 1………………………………………….25
Hình 3.3.1.d. Phổ 13C - NMR và các phổ DEPT của 1……………………...25
Hình 3.3.1.e. Phổ khối lượng ESI - MS (positive) của 1……………………26

Hình 3.3.1.f. Phổ khối lượng ESI - MS (negative) của 1……………………26
Hình 3.3.2.a. Phổ 1H - NMR của 2…………………………………………..27
Hình 3.3.2.b. Cấu trúc hóa học của 2………………………………………..27
Hình 3.3.2.c. Phổ 13C - NMR và các phổ DEPT của 2………………………28
Bảng 3.3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2……………………………….29
Hình 3.3.2.d. Phổ HSQC của 2………………………………………………30
Hình 3.3.2.e. Phổ HMBC của 2……………………………………………...31

Nguyễn Thị Trà Anh

8

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Mở đầu
Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa tương đối lớn, độ ẩm
cao ( khoảng trên 80%), Việt Nam hiện có một hệ thống thực vật rất phong
phú với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta làm
thảo dược cùng với các mục đích khác phục vụ cuộc sống con người.
Cùng với bề dày phát triển 4000 năm lịch sử của dân tộc, ngành đông y
đã dành được những thành tựu rực rỡ, nhiều phương thuốc cây cỏ, động vật
đã được ứng dụng hiệu quả và lưu truyền cho đến nay. Đó là cơ sở rất quan
trọng trong việc phát triển ngành Hóa học các hợp chất Thiên nhiên.
Và hoá học các hợp chất thiên nhiên lại đóng vai trò quan trọng trong sự
phát triển của y dược hiện đại, đặc biệt trong các nghiên cứu về kháng sinh và

kháng u. Hoá học các hợp chất thiên nhiên còn cung cấp nguyên liệu ban đầu
dưới dạng các hợp chất hoặc nguyên liệu cho quá trình hình thành thuốc.
Để hình thành một loại thuốc có hoạt tính sinh học đặc biệt dùng trong
điều trị bệnh, các nhà nghiên cứu cần có một hợp chất ban đầu, hợp chất ban
đầu này thường tìm thấy ở các nguồn hợp chất thiên nhiên, mức độ thể hiện
hoạt tính sinh học của các hợp chất ban đầu này có thể không cao và ngay cả
bản thân hợp chất ban đầu cũng có thể chứa đựng những tác dụng phụ không
mong muốn. Bằng các biến đổi như chuyển hoá hoặc tổng hợp, kết hợp với
mô hình đánh giá mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính, các hợp chất ban
đầu sẽ dần dần được tinh chế và hình thành các hợp chất có hoạt tính cao hơn,
giảm các tác dụng phụ không mong muốn.
Cây Sưa hay sưa Bắc Bộ, trắc thối, huê mộc vàng, danh pháp khoa học
Dalbergia tonkinensis Prain, là một loài thân gỗ thuộc họ Đậu (Fabaceae) là
cây thân gỗ quý hiếm và có giá trị kinh tế cao.

Nguyễn Thị Trà Anh

9

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Từ xa xưa người ta đã sử dụng gỗ trắc thối để đóng đồ nội thất cao cấp.
Nó vừa là hương liệu vừa là dược liệu. Gỗ cây còn được làm thuốc chữa bệnh
đau dạ dày…Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có nhiều nghiên cứu hoá học về loài
cây này. Xuất phát từ thực tiễn trên và mong muốn làm phong phú thêm

nguồn kiến thức về loài cây này, tôi lựa chọn đề tài:
“Nghiên cứu, phân lập genistein và lanceolarin từ cây Dalbergia tonkinensis”
Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu


Nghiên cứu phân lập genistein và lanceolarin từ cây Dalbergia

tonkinensis bằng các phương pháp chiết, sắc ký kết hợp.


