Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin từ hai loại bèo tấm lemna aequinoctialis db1 và spirodela polyrhyza db2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
-------

TRẦN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN
BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA
AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
-------

TRẦN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN
BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA
AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ PHƢƠNG LIÊN

Thái Nguyên – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LƠI CẢM ƠN
̀
Trươc hêt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thanh va sâu săc tơi TS. Trân Thị
́
́
̀
̀
́ ́
̀
Phương Liên – phịng Cơng nghệ ADN Ứng dụng – Viên Công nghê Sinh hoc đa
̣
̣
̣
̃
tân tì nh hương dân va dì u dăt tôi trong qua trì nh hoan thanh luân văn.
̣
́
̃

̀
́
́
̀
̀
̣
Luận văn này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ
gen với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài nhánh: “Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen
H5N1 để chuyển vào bèo tấm” thuộc đề tài: Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang
gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm thuộc Chương trình
Cơng nghệ Sinh học Nơng nghiệp 2007-2010.
Tơi xin chân thành cam ơn lanh đao Viên Công nghê sinh hoc va cac thây cô
̉
̃
̣
̣
̣
̣
̀ ́
̀
giáo trong khoa Sinh – KTNN, Trương Đai hoc Sư pham Thai Nguyên , Đai học
̀
̣
̣
̣
́
̣
Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điểu kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin bay to biêt ơn tơi toan thê cac can bô Phong Công nghê ADN Ưng
̀ ̉

́
́
̀
̉ ́
́
̣
̀
̣
́
dụng, Viên Công nghê sinh hoc , đăc biêt la PGS.TS. Nông Văn Hai – Trương
̣
̣
̣
̣
̣ ̀
̉
̉
phịng Cơng nghệ ADN Ứng dụng , KS. Hà Hờng Hạnh đa giup đơ va chỉ bao tôi
̃
́
̃ ̀
̉
rât tân tì nh trong suôt thơi gian tôi thưc tâp va thưc hiên luân văn vưa qua.
́ ̣
́
̀
̣
̣
̀
̣

̣
̣
̀
Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Di truyền Nông nghiệp đã cung cấp nguyên
liệu bèo tấm cho luận văn.
Cuôi cung , tôi xin danh cho gia đì nh va ban be long biêt ơn sâu săc vì sư
́ ̀
̀
̀ ̣
̀ ̀
́
́
̣
quan tâm, đông viên va gop y cho tôi trong suôt qua trì nh hoc tâp va hồn thanh
̣
̀ ́ ́
́
́
̣ ̣
̀
̀
khóa luận.
Học viên

Trân Thị Kim Dung
̀

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ cơng trình
nào khác.
Thái Ngun, ngày

tháng

năm 2009

Tác giả luận văn

Trần Thị Kim Dung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




NHƢNG TƢ VIÊT TĂT
̃
̀
́
́

Amp

Ampicilin

DNA

Deoxyribonucleic acid

ATP

Adenosine triphosphate

bp

Base pair (căp bazơ)
̣

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

ddNTP

Dideoxynucleoside triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene diamine tetra-acetic acid

epp

Eppendorf

EtBr

Ethidium bromide

IPTG

Isopropyl thio-β-D-galactoside

kb

Kilo base

LB

Luria – Bertani

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNase

Ribonuclease

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

SHPT

Sinh học phân tử

TAE

Tris – acetate – EDTA

X - gal
v/p

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactocide
vong/phút
̀

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Kích thước gen nhân của một số loài bèo tấm

8

1.2

Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo

9

3.1

Các vị trí nucleotide khác biệt giữa Sp-Ubi-pin (Mỹ) với pJETSpUbipin6 và

43

pJETSpUbipin6R
3.2

Các vị trí nucleotide khác biệt giữa La-Ubi-pin (Mỹ) với La-Ubi-10F

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

50


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Hoa của Lemna gibba

5

1.2

Cây phân loại bèo tấm theo Landolt và cộng sự

5

1.3

Sinh sản vơ tính bằng hình thức nảy chồi ở S. polyrrhiza

6

1.4

Sơ đồ cấu trúc gen điển hình

11

1.5

Sơ đồ cấu tạo promoter nhóm II ở sinh vật nhân chuẩn

12

1.6

Cấu trúc hệ thống điều khiển Ubiquitin ở thực vật

14

2.1

1. Lemna aequinoctialis DB1; 2. Spirodela polyrrhiza DB2

21

3.1

Điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8%

33

3.2

Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài

34

bèo tấm Spirodela polyrrhiza DB2 (Mỹ) và vị trí các mồi.
3.3

Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%

36

3.4

Điện di plasmid trên gel agarose 0,8%

38

3.5

Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme

39

3.6

Trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm

40

Spirodela polyrrhiza DB2 với dự đoán các vùng chức năng promoter

3.7

Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài

44

bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và vị trí các mồi.
3.8

Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%

45

3.9

Điện di plasmid trên gel agarose 0,8%

47

3.10

Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme

48

3.11

Trình tự đoạn promoter của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 với dự

49

đốn các vùng chức năng promoter

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC
Lời cam đoan
Những từ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Mục lục
Trang
MƠ ĐÂU
̉
̀

