Nghiên cứu phương pháp lưu giữ và bảo quan in vitro giống khoai môn sọ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
********

PHẠM NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP LƢU TRỮ VÀ
BẢO QUẢN IN VITRO GIỐNG KHOAI MÔN –SỌ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Kỹ thuật Nông nghiệp
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS.Vũ Ngọc lan

HÀ NỘI, 2014

Phạm Ngọc Anh

K36C – Sinh KTNN


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
TS. Vũ Ngọc Lan giảng viên trƣờng Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội đã tận
tình hƣớng dẫn và truyền đạt cho tôi các phƣơng pháp nghiên cứu khoa học
và những kinh nghiệm học thật quý báu trong quá trình thực hiện khóa luận.
Đồng thời, tôi xin cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo trong khoa
Sinh – KTNN Trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Hà Nội 2, đã tạo điều kiện cho tôi
đƣợc tiếp thu những kiến thức chuyên môn về chuyên ngành Kĩ thuật Nông
nghiệp
Nhân dịp này, cũng cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng biết ơn tới những
ngƣời thân trong gia đình, bạn bè đã luôn cổ vũ, động viên và giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn.
Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng
nhƣng chắc chắn không thể tránh đƣợc những thiếu sót. Vì vậy, tôi kính mong
nhận đƣợc ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn.
Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 06 tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Phạm Ngọc Anh

Phạm Ngọc Anh

K36C – Sinh KTNN


LỜI CAM ĐOAN
Để đảm bảo tính trung thực của khóa luận tốt nghiệp, tôi xin cam đoan:
Khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu ph

ng ph p

u gi v

o qu n in vitro

gi ng ho i m n – sọ” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, thực hiện
dƣới sự hƣớng dẫn của TS.Vũ Ngọc Lan – Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội.
Các kết quả thu đƣợc trong luận văn là trung thực và chƣa từng công bố trong
bất kỳ nghiên cứu khoa học nào trƣớc đây.

Hà Nội, Ngày 06 tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Phạm Ngọc Anh

Phạm Ngọc Anh

K36C – Sinh KTNN


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

BA

: 6-Benzyladenine

BAP

: N6-Benzyl aminopurine

CT

: Công thức

DC

: Đối chứng

IAA

: Indole-3-acetic-acid

MS

: Murashige and Skoog

NAA

: Naphthalene acetic acid

PP333

: Paclobutrazol

TDZ

: Thiadiazuron

TE

: Dịch chiết khoai môn – sọ

TB

: Trung bình

B9

: Daminozide

Phạm Ngọc Anh

K36C – Sinh KTNN


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài .................................................................................... 1
2. Mục đích và mục tiêu ............................................................................. 2
2.1. Mục đích.......................................................................................... 2
2.2. Yêu cầu........................................................................................... 3
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài................................................. 3
3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................. 3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................. 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1. Giới thiệu chung về cây khoai môn – sọ (Colocasia esculenta) ........... 4
1.1.1. Nguồn gốc .................................................................................... 4
1.1.3. Phân bố ........................................................................................ 5
1.2. Các phƣơng pháp bảo tồn .................................................................... 7
1.3. Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ...................................... 8
1.3.1. Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ trên thế giới ........... 8
1.3.2. Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ tại Việt Nam ........ 11
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG ,VẬT LIỆU VÀ ............................................... 13
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 13
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................ 13
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................... 13
2.2.1. Địa điểm ..................................................................................... 13

2.2.2. Thời gian nghiên cứu .................................................................. 13
2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .......................................................... 13
2.3.1. Các trang thiết bị ......................................................................... 13
2.3.2. Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm ...................................... 14
2.4. Phƣơng pháp nội dung nghiên cứu..................................................... 16
2.5. Các chỉ tiêu theo dõi .......................................................................... 19
2.6. Phƣơng pháp xử lí số liệu .................................................................. 19
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 20
3.1. Ảnh hƣởng của HgCl2 đến khả năng tạo nguồn mẫu sạch
khoai môn – sọ in vitro ............................................................................. 20
3.2. Ảnh hƣởng của các nền môi trƣờng đến thời gian cấy chuyển cây khoai
môn – sọ in vitro....................................................................................... 21
Sau khi tiến hành thí nghiệm 2 chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau: .... 22
3.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng saccaroza đến thời gian cấy chuyển cây
khoai môn – sọ in vitro ............................................................................. 23
3.4. Ảnh hƣởng của các nồng độ NaCl đến thời gian cấy chuyển cây khoai
môn – sọ in vitro....................................................................................... 25
3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng saccaroza đến khả năng tạo củ khoai
môn – sọ in vitro....................................................................................... 27
Phạm Ngọc Anh

K36C – Sinh KTNN


3.6. Ảnh hƣởng của quang chu kì khác nhau đến khả năng tạo củ
khoai môn – sọ in vitro ............................................................................. 28
3.7. Ảnh hƣởng của chất kìm hãm sinh trƣởng đến khả năng hình thành củ
................................................................................................................. 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 33
MỘT SỐ HÌNH ẢNH .................................................................................. 35