Xác định cấu trúc hoá học của genistein và laceolarin bằng các phương

pháp như phổ NMR, MS,IR,…

Nguyễn Thị Trà Anh

10

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Những nghiên cứu tổng quan về cây Sƣa (Dalbergia tonkinesis)
1.1.1. Đặc điểm thực vật [1,2]
Sưa hay sưa Bắc Bộ, trắc thối, huê mộc vàng, danh pháp khoa học
Dalbergia tonkinensis Prain, là một loài cây thân gỗ thuộc họ Đậu

(Fabaceae). Là cây gỗ nhỡ, lá thường xanh có thể cao tới 10-15 m, sinh
trưởng trung bình, thân màu vàng nâu hay xám, nứt dọc. Lá dài 9-20 cm;
cuống không lông; lá kèm sớm rụng, nhỏ, có lông nhỏ mịn và thưa, màu nâu
vàng. Các cuống nhỏ không lông; số lá chét 5-9, với lá chét tận cùng thường
là to nhất, hình trứng hay hơi thuôn dài, nhẵn, chất da, có lông mịn lơ thơ khi
non, nhanh chóng chuyển thành không lông, gốc lá chét tròn, nhọn mũi.

Hình 1.1.a. Cây Sưa
Hoa dạng chuỳ, mọc ở nách lá, khoảng 5-15 cm. Hoa trắng có đài hợp,
thơm. Quả dạng quả đậu hình trứng, thuôn dài, dài 5-6 cm, rộng khoảng 1 cm
và chứa 1-2 hạt dạng bầu dục, đường kính khoảng 9 mm. Quả khi chín không

Nguyễn Thị Trà Anh

11

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

tự nứt. Cành non màu xanh có đốm bì khổng màu trắng. Hoa ra tháng 4-7.
Quả chín thu hoạch tháng 11-12.

Hình 1.1.c. Quả của cây Sưa

Hình 1.1.b. Hoa của cây Sưa

Có hai loài sưa chính là sưa trắng và sưa đỏ. Sưa trắng cho hoa đẹp quả
to, đốt không có mùi, nhưng giá trị gỗ không bằng sưa đỏ. Sưa đỏ trông gần
giống sưa trắng, quả thành từng chùm, đốt lên có mùi thối.
1.1.2. Sinh thái và phân bố
Cây mọc rải rác, có khi thành từng đám nhỏ trong rừng rậm nhiệt đới.
Là cây ưa sáng, ưa đất sâu, dày, ít dốc trên đất phù sa cổ từ xám đến xán
vàng. Phân bố ở độ cao dưới 500m. Có khả năng tái sinh hạt tốt.
Phân bố chủ yếu ở miền Bắc Việt Nam và được tìm thấy rải rác tại Hải
Nam, Trung Quốc. Tại đây gọi nó là hoàng (huỳnh) đàn Việt Nam.
1.1.3. Công dụng
Gỗ trắc thối có mùi thơm quyến rũ thoảng nhẹ kiểu hương trầm. Khi đốt
tàn có màu trắng đục, mùi khó chịu nên được gọi là Trắc thối.
Gỗ trắc thối chỉ dùng phần lõi những cây trên trăm tuổi.

Nguyễn Thị Trà Anh

12

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Gỗ sưa thớ mịn, vừa cứng lại vừa dẻo, có nhiều hoa văn đẹp. Thời
phong kiến vua chúa dùng gỗ trắc thối để đóng đồ nội thất cao cấp trong cung
đình vì nó vừa là hương liệu vừa là dược liệu.
Do đặc điểm hoa trắng, có mùi thơm, tán rộng, nên người ta có thể trồng
làm cảnh tại các đường phố. Theo Giáo sư Đỗ Tất Lợi thì gỗ cây này còn