1

Chƣơng 1. TƠNG QUAN TAI LIÊU
̉
̀
̣

3

1.1. Giới thiệu chung về cây bèo tấm

3

1.1.1. Phân bố của bèo tấm

3

1.1.2. Đặc điểm hình thái bèo tấm

3

1.1.3. Cây phân loại bèo tấm

5

1.1.4. Hình thức sinh sản của bèo tấm

5

1.1.5. Hệ gen của bèo tấm

7

1.1.6. Giá trị dinh dưỡng

8

1.1.7. Tiềm năng sử dụng bèo tấm trong công nghệ sinh học

9

1.2. Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật

10

1.2.1. Cấu trúc gen sinh vật

10

1.2.2. Cấu trúc promoter

11

1.2.3. Vai trò biểu hiện gen của promoter

13

1.2.4. Phân loại promoter

13

1.2.5. Ứng dụng promoter trong cơng nghệ gen thực vật

15

1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở bèo tấm

17

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

17

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

19

Chƣơng 2. NGUYÊN LIÊU VA PHƢƠNG PHAP NGHIÊN CƢU
̣
̀
́
́

21

2.1. Nguyên liệu

21

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.1.1. Nguyên liệu thực vật

21

2.1.2. Hóa chất

21

2.1.3. Thiết bị

22

2.2. Phương pháp nghiên cứu

22

2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật

22

2.2.2. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose

24

2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR

24

2.2.4. Các phương pháp sử dụng để tách dịng gen

26

2.2.5. Xác định trình tự gen

30

2.2.6. Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng

30

Chƣơng 3. KÊT QUA VA THAO LUÂN
́
̉
̀
̉
̣

31

3.1. Tách chiết DNA tổng số từ bèo tấm

31

3.2. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ở loài S. polyrhiza

33

3.2.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter

33

3.2.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pJET1.2

33

3.2.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE

38

3.2.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter.

39

3.3. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ở loài L. aequinoctialis

43

3.3.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter

43

3.3.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pCR1.2

44

3.3.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE

46

3.3.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter.

48

KÊT LUÂN VA ĐÊ NGHỊ
́
̣
̀

̀

53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỞ ĐẦU
Khi con người có cuộc sống định cư, khoảng 8000 năm trước Công nguyên,
ở khu vực Tiểu Á và lưu vực sông Nin người ta đã bắt đầu việc trồng trọt truyền
thống với mục đích duy trì và cải thiện chất lượng giống cây trồng nhằm thỏa mãn
yêu cầu của con người ngày một tốt hơn. Con người đã biết tạo ra giống cây trồng
mang các đặc tính mong muốn bằng phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính giữa
hai dòng cây trồng). Phương pháp này cần nhiều thời gian, công sức và trong nhiều
trường hợp cây lai thu được kèm theo cả tính trạng khơng mong muốn.
Ngày nay, công nghệ gen sử dụng các phương pháp hiện đại đã khắc phục
được các hạn chế đó. Cơng nghệ gen cho phép các nhà di truyền và chọn giống thực
vật xác định và thiết kế các gen đặc hiệu cho các mục tiêu mong muốn (kể cả các
gen có nguồn gốc từ các sinh vật khác loài) rồi chuyển các gen này vào các giống
đang sử dụng, tạo ra những giống cây trồng biến đổi gen mang những đặc tính mới
đáp ứng yêu cầu của con người và có thể đem lại lợi ích quan trọng như tăng tính
chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng năng suất và chất lượng, cải
thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hố học cần sử dụng. Cơng nghệ
gen thực vật còn mở ra một khả năng mới là sử dụng thực vật như một nhà máy sản

xuất các loại thuốc cần thiết cho con người như vitamin, enzyme, kháng thể, vacxin
và các loại thuốc chữa bệnh khác [3].
Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, bên cạnh những gen có giá trị mã hố
cho các tính trạng mong muốn, các promoter cần thiết cho sự biểu hiện của các gen
cũng nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu công nghệ gen thực
vật. Promoter là thành phần quan trọng trong cấu trúc của tất cả các gen, khởi đầu
cho sự phiên mã, đóng vai trị then chốt trong việc biểu hiện gen. Việc phân lập các
promoter biểu hiện gen hữu hiệu trên cây trồng, đặc biệt là promoter đặc hiệu cho
từng loại cây, biểu hiện trong các loại mô tế bào khác nhau ngày càng được quan
tâm đến. Nhiều promoter từ các gen ở thực vật được phân lập trong số đó phải kể
đến promoter ubiquitin gen ngô, promoter gen rbcS (ribulose – 1,5-bisphosphate
carboxylase small subunit), promoter của gen mã hóa sucrose synthase...[4].
Ubiquitin - protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) với phân tử lượng nhỏ, có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1




mặt trong mọi tế bào ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, protein này tham gia vào
quá trình phân giải polypeptide trong tế bào chất, đóng vai trị quan trọng trong việc
bảo vệ tế bào và chuyển hóa các chất trong tế bào. Promoter của Ubiquitin gen từ
cây ngô được sử dụng rộng rãi trong công nghệ gen thực vật [22], [41], [53].
Bèo tấm là cây một lá mầm nhỏ nhất, có hàm lượng protein và
polysaccharide cao. Với đặc thù cấu trúc và quá trình trao đổi chất, bèo tấm được sử
dụng trong công nghệ gen thực vật như nhà máy sản xuất protein tái tổ hợp. Một số
promoter bèo tấm đã được phân lập như promoter của các gen SSU5A, SSU5B,
promoter của gen NPR1 (negatively phytochrome regulated1)... có phản ứng với

điều kiện chiếu sáng hoặc cảm ứng ABA trong các nghiên cứu về quá trình quang
hợp ở cây [18], [61]. Để tăng cường hiệu quả chuyển gen, ngoài sử dụng promoter
truyền thống như promoter 35S CAMV, promoter Ubiquitin từ loài bèo tấm Lemna
minor đã phân lập, nghiên cứu và hồn thiện ở Mỹ, đã được đánh giá có hiệu quả
cao hơn và đăng ký thành patent [24]. Ở Việt nam có 3 lồi bèo tấm được phát hiện
thấy là Lemna aequinoctialis, Spirodela polyrrhiza và Wolffia globosa ở nhiều vùng
khác nhau
Nhằm mục đích nghiên cứu phân lập promoter đặc hiệu từ các loài bèo tấm
Việt Nam phục vụ cho việc thiết kế tiếp theo các vector mang những gen đem lại lợi
ích cho con người để chuyển vào bèo tấm, chúng tôi xin đăng ký thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin từ hai loài
bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2” với các nội
dung chính sau đây:
1. Hồn thiện các phương pháp tách DNA tổng số từ hai loài bèo tấm Lemna
aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2;
2. Nghiên cứu thiết kế các mồi đặc hiệu và nhân đoạn các yếu tố điều khiển
biểu hiện gen đặc hiệu từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela
polyrrhiza DB2 bằng PCR;
3. Tách dịng và xác định trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen
đặc hiệu từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza
DB2.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2




Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây bèo tấm
1.1.1. Phân bố của bèo tấm
Bèo tấm với tên khoa học Lemnaceae là lồi sinh vật thủy sinh có khả năng
tồn tại và phát triển ở nhiều nơi trên thế giới, trừ những vùng cực bắc và cực nam
quanh năm giá lạnh. Ở vùng sa mạc và vùng ẩm ướt thì sự có mặt của bèo tấm cũng
ít hơn. Trong các chi thuộc lồi bèo tấm thì 3 chi (Spirodela, Lemna, Wolffia) được
phân bố khắp thế giới, trong khi đó Wolffia ít tìm thấy ở châu Mỹ và châu Phi.
Spirodela có tâm phân bố ở Nam Mỹ. Chi Lemna có tính đa dạng cao nhất ở Bắc
Mỹ và Đơng Nam Á. Wolffiella phân bố chủ yếu ở vùng ven nhiệt đới của châu Mỹ
và châu Phi. Wolffia tồn tại chủ yếu ở châu Mỹ, Đông Nam Á và châu Úc. Lemna
aequinoctialis được phân bố rộng rãi ở các vùng có khí hậu ấm áp trên thế giới.
Cùng với nghề trồng lúa nước, chúng có mặt rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau như:
Nam Âu, vùng trung tâm Bắc Mỹ, Bắc Trung Quốc, Bắc Nhật Bản…[36]. Ở Việt
Nam, đã phát hiện thấy có 3 lồi bèo tấm thuộc 3 chi khác nhau (Spirodela, Lemna,
Wolffia) đó là lồi L. aequinoctialli, S. polyrrhiza và W. globosa [36]. Hiện nay,
các loài bèo này phân bố khá phổ biến trên các vùng mặt nước, ao hồ đồng ruộng và
tập trung nhiều ở khu vực đồng bằng Bắc Bộ và Nam bộ [7], [36].
1.1.2. Đặc điểm hình thái bèo tấm
Lemnaceae thuộc nhóm cây một lá mầm nhỏ nhất phần lớn có cả lá, rễ, hoa,
quả, những cây trưởng thành khơng có thân cây. Lá (cánh bèo) có kích thước khác
nhau phụ thuộc vào từng chi, từng loài.
1.1.2.1. Đặc điểm cánh bèo
Dạng thân giống lá của các loài Lemnaceae được gọi là “frond” (cánh bèo),
là một tập hợp của các mơ có sự biệt hóa hạn chế. Mức độ tổ chức của mô cánh bèo
trong họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella và Wolffia [36]. Cánh
bèo không ở dạng phẳng mà tồn tại các u lồi đặc trưng trên đó có định vị các gân lá,
cây trưởng thành thường có từ 4-7 gân lá trong khi các cây non chỉ có 3 gân lá. Đa
số bèo tấm có cánh mỏng giống lá. Một số lồi có cánh khơng dẹt do có xoang khí

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3




lớn. Cánh bèo có hình ơ van (hoặc trịn) dài tới 1,5 cm và rộng tới 1 cm
(S. polyrrhiza, L. trisulca). Lồi nhỏ nhất có cánh đạt kích thước 3 mm ở điều kiện
tối ưu. Ở điều kiện thường có thể nhỏ hơn 1 mm (Wolffia). Kích thước và hình dạng
của cánh bèo phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bên ngoài và kiểu gen của chúng.
Các yếu tố ngoại cảnh này bao gồm: ánh sáng, hàm lượng đường, hàm lượng nitơ,
phospho, kali, canxi và magie, nhiệt độ…[36].
1.1.2.2. Đặc điểm rễ bèo
Kích thước và số lượng rễ trên 1 cánh bèo ở các lồi bèo tấm khơng giống
nhau và phụ thuộc vào từng loài [36]. Đa số các loài thuộc họ Lemna chỉ có một rễ,
S. polyrrhiza có từ 7-12 rễ hoặc nhiều hơn và có thể dài đến 10 mm, Landoltia có 23 rễ và có thể lên đến 5 rễ với chiều dài tối đa có thể đạt được là 6 mm. Ngoại trừ
điều kiện khắc nghiệt, trong điều kiện thiếu nitơ, phosphate hay các chất khoáng, rễ
sẽ dài hơn. Trong khi đó, trong mơi trường dinh dưỡng thuận lợi, rễ ngắn hơn và
thậm chí có loại khơng hình thành rễ. Cấu trúc rễ của bèo tấm cũng hết sức đơn
giản, khơng có các rễ con và khơng phản ánh sự tăng trưởng cũng như sự tạo nhánh.
Vì lẽ đó, rễ của bèo tấm rất mảnh và nhỏ. Cũng giống như các loại rễ phổ biến khác,
rễ bèo tấm có cấu tạo gồm 4 phần chính: Đỉnh rễ, vùng mô phân sinh, vùng kéo dài,
và vùng các tế bào thuần thục.
1.1.2.3. Hoa và quả bèo
Hoa của các loài bèo tấm đã được nghiên cứu tương đối kĩ. Chúng thường
hình thành và tồn tại trong thời gian ngắn và hiếm khi được quan sát thấy. Hoa của
các loài bèo có thể hình thành trong thời gian ngắn hay dài khác nhau tuỳ thuộc vào
lồi. Mỗi hoa thường có 2 nhị hoa và 1 vòi nhụy hoa duy nhất. Các nhụy hoa
thường ngắn và khó quan sát hơn. Quả của bèo tấm đa phần là nhỏ, có lớp vỏ ngồi

khơ, một số trong đó có thể được quan sát thấy bằng mắt thường. Quả bèo thường
có dạng như một túi có răng cưa, đơi khi có dạng dọc hơi phẳng, và thường chứa từ
1-6 hạt [36]. Hình 1.1 thể hiện một số đặc điểm của hoa bèo tấm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4




