Định lượng đồng thời amoxicillin và cloxacillin trong chế phẩm bằng phương pháp quang phổ đạo hàm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Vũ Tùng Lâm

ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI
AMOXICILLIN VÀ CLOXACILLIN
TRONG CHẾ PHẨM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP PHỔ ĐẠO HÀM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014
1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Vũ Tùng Lâm

ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI
AMOXICILLIN VÀ CLOXACILLIN
TRONG CHẾ PHẨM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP PHỔ ĐẠO HÀM

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.VŨ ĐẶNG HOÀNGAA
TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO A

Hà Nội - 2014


LỜI CẢM ƠN
Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ dƣợc học, tôi xin đƣợc bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, gia đình, bạn bè và
những ngƣời đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ
Đặng Hoàng ngƣời thầy kính mến đã hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Lê Thị Hồng Hảo - Viện Phó Viện Vệ
Sinh An Toàn Thực Phẩm Quốc Gia, ngƣời đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn Hóa
Phân Tích đã hết giúp quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực
hiện luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học,
và các thầy cô giáo trường Khoa Học Tự Nhiên Hà Nội đã giảng dạy và tạo
điều kiện tốt nhất cho quá trình học tập và nghiên cứu của tôi tại trƣờng.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới những ngƣời bạn đã
luôn sát cánh, động viên tôi trong học tập cũng nhƣ trong cuộc sống.
Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình thân
yêu, những ngƣời đã luôn ở bên cạnh tôi trong suốt cuộc đời.

Hà Nội, tháng 12 năm 2014
Học viên

Vũ Tùng Lâm

1


MỤC LỤC

Trang bìa
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
LỜI CẢM ƠN
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG PHÂN TÍCH ..........................................3
1.1.1. Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicillin trihydrat và Cloxacillin ...........3
1.1.2. Đặc điểm dƣợc động học và độc tính của Amoxicillin trihydrat và
Cloxacillin [5] .....................................................................................................4
1.1.2.2. Cloxacilin [5]. ........................................................................................5
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH. ...............................6
1.2.1. Các phƣơng pháp định lƣợng amoxicillin và cloxacillin trong chế phẩm6
1.2.2. Kết luận về các phƣơng pháp phân tích tham khảo. .................................7
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ ĐẠO HÀM
(Derivative spectrophotometry)...........................................................................7
1.3.1. Khái niệm .................................................................................................7
1.3.2. Các phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp đa thành phần bằng quang phổ

đạo hàm.............................................................................................................15
1.3.3. Phƣơng pháp đạo hàm giao điểm không (zero-crossing derivative
spectrophotometry) ...........................................................................................16
1.3.4. Phƣơng pháp đạo hàm phổ tỷ số phổ (Ratio Spectra Derivative
Spectrophotometry) ..........................................................................................17
1.3.5. Ứng dụng quang phổ đạo hàm trong định lƣợng thuốc đa thành phần ở
Việt Nam...........................................................................................................19
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................22
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU. ....................................................................22
2.2. THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ..........................................................................22

ii


2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................23
2.3.1. Xây đựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời AMO và CLO bằng các
phƣơng pháp quang phổ UV-VIS và sắc ký lỏng hiệu năng cao .....................23
2.3.2. Ứng dụng để định lƣợng đồng thời AMO và CLO trong viên nang
Faclacin 2 ..........................................................................................................24
2.3.3. Xử lý kết quả thực nghiệm [3]................................................................24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................25
3.1. PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AMO VÀ
CLO ......................................................................................................................25
3.1.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu .......................................................................25
3.1.2. Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời Amo và Clo.......................26
3.1.3. Độ lặp của phƣơng pháp .........................................................................34
3.1.4. Độ đúng của các phƣơng pháp ...............................................................36
3.2. PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ...........................37
3.2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu .......................................................................37
3.2.2. Kiểm tra lại phƣơng pháp sắc ký lỏng áp dụng tại Công ty Cổ phần

Dƣợc phẩm Trung ƣơng 1 ................................................................................37
3.2.3. Khảo sát tính tích hợp của hệ thống. ......................................................41
3.2.4. Khảo sát độ lặp của phƣơng pháp ..........................................................42
3.2.5. Khảo sát độ đúng của phƣơng pháp .......................................................43
3.3. KẾT QUẢ PHÉP ĐỊNH LƢỢNG ..............................................................44
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................47