Phạm Ngọc Anh

K36C – Sinh KTNN


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân bố khoai môn – sọ trên thế giới trong những năm gần đây ..... 6
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng ................... 20
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của các nền môi trƣờng đến thời gian cấy chuyển cây
khoai môn – sọ in vitro ................................................................................. 22
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng saccaroza đến thời gian cấy chuyển cây
khoai môn – sọ in vitro ................................................................................. 24
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của các nồng độ NaCl đến thời gian cấy
khoai môn – sọ in vitro ............................................................................... 26
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng đến khả năng hình thành củ trên
giống TH1 .................................................................................................... 27
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng hình thành củ
trên giống TH1 ............................................................................................. 29
Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của chất kìm hãm sinh trƣởng đến sự hình thành củ
trên giống TH1 ............................................................................................ 30

Phạm Ngọc Anh

K36C – Sinh KTNN


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Khoai môn, khoai sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) thuộc họ Ráy

(Araceae) có lịch sử trồng trọt lâu đời và giữ một vai trò quan trọng trong sản
xuất lƣơng thực ở những nƣớc nông nghiệp nghèo, chậm hoặc đang phát triển.
Đây là loại cây trồng lấy củ quan trọng, không chỉ là nguồn cây lƣơng thực
chính của các nƣớc ở quần đảo Thái Bình Dƣơng mà còn là nguồn lƣơng thực,
thực phẩm tại nhiều quốc gia trên thế giới tập trung ở Châu Phi, Tây Ấn Độ,
Nam Mỹ và Châu Á. Trên thế giới khoai môn – sọ xếp thứ 14 trong số các cây
trồng với khoảng 12 triệu tấn đƣợc sản xuất trên toàn cầu từ khoảng 2 triệu ha
với năng suất trung bình là 6,5 tấn/ha (FAOSTAR 2010).
Tuy nhiên, trong những năm gần đây, nhờ sự tiến bộ vƣợt bậc trong ngành
trồng lúa nƣớc nên không những đảm bảo an toàn lƣơng thực trong nƣớc mà
còn xuất khẩu ra nƣớc ngoài. Thực tế đã làm ảnh hƣởng không nhỏ đến sản
xuất cây có củ nói chung và cây khoai môn – sọ nói riêng ở nƣớc ta. Nguồn tài
nguyên cây khoai môn – sọ nƣớc ta đang dần dần bị lãng quên. Các giống địa
phƣơng đang dần biến mất một cách nhanh chóng trong khi các nghiên cứu di
truyền, chọn giống, bảo tồn nguồn gen đối với loại cây trồng này ở nƣớc ta còn
ít [2].
Mặt khác, diện tích trồng khoai môn – sọ giảm dần là do thoái hóa giống.
Các giống sử dụng bị nhiễm bệnh nhƣ bệnh sƣơng mai (P. colocasiae, P.
palmirora, P. citrophthora, P. capsici). Việc nhân giống và bảo tồn nguồn gen
các giống khoai môn – sọ đặc sản gặp rất nhiều khó khăn vì các giống địa
phƣơng cho năng suất không cao, thời gian sinh trƣởng dài và dễ bị sâu bệnh.
Nguồn giống thiếu là một trong những hạn chế lớn nhất để có thể trồng đại trà
với quy mô lớn [6].
Để hạn chế tác hại của bệnh, nguồn gen cây khoai môn – sọ đòi hỏi cần
phải có nguồn gen kháng bệnh phong phú và đa dạng di truyền trong vùng và

Phạm Ngọc Anh

1

K36C – Sinh KTNN


các vùng khác nhau, của nƣớc ta với các nƣớc khác. Việc mô tả và đánh giá đa
dạng di truyền quỹ gen cây khoai môn – sọ sẽ cung cấp một số thông tin cần
thiết về sự biến dị di truyền có ở các vât liệu nghiên cứu. Những thông tin thu
đƣợc sẽ đƣợc sử dụng hữu ích trong công tác chọn tạo giống khoai môn – sọ
mới.
Tại Việt Nam những nghiên cứu về sử dụng chỉ thị phân tử (RAPD và
SSR) để đánh giá đa dạng di truyền các giống khoai môn – sọ còn khiêm tốn,
mới chỉ có một dự án hợp tác của Trung tâm Tài nguyên thực vật đƣợc tiến
hành. Ứng dụng Công nghệ Sinh học, cụ thể sử dụng phƣơng pháp RAPD
trong phân tích các mẫu giống còn ít, hơn nữa việc ứng dụng phƣơng pháp
SSRs trong các thí nghiệm hầu nhƣ chƣa thực hiện. Việc nuôi cấy và giữ cây
khoai môn – sọ in vitro cũng đã gặp không ít những khó khăn, thời gian giữ
giống thấp nên tốn công sức cấy chuyển. Khi số lần cấy chuyển tăng lên
thƣờng rất dễ xảy ra các biến dị soma ảnh hƣởng không tốt cho việc bảo quản
giống. Ngoài ra kích thƣớc cây khoai môn – sọ in vitro khá lớn cũng đã gây ra
những khó khăn nhất định khi cấy chuyển chúng. Việc bảo tồn và lƣu giữ
nguồn gen trong nuôi cấy in vitro ngày càng đƣợc quan tâm.
Khoai môn – sọ là cây cho thu củ, củ là thực phẩm cũng là nguyên liệu
cung cấp cho ngành dƣợc đồng thời củ cũng là hình thức để giống phổ biến,
chính vì vậy củ thuộc loại giàu dinh dƣỡng, nên rất khó lƣu giữ, nhất là trong
bảo quản củ làm giống. Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên chúng tôi tiến
hành đề tài: “Nghiên cứu ph

ng ph p

u gi v

o qu n in vitro gi ng

khoai môn – sọ ”.
2. Mục đích và mục tiêu
2.1. Mục đích
Xác định đƣợc phƣơng pháp khử trùng mẫu đạt hiệu quả cao nhất và ảnh
hƣởng của một số chất điều tiết sinh trƣởng tự nhiên đến giai đoạn nuôi cấy lƣu
giữ và bảo quản in vitro giống khoai môn – sọ.