Hình 1.1. Hoa của Lemna gibba

1.1.3. Cây phân loại bèo tấm

Hình 1.2. Cây phân loại bèo tấm theo Landolt và cộng sự

Theo Landolt, bèo tấm thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp
Liliopsida, bộ Arales, họ Lemnaceae gồm các chi Lemna, Spirodela, Wolffia,
Woffiela với trên 40 lồi khác nhau [36]. Ơng đã phân loại bèo tấm dựa trên số rễ và
kích thước của cánh bèo: Lemna (1 rễ); Spirodela (7-12) rễ; cánh bèo từ 10 mm trở
lên); Landoltia (2-3 rễ, cánh bèo 3-6 mm); Wolffia (khơng có rễ, cánh bèo 0,6-1,2
mm)…

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5

Năm 2002, Les và cộng sự đã dựa trên đặc điểm về hình thái nhiễm sắc thể
và vi phân tử (DNA của nhân và lục lạp) đề ra giả thiết về cây phân loại của bèo
tấm gồm 5 chi tức là có thêm một chi mới là Landoltia [38].
Một số nghiên cứu gần đây của Rothwell và cộng sự, dựa trên sự so sánh
trình tự đoạn intron tRNALeu UAA (trnL) và tRNAPhe UAA (trnF) của bộ gen lục
lạp đã xác định rằng họ Lemnaceae và Pisita cùng thuộc họ ráy Araceae [48]. Hình
1.2 biểu thị cây phân loại bèo tấm [37].
1.1.4. Hình thức sinh sản của bèo tấm
Bèo tấm có hai phương thức sinh sản để duy trì nịi giống: Sinh sản hữu tính
và sinh sản vơ tính. Sinh sản vơ tính chiếm ưu thế so với sinh sản hữu tính. Hình
thức sinh sản hữu tính của bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất lợi để bảo
tồn nịi giống [36], [37].
1.1.4.1. Sinh sản vơ tính
Bèo tấm sinh sản vơ tính bằng hình thức nảy chồi từ vùng đỉnh phân sinh
nằm trong xoang ở vùng gốc cánh. Hình 1.3 thể hiện q trình sinh sản vơ tính bằng
hình thức nảy chồi của S. polyrrhiza.

Hình 1.3. Sinh sản vơ tính bằng hình thức nảy chồi ở S. polyrrhiza

Ở điều kiện tối ưu, tốc độ sinh sản vơ tính của bèo tấm gần đạt mức tăng theo
hàm số mũ. Lượng cánh bèo có thể tăng gấp đơi chỉ sau 24 giờ ni cấy ở các lồi
sinh trưởng nhanh như L. aequinoctialis, W. microscopica. Với hình thức sinh sản
vơ tính thì thời gian một vịng đời của cánh bèo chỉ vài tuần. Theo nhiều tác giả cho
biết, vòng đời của một cánh bèo phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi, ở 30 oC vịng đời giảm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6

một nửa so với ở 20oC. Trong giai đoạn ngủ, nghỉ và ở nhiệt độ thấp, cánh bèo có
thể tồn tại trong vài tháng. Điều kiện dinh dưỡng cũng có ảnh hưởng đến vòng đời
của cánh bèo. Sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng có thể làm cánh bèo già hố nhanh
và chết chỉ sau 1 đến 2 tuần. Có thể nói, vịng đời sẽ dài hơn khi tốc độ nhân lên của
cánh bèo nhỏ. Khi nồng độ dinh dưỡng giảm dưới ngưỡng tối thiểu thì cánh bèo bị
tổn thương và chết nhanh hơn bình thường [36].
1.1.4.2. Sinh sản hữu tính
Sinh sản hữu tính được thực hiện thơng qua sự ra hoa và tạo hạt tương tự như
các loài thực vật hạt kín khác. Với kích thước cánh bèo, hoa và hạt nhỏ bé, bèo tấm
được coi là loài thực vật hạt kín nhỏ bé nhất trong giới thực vật. Sinh sản hữu tính ở
bèo tấm bao gồm 2 giai đoạn: (i) Ra hoa và (ii) Tạo quả và hạt.
* Giai đoạn ra hoa: Cơ quan ra hoa ở bèo tấm L. aequinoctialis gồm các
thành phần: 1 lá bắc, 2 nhị hoa, 1 nhụy hoa. Ở Spirodela và Lemna, các cơ quan của
hoa phát sinh trong xoang phát sinh cánh con. Ở Wolffiella và Wolffia, hoa phát sinh
trong 1 xoang ở bề mặt trên của cánh bèo và không ở cung xoang phát sinh cánh
con. Hoa của Wolffia nằm dọc theo đường trung tâm cánh. Hoa của Wolffiella nằm
ở cạnh đường trung tâm của cánh [36].
* Giai đoạn tạo quả và hạt: Sau khoảng thời gian từ 2 đến 5 tuần tính từ lúc
thụ tinh thì quả chín. Mỗi quả có lá bao khơ và thường có 1 - 6 hạt. Ở hầu hết các
loài, quả gần như đối xứng ngoại trừ L. valdiviana và L. perpusilla. Quả thường dài
từ 0,35 mm đến 2,75 mm. Hạt bèo tấm có dạng hình trứng với 1 vảy đen ở đỉnh.
Khi quả có nhiều hơn 1 hạt thì quả có thể ở dạng hình trứng hoặc tam giác. Kích
thước hạt biến đổi trong cùng một loài và giữa các loài từ 0,3 – 2 mm về chiều dài
và 0,2 – 0,8 mm về đường kính. Hạt có vỏ hạt ngồi và vỏ hạt trong, nội nhũ và
phơi. Vỏ ngồi gồm 2 – 11 lớp tế bào của biểu bì ngồi, ở đỉnh có nhiều lớp tế bào
hơn ở giữa và cuối hạt [36].
1.1.5. Hệ gen của bèo tấm