iii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AMO

: Amoxicilin

CLO

: Cloxacilin

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu nâng cao

PĐH

: Phổ đạo hàm

PĐHTĐ

: Phổ đạo hàm tỷ đối

TLTK

: Tài liệu tham khảo

VKNTW

: Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ƣơng

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số đặc điểm hoá lý của AMOXICILLIN TRIHYDRAT và
CLOXACILLIN NATRI .............................................................................................3
Bảng 1.2. Ứng dụng quang phổ đạo hàm ở Việt Nam từ năm 1990 đến nay ...........20
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CLO.................................................32
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của AMO. ..............................................33
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của các phƣơng pháp quang phổ UV-VIS.
...................................................................................................................................34
Bảng 3.6. Độ lặp của các phƣơng pháp quang phổ UV-VIS...........................................35
Bảng 3.7. Kết quả định lƣợng hỗn hợp mẫu tự tạo AMO 100mg/L và CLO 100mg/L
bằng các phƣơng pháp quang phổ .............................................................................36
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của AMO 100mg/L. ...............................38
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CLO 100 mg/L .................................39
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính giữa diện tích pic với nồng độ của
AMO và CLO ............................................................................................................40

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký ............................41
Bảng 3.12. Độ lặp của phƣơng pháp HPLC ..............................................................42
Bảng 3.13. Kết quả định lƣợng hỗn hợp mẫu tự tạo bằng phƣơng pháp HPLC .......43
Bảng 3.14. Kết quả định lƣợng AMO trong viên nang FACLACIN 2 .....................44
Bảng 3.15. Kết quả định lƣợng CLO trong viên nang FACLACIN 2 ......................45

v


Danh môc c¸c h×nh
Hình 1.1. Phổ hấp thụ và đạo hàm của dải phổ tuân theo định luật phân bố Gauss ...9
Hình 1.2. Phổ hấp thụ (a), phổ đạo hàm bậc 1 (b), phổ đạo hàm bậc 4 (c) (dải phổ
của 2 chất có cùng vị trí và cùng độ cao nhƣng có độ rộng gấp đôi); phổ hấp thụ của
trans – stillben trong cyclohexan (d) và phổ đạo hàm bậc 2 (e), bậc 4 (f) tƣơng ứng
...................................................................................................................................10
Hình 1.3. Ảnh hƣởng của tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thụ và phổ đạo hàm bậc 1 [ 11
Hình 1.4. Phân biệt các dải phổ bằng phép toán đạo hàm ........................................12
Hình 1.5. Phƣơng pháp peak – zero (zn tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích) ........13
Hình 1.6. Đạo hàm bậc 1 của lamivudin (1) 15µg/ml; (2) 20 µg/ml; (3) 30 µg/ml
(đƣờng nét liền) và zidovudin (1) 30 µg/ml; (2) 50 µg/ml; (3) 75 µg/ml (đƣờng nét
đứt) trong methanol. Mũi tên chỉ bƣớc sóng định lƣợng ..........................................16
Hình 1.7. (a) Phổ tỷ số phổ của acetaminophen tại các nồng độ (a) 5,0 µg/ml, (b)
17,5 µg/ml, (c) 25,0 µg/ml, (d) 37,5 µg/ml, (e) 50,0 µg/ml khi nồng độ của số chia
(mephenoxalon) là 12,5 µg/ml trong methanol (Δλ = 4 nm). (b) Phổ đạo hàm tỷ số
phổ bậc 1 của acetaminophen tại các nồng độ (a) 5,0 µg/ml, (b) 17,5 µg/ml, (c)
25,0 µg/ml, (d) 37,5 µg/ml, (e) 50,0 µg/ml khi nồng độ của số chia (mephenoxalon)
là 12,5 µg/ml trong methanol (Δλ = 4 nm) ...............................................................18
Hình 3.8. Phổ hấp thụ của dung dịch AMO 100 mg/L, CLO 100 mg/L và hỗn hợp
AMO 100 mg/L + CLO 100 mg/L ............................................................................26
Hình 3.9. PĐH bậc nhất của dung dịch AMO nồng độ (60 – 140 mg/L) .................28

Hình 3.10. PĐH bậc 2 của dung dịch CLO nồng độ (60 – 140 mg/L) .....................29
Hình 3.11. PĐHTĐ của dung dịch AMO nồng độ (60 – 140 mg/L) với số chia
CLO 60 mg/L ............................................................................................................30

vi


Hình 3.12. PĐHTĐ của dung dịch CLO nồng độ (60-140 mg/L) với số chia AMO
60 mg/L .....................................................................................................................31
Hình 3.13. Phổ đạo hàm bậc nhất của CLO tại bƣớc sóng 258,7 nm .......................32
Hình 3.14. Phổ đạo hàm tỉ đối số chia AMO tại bƣớc sóng 258 nm ........................33
Hình 3.15. Sắc kí đồ tách 2 chất AMO 100 mg và CLO 100 mg .............................38
Hình 3.16. Khoảng tuyến tính của AMO từ 60 mg/L đến 140 mg/L. ......................39
Hình 3.17. Khoảng tuyến tính của AMO từ 60 mg/L đến 140 mg/L. ......................40