Phạm Ngọc Anh

2

K36C – Sinh KTNN


2.2. Yêu cầu
- Xác định phƣơng pháp khử trùng mẫu đạt hiệu quả cao nhất, tạo ra số
lƣợng lớn nguồn vật liệu ban đầu phục vụ các nghiên cứu tiếp theo đối với
giống khoai môn – sọ.
- Xác định ảnh hƣởng của một số chất điều tiết sinh trƣởng tự nhiên đến
giai đoạn nuôi cấy lƣu giữ và bảo quản in vitro giống khoai môn – sọ.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp một số cơ sở lý thuyết cho lƣu trữ, bảo quản in vitro loài
khoai môn – sọ.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Bổ sung cơ sở để lƣu trữ, bảo quản giống khoai môn – sọ cung cấp
nguồn củ giống chất lƣợng cao và số lƣợng lớn cho sản xuất đại trà.

Phạm Ngọc Anh

3

K36C – Sinh KTNN


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây khoai môn – sọ (Colocasia esculenta)
1.1.1. Nguồn gốc
Cây khoai môn – sọ (Colocasia esculenta) là cây Một lá mầm thuộc chi
Colocasia, họ Araceae (họ Ráy).
Các bằng chứng phân loại thực vật cho thấy rằng khoai môn – sọ có
nguồn gốc ở Nam Trung Á, có lẽ ở Ấn Độ hoặc bán đảo Mã Lai. Dạng hoang
dại phát sinh ở các vùng khác nhau của Đông Nam Á (Purseglove, 1972). Gần
đây nhiều tác giả đều thống nhất rằng rất nhiều dạng hoang dại và dạng trồng
của cây khoai môn – sọ có nguồn gốc tại các dải đất kéo dài từ Đông Nam Ấn
Độ và Đông Nam Á tới Papua New Guuinea và Melanesia (Kuruvilla và Singh,
1981; Matthew, 1995; Lebot, 1999). Từ châu Á, khoai môn sọ lan rộng về phía
tây tới Ả Rập Saudi và vùng Địa Trung Hải.
1.1.2. Phân loại
Trong hệ thống phân loại thực vât, loài khoai môn – sọ có vị trí phân loại sau :
Giới

:

Thực vât (Plantae)

Ngành

:

Thực vât hạt kín (Magnoliophyta)

Lớp

:

Một lá mầm (Monocotyledoneae )

Phân lớp

:

Cau (Arecidae)

Bộ

:

Trạch tả (Alismatales)

Họ

:

Ráy (Araceace)

Phân họ

:

Aroideae

Chi

:

Khoai môn (Colocasia)

Loài

:

Colocasia esculenta

Phạm Ngọc Anh

4

K36C – Sinh KTNN


Cây khoai môn – sọ thuộc chi Colocasia là một trong những chi quan
trọng nhất trong họ ráy (Araceae). Do có lịch sử dài lâu nhân giống vô tính nên
hiện nay vấn đề phân loại thực vật, còn có nhiều điểm chƣa rõ ràng.
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều các giống môn – sọ với nhiều biến
dạng thực vật, tuy nhiên hầu hết các giống đều thuộc hai nhóm chính:
• Colocasia esculenta (L.) Schott var. esculenta đƣợc mô tả là cây có
một củ cái chính to hình trụ và rất ít củ con thƣờng đƣợc gọi là dạng dasheen.

Ở loài này có hai nhóm là nhóm khoai nƣớc (chịu ngập úng) và nhóm khoai
môn (sử dụng củ cái và trồng trên đất cao). Hai nhóm này sử dụng củ cái để ăn,
củ con để làm giống và dọc lá để chăn nuôi. Hầu hết các giống thuộc loài phụ
có bộ nhiễm sắc thể 2n = 28 đƣợc gọi là loại "dasheen" của khoai môn.
• Colocasia esculenta (L.) Schott var. antiquorum đƣợc phân biệt là có
một củ cái nhỏ hình cầu với nhiều củ con mọc ra từ củ cái, thƣờng đƣợc gọi là
dạng eddoe. Thuộc loài phụ này chủ yếu là nhóm cây khoai sọ. Nhóm khoai sọ
phân bố rộng có thể trồng trên ruộng lúa nƣớc hoặc trên đất bằng phẳng có tƣới
nƣớc. Hầu hết các giống thuộc phần phụ này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n = 48,
thƣờng đƣợc gọi là dạng tam bội.
Ngoài ra còn có 1 nhóm mang đặc tính trung gian giữa 2 nhóm kể trên.
Chính vì vậy gọi nhóm cây khoai môn – sọ là chính xác nhất.
1.1.3. Phân bố
Khoai môn – sọ là cây có khả năng thích nghi cao với điều kiện ngoại
cảnh và có khả năng sống chịu đƣợc với điều kiện bất thuận .Do đó chúng đƣợc
phân bố khá rộng rãi. Chúng đƣợc trồng phổ biến ở khắp các vùng nhiệt đới
cũng nhƣ ôn đới ấm áp. Trong nhiều nƣớc, đặc biệt ở Châu Á – Thái Bình
Dƣơng. Ngày nay khoai môn – sọ đƣợc phân bố và trồng chủ yếu ở các vùng
nhiệt đới. Tỉ lệ canh tác cao và đóng góp của khoai môn – sọ vào chế độ ăn của
ngƣời dân cao nhất tại quần đảo Thái Bình Dƣơng. Tuy nhiên, diện tích canh
tác lớn nhất lại là tại vùng Tây Phi, do đó chiếm sản lƣợng lớn nhất.