Các nghiên cứu đối với hệ gen bèo tấm được tiến hành từ đầu những năm 80
của thế kỷ trước cho đến ngày nay. Các kết quả cho thấy, bộ gen bèo tấm giống với
bộ gen của thực vật nói chung, bao gồm gen nhân và gen ngồi nhân. Bộ gen của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7




bèo tấm có kích thước rất nhỏ, (lượng DNA trên 01 nhiễm sắc thể: 1C=0,6 pg
DNA) trong khi đó ở các loài thực vật khác như Triticum monococcum bộ gen lớn
hơn nhiều (1C=6,23 pg) [54]. Kích thước gen nhân của các loài bèo tấm là khác
nhau, nhỏ nhất ở Spirodela và lớn nhất ở Wolffia. Số lượng nhiễm sắc thể ở các loài
khác nhau cũng rất khác nhau từ 2n = 16 đến 2n = 126. Kích thước bộ gen của một
số loài bèo tấm so với các loài đối chứng được liệt kê trên bảng 1.1 [36].
Bảng 1.1. Kích thƣớc gen nhân của một số loài bèo tấm
Loài

2n

pg DNA

pg DNA /

pg DNA /

1C

chromsome

Spirodela polyrrhiza 7110

80

1.19 / 8C

0.15

0.015

Spirodela punctata 7461

46

1.48 / 4C

0.37

0.032

Lemna minor 7115

126

5.82 / 12C

0.49

0.046

Wolffiella oblonga 79 (7166)
Wolffia arrhiza 7347

42
42

3.02 / 4C
6.53 / 4C

0.76
1.63

0.072
0.155

Gen ngoài nhân của bèo tấm bao gồm gen lục lạp và gen ty thể. Gen lục lạp
(cpDNA) của bèo tấm là đối tượng được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Tháng 5
năm 2008, bộ gen lục lạp của Lemna minor đã giải trình tự hồn chỉnh. Bộ gen lục
lạp có cấu trúc mạch vịng bao gồm 165 955 bp mã hóa cho 112 gen (78 gen mã hóa
protein, 30 tRNA gen và 4 rRNA gen [42].
1.1.6. Giá trị dinh dƣỡng
Bèo tấm có chứa các chất dinh dưỡng với sự đa dạng về cả thành phần và
hàm lượng. Sinh khối bèo tấm có chứa các vitamin A, B1, B2… và các amino acid
không thay thế trừ methionine. Bèo tấm nuôi ở điều kiện tối ưu là một trong số các
loài thực vật cho hàm lượng protein tổng số đạt giá trị cao nhất. Hầu hết các lồi
bèo tấm có hàm lượng protein đạt từ 6,8 – 45% phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện
nuôi cấy [37]. Trong thời gian gần đây, đã có các nghiên cứu sử dụng bèo tấm như
là hệ thống sinh tổng hợp các chất thứ cấp, các sản phẩm mang lợi ích cho người

dân, các protein với hàm lượng lớn và hoạt tính sinh học cao…[38]. Các yếu tố ảnh
hưởng tới hàm lượng protein trong cánh bèo gồm có: ánh sáng, nhiệt độ, thành phần
và hàm lượng khống chất trong mơi trường ni (đặc biệt là nitơ). Thành phần và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8




hàm lượng các chất dinh dưỡng và các thành phần hữu cơ khác của bèo tấm được
liệt kê ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Thành phần và hàm lƣợng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo

Thành phần
Hàm lượng (% trọng lượng chất khô)
Proteins
6,8 – 45
Lipid
1,8 – 9,2
Sợi thô
5,7 – 16,2
Đường
14,1 – 43,6
Tro
12,0 – 27,6
1.1.7. Tiềm năng sử dụng bèo tấm trong cơng nghệ sinh học
Một trong những mục đích chủ yếu của công nghệ sinh học, đặc biệt là công
nghệ DNA tái tổ hợp là tạo ra các sản phẩm chuyển gen có giá trị thương mại cao.

Để có thể tiến hành ứng dụng công nghệ sinh học trong quy mơ sản xuất lớn, một
địi hỏi cấp thiết là cần phải có hệ thống tái sinh tốt với khả năng sinh trưởng và
phát triển nhanh, ổn định [13]. Cho đến nay, các nhà công nghệ sinh học phân tử đã
và đang sử dụng nhiều hệ thống sinh học bao gồm: vi khuẩn, nấm, các dịng tế bào
cơn trùng, thực vật, động vật có vú, virus của cơn trùng, của thực vật, các sinh vật
đa bào…Việc lựa chọn hệ thống sinh học phụ thuộc phần lớn vào sản lượng và chất
lượng thương phẩm. Hệ thống sinh học từ vi khuẩn có khả năng tạo ra protein với
hàm lượng cao nhưng hoạt tính của các protein thu được có một số hạn chế nhất
định. Các tế bào động vật bậc cao có khả năng cải biến tốt các protein sau dịch mã
nhưng lại tiềm ẩn các tác nhân gây bệnh có nguồn gốc virus do chúng là ký chủ cho
nhiều loại virus gây bệnh cho người và gia súc. Do đó nhiệm vụ của các nhà sinh
học phân tử là tìm ra được các hệ thống sản xuất protein khác đảm bảo các yêu cầu:
rẻ tiền, dễ sử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus.
Hệ thống đó là thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế
trong việc sản xuất protein tái tổ hợp. Trước hết phải kể đến khả năng glycoside hóa
các protein, bởi các glycoprotein là nhóm protein có vai trị quan trọng trong các
phản ứng miễn dịch. Lợi thế thứ hai là protein tạo thành từ thực vật tương đối an
tồn so với protein có nguồn gốc động vật bậc cao. Thứ ba là lợi thế về giá thành,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9