được sử dụng cùng với dạ dày nhím làm vị chính trong đơn thuốc chữa bệnh
đau dạ dày. Hiện gỗ Sưa ở Việt Nam đang được các thương lậu Trung Quốc
thu mua với giá cả rất cao (1,3 tỷ VND/m3).
Hiện nay đang bị tận diệt khai thác. Theo IUCN thì cấp đe doạ của nó
hiện nay là VU A1cd= sắp nguy cấp (năm đánh giá 1997). Theo Việt Nam gỗ
sưa thuộc nhóm 1A là nhóm đặc biệt quý hiếm. Giá trị thương mại gỗ sưa
hiện nay rất cao (theo một số phương tiện thông tin đại chúng thì 1 tấn ~ 1 tỉ
đồng Việt Nam). Vì vậy việc bảo vệ cây gỗ sưa tại Việt Nam đang là một việc
rất đáng lo ngại.
1.2. Giới thiệu về hoá học và hoạt tính sinh học
Hiện nay, tại Việt Nam cũng như trên thế giới chưa có công trình khoa
học nào công bố về thành phần hoá học của cây sưa (Dalbergia tonkinensis).
Các nghiên cứu đã công bố trên thế giới cho thấy, chi Dalbergia sản sinh
các hợp chất thứ cấp có cấu trúc hoá học rất độc đáo. Dưới đây là một số hợp
chất điển hình đã được phân lập từ chi Dalbergia:
OH
OMe

O

MeO
O

HO

OH
O
O

Ph

O

OMe

MeO

Candenatone [3]

Nguyễn Thị Trà Anh

O
OMe

Dacroidain [4]

13

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

OMe
OMe

O OH

HO

9

6

O

O
3'

O
O

O

HO

H

OH
HO

1'
2'

O

Glc

CH 2OH

Dalpanin [6]

Dalbinol [5]

HO

OH

OH

HO

O

O

O

3-(2,4-Dihydroxyphenyl)-7O

HO

hydroxycoumarin [8]

OH

Ph
HO

OMe
OH

O

OMe
O

MeO
Ph

OMe

O

OMe

2-[[4,5-Dimethoxy-2-(3-phenyl-2-

2',7-Dihydroxy-4'-methoxyflavone(35')-

propenyloxy)phenyl]methyl]-6-methoxy-3-

2',7-dihydroxy-4'-methoxyisoflavan [7]

phenyl-5-benzofuranol [9]

HO

O

Ph

HO

HO

OMe

OH
MeO

OMe O

HO

OMe

O

OH

Ph

O

7-Hydroxy-4'-methoxyisoflavan-2',5'-

O

quinone(45')-2',7-dihydroxy-4'-

O
MeO

methoxyisoflavan [10]

Nguyễn Thị Trà Anh

O

Isodaljanelin D [11]
MeO

HO

O

OH
O

Neocandenatone [12]

14

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

OH

O
HO

MeO

O

OMe
OMe
O

O

HO
OH

Retusapurpurin A [13]

Spirolouvelin [14]

1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp chiết [15]
1.3.1. Đặc điểm chung của chiết
- Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một
chất hào tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà tan với nó.
- Mục đích của chiết:

+ Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi
này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần
nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu.
+ Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất
trong một hỗn hợp phức tạp với kiều kiện chiết thích hợp. Thường dùng trong
phân lập các hợp chất thiên nhiên.
1.3.2. Cơ sở của quá trình chiết
- Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không hoà
lẫn với nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất
trong các pha lỏng
- Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst:
KA = [A]hc/ [A]n
KA: Hằng số phân bố
[A]hc, [A]n: Hoạt độ xác định của chất hoà tan trong pha hữu cơ và pha nước

Nguyễn Thị Trà Anh

15

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.3.3. Quá trình chiết thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và sấy mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có
trong các mẫu khác nhau (Chất không phân cực, chất có độ quay cực vừa
phải,…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.

1.3.3.1. Chọn dung môi chiết
Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung
môi dùng cho quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Yêu cầu với dung môi dùng cho quá trình chiết
Nó phải hoà tan các chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng
được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, dễ
bốc cháy. Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch
trước khi sử dụng. Nếu chúng có lẫn các chất khác vì có thể ảnh hưởng đến
hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết.
Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phatalat,
tri-n-butyl-axetylcitrat và tributyl phosphat. Những chất này có thể lẫn với
dung môi trong quá tr ình sản xuất dung môi hoặc trong khâu bảo quản như
các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa.
Metanol và clorofoc thường chứa Dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)phtalat
hoặc Bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân tích
trong quá trình nghiên cứu thực vật.
Chất này còn thể hiện hoạt tính trong thực nghiệm sinh học và có thể
làm bẩn dịch chiết của cây.
Những dung môi hay được sử dụng
1 - Clorofoc, metylenclorit và metanol là những dung môi thường được lựa
chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (lá, thân, rễ, củ, quả,…).