Phạm Ngọc Anh

5

K36C – Sinh KTNN


Bảng 1.1: Phân bố khoai môn – sọ trên thế giới trong những năm gần đây

Toàn
Châu
Năm thế
Phi
giới

Bắc +
Trung
Mỹ

Châu
Á

Châu
Đại
Dƣơng

1998 0,381 0,207 0,0016 0,00076 0,131

0,042

Diện tích

1999 1,421 1,247 0,0018 0,00076 0,130

0,041

(triệu ha)

2000 1,450 1,276 0,0018 0,00076 0,129

0,042

2001 1,463 1,291 0,0018 0,00076 0,127

0,042

Châu
lục

Nam
Mỹ

Châu
Âu

Không

1998

6,30

5,42

10,08

5,4

14,5

5,9

Năng suất 1999
(tấn/ha) 2000

6,23

5,35

10,12

5,4

14,5

6,4

6,12

5,22

10,23

5,4

14,9

6,3

môn –

2001

6,13

5,23

10,13

5,4

15,1

6,5

sọ

0,0041

1,900

0,247

Sản lƣợng 1999 8,855 6,672 0,0182 0,0041
(triệu tấn) 2000 8,878 6,662 0,0185 0,0041

1,899

0,261

1,928

0,265

2001 8,974 6,756 0,0183 0,0041

1,923

0,273

1998 8,706 6,538 0,0161

trồng
khoai

Nguồn FAO 2001
Cũng theo số liệu của FAO tính đến năm 2004 nƣớc có diện tích trồng
khoai môn - sọ lớn nhất là Trung Quốc: 86,881ha, tiếp đến là Nigeria:
59,400ha. Về năng suất, Châu Á có năng suất bình quân cao nhất là
15,1tấn/ha, còn Châu Phi có năng suất thấp nhất 5,23 tấn/ha. Quốc gia trồng
khoai môn - sọ có năng suất cao nhất là Cyprus đạt tới 27,4 tấn/ha, nƣớc trồng
có năng suất thấp nhất là Togo chỉ đạt 1,2 tấn/ha.
Năm 2005, tổng sản lƣợng khoai môn – sọ trên thế giới đạt 9,2 triệu
tấn. Trong đó, nƣớc có sản lƣợng khoai môn – sọ lớn nhất là Nigeria với
sản lƣợng đạt 4,0 triệu tấn. Tiếp sau đó là Ghana 1,8 triệu tấn, China 1,6
triêu tấn (FAO, 2005).

Phạm Ngọc Anh

6

K36C – Sinh KTNN


Ở Việt Nam, khoai môn – sọ đƣợc thuần hóa sớm, đặc biệt là khoai môn
nƣớc đƣợc thuần hóa trƣớc cả cây lúa (cách đây khoảng 10000 – 15000 năm).
Khoai môn – sọ đƣợc phân bố ở tất cả các vùng sinh thái và nó đã gắn liền với
đời sống văn hóa, phong tục tập quán của mỗi địa phƣơng. Tuy nhiên những
vùng có sự phân bố lớn của khoai môn – sọ là: Cao Bằng, Lạng Sơn, Sơn La,
Lai Châu, Quảng Ninh và Quảng Trị.
1.2. Các phƣơng pháp bảo tồn
Công tác bảo tồn nguồn gen khoai môn – sọ trên thế giới có từ lâu nhƣng
chỉ đƣợc quan tâm chú ý nhiều bắt đầu từ những năm 1990 tới nay. Bảo quản,
lƣu giữ chủ yếu là bảo quản Exsitu dƣới dạng tập đoàn nguồn gen trên đồng
ruộng, trồng trong chậu vại tại các cơ quan nghiên cứu [4].
Ngoài phƣơng pháp bảo quản và nhân giống trên đồng ruộng, các nhà
khoa học còn tiến hành sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy mô để nhân giống và
bảo quản nguồn gen cây khoai môn – sọ. Đây là biện pháp lƣu giữ những
nguồn gen miền núi hoặc các dạng hoang dại khó lƣu giữ trên đồng ruộng.
Hiện nay, phƣơng pháp nuôi cấy mô đƣợc xem nhƣ là một công cụ quan
trọng để nhân giống sạch bệnh, bảo quản dài hạn nguồn gen và cũng là phƣơng
tiện để trao đổi giống đối với những cây nhân giống vô tính trong đó có
khoai môn – sọ. Ở Solomons, ngƣời ta dùng chồi đỉnh của cây khoai làm thực
liệu nuôi cấy mô để nhân giống sạch bệnh và bảo quản dài hạn (Jackson, 1979).
Hartman (1974) đã loại trừ bệnh khảm virus (DMV) bằng nuôi cấy mô
phân sinh ở đỉnh của cây trên môi trƣờng MS (Murashige và Skoog, 1962)
đƣợc bổ sung KIN (1,0mg/l) và IAA (10mg/l); Starisky và cs, (1986) đã sử
dụng môi trƣờng MS giảm một nửa nồng độ và đƣợc bổ sung 1g/lKNO3,
10mg/l thiamine, 50mg/l cysteine HCl, 100mg/l inositol, 100mg/l casein
hydrolysate, 30g/l succarosa, 0,5% agar (Oxoid), 5mg/l BAP và 0,5mg/l IBA;

với chế độ chiếu sáng 12 giờ trong 1 ngày đêm, nhiệt độ đƣợc duy trì 280C vào
ban ngày và 240C vào ban đêm, đã nuôi cấy rất thành công mô phân sinh của

