Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp xác định hàm lượng vitamin D (D2 và D3 ) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Viện Dinh Dỡng
Trung tâm kiểm nghiệm vsATTP
*****************

Báo cáo kết quả nghiên cứu

Chuẩn hóa phơng pháp xác định hàm
lợng vitamin D (D2 và D3) trong thực
phẩm bằng phơng pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC)

Chủ nhiệm đề tài : Ks. Đoàn Thị Hờng

6544
20/9/2007

Hà nội, 2007


Viện Dinh Dỡng
Trung tâm kiểm nghiệm vsATTP
*****************

Báo cáo kết quả nghiên cứu

Chuẩn hóa phơng pháp xác định hàm
lợng vitamin D (D2 và D3) trong thực
phẩm bằng phơng pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC)

Chủ nhiệm đề tài:

Ks. Đoàn Thị Hờng

Các cán bộ tham gia: C n. Nguyễn Thu Hằng
Cơ quan chủ trì:

Trung tâm kiểm nghiệm VSATTP

Cơ quan chủ quản:

Viện dinh dỡng

Kinh phí:

20 triệu đồng (Nguồn NNS)

Hà nôi, 2007


Mục lục
TT

Nội dung

Trang

1

Danh mục các chữ viết tắt

2

Danh mục các bảng

3

Danh mục các hình

4

Phần 1: Mở đầu

1

5

Phần 2: Tổng quan

3

6

Phần 3: Mục tiêu, đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

8

1. Mục tiêu

8

2. Đối tợng

8

3. Nội dung và phơng pháp nghiên cứu

8

4. Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao áp

9

5. Các phơng pháp định lợng bằng HPLC

11

6. Quy trình phân tích thử nghiệm

13

Phần 4: Kết quả nghiên cứu

17

1. Khảo sát điều kiện chạy sắc ký

17

2. Xác định LOD

28

3. Xác định LOQ

28

4. Xác định khoảng tuyến tính

29

5. Xác định độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên

32

6. Xác định độ thu hồi

35

7. Một số sắc đồ chạy sắc ký của mẫu phân tích

37

8

Phần 5: Nhận xét và bàn luận kết quả

39

9

Phần 6: Quy trình phân tích xác định hàm lợng vitamin D
trong thực phẩm bằng phơng pháp HPLC
Phần 7: Tài liệu tham khảo

41

7

10
11

Phần phụ lục: Các sắc đồ của dung dịch chuẩn vitamin D2
và D3 xây dựng khoảng tuyến tÝnh

45


các chữ viết tắt

TT

Các chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

1

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

2

DAD

Detector mảng diôt

3

UV-VIS

Quang phổ tử ngoại - khả kiến

4

RDA

Nhu cầu ăn khuyến cáo

5

TCVN

Tiêu chuẩn Việt nam

6

AOAC

Hiệp hội phân tích hoá học

7

LOD

Giới hạn phát hiện

8

LOQ

Giới hạn định lợng

9

SD

Độ lệch chuẩn

10

Cv

Hệ số biến thiên

11

MeOH

Methanol

12

THF

Tetra hydrofuran

13

ACN

Acetonitril

14

SPE

Cột chiết pha rắn

15

TBHQ

Tert butyl hydroquinol


Danh mục các bảng

TT
Bảng 1

Nội dung bảng
Thời gian lu của vitamin D2 và D3 đối với điều kiện chạy cột
Waters RP- 18, detector DAD, b−íc sãng 265nm, pha ®éng
MeOH: H2O = 98: 2, tốc độ dòng 1ml/phút

Bảng 2

Thời gian lu của vitamin D2 chạy cột Inertsil ODS 3 và cột
Waters RP18, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN :
MeOH =75:25, tốc độ dòng 1ml/phút.

Bảng 3

Nhận xét các sắc đồ cđa hai chÊt chn ®èi víi cét Inertsil ODS 3
detector DAD b−íc sãng 265nm, Pha ®éng ACN : H2O =75:25,
tèc độ dòng 1ml/phút

Bảng 4

Nhận xét kết quả chạy sắc ký hai chuẩn trên cột Inertsil ODS 3
pha động ACN : MeOH = 50: 50, detector DAD b−íc sãng
265nm, tèc ®é dòng 1ml/phút.