vii


MỞ ĐẦU

Kháng sinh là nhóm thuốc đƣợc sử dụng nhiều nhất ở Việt Nam do mô hình
bệnh tật của nƣớc ta chủ yếu vẫn là các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm ký sinh trùng và
nhiễm nấm. Do sự kháng thuốc của vi khuẩn và tính phức tạp của các bệnh nhiễm
khuẩn ngày càng gia tăng, việc sử dụng kháng sinh đơn thành phần trong nhiều
trƣờng hợp không còn đáp ứng đƣợc yêu cầu điều trị. Nhìn vào các đơn thuốc đƣợc
kê hiện nay, phổ biến có đến 2-3 loại kháng sinh đƣợc sử dụng cùng lúc để tăng
hiệu quả trong điều trị. Mặc dù vậy, việc phối hợp kháng sinh này có thể gặp phải
một số tƣơng tác bất lợi gây ra những tai biến đáng tiếc và hiện tƣợng vi khuẩn
kháng thuốc hết sức nguy hiểm.
Amoxicillin và Cloxacillin là 2 kháng sinh thuộc nhóm Penicillin đƣợc sử

dụng phổ biến hiện nay. Amoxicillin bền vững với dịch vị có khả năng hấp thu qua
đƣờng tiêu hoá tốt nên kháng sinh nhóm Penicillin có hoạt phổ rộng này hay đƣợc
sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn toàn thân. Cloxacillin có tác dụng kháng
penicillinase nên đƣợc chỉ định trong các bệnh do vi khuẩn gram dƣơng tiết ra
penicillinase nhất là các liên cầu khuẩn [1]. Để nâng cao hiệu quả điều trị cũng nhƣ
tạo điều kiện cho việc sử dụng thuốc thuận tiện, sự kết hợp Amoxicillin trihydrate
và Cloxacillin Natri trong cùng một chế phẩm đã và đang đƣợc chỉ định cho các
bệnh nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp, sinh dục tiết niệu, da và mô mềm, điều trị cấp cứu
các nhiễm khuẩn có nguy cơ cao khi chờ đợi kết quả kháng sinh đồ.
Tuy các thuốc có chứa đồng thời Amoxicillin và Cloxacillin đang lƣu hành
rộng rãi trên thị trƣờng dƣới dạng viên nang nhƣng cho tới nay Dƣợc điển Việt Nam
vẫn chƣa có chuyên luận riêng nào cho dạng chế phẩm này. Việc định lƣợng
Amoxicillin và Cloxacillin trong viên nang đƣợc tiến hành chủ yếu bằng phƣơng
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa vào các công trình nghiên cứu đã biết [2, 4, 21,
23, 30, 31]. Đây là kỹ thuật phân tích hiện đại, có khả năng định tính và định lƣợng

1


đồng thời các chất trong hỗn hợp với tính chọn lọc, độ nhạy, độ đúng và độ lặp cao;
đặc biệt với khả năng tích hợp nhiều loại detector khác nhau nhƣ UV-VIS, khối
phổ, huỳnh quang, điện hóa, HPLC cho phép phân tích đƣợc hầu hết các dƣợc chất.
Tuy nhiên, khi số lƣợng mẫu lớn kỹ thuật này thƣờng đòi hỏi chi phí tốn kém (trang
thiết bị, dung môi hóa chất) và thời gian phân tích kéo dài.
Ngày nay với sự hỗ trợ của công nghệ tin học, các kỹ thuật quang phổ đƣợc
ứng dụng nhiều trong công tác kiểm nghiệm thuốc. Trong số các kỹ thuật này,
phƣơng pháp quang phổ đạo hàm và đạo hàm tỉ đối đƣợc biết đến với ƣu điểm nổi
bật cho phép định lƣợng đồng thời và trực tiếp, không đòi hỏi quá trình tách chiết
hoặc tinh chế đối với hỗn hợp đa thành phần, giúp giảm thiểu thời gian và chi phí
[18, 22, 26]. Do vậy, nghiên cứu ứng dụng quang phổ để định lƣợng đồng thời các