Phạm Ngọc Anh

7

K36C – Sinh KTNN


cây khoai môn – sọ và các cây khác trong các chi khác thuộc họ ráy (Araceae)
nhƣ Xanthoxoma, Alocasia… (Strauss and Arditti, 1980; Krikorian, 1994). Ở
Hawai và Samoa, ngƣời ta dùng cả chồi đỉnh và chồi bên của giống khoai
thuộc nhóm C. esculenta var. esculenta để nuôi cấy và nhân giống trên môi
trƣờng nƣớc dừa và MS đƣợc bổ sung Adenine hoặc BAP và 2IP [1].
Một số tác giả đã đề cập đến tận dụng khả năng ra hoa, kết hạt để có thể
làm giàu nguồn gen và có hạt giống tiến tới bảo quản trong ngân hàng gen hạt
(Hirai, 1989).
Từ năm 2001, Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật bắt đầu nghiên
cứu bảo tồn Insitu cho nguồn gen cây có củ này. Nguồn gen khoai môn – sọ
đƣợc bảo tồn khá tốt trong các vƣờn gia đình và tại một số vùng có truyền
thống sản xuất khoai môn – sọ nhƣ huyện Yên Thuỷ và Đà Bắc tỉnh Hoà Bình,
huyện Nho Quan tỉnh Ninh Bình, huyện Thuận Châu tỉnh Sơn La, huyện Tràng
Định tỉnh Lạng Sơn và huyện Thạch An tỉnh Cao Bằng…[5].
1.3. Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ
1.3.1. Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ trên thế giới
Để tiến hành nuôi cấy khoai môn – sọ, ngƣời ta thƣờng sử dụng củ khoai
môn – sọ để làm mẫu. Củ khoai môn – sọ là bộ phận sử dụng chủ yếu, chúng
nằm trong đất nên thƣờng dễ bị nấm bệnh tấn công. Cũng chính vì vậy việc vào
mẫu nuôi cấy cũng đã gặp không ít khó khăn. S. Seetohul và D. Puchooa đã

tiến hành các thí nghiện vào mẫu với các chế độ khử trùng khác nhau: Đầu tiên,
chồi và mắt ngủ đƣợc rửa sạch dƣới vòi nƣớc. Tiếp đến đƣợc khử trùng bằng
dung dịch benlate 0,06% trong 15 phút. Sau đó các mẫu này đƣợc đƣa vào khử
trùng trong dung dịch NaClO với 4 nồng độ khác nhau: 1%; 1,5%; 2%; 2,5%
cùng với 100 ml Tween 20 trong thời gian 15 phút. Các mẫu này sau khi khử
trùng đƣợc rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng. Kết quả cho thấy khử trùng
mẫu tốt nhất là ở nồng độ NaClO 2%, ở chế độ khử trùng này cho tỷ lệ mẫu
sống, bật chồi cao nhất và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất.

Phạm Ngọc Anh

8

K36C – Sinh KTNN


Sau khi khử trùng, các chồi, mắt ngủ đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS
có bổ sung IAA với các nồng độ khác nhau là: 0 mg/l; 10 mg/l; 15 mg/l; 20
mg/l; 25 mg/l. Các tác giả cũng đã đi đến kết luận rằng môi trƣờng cho số lá và
rễ nhiều nhất là môi trƣờng MS + 10 mg/l IAA.
- Tác giả H. Chand và cộng sự (1999) đã tiến hành nhân nhanh in vitro
khoai môn – sọ trên môi trƣờng MS có bổ sung chất điều tiết sinh trƣởng là BA
và TDZ. Mẫu cấy sử dụng trong thí nghiệm là đỉnh chồi và mắt ngủ. Sau khi
khử trùng, mẫu cấy đƣợc cắt với kích thƣớc 5 – 10 mm, sâu 5 mm đối với mắt
ngủ và 15 – 30 mm đối với đỉnh chồi, cấy mẫu trên môi trƣờng : MS + 30 g/l
saccarose + 150 ml/l nƣớc dừa. Sau đó khảo sát sự nhân nhanh trên các môi
trƣờng:
MS + BA (0; 0,03; 0,13; 0,63; 1,13; 2 mg/l)
MS + TDZ (0; 0,03; 0,13; 0,63; 1,13; 2 mg/l)
Với cách bố trí thí nghiệm với 5 mẫu/CT, chồi xuất hiện sau 4 tuần vào