thực vật có thể trồng trên diện tích lớn với chi phí tối thiểu về phân bón, cơng chăm
sóc và nguyên liệu đầu vào.
Trong các loài thực vật được nghiên cứu để làm hệ thống tái sinh, các loài
thuộc họ bèo tấm đang được đặc biệt quan tâm với vòng đời ngắn và khả năng tăng

sinh khối nhanh. Bèo tấm có tốc độ sinh sản rất nhanh, nhân đơi trọng lượng trong
vòng 24 – 72 giờ. Một số giống bèo tấm có tốc độ tăng sinh khối cao hơn hẳn so với
các lồi thực vật khác. Đối với cây ngơ, từ 1 g chất khô ban đầu, sau một tuần
không thể tạo ra lượng chất khô lớn hơn 2,3 kg. Trong khi đó một số lồi bèo tấm
lại có thể tạo ra 64 g chất khô từ 1 g chất khô ban đầu sau 1 tuần [31], [50].
Mặt khác hàm lượng các chất dinh dưỡng của bèo tấm rất cao với sự đa dạng
về thành phần các vitamin (A, B1, B2…), các amino acid không thay thế. Riêng
protein của bèo tấm có thể đạt từ 6,8 – 45 % trọng lượng khơ tuỳ theo lồi [36], tức
là tỷ lệ tương đương với đậu tương. Theo tính tốn, chỉ cần 1 - 3 % tổng số protein
nói trên có hoạt tính sinh học quan tâm là đủ để bèo tấm được coi là hệ thống tái
sinh hiệu quả. Do những ưu điểm đó, trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên
cứu chuyển gen để sản xuất các hoạt chất sinh học từ bèo tấm. Các nhà khoa học
Mỹ, Israel, Pháp đã sử dụng các loài Lemna để chuyển các gen có giá trị kinh tế,
nhằm sản xuất các hoạt chất sinh học khác nhau trong đó có vacine. Quy trình
chuyển gen vào bèo tấm cũng tương tự như quy trình biến nạp gen ở một số loài
thực vật khác, tức là phải tạo vật liệu vô trùng trong ống nghiệm, tạo callus, sau đó
tái sinh callus đã chuyển gen thành cây hoàn chỉnh. Ngoài ra, các loài thuộc họ bèo
tấm cịn có khả năng chuyển gen sử dụng ngun cây mà không cần nuôi cấy mô và
vật liệu vô trùng. Tháng 10 năm 2004, chính phủ Pháp đã tài trợ để thành lập cơng
ty Lemnagene nhằm mục đích nghiên cứu ứng dụng bèo tấm đối với công nghệ sinh
học [68].
1.2. Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật
1.2.1 Cấu trúc gen sinh vật
Gen là một đoạn phân tử DNA, RNA, mang thông tin di truyền xác định cấu
trúc của một chuỗi polypeptide hoặc một phân tử RNA nhất định. Một gen có cấu
trúc điển hình gồm ba vùng chính: Vùng điều khiển, vùng mang mã di truyền và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10

vùng kết thúc. Vùng điều khiển có một số trình tự đặc hiệu điều khiển hoạt động
gen. Vùng mang mã chứa các thông tin di truyền, được phiên mã sang RNA thơng
tin (mRNA), gen cấu trúc có thể được dịch mã tạo ra sản phẩm là các protein. Vùng
kết thúc mang trình tự phân biệt giữa các gen, và các trình tự kết thúc quá trình
phiên mã. Cấu trúc gen còn bao gồm một số cấu trúc đặc thù nằm ở phía trước, phía
sau hoặc trong gen như các trình tự điều hòa, vùng tăng cường (enhanor), vùng bất
hoạt (silencer), vùng đệm (spacer)… [39]. Hình 1.4 là sơ đồ cấu trúc 1 gen điển
hình.

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc gen điển hình

1.2.2 Cấu trúc promoter
Gen cấu trúc có thể biểu hiện được thành protein cần sự có mặt của các trình
tự điều khiển thích hợp nằm ở những vị trí nhất định. Trình tự tham gia tích cực vào
q trình điều khiển biểu hiện gen là trình tự khởi động (promoter). Promoter bao
gồm trình tự nucleotide nằm ngược phía trên đầu 5’ so với vị trí khởi đầu phiên mã
gen (transcription start site – TSS), đóng vai trị điều khiển quá trình phiên mã nhờ
khả năng đảm bảo các vị trí nhận biết cho các protein tham gia vào việc điều khiển
biểu hiện gen như enzyme RNA polymerase, các nhân tố phiên mã (transcription
factor – TF). Tùy thuộc vào khoảng cách từ TSS, các thuật ngữ “promoter gần” hay
“promoter tối thiểu” (khoảng vài trăm nucleotide quanh vùng TSS) (proximal
promoter hay minimal promoter ) và “promoter xa” (hàng nghìn nucleotide ở phía
trên TSS) (distal promoter) có thể được sử dụng. Cả hai loại promoter gần và xa đều
chứa rất nhiều yếu tố tham gia vào quy trình phức tạp của các nhân tố điều hịa
phiên mã đặc hiệu tế bào, mơ, cơ quan, giai đoạn phát triển và môi trường [3], [53].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11




Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo promoter nhóm II ở sinh vật nhân chuẩn [69]