hoạt chất trong hỗn hợp đa thành phần sẽ góp phần giảm sự phụ thuộc vào HPLC
trong kiểm nghiệm thƣờng qui. Cho tới nay, đây là hƣớng nghiên cứu còn ít đƣợc
phát triển ở Việt Nam.
Với mong muốn đề xuất một phƣơng pháp định lƣợng đồng thời hỗn hợp hai
thành phần có khả năng ứng dụng trong công tác kiểm nghiệm thuốc, chúng tôi tiến
hành đề tài “Định lƣợng đồng thời Amoxicillin và Cloxacillin trong viên nang
Faclacin 2 bằng phƣơng pháp phổ đạo hàm” với hai mục tiêu sau:
1. Xây dựng phép định lƣợng đồng thời hỗn hợp hai thành phần Amoxicillin và
Cloxacillin bằng các phƣơng pháp quang phổ tử ngoại lấy phƣơng pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao làm phƣơng pháp đối chiếu.
2. Ứng dụng các phƣơng pháp này để định lƣợng Amoxicillin và Cloxacillin
trong một số lô của chế phẩm Faclacin 2 của Công ty Cổ phần Dƣợc phẩm Trung
Ƣơng I - Pharbaco.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG PHÂN TÍCH
1.1.1. Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicillin trihydrat và Cloxacillin
Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicilin trihydrat và Cloxacillin đƣợc tóm tắt
trong bảng 1.1:
Bảng 1.1. Một số đặc điểm hoá lý của AMOXICILLIN TRIHYDRAT và
CLOXACILLIN NATRI
AMOXICILLIN TRIHYDRAT

CLOXACILLIN NATRI

TL
TK

C19H17ClN3NaO5 S. H2O (M =

C16H19O5S. 3H2O (M = 419,4)

475,9)

Công
thức

[4]

Hóa
học

.3H2O

Tên

Acid (6R)-6-(α-D-4

Natri ((6R)-6-3-(2-clorophenyl)-5-

khoa

hydroxyphenylglycylamino)

methylisoxazol-4-carboxamido)

học

penicilanic trihydrat.

penicilat monohydrat.

[4]

Bột kết tinh màu trắng dạng tinh thể, Bột kết tinh màu trắng, hoặc gần
Tính
chất
hóa,
lý

vị đắng.

trắng, có mùi, vị đắng, dễ hút ẩm.

Khó tan trong nƣớc (1g/370mL), Dễ tan trong nƣớc, methanol. Tan
alcol (1g/2000mL); thực tế không trong ethanol. Không tan trong
tan trong ether, cloroform, dầu; tan ethylacetat.
trong các dung dịch acid hoặc pH (dung dịch nƣớc) = 5,0  7,0
hydroxyd kiềm loãng (do là một acid

3

[2,
4]


AMOXICILLIN TRIHYDRAT

CLOXACILLIN NATRI

amin).
Bị phân huỷ ở độ ẩm cao và nhiệt độ
trên 370C
pH (dung dịch nƣớc) = 3,5  5,5

1.1.2. Đặc điểm dƣợc động học và độc tính của Amoxicillin trihydrat và
Cloxacillin [5]
1.1.2.1. Amoxicilin
a. Dƣợc động học của Amoxicilin.
- Amoxicilin bền vững trong môi trƣờng acid dịch vị. Hấp thu không bị ảnh
hƣởng bởi thức ăn, nhanh và hoàn toàn hơn qua đƣờng tiêu hóa so với ampicilin.
Khi uống cùng liều lƣợng nhƣ ampicilin, nồng độ đỉnh amoxicilin trong huyết
tƣơng cao hơn ít nhất 2 lần. Amoxicilin phân bố nhanh vào hầu hết các mô và dịch
trong cơ thể, trừ mô não và dịch não tủy, nhƣng khi màng não bị viêm thì
amoxicilin lại khuếch tán vào dễ dàng. Sau khi uống liều 250 mg amoxicilin 1 - 2
giờ, nồng độ amoxicilin trong máu đạt khoảng 4 - 5 microgam/ml, khi uống 500
mg, nồng độ amoxicilin đạt khoảng 8 - 10 microgam/ml. Tăng liều gấp đôi có thể
làm nồng độ thuốc trong máu tăng gấp đôi. Amoxicilin uống hay tiêm đều cho
những nồng độ thuốc nhƣ nhau trong huyết tƣơng. Nửa đời của amoxicilin khoảng
61,3 phút, dài hơn ở trẻ sơ sinh, và ngƣời cao tuổi. ở ngƣời suy thận, nửa đời của
thuốc dài khoảng 7 - 20 giờ.
- Khoảng 60% liều uống amoxicilin thải nguyên dạng ra nƣớc tiểu trong
vòng 6 - 8 giờ. Probenecid kéo dài thời gian thải của amoxicilin qua đƣờng thận.
Amoxicilin có nồng độ cao trong dịch mật và một phần thải qua phân.