Bảng 5

Thời gian lu của hai chất chuẩn tơng ứng với pha động khác
nhau tốc độ 1ml/ phút, cột Inertsil ODS 3, detector DAD 265nm

B¶ng 6

Thêi gian l−u cđa hai chất ứng với tốc độ dòng khác nhau trên hƯ
pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5, detector DAD 265nm,
cét Inertsil ODS 3

Bảng 7

Tổng kết điều kiện chạy HPLC phân tích vitamin D

Bảng 8

Tơng quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn của vitamin D2

Bảng 9

Tơng quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn vitamin D3

Bảng 10

Xác định hàm lợng vitamin D2 mẫu sữa bột XO

Bảng 11

Xác định hàm lợng vitamin D3 trong sữa Sunny grow baby

Bảng 12

Xác định hàm lợng vitamin D trong sữa chua nestlé có đờng

Bảng 13

Xác định hàm lợng vitamin D3 trong sữa Kappi hộp 100ml

Bảng 14

Xác định hàm lợng vitamin D3 trong sữa bột giầu năng lợng

Bảng 15

Xác định hàm lợng vitamin D trong sữa đặc có đờng

Bảng 16

Kết quả hàm lợng vitamin D trong một số mẫu khác

Bảng 17

Độ thu hồi của vitamin D3

Bảng 18

Độ thu hồi của vitamin D2

Bảng 19

Kết quả phân tích mẫu sữa bột mẫu DDP4 vật liệu chuẩn

Bảng 20

Tổng hợp các thông số thẩm định


Danh mục các hình

TT

Nội dung các hình
Phần tổng quan

Hình 1

Công thức hoá học, công thức cấu tạo của vitamin D2 và D3

Hình 2

Sơ đồ chuyển hoá của vitamin D trong cơ thể
Phần mục tiêu, đối tợng và phơng pháp

Hình 3

Mô tả quá trình chạy sắc ký

Hình 4

Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC

Hình 5

Đồ thị phụ thuộc diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ

Phần kết quả nghiên cứu
* Khảo sát điều kiện chạy

Hình 6

Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nång ®é 0,04ppm, cét Waters, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha động MeOH: H2O = 98:2, tốc độ 1ml/ phút

Hình 7

Dạng phổ hấp thụ của vitamin D2

Hình 8

Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nång ®é 0,08ppm, cét Waters, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha động MeOH: H2O = 98:2, tốc độ 1ml/
phút

Hình 9

Dạng phổ hấp thụ của vitamin D3

Hình 10 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nång ®é 0,04ppm, cét Waters, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ

dòng 1ml/ phút
Hình 11 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,04ppm, cét Inertsil ODS 3,
detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25,
tèc ®é 1ml/ phót

Hình 12 Sắc đồ chuẩn vitamin D3, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc
sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 1ml/ phút
Hình 13 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 1ml/ phút

Hình 14 Sắc đồ chuẩn vitamin D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc
sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50: 50, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 15 Sắc đồ chuẩn vitamin D3, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc
sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50: 50, tốc độ 1ml/ phút
Hình 16 Sắc đồ hỗn hợp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD
b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50:50, tèc ®é 1ml/ phút
Hình 17 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha động ACN: MeOH = 90:10, tốc độ
1ml/ phút
Hình 18 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10 tốc độ
dòng 1,2 ml/ phút
Hình 19 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10 tốc độ
dòng 1,5 ml/ phút
Hình 20 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tốc
độ dòng 1 ml/ phút
Hình 21 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tốc
độ dòng 1,2 ml/ phút
Hình 22 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD
b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tốc độ dòng 1,5
ml/ phút.