Về mặt cấu trúc, promoter có tổ chức phức tạp và chứa rất nhiều yếu tố đặc
trưng có chức năng bám/gắn với các nhân tố protein tham gia vào quá trình phiên
mã gen. Các nhân tố điều hòa (regulatory elements) nằm trên promoter và cùng một
sợi với vùng mang mã của gen được gọi các nhân tố Cis (cis elements) [16]. Mỗi
yếu tố được đặt tên dựa trên cơ sở trình tự nucleotide của chúng. Yếu tố cis cơ bản
nhất là hộp TATA (TATA box), được tìm thấy ở hầu hết các gen sinh vật nhân
chuẩn, nằm ở vị trí -30 (nằm về phía trước vị trí khởi đầu phiên mã (vị trí +1) 1
đoạn 30 nucleotide). Ở sinh vật nhân sơ, hộp TATA thường nằm ở quanh vị trí -10.
Ở sinh vật nhân chuẩn có các nhóm promoter tương ứng với ba loại enzyme RNA
polymerase I, II và III. Promoter nhóm II bao gồm các promoter của các gen hoạt
hoá cho sự phiên mã mRNA và một số loại small RNA, U1, U2, U3… Cấu tạo
promoter nhóm II có bốn thành phần: Tâm promoter, trình tự UP (upstream
element), trình tự khởi đầu Inr, trình tự dowstream element (DE). Tâm promoter
gồm các hộp TATA có vị trí từ -35 đến -25. Hộp TATA giúp RNA polymerase
nhóm II nhận biết và gắn chính xác vào vị trí khởi đầu phiên mã. Trình tự UP ở vị
trí trước TATA khoảng 25 bp, có chứa nhiều cặp G - C (hộp G - C) và trình tự
CCAAT (hộp CAT) là vị trí tiếp xúc đầu tiên của RNA polymerase. Trình tự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12

dowstream element (DE) ở vị trí khoảng 27 - 34 sau hộp TATA. Trình tự khởi đầu
(initiator - Inr) nằm giữa hộp TATA và trình tự DE.
1.2.3 Vai trị biểu hiện gen của promoter
Quá trình biểu hiện của một gen cấu trúc bao gồm: giai đoạn phiên mã, giai
đoạn dịch mã và giai đoạn cải biến sau dịch mã. Quá trình phiên mã (giai đoạn sơ
khai đầu tiên để biểu hiện một gen thành protein), chịu sự điều khiển của nhiều yếu
tố: promoter, các nhân tố phiên mã, các trình tự tăng cường, trình tự kết thúc…
[60]. Trong đó, đoạn promoter đóng vai trị chính trong q trình biểu hiện gen. Về
cơ bản, promoter đóng vai trị như một cơng tắc đóng mở gen. Tất cả các gen đều
cần có promoter để khởi động q trình biểu hiện. Promoter có rất nhiều module
khác nhau hoạt động như các cảm biến (sensor) và cho phép chúng có thể phản ứng
theo những cách mà đến nay chúng ta cũng chưa hoàn toàn hiểu rõ, đối với những
tín hiệu khác nhau từ những gen khác hoặc từ môi trường, định rõ khi nào thì khởi
động và khởi động ở đâu với cường độ và thời gian như thế nào. Trong những điều
kiện nhất định, promoter có thể khơng hoạt động và khi đó thì gen hồn tồn khơng
được khởi động. Nói chung, đối với một gen bình thường trong một sinh vật, vai trò
của promoter là cho phép gen hoạt động đúng trong các chu trình điều hồ hết sức
phức tạp. Promoter liên quan đến các gen thuộc từng sinh vật được thích ứng với
gen đó trong khi tồn bộ các gen của sinh vật được thích ứng để tồn tại và hoạt động
cùng nhau qua hàng triệu hay hàng trăm triệu năm.
1.2.4. Phân loại promoter
Promoter có thể được chia làm hai loại chính: Promoter khơng đặc hiệu hay
promoter cơ định (constituve promoter) và promoter đặc hiệu với các yếu tố cis
chuyên biệt (specific promoter) [3].
1.2.4.1. Prompter cơ định
Promoter cơ định tham gia điều khiển quá trình biểu hiện gen ở hầu hết các

loại mô khác nhau trong nhiều giai đoạn phát triển của sinh vật. CaMV35S
promoter điều khiển sự biểu hiện của RNA 35S được phân lập từ virus khảm súp lơ
(cauliflower mosaic virus – CaMV) là một ví dụ điển hình của loại promoter này.
Promoter này có cấu tạo gồm 3 bộ phận chính: Vùng trung tâm (hộp TATA có vị trí

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13




từ - 46 đến + 8) hai đoạn trình tự tăng cường (enhanor). Trong thời gian gần đây,
vai trò của các vùng khác nhau trên CaMV35S promoter trong việc gây bệnh của
CaMV đã được nghiên cứu [44].
Trong hệ thống các promoter cơ định, promoter ubiquitin đóng một vai trị
hết sức quan trọng. Năm 1992, Christensen và cộng sự đã phát hiện ra 8 đến 10
locus mã hoá cho ubiquitin ở cây ngơ. Cả hai gen đặc tính Ubi-1 và Ubi-2 đều chứa
một khung đọc mở bao gồm 1599 bp sắp xếp thành 7 chuỗi liên tiếp từ đầu đến cuối
với đoạn lặp lại có chiều dài 228 bp [22], [43]. Vùng điều chỉnh (regulatory region)
là vùng điều điều khiển quá trình biểu hiện gen Ubi-1 ở cây ngơ là đoạn trình tự bắt
đầu từ vị trí -899 bp từ đầu 5’ của vị trí khởi đầu phiên mã đến vị trí 1093 bp đầu 3’
của vị trí khởi đầu phiên mã. Trình tự vùng điều chỉnh có kích thước khoảng 2 kb
bao gồm:
 Hộp TATA nằm ở vị trí -30 về đầu 5’ so với vị trí khởi đầu phiên mã
 Hai đoạn trình tự trùng khớp (overlaping sequence) có liên quan đến các yếu
tố sốc nhiệt nằm ở vị trí -214 đến -204 so với vị trí khởi đầu phiên mã. Nhân
tố sốc nhiệt của vùng điều chỉnh làm tăng khả năng biểu hiện của ubiquitin
trong quá trình chống chịu lại với nhiệt độ
 Một đoạn trình tự exon khơng phiên mã có kích thước 83 bp nằm liền kề với

vị trí khởi đầu phiên mã
 Một đoạn trình tự intron kích thước khoảng 1 kb kéo dài từ vị trí +84 đến vị
trí +1093.