mẫu ở các nồng độ từ 0,13 – 1,13 mg/l. Trong đó công thức thí nghiệm với BA
hệ số nhân cao nhất ở nồng độ 1,13 mg/l. Sau 12 tuần nuôi cấy hệ số nhân cao
nhất thu đƣợc ở thí nghiệm với BA và TDZ đều là ở nồng độ 1,13 mg/l. Sau
khi tổng kết thí nghiệm tác giả đã tìm ra môi trƣờng nhân nhanh thích hợp là:
MS + 1 mg/l BA với hệ số nhân là 4,5 lần
MS + 1 mg/l TDZ với hệ số nhân là 25 lần sau 20 tuần nuôi cấy
Theo tác giả thì khi nuôi cấy trên môi trƣờng TDZ tuy hệ số nhân cao hơn
trên môi trƣờng BA nhƣng chồi nhỏ và yếu hơn[13].
Trong trƣờng hợp protocol (Deo et al. (2009)) tạo từ lát củ nuôi cấy
in vitro trên môi trƣờng MS có 2,0 mg/l 2,4-D trong khoảng 20 ngày ở điều
kiện tối, sau đó cấy chuyển sang môi trƣờng MS với 1,0 mg/l TDZ đặt ở trong
tối. Chồi callus hình thành sau 75 ngày và tiếp tục nuôi cấy đến 100 ngày. Sử
dụng môi trƣờng có 1 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l TDZ đã hình thành chồi callus
nhƣng tần số thấp hơn so với môi trƣờng chứa 2 mg/l 2,4-D và 1 mg/l TDZ.

Phạm Ngọc Anh

9

K36C – Sinh KTNN


Nồng độ các chất trên có thể khác nhau giữa các loại khoai môn – sọ. Chồi
Callus đƣợc hình thành trong môi trƣờng MS có cả 2 loại hormone: 0,5 mg/l
2,4-D, 1 mg/l TDZ, 800 mg/l glutamine rồi chuyển tới môi trƣờng nửa MS, nó
phân hóa tạo phôi [12].
Năm 2010, Deo Pradeep C và cộng sự đã nghiên cứu và đƣa ra kết luận
rằng: Việc tạo phôi vô tính từ callus đƣợc cảm ứng bằng cách nuôi cấy lát cắt
mỏng của củ Khoai môn - sọ trong môi trƣờng MS rắn hoặc bán rắn có chứa 2
mg/l 2,4-D trong 20 ngày rồi chuyển sang môi trƣờng chứa 1 mg/l TDZ.

Callus đƣợc cấy chuyển nhân lên trong môi trƣờng rắn chứa 1 mg/l TDZ, 0,5
mg/l 2,4-D và 800 mg/l glutamine trƣớc khi đƣợc chuyển sang môi trƣờng
lỏng với thành phần nhƣ trên nhƣng nồng độ của glutamine là 100 mg/l. Sau 3
tháng nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng lắc, tập hợp các tế bào đậm đặc đƣợc
hình thành. Phôi vô tính đƣợc cảm ứng từ nuôi cấy huyền phù tế bào ở môi
trƣờng rắn bổ sung 0,1 mg/l TDZ, 0,05 mg/l 2,4-D, 40 - 50 g/l sucrose, 1 mg/l
biotin. Phôi thành thục và nảy mầm sau khi đƣợc nuôi trong môi trƣờng chứa
0.05 mg/l BA, 0.1 mg/l IAA [12].
Theo dự án bảo tồn in vitro nguồn gen khoai môn – sọ của FAO, nguồn
gen khoai môn – sọ đƣợc bảo tồn in vitro trên môi trƣờng cơ bản: MS + 1 mg/l
BA + 0,2 mg/l α NAA (pH: 5,5 – 5,8). Ngoài ra việc bảo tồn in vitro
khoai môn – sọ còn đƣợc tiến hành trên các môi trƣờng khác là:
MS + 0,005 mg/l TDZ
MS +0,025 mg/l TDZ
MS + 0,05 mg/l TDZ
MS + 0,8 mg/l BA
Trong nghiên cứu về vấn đề bảo tồn nguồn gen khoai môn – sọ của
Hiroko Takagi và cộng sự (2005) thì việc bảo tồn in vitro đƣợc tiến hành trên
môi trƣờng có hàm lƣợng đƣờng cao: MS + 120 g/l saccarose.

Phạm Ngọc Anh

10

K36C – Sinh KTNN


1.3.2. Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ tại Việt Nam
Đối với nƣớc ta việc nghiên cứu nhân giống cây khoai môn – sọ bằng
công nghệ tế bào hiện nay còn chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều. Tuy nhiên, trong

những năm gần đây do nhận thấy giá trị của cây khoai môn – sọ mà vấn đề
nghiên cứu nhân nhanh đang nhận đƣợc sự quan tâm rất lớn. Đã có nhiều các
công trình nghiên cứu với các kết quả công bố về bƣớc đầu trong nhân giống
khoai môn – sọ bằng nuôi cấy mô tế bào: Công trình nghiên cứu của Phân Viện
sinh học Đà Lạt (2003)…
Để phục tráng giống và làm sạch bệnh của các dòng, giống
khoai môn – sọ bị thoái hóa hoặc bị nhiễm bệnh, Nguyễn Thị Ngọc Huệ và
Đinh Thế Lộc đã sử dụng phƣơng pháp nhân giống in vitro [4]. Các mô phân
sinh từ chồi bên của củ cái sau khi đƣợc khử trùng bằng thủy ngân (HgCl2)
đƣợc đƣa vào môi trƣờng MS có bổ sung 10mg/l IAA. Sau khi mô phân sinh
tạo chồi, chúng đƣợc cây chuyển sang môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l αNAA để
tạo rễ. Cá cây này đƣợc đem trồng vào khay 1 tháng trƣớc khi đem ra trồng
trên đồng ruộng.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của việc bổ sung các chất điều tiết sinh trƣởng và
hiệu quả khi kết hợp chúng với nhau, tại Phân Viện Sinh học Đà Lạt, Dƣơng
Tấn Nhựt và cộng sự (2003) đã tìm ra môi trƣờng nhân nhanh thích hợp nhất là
môi trƣờng MS + 2mg/l BA + 0/5mg/l IAA + 3% saccaroza. Môi trƣờng ra rễ
thích hợp nhất là MS + 0/1mg/l BA + 1% saccaroza [11].
Để mở rộng diện tích trồng khoai môn – sọ thì việc cung cấp đủ lƣợng
giống là điều cần thiết. Do đó quá trình nhân giống khoai môn – sọ in vitro cần
có đƣợc môi trƣờng nhân nhân nhanh tối ƣu làm tăng hệ số nhân của
khoai môn – sọ. Năm 2008, Nguyễn Thị Loan đã nghiên cứu ảnh hƣởng của
nồng độ TDZ đến hệ số nhân của khoai môn – sọ. Mẫu đƣợc cấy trong môi
trƣờng MS có bổ sung TDZ với các nồng độ khác nhau: 0,5mg/l, 1mg/l,
1,5mg/l, 2mg/l. Tác giả đi đến kết luận: TDZ là chất điều tiết sinh trƣởng cho