Nguyễn Thị Trà Anh

16

K32C - Hóa

Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Những tạp chất của clorofoc như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với
một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác.
Tương tự như vậy sự có mặt của một lượng nhỏ axit clohidric (HCl)
cũng có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác khéo
léo, cẩn thận ở nơi thông thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc, Metylen clorit
ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofoc.
2 - Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon
thế clo, người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên
màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn
các thành phần trong tế bào.
Trái lại, clorofooc khả năng phân cực thấp hơn, có thể rửa giải các chất
nằm ngoài tế bào.
Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các
hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất
này cũng sẽ bị hoà tan đồng thời.
Thông thường dung môi cồn trong nước dường như có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
metanol trong suốt quá trình chiết. Ví dụ: Trechonolide B bằng quá trình
metyl hoá khi đun nóng với metanol chứa một ít axit và quá trình phân huỷ
1- hydroxytropacocain cũng xảy ra khi Erythroxylum novogranatense được
chiết trong metanol nóng.
3 - Người ta thường ít khi sử dụng nước để thu dịch chiết thô từ cây mà thay
vào đó là dung dịch nước của metanol.
4 - Dietylete hiếm khi được dùng trong các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng dễ chuyển thành

peroxit dễ nổ, peroxit của dietylete dễ gây ra phản ứng oxi hoá với những hợp

Nguyễn Thị Trà Anh

17

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton
cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit.
Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá
trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dich chiết bằng axit - bazơ có
thể tạo ra những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong
cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho
quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo
thành chất mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không
quá 300C – 400C với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ
cao hơn.
1.3.3.2. Quá trình chiết
Hầu hết các quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
+ Chiết ngâm
+ Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet
+ Chiết sắc với dung môi nước

+ Chiết lôi cuốn theo hơi nước
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
trong các quá trình chiết mẫu thực vật bởi nó không đòi hỏi nhièu công sức và
thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở đáy để tạo
tốc độ chảy cho quá trình tách rửa dung môi.
Mẫu thực vật được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ
và sau đó chất chiết được lấy ra. Cần lưu ý, sau một quá trình chiết 3 lần dung
môi cặn thu được sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá
trình chiết được xác định bằng một vài cách. Bởi vì khi chiết các ancaloit, ta
có thể kiểm tra sự xuất hiện của nhiều hợp chất này ra khỏi bình chiết bằng sự

Nguyễn Thị Trà Anh

18

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Dragendorff và
tác nhân Mayer.
Cũng vậy, các flavoloid thường là những hợp chất màu và bởi vậy khi
dịch chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu là đã rửa hết những chất này trong
quá trình chiết. Khi chiết các chất béo nồng độ trong các phần của dịch chiết
ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
Trong trường hợp các lacton của secquitecpen và các glicozid trợ tim, phản
ứng Kedde có thể được sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi

cho phản ứng với anilin axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của hydrat cacbon, và
từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết mà lựa chọn dung môi cho thích hợp
và thực hiện quy trình hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao. Ngoài ra có thể dựa vào
mối quan hệ của dung môi và chất hoà tan của các lớp chất mà ta có thể tách
thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Tổng quan về các phƣơng pháp sắc ký [15]
Phương pháp sắc ký (chromatography) là phương pháp phổ biến và hữu
hiệu nhất hiện nay. Được sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung
và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
Sắc ký bao gồm có pha tĩnh và pha động. Trên thế giới hiện nay phổ
biến sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất phụ như silicagel,
YMC, ODS, Al2O3,…) còn pha động được sử dụng là chất lỏng (sắc ký lỏng),
hay chất khí (sắc ký khí). Pha động đươc dùng trong sắc ký lỏng là các dung
môi hữu cơ trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi
phân cực hơn và ngược lại chất ít phân cực sẽ tan tốt trong dung môi kém
phân cực.