4

TL
TK


b. Tính độc tính của Amoxicilin
- Bệnh nhân đƣợc điều trị bằng Amoxicillin có thể gặp các hiện tƣợng nhƣ
các phản ứng quá mẫn trầm trọng ở những ngƣời bệnh có tiền sử dị ứng với
penicilin hoặc các dị nguyên khác, nên cần phải điều tra kỹ tiền sử dị ứng với
penicilin, cephalosporin và các dị nguyên khác.
- Nếu phản ứng dị ứng xảy ra nhƣ ban đỏ, phù Quincke, sốc phản vệ, hội
chứng Stevens - Johnson, phải ngừng liệu pháp amoxicilin và ngay lập tức điều trị
cấp cứu bằng adrenalin, thở oxy, liệu pháp corticoid tiêm tĩnh mạch và thông khí, kể
cả đặt nội khí quản và không bao giờ đƣợc điều trị bằng penicilin hoặc
cephalosporin nữa.
1.1.2.2. Cloxacilin [5].
a. Dƣợc động học của Cloxacilin
- Cloxacilin là kháng sinh diệt khuẩn, ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn
nhƣ benzylpenicilin, nhƣng kháng penicilinase của Staphylococcus. Vì vậy thuốc có
hoạt tính chống Staphylococcus sinh hoặc không sinh penicilinase với nồng độ tối
thiểu ức chế khoảng 0,25 - 0,5 microgam/ml. Nhƣng cloxacilin không có hoạt tính
với Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) do vi khuẩn này có những
protein gắn penicilin (PBP) biến đổi. Hoạt tính đối với Strepxococcus nhƣ
Strepxococcus pneumoniae và Strepxococcus pyogenes thấp hơn benzylpenicilin,
nhƣng thƣờng đủ tác dụng khi các vi khuẩn này cùng có mặt với Staphylococcus
kháng penicilin. Cloxacilin không có hiệu lực với Enterococcus faecalis.
b. Tính độc tính của Cloxacilin
- Tác dụng không mong muốn thƣờng gặp nhất là phản ứng quá mẫn, đặc
biệt là ban da, đôi khi có phản vệ. Ngƣời suy thận cũng có nguy cơ cao.Tác dụng
không mong muốn thƣờng xảy ra là phát ban (khoảng 4% ngƣời bệnh tiêm
cloxacilin). Ðối với ngƣời bệnh uống cloxacilin, các tác dụng không mong muốn

thƣờng gặp là các triệu chứng tiêu hóa phụ thuộc theo liều uống.

5


1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH.
1.2.1. Các phƣơng pháp định lƣợng amoxicillin và cloxacillin trong chế phẩm
Để định lƣợng Amoxicillin và Cloxacillin trong các chế phẩm đơn thành
phần, phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao thƣờng đƣợc sử dụng hiện nay tại
Việt Nam. Theo qui định của các dƣợc điển quốc tế, các hoạt chất này đƣợc tách ra
khỏi nền mẫu bằng cột pha đảo cột C18 và phát hiện bằng detector tử ngoại tại bƣớc
sóng 254 nm (cho amoxicillin) và 225 nm (cho cloxacillin) [8, 19, 20]. Để định
lƣợng amoxicillin, thành phần pha động đƣợc sử dụng gồm có MeOH: dd
NaCH3COO 0,01M (5:95) [31], acetonitril: dd KH2PO4 45% w/w (4:96) [31]; hoặc
acetonitril: dd KH2PO4 0,05M pH 5,0 (1:99) [22]. Để định lƣợng cloxacillin, thành
phần pha động đƣợc sử dụng gồm có acetonitril: dd KH2PO4 0.05 M pH 5,0 (1:96)
[29], acetonitril: dd KH2PO4 0,02M pH 6,8 (20:80) [31]; hoặc acetonitril: dd
KH2PO4 2,7 g/L, pH 5,0 (25:75) [22].
Ngoài ra, có thể định lƣợng amoxicillin trong chế phẩm bằng phép chuẩn độ
đo thế. Theo phƣơng pháp này, hàm lƣợng phần trăm của amoxicillin đƣợc tính
bằng hàm lƣợng phần trăm của penicillin toàn phần trừ đi hàm lƣợng phần trăm của
sản phẩm phân huỷ. Chế phẩm đƣợc hòa tan vào dung dịch đệm boric pH 9,0 và
anhydrid acetic, trƣớc khi tiến hành phản ứng thuỷ phân trong môi trƣờng kiềm và
chuẩn độ bằng bằng Hg(NO)2 0,02M trong môi trƣờng đệm acetate pH 4,6. Điểm
kết thúc của chuẩn độ đo thế đƣợc xác định với điện cực so sánh là điện cực thuỷ
ngân - thuỷ ngân (I) sulfat; điện cực chỉ thị là điện cực platin (hoặc điện cực thuỷ
ngân) [2,4]. Amoxicillin cũng có thể định lƣợng bằng phép đo iod sau phản ứng
thủy phân trong môi trƣờng kiểm. Sản phẩm phân hủy của amoxicillin đƣợc phản
ứng với iod dƣ. Định lƣợng iod dƣ bằng NaS2O3 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột cho
vào thời điểm gần kết thúc định lƣợng [4].