Phạm Ngọc Anh

11

K36C – Sinh KTNN


hệ số nhân giống môn sọ tốt nhất, với nồng độ TDZ là 1,5mg/l, hệ số nhân môn
– sọ có thể đạt 16,1 lần sau 10 tuần nuôi cấy đối với giống khoai – sọ Hoà
Bình, 18,6 lần đối với giống khoai môn tím và 14,3 lần đối với giống khoai sọ
vàng.

Phạm Ngọc Anh

12

K36C – Sinh KTNN


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG ,VẬT LIỆU VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nghiên cứu trên giống khoai sọ trắng (kí hiệu: TH1, nguồn thu thập: Bắc
Giang).
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm
Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh lý thực vật khoa Nông học trƣờng Đại học
Nông Nghiệp Hà Nội.
2.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 5/2013-12/2013.
2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
2.3.1. Các trang thiết bị
* Phòng chuẩn bị môi trƣờng:
- Nồi hấp: Hấp sấy vô trùng môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy.

- Tủ sấy: Để khô các dụng cụ.
- Cân phân tích: Để cân các loại hóa chất.
- Cân kỹ thuật: Cân agar, đƣờng.
- Tủ lạnh: Bảo quản các hóa chất và môi trƣờng.
- Bếp gas: Đun hóa chất.
- Máy đo pH.
- Các loại hóa chất, vật tƣ sử dụng trong nuôi cấy mô.
* Phòng cấy:
- Tủ cấy vô trùng.
- Đèn cực tím.
- Các dụng cụ cấy nhƣ: dao, kéo, panh, đèn cồn...
- Giá, bàn để môi trƣờng và mẫu cấy.
* Phòng nuôi cây:

Phạm Ngọc Anh

13

K36C – Sinh KTNN


- Máy điều hòa nhiệt độ, nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 ± 20C.
- Nhiệt kế đo nhiệt độ phòng nuôi.
- Ẩm kế đo độ ẩm phòng nuôi.
- Gía lắp đèn huỳnh quang dài 1,2m.
2.3.2. Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm
Môi trƣờng MS (Murashige and Skoog) gồm các thành phần sau:
Hóa chất

Khối lƣợng

Đơn vị

- NH4NO3

33,00

g/l

- KNO3

38,00

g/l

10,00

g/l

- KH2PO4

3,40

g/l

- CaCl2

6,60

g/l

- H3BO3

620,00

mg/l

- ZnSO4.7H2O

860,00

mg/l

- MnSO4.4H2O

2230,00

mg/l

- KI

83,00

mg/l

- Na2MoO4.2H2O

25,00

mg/l

- CuSO4.5H2O

2,50

mg/l

- CoCl2.6H2O

2,50

mg/l

- Thiamine (B1)

20,00

mg/l

- Pyridoxine (B6)

100,00

mg/l

- Nicotinic acid (B5)

100,00

mg/l

- Glicine

100,00

mg/l

- FeSO4.7H2O

5,56

g/l

- Na2EDTA.2H2O

7,46

g/l

* Nguyên tố đa lƣợng : - MgSO4.7H2O

* Nguyên tố vi lƣợng:

* Vitamin:

* FeEDTA

Phạm Ngọc Anh

14

K36C – Sinh KTNN


Môi trƣờng White gồm các thành phần sau:
Hóa chất

* Nguyên tố đa lƣợng :

* Nguyên tố vi lƣợng:

* Vitamin:

Phạm Ngọc Anh

Khối lƣợng

Đơn vị

-Ca(NO3)2.4H2O

288,00

mg/l

- KNO3

80,00

mg/l

- MgSO4.7H2O

737,00

mg/l

- KCl

65,00

mg/l

- NaH2PO4

16,50

mg/l

- Na2SO4

200,00

mg/l

- H3BO3

1,50

mg/l

- ZnSO4.7H2O

2,67

mg/l

- MnSO4.2H2O

5,04

mg/l

- KI

0,75

mg/l

- NaMoO3

0,001

mg/l

- CuSO4.5H2O

0,01

mg/l

- Fe2(SO4)3

2,50

mg/l

- Thiamine (B1)

0,10

mg/l

- Pyridoxine (B6)

0,10

mg/l

- Nicotinic acid (B5)

0,50

mg/l

- Glicine

3,00

mg/l

15

K36C – Sinh KTNN


Môi trƣờng B5 gồm các thành phần sau:
Hóa chất

* Nguyên tố đa lƣợng :