Nguyễn Thị Trà Anh

19

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào độ khác nhau về ái lực giữa

các chất cần tách với chất hấp phụ. Độ hấp phụ của dung môi tăng dần từ ete
dầu hoả đến nước.
STT

Tên dung môi

Số phân cực

1

Ete dầu hoả

0,1

2

Izo octan

0,1

3

Hexan

0,1

4

Xyclohaxan

0,2

5

Hexandecan

0,5

6

CCl4

1,6

7

Toluen

2,4

8

Etyl ete

2,8

9

CH2Cl2

3,1

10

CHCl3

4,1

11

EtOAc

4,6

12

Axeton

4,8

13

DMSO

7,2

14

MeOH

8,8

15

Nước

10,02

Hình 1.4. Độ phân cực của một số dung môi
Tuỳ thuộc vào cách tiến hành sắc ký mà người ta chia ra thành các
phương pháp sắc ký chủ yếu sau:
1.4.1. Sắc ký cột (CC)
Đây là phương pháp phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao gồm các
loại silicagel (độ hạt khác nhau) pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS,
DIANION,…Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột bằng thuỷ tinh hay cột
bằng kim loại inox, nhưng phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất

Nguyễn Thị Trà Anh

20

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách
của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số lý thuyết càng lớn,

do đó khả năng tách càng cao và ngược lại.
Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ dòng chảy
càng giảm. Trong một số trường hợp khi lực trọng trường không đủ lớn thì
gây nên hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) do đó người ta phải
sử dụng áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột tỉ lệ giữa chiều cao cột (L) so với đường kính cột (D)
rất quan trọng đồng thời nó thể hiện khả năng tách c ủa cột. Tỉ lệ L/D cụ thể
phụ thuộc vào yêu cầu tách tức là phụ thuộc vào hỗn hợp.
Trong sắc ký tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng
đường đi được của dung môi gọi là Rf, với mỗi chất sẽ có một Rf khác nhau.
Chính nhờ sự khác nhau về Rf mà người ta tách được từng chất ra khỏi hỗn
hợp chất. Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ
thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng
các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì người ta
thường phải tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn sau đó đưa lên
cột. nếu tách tinh thì người ta hay đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan
chất dung môi chạy cột với một lượng tối thiểu. Việc nhồi cột (bằng chất hấp
phụ) cũng hết sức quan trọng. Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột
+ Một là nhồi cột khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để cho
chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột . Sau đó dùng dung môi chạy cột đến khi
cột trong suốt.
+ Hai là nhồi cột ướt, tức là chấp hấp phụ được lắc đều trong dung môi chạy
cột trước, sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết.

Nguyễn Thị Trà Anh

21

K32C - Hóa

Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2
Việc chuẩn bị cột hết sức quan

Khóa luận tốt nghiệp
trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu

quả tách. Yêu cầu cột không được có bọt khí bên trong (điều này gây nên hiện
tượng chảy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt, gãy.
Tốc độ dòng chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách . Nếu
tốc độ chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách

. Tuy nhiên nếu tốc độ dòng

chảy thấp quá sẽ làm kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công
việc.
1.4.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định
hướng cho sắc ký cột. Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng tráng
sẵn silicagel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh.
Ngoài việc sử dụng sắc ký lớp mỏng để định hướng cho sắc ký cột người
ta còn dùng sắc ký lớp mỏng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng
bản SKLM điều chế (bản được tráng silicagel dày hơn), có thể đưa lượng chất
nhiều hơn lên bản , và sau khi chạy sắc ký , người ta có t hể cạo riêng silicagel
rồi giải hấp bằng dung môi thí ch hợp để thu được từng chất riêng biệt . Có thể
phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc
trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng axit H2SO4 10%.
1.5. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ
Cấu trúc của chất phân lập ra được xác định bằng sự kết hợp của nhiều
phương pháp khác nhau. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất

mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau. Cấu trúc càng phức tạp thì
yêu cầu phối hợp các phương pháp càng cao.
1.5.1. Điểm nóng chảy (Mp)
Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan
trọng. Thông thường việc phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm

Nguyễn Thị Trà Anh

22

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

kết tinh là việc xác định điểm chảy vì đó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ
tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng rất ít mẫu thử.
Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ
chênh lệch nhau không quá 0,50C thì có thể xem sản phẩm kết tinh là tinh
khiết. Khi điểm chảy xác định được, đối chiếu với tài liệu tham khảo để có thể
đưa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu.
1.5.2. Độ quay cực ([α]D)
Ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trường bất đẳng hướng, trong điều
kiện nhất định nào đó, do tác dụng của môi trường làm cho cường độ điện
trường chỉ còn dao động theo một phương nhất định được gọi là ánh sáng
phân cực thẳng hay ánh sáng phân cực toàn phần.
Mặt phẳng chứa tia sáng và phương dao động của vectơ điện trường
được gọi là mặt phẳng dao động, còn mặt phẳng chứa tia sáng và vuông góc

với mặt phẳng dao động gọi là mặt phẳng phân cực.
Khi cho ánh sáng phân cực thẳng đi qua dung dịch một chất quang hoạt
thì mặt phẳng phân cực sẽ bị quay một góc α. Tuỳ theo chất quang hoạt mà
góc quay này có thể sang phải (+) hay sang trái (-). Độ lớn của góc quay α
phụ thuộc vào nồng độ C (g/100ml dung dịch), chiều dài lớp dung dịch (dung
môi) l, nhiệt độ t và chiều dài sóng λ:
α = [ ]t

Cl
100

1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
spectroscopy, NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu
hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hoá học các hợp chất hữu
cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng. Với việc sử dụng kết hợp các

Nguyễn Thị Trà Anh

23

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác
định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ cacbon)
là sự cộng hưởng ở các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới
tác dụng của từ trường ngoài. Các tần số cộng hưởng khác nhau này được
biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học. Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn
được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau.


Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (δ) của các

proton được xác định trong thang từ 0 đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai
hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử. Mỗi loại
proton cộng hưởng ở một trường khác nhau vì vậy chúng được biểu diễn bằng
một độ dịch chuyển hoá học khác nhau. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch
chuyển hoá học cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà
người ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.


Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên

tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ
khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải
thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 đến 240 ppm).


Phổ DEPT: Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại

cacbon khac nhau. Trên các phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc 4 biến mất.
Tín hiệu phổ của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 thì nằm về phía đối
diện trên phổ DEPT 1350 . Còn trên phổ DEPT 900 thì chỉ xuất hiện tín hiệu
phổ của các CH.



Phổ 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định

các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều.

Nguyễn Thị Trà Anh

24

K32C - Hóa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Phổ HMBC: Dây là phổ biểu diễn các tương tác xa của C và H trong

phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng
như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.


Phổ HSQC: Đây là phổ biểu diễn các tương tác của C và H liên kết trực

tiếp với nhau trong phân tử. Như ở phổ HMBC, nhờ vào các tương tác trên
phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định
về cấu trúc.
1.5.4. Phổ khối lượng (Mass spectrocopy, MS)

Phổ khối lượng được dùng khá phổ biến để xác định cấu trúc hoá học
của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này là
dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên
ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác dựa vào đó
người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại cấu trúc hoá học
các hợp chất.


Phổ EI-MS: Dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion

bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV.


Phổ ESI-MS: Còn được gọi là phổ khối lượng phun mù điện tử. Phổ

này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS,
do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic dặc trưng cho sự phá
vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ phá vỡ.

Nguyễn Thị Trà Anh

25

K32C - Hóa