Hình 1.6. Cấu trúc hệ thống điều khiển Ubiquitin ở thực vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14




1.2.4.2. Promoter đặc hiệu
Sự biểu hiện đặc hiệu là sự biểu hiện các sản phẩm của gen giới hạn ở một
hoặc một vài mô hay một vài giai đoạn phát triển. Cần nhấn mạnh rằng khơng có
một promoter hồn tồn đặc hiệu: các promoter hoạt động bình thường ở một số mơ
nhất định trong khi ở các mơ khác thì không hoặc chỉ hoạt động yếu (sự biểu hiện
yếu). Trong số các promoter đặc hiệu, có nhóm promoter biểu hiện đặc hiệu mô
(tissue specific promoter), biểu hiện đặc hiệu về thời gian, biểu hiện cảm ứng với
môi trường (environmentally inducible promoter).
* Promoter đặc hiệu mô
Promoter đặc hiệu mô là những promoter chỉ điều khiển biểu hiện gen ở
những mô đặc hiệu, ví dụ promoter đặc hiệu bó mạch ở thực vật thì điều khiển biểu
hiện gen ở bó mạch. Promoter này chứa các trình tự đặc trưng của một promoter
như hộp TATA, hộp CCAAT… và các trình tự đặc hiệu quyết định sự biểu hiện gen
đặc hiệu bó mạch như hơp ASL, hộp GATA…[66]. Thuộc nhóm promoter này,
promoter điều khiển biểu hiện gen mã hoá sucrose synthase đặc hiệu ở bó mạch
được biết đến rộng rãi nhất .
* Promoter đặc hiệu cảm ứng

Trong điều kiện stress (khô hạn, nhiệt độ khắc nghiệt, oxy hoá cao…), các
gen chống chịu thường biểu hiện với tốc độ nhanh. Do đó, vấn đề khởi động sự
phiên mã cũng như cấu trúc promoter của chúng và các protein tham gia vào việc
điều khiển biểu hiện gen được đặc biệt chú ý. Promoter điều khiển biểu hiện gen
chống chịu có trình tự đặc trưng nGAAn gọi là HSE (heat shock element). Khi nhân
tố phiên mã HSF (heat shock transcription factor) – protein nội bào nhận biết được
HSE chúng sẽ hoạt hóa promoter để biểu hiện gen HS [8]. Promoter điều khiển biểu
hiện gen rbcS (ribulose – 1,5 – bisphosphate carboxylase small subunit) cảm ứng
ánh sáng ở nhóm cây hai lá mầm, chứa trên 30 vùng trình tự bảo thủ trong đó những
vùng cảm ứng ánh sáng là hộp G, hộp I, GT – 1 (hộp II)… Hộp G có trình tự đặc
trưng là CACGTG, hộp I có trình tự nhận biết là GATAAGR và trình tự ngược
chiều của nó – YCTATC cũng được chú ý đặc biệt. Đột biến xảy ra tại vùng này
làm giảm rõ rệt mức độ biểu hiện của gen rbcS khi có ánh sáng [63].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15




1.2.5. Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật
Promoter đóng vai trị quan trọng trong q trình chuyển gen nói chung và
chuyển gen ở thực vật nói riêng. Việc chuyển nạp gen ở các giống cây có ý nghĩa
kinh tế thường rất khó vì vậy, cần phải thử nghiệm tiềm năng biểu hiện của gen chỉ
thị chọn lọc với các promoter khác nhau. Nhiều promoter được dùng trong chuyển
gen thực vật đã được nghiên cứu và sử dụng có hiệu quả. Promoter 35S của virus
khảm CaMV hoặc FiMV và promoter NOS thường được sử dụng. Promoter 35S có
tiềm năng cao và thường được sử dụng nhiều trong các thiết kế vetor chuyển gen.
Các promoter cảm ứng có vai trị đối với quá trình biểu hiện các gen chuyển

nạp trong những điều kiện cảm ứng như các gen chống lại q trình oxi hóa giúp
cho cây chống lại các stress hiếu khí hay các gen kháng kháng sinh tạo ra do nhiệt
độ để chọn các đột biến trong việc tạo ra tín hiệu ở chu trình chuyển hố các chất
dưới tác dụng của nhiệt. Một số các promoter cảm ứng khác cũng được nghiên cứu
promoter sốc nóng [11], chuỗi khởi động cảm ứng nitrate từ gen nitrite reductase
[12] và các promoter cảm ứng hormone [65].
Do các mối quan tâm ngày càng nhiều về việc sử dụng thực vật như là hệ
thống mẫu để phát triển sinh học phân tử, nhiều gen và các chuỗi khởi động liên
quan được mô tả. Các gen này được thể hiện trong các loại mô hay trong các giai
đoạn phát triển khác nhau của cây như các gen thể hiện ở hạt phấn [9], ở hoa [59], ở
rễ [26] và ở thân [17].
Các nghiên cứu về gen ubiquitin ở thực vật đã phát hiện ra một số lượng lớn
các nhóm promoter có sự biểu hiện mạnh ở thực vật. Polyubiquitin promoter được
phân lập và xác định đặc tính từ cây ngơ [22], cây thuốc lá [48], Arabitalic [19], cây
hướng dương [15], khoai tây [28], cà chua [50], lúa [55], [61], mía đường [64] và
đậu tương [21]. Đa số các promoter này điều khiển ở mức độ cao hơn so với
promoter CaMV35S trong quá trình biểu hiện ở các loài thực vật chuyển gen. Do
gen Ubiquitin được biểu hiện ở hầu hết các mô thực vật trong điều kiện tự nhiên,
nên promoter ubiquitin đã được sử dụng để biểu hiện gen trong các loại thực vật
chuyển gen đặc biệt là giữa các loài gần gũi. Sự biểu hiện mạnh của promoter
ubiquitin được chi phối bởi sự xuất hiện của các đoạn intron, những đoạn chủ yếu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16