Hàm lƣợng cloxacillin trong chế phẩm có thể định lƣợng bằng phƣơng pháp
vi sinh dựa vào mối quan hệ đƣờng kính vòng vô khuẩn của mẫu thử và mẫu chuẩn

6


tỷ lệ thuận với lƣợng cloxacillin tƣơng ứng có trong mẫu. Phƣơng pháp này sử dụng
chủng chỉ thị: Bacillus subtilis ATCC 6633 [30].
1.2.2. Kết luận về các phƣơng pháp phân tích tham khảo.
Qua phân tích tài liệu tham khảo, phƣơng pháp HPLC thƣờng đƣợc triển
khai cho công tác kiểm nghiệm thƣờng qui chế phẩm đơn thành phần amoxicillin và
cloxacillin. Cho tới nay, chƣa có phƣơng pháp nào đƣợc công bố để định lƣợng
đồng thời amoxicillin và cloxacillin trong hỗn hợp. Có thể nhận thấy, phƣơng pháp
HPLC thƣờng dùng dung môi hữu cơ có độc tính là acetonitril; chi phí kiểm nghiệm
thuốc sẽ tăng khi số lƣợng mẫu phân tích lớn. Ngoài ra phƣơng pháp này cũng đòi
hỏi trang thiết bị đắt tiền và thời gian phân tích mẫu kéo dài. Do vậy, nghiên cứu
này đƣợc tiến hành nhằm xây dựng một phƣơng pháp quang phổ tiến kiệm dung
môi hóa chất, thời gian phân tích có khả năng thay thế HPLC trong công tác kiểm
nghiệm.
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ ĐẠO HÀM (Derivative
spectrophotometry)
1.3.1. Khái niệm
Quang phổ đạo hàm là kỹ thuật phân tích đƣợc Giese và French giới thiệu
lần đầu tiên vào năm 1955 [20]. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sử dụng thuật
toán lấy đạo hàm phổ hấp thụ nhằm thu đƣợc nhiều hơn các thông tin định tính,
định lƣợng đối với các dải phổ không đƣợc phân tách hoàn toàn. Phép lấy đạo hàm
một đƣờng cong hay hàm toán học của đƣờng cong về bản chất là sự ƣớc lƣợng độ
dốc tại mỗi điểm trên đƣờng cong khảo sát.
Trong phƣơng pháp quang phổ UV-VIS, mối quan hệ giữa khả năng hấp thụ
ánh sáng và nồng độ của một dung dịch đƣợc miêu tả qua biểu thức toán học của

định luật Bouguer – Lambert – Beer:

7


(1)

(2)
: nồng độ của chất hấp thụ (mol/l)

: cƣờng độ của ánh sáng sau khi đi
qua chất hấp thụ

: độ dài quang học (cm)
: độ hấp thụ phân tử của chất hấp thụ tại

: cƣờng độ ánh sáng tới (
không đổi).

bƣớc súng

: độ truyền qua.

: độ hấp thụ.

Thực tế, trong quang phổ đạo hàm A thƣờng đƣợc dùng nhiều hơn T do khi
tăng bậc đạo hàm (n) mối tƣơng quan tuyến tính giữa đạo hàm T và nồng độ C chỉ
có đƣợc trong các điều kiện đặc biệt trong khi giá trị đạo hàm của A luôn tỷ lệ với
C dù n vô cùng lớn (phƣơng trình (3)).
Đạo hàm bậc n của A:

(3)

8


Hình 1.1. Phổ hấp thụ và đạo hàm của dải phổ tuân theo định luật phân bố Gauss [3]
Hình 1.1 biểu diễn phổ hấp thụ và các phổ đạo hàm tƣơng ứng của một dải
phổ tuân theo định luật phân bố Gauss. Theo tính chất của đạo hàm, ta có thể nhận
thấy:
- Các cực trị ở đạo hàm bậc n sẽ có giá trị 0 tại đạo hàm bậc n + 1 còn các
điểm uốn ở đạo hàm bậc n lại trở thành cực trị ở đạo hàm bậc kế tiếp. Do đó, xuất
phát từ 1 peak ban đầu sau n lần đạo hàm sẽ cho n cực trị mới đƣợc gọi là cực trị ảo
(virtual extrema) hay các vệ tinh (satellites).