* Nguyên tố vi lƣợng:

* Vitamin:

Khối lƣợng

Đơn vị

- (NH4)2SO4

134,00

mg/l

- KNO3

2500,00

mg/l

- MgSO4.7H2O

250,00

mg/l

- NaH2PO4

130,50

mg/l

- CaCl2

150,00

mg/l

- H3BO3

3,00

mg/l

- ZnSO4.7H2O

2,00

mg/l

- MnSO4.4H2O

10,00

mg/l

- KI

0,75

mg/l

- Na2MoO4.2H2O

0,25

mg/l

- CuSO4.5H2O

0,025

mg/l

- CoCl2.6H2O

0,025

mg/l

- Na2EDTA.2H2O

37,30

mg/l

- FeSO4.7H2O

27,80

mg/l

- Thiamine (B1)

10,00

mg/l

- Pyridoxine HCl

0,10

mg/l

- Nicotinic acid (B5)

1,00

mg/l

100,00

mg/l

- Myo-Inositol
2.4. Phƣơng pháp nội dung nghiên cứu

Tiến hành 7 thí nghiệm theo dõi và thu thập số liệu, tổng kết đánh giá
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 đến khả năng tạo nguồn
mẫu sạch khoai môn – sọ in vitro.
Vật liệu khởi đầu để tiến hành thí nghiệm là củ giống khoai sọ trắng với
5 công thức sau:

Phạm Ngọc Anh

16

K36C – Sinh KTNN


CT1: HgCl2 0,1% trong 5 phút.
CT2: HgCl2 0,1% trong 7 phút.
CT3: HgCl2 0,1% trong 9 phút.
CT4: Khử trùng kép HgCl2 0,1% lần 1 trong 7 phút, lần 2 trong 1 phút.
CT5: Khử trùng kép HgCl2 0,1% lần 1 trong 7 phút, lần 2 trong 3 phút.
Mỗi công thức đƣợc tiến hành với 10 bình mỗi bình 01 mẫu cấy.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các nền môi trường đến thời
gian cấy chuyển cây khoai môn – sọ in vitro.
Bố trí thí nghiệm trên giống TH1 với các loại nền môi trƣờng đƣợc bổ

sung + 20g/l Saccaroza + 6g/l agar với các công thức nhƣ sau:
CT1: MS.
CT2: B5.
CT3: White.
Mỗi công thức thí nghiệm đƣợc tiến hành làm với 3 lần nhắc lại, mỗi
lần 10 bình mỗi bình 1 cây.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza đến thời
gian cấy chuyển cây khoai môn – sọ in vitro.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên giống TH1 với các loại nền môi
trƣờng đƣợc bổ sung 20g/l saccaroza + 6g/l agar với các công thức nhƣ sau:
CT1: MS+ 20g/l saccaroza.
CT2: MS+ 30g/l saccaroza.
CT3: MS+ 40g/l saccaroza.
Mỗi công thức thí nghiệm đƣợc tiến hành làm với 3 lần nhắc lại, mỗi
lần 10 bình mỗi bình 1 cây.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ NaCl đến thời gian
cấy chuyển cây khoai môn – sọ in vitro.
Với mục đích bảo quản nguồn giống khoai môn – sọ bằng phƣơng pháp
duy trì sinh trƣởng chậm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu bổ sung NaCl vào

Phạm Ngọc Anh

17

K36C – Sinh KTNN


môi trƣờng nuôi cấy nhằm hạn chế sự tăng trƣởng của cây và xác định nồng
độ NaCl thích hợp trên giống TH1, với nền môi trƣờng là công thức MS +
20g/l Saccaroza + 6g/l agar theo các công thức nhƣ sau:

CT1: MS (đối chứng).
CT2: MS+ 0,9g/l NaCl .
CT3: MS+ 1,2g/l NaCl.
CT4: MS+ 1,5g/l NaCl.
Mỗi công thức thí nghiệm đƣợc tiến hành làm với 3 lần nhắc lại, mỗi
lần 5 bình mỗi bình 1 cây.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường saccaroza đến
khả năng tạo củ khoai môn – sọ in vitro.
Vật liệu khởi đầu để tiến hành thí nghiệm là các cây nuôi cấy in vitro.
Mỗi công thức đƣợc tiến hành với 5 bình mỗi bình 5 cây và đƣợc nuôi cấy
trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng một ngày, nhiệt độ 25oC.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên giống TH1 với các nền môi trƣờng MS
có nồng độ đƣờng thay đổi theo các công thức nhƣ sau:
CT1: MS + 30g/l Saccaroza + 6g/l aga (đối chứng).
CT2: MS + 60g/l Saccaroza + 6g/l aga.
CT3: MS + 90g/l Saccaroza + 6g/l aga.
CT4: MS + 120g/l Saccaroza + 6g/l aga.
CT5: MS + 150g/l Saccaroza + 6g/l aga.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của quang chu kì khác nhau đến
khả năng tạo củ khoai môn – sọ in vitro.
Bố trí thí nghiệm trên giống TH1 với nền môi trƣờng là công thức
MS + 90g/l Saccaroza + 6g/l aga sau 15 ngày đƣa cây vào các điều kiện
quang chu kỳ khác nhau nhƣ sau:
CT1: Trong tối hoàn toàn.
CT2: 8h sáng/ ngày.

Phạm Ngọc Anh

18

K36C – Sinh KTNN