9


- Sự xuất hiện của các cực trị ảo này sẽ làm tăng khả năng phân tích phổ hấp
thụ ban đầu. Hình 1.2 minh họa cho sự chuyển dạng từ phổ UV – VIS sang phổ đạo
hàm cho thấy thông tin thu đƣợc trên phổ đạo hàm nhiều hơn phổ hấp thụ ban đầu
(số cực trị tăng khi số bậc đạo hàm tăng) có thể ứng dụng đƣợc trong phân tích định
tính.

Hình 1.2. Phổ hấp thụ (a), phổ đạo hàm bậc 1 (b), phổ đạo hàm bậc 4 (c) (dải phổ của
2 chất có cùng vị trí và cùng độ cao nhƣng có độ rộng gấp đôi); phổ hấp thụ của trans
– stillben trong cyclohexan (d) và phổ đạo hàm bậc 2 (e), bậc 4 (f) tƣơng ứng [29]
- Khi tăng bậc đạo hàm, độ nhọn của các dải phổ tăng lên tuy nhiên tín hiệu
đạo hàm giảm và độ rộng của các dải phổ thu hẹp lại. Đáng chú ý, khi tăng n tỷ số
tín hiệu – nhiễu (signal to noise ratio) lại giảm đặc biệt với các peak tù. Chính vì
vậy, để ứng dụng quang phổ đạo hàm trong phân tích, phải cân nhắc giữa thuận lợi

và khó khăn để lựa chọn đƣợc bậc đạo hàm thích hợp.

10


Một trong những ƣu điểm nổi bật của quang phổ đạo hàm là có thể loại bỏ
đƣợc hiện tƣợng trôi nền gây bởi sự không ổn định của trang thiết bị hoặc thao tác
và giảm ảnh hƣởng của tán xạ ánh sáng khi các tiểu phân nhỏ xuất hiện trong mẫu,
qua đó cải thiện độ chính xác của phép định lƣợng (hình 1.3). Khi bậc đạo hàm
tăng, cƣờng độ tín hiệu của các dải phổ rộng sẽ giảm nhiều so với các dải phổ hẹp.
Do vậy việc định lƣợng các dải phổ hẹp sẽ chính xác hơn (hình 1.4). Điều này cũng
đƣợc ứng dụng để giảm thiểu sai số trong trƣờng hợp tán xạ ánh sáng hoặc nhiễu
nền do tia sáng lạc gây ra đối với các mẫu đục

Hình 1.3. Ảnh hƣởng của tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thụ và phổ đạo hàm bậc 1
[25]

11


Hình 1.4. Phân biệt các dải phổ bằng phép toán đạo hàm
Phép định lƣợng bằng quang phổ đạo hàm có nguyên tắc chung là dựa vào
mối quan hệ tuyến tính giữa biên độ tín hiệu đạo hàm và nồng độ chất phân tích.
Trong phép định lƣợng, vị trí chính xác của các cực trị trong phổ đạo hàm không có
vai trò quan trọng nếu điều kiện xử lý số liệu đƣợc giữ không đổi. Các tín hiệu thu
đƣợc từ phổ đạo hàm thông thƣờng đƣợc lƣợng giá theo phƣơng pháp peak-zero
(giá trị tuyệt đối của đạo hàm tại bƣớc sóng đó chọn tính từ đỉnh peak đến trục
hoành: hình 1.5).

12

Hình 1.5. Phƣơng pháp peak – zero (zn tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích)
Để thực hiện phép lấy đạo hàm, về mặt kỹ thuật các máy quang phổ có thể
áp dụng các phƣơng pháp nhƣ hình học (graphical), điện cơ (mechanical-eletrical),
quang học (optical), tín hiệu trễ (signal delay), thuật toán tƣơng tự (analog
computing) và thuật toán kỹ thuật số (digital computing). Tuy nhiên trên thực tế,
phép lấy đạo hàm bằng kỹ thuật điện tử (analog differentiation) và kỹ thuật số
(digital diffenrentiation) là hai phƣơng pháp hiện còn đƣợc ứng dụng trong các máy
quang phổ vì chúng có khả năng tạo ra các phổ đạo hàm bậc cao (n > 2). Để sử
dụng thuật toán trong phép lấy đạo hàm, phổ hấp thụ phải đƣợc số hóa với khoảng
chênh lệch về bƣớc sóng ∆. Độ lớn của ∆ đƣợc lựa chọn tùy theo độ rộng của dải
phổ đƣợc khảo sát và độ rộng khe sáng của máy quang phổ sử dụng [28]. Trong số
các thuật toán đạo hàm, hàm đa biến Savitzky-Golay đƣợc sử dụng phổ biến nhất để
tạo ra tín hiệu đạo hàm của phổ hấp thụ và các đƣờng cong thu đƣợc từ các nguồn
tín hiệu khác nhau [19].
Nguyên tắc của thuật toán này là miêu tả một cửa số phổ có chứa 2n + 1
bƣớc sóng trên toàn phổ hấp thụ bằng một hàm đa thức bậc m có dạng nhƣ sau:

13


(4)
với n và m là các thông số tùy chọn. Bậc của đa thức có thể là hai – ba hoặc bốn –
năm tùy theo hình dạng của đƣờng cong.
Với các hệ số

,

, ...,

thu đƣợc, các đạo hàm tại bƣớc sóng

(bƣớc

sóng trung tâm của cửa số phổ) đƣợc tính nhƣ sau:
(5)

(6)

(7)

Sau khi giá trị đạo hàm tại điểm 0 đƣợc xác định, cửa sổ phổ này đƣợc dịch
chuyển thêm một bƣớc sóng về phía tay phải để tạo nên một cửa sổ mới. Qui trình
đƣợc tiếp diễn cho đến khi cửa sổ phổ chứa điểm cuối cùng của toàn dải phổ khảo
sát. Sử dụng phƣơng pháp này có thể thu đƣợc phổ đạo hàm từ bậc một tới bậc năm
tùy theo bậc của hàm đa thức [30].
Một nhƣợc điểm điển hình của phổ đạo hàm là tỉ số tín hiệu – nhiễu giảm đi
đáng kể với phổ đạo hàm bậc cao. Để khắc phục nhƣợc điểm này, các máy quang
phổ luôn đƣợc bố trí thiết bị lọc nhiễu tƣơng tự (analog filtering) hoặc kỹ thuật số
(digital filtering). Thuật toán Savitzky – Golay cũng đƣợc áp dụng để làm trơn phổ
đạo hàm khi coi điểm trung tâm của đoạn đƣờng cong đƣợc xây dựng theo hàm đa
thức là điểm mới đƣợc làm trơn.
Giá trị của điểm yk bất kỳ trên đƣờng cong đƣợc làm trơn thành (yk)s bằng
phƣơng pháp Savitzky-Golay có thể biểu diễn bằng phƣơng trình sau:

14


(8)

Trong đó: Ai là trọng số (weighting coefficient) hay số nguyên tích chập
(convolution integer).
Độ rộng của dải phổ đƣợc làm trơn (N) sẽ trải dài từ giá trị của bƣớc sóng k
–n

đi qua k tới k + n. Theo lý thuyết N có thể thay đổi từ 5 đến 25 (các số lẻ). Nếu

N càng lớn hiệu quả của phép làm trơn sẽ càng tăng (nhiễu giảm đi nhiều) tuy nhiên
hỡnh dạng của phổ sẽ bị biến dạng. Đáng chú ý, tỉ số tín hiệu – nhiễu đƣợc cải thiện
không chỉ phụ thuộc vào bậc của đa thức, N mà còn phụ thuộc vào số lần làm trơn
phổ.
1.3.2. Các phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp đa thành phần bằng quang phổ
đạo hàm
Vì phổ đạo hàm là kết quả của phép biến đổi từ phổ hấp thụ nên giá trị của
phổ đạo hàm tại các bƣớc sóng cũng có sự cộng tính nhƣ phổ hấp thụ của dung dịch
có nhiều thành phần với điều kiện tƣơng tác giữa các thành phần này là không đáng
kể và có thể bỏ qua:
(1)

(2)

trong đó

và

dung dịch có

lần lƣợt là độ hấp thụ phân tử và nồng độ của thành phần
thành phần (

.

15

trong


1.3.3. Phƣơng pháp đạo hàm giao điểm không (zero-crossing derivative
spectrophotometry)
Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong việc ứng dụng quang
phổ đạo hàm để định lƣợng đồng thời hỗn hợp hai thành phần. Phƣơng pháp này dựa
trên nguyên tắc bƣớc sóng đƣợc lựa chọn là bƣớc sóng tại đó đạo hàm độ hấp thụ của
một trong hai thành phần cần định lƣợng bằng 0 và thành phần còn lại khác 0. Với
phƣơng pháp này phổ đạo hàm đƣợc sử dụng thƣờng có bậc một hoặc hai (hình 1.6).

Hình 1.6. Đạo hàm bậc 1 của lamivudin (1) 15µg/ml; (2) 20 µg/ml; (3) 30 µg/ml
(đƣờng nét liền) và zidovudin (1) 30 µg/ml; (2) 50 µg/ml; (3) 75 µg/ml (đƣờng nét
đứt) trong methanol. Mũi tên chỉ bƣớc sóng định lƣợng [32]

16