Hình 23 Sắc đồ vitamin D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng
265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút
Hình 24 Sắc đồ vitamin D3, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng
265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút
* Xác định khoảng tuyến tính
Hình 25 Đờng chuẩn vitamin D2
Hình 26 Đờng chuẩn vitamin D3
* Sắc đồ chạy mẫu
Hình 27 Sắc đồ xác định hàm lợng vitamin D trong sữa tuơi Kapi
Hình 28 Sắc đồ chạy mẫu sữa tơi xác định hàm lợng vitamin D2
Hình 29 Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3
Hình 30 Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3
Phần phụ lục:
Các sắc đồ dung dịch chuẩn xây dựng khoảng tuyến tính
Hình 31 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,0022ppm
Hình 32 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,02ppm
Hình 33 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,041ppm
Hình 34 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,082ppm
Hình 35 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,165ppm
Hình 36 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,33ppm
Hình 37 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,0068ppm
Hình 38 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,068ppm
Hình 39 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,137ppm
Hình 40 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,274ppm
Hình 41 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,392ppm
Hình 42 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,5ppm

Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

Phần 1: Mở đầu
Để tồn tại, phát triển và cải thiện nòi giống, cơ thể chúng ta luôn cần
đợc cung cấp đủ các chất dinh dỡng, nguồn cung cấp các chất này có
nhiều trong thực phẩm ăn vào hàng ngày. Các chất dinh dỡng chính là các
nhóm cung cấp năng lợng cho cơ thĨ nh− glucid, lipid, protein, nhãm cung
cÊp mi kho¸ng, nhãm cung cấp các loại vitamin và nớc. Theo quan
điểm của các chuyên gia dinh dỡng hiện nay trên thế giới mà chúng ta
đang sống tồn tại hai thái cực khác nhau, một bên là vực thẳm của sự thiếu
ăn và một bên là vực thẳm của sự thừa ăn. Sự thiếu ăn đà dẫn đến tình trạng
suy dinh dỡng do thiếu năng lợng protein, tuy nhiên với sự phát triển của
nền khoa học tiến tiến trên thế giới đời sống của ngời dân ở hầu hết các
nớc đà đợc cải thiện, không ngừng nâng cao. ở Việt nam với sự hỗ trợ
của các chơng trình phòng chống suy dinh dỡng, chơng trình VAC và
cuộc cách mạng xanh trong ngành nông nghiệp đà góp phần to lớn trong
việc tăng cờng an ninh thực phẩm quốc gia, vấn đề đói ăn không còn là
điều bức xúc. Hàng năm tỷ lệ suy dinh dỡng đà giảm đi một cách đáng
kể..... Tuy nhiên vấn đề dinh dỡng mới nảy sinh đó là các bệnh mÃn tính
liên quan đến dinh dỡng đang là mối quan tâm của nhiều ngời. Khái
niệm thực phẩm chức năng (thực phẩm chữa bệnh) đà trở nên quen thuộc
dần với mọi ngời dân. Hiện nay để giải quyết vấn đề này trên thế giới cũng
nh trong nớc đà xuất hiện nhiều loại thực phẩm chữa bệnh, thực phẩm bổ
sung vi chất dinh dỡng phục vụ cho bệnh nhân liên quan. Có thể coi thực
phẩm chức năng, vai trò của thực phẩm ®èi víi bƯnh m·n tÝnh lµ h−íng tiÕp
cËn rÊt míi trong ngành dinh dỡng, thức ăn là thuốc, thuốc là thức ăn [16].
ở Nhật bản cho đến nay đà có khoảng hơn 192 sản phẩm đợc gọi là thực
phẩm chức năng nhằm góp phần vào duy trì, cải thiện chế độ ăn và sức

Trang 1/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

khoẻ [16]. Một trong số các vi chất rất quan trọng đà đợc bổ sung vào thực
phẩm đó là các loại vitamin.
Vitamin là những chất không sinh năng lợng nhng không thể thiếu
đợc đối với sự tồn tại, phát triển của mỗi cơ thể sống. Vitamin có vai trò
tạo ra các coenzim cần thiết trong các phản ứng chuyển hoá khác nhau. Tất
cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất trong cơ thể đều có sự
tham gia trực tiếp cđa vitamin [14]. Ngn cung cÊp vitamin chđ u lµ từ
thức ăn. Khi thiếu vitamin cơ thể sẽ mắc phải mét sè bƯnh lý, nh− thiÕu
vitamin A dƠ dÉn tíi bệnh mù loà, thiếu vitamin B1 dễ bị bệnh tê phï, thiÕu
vitamin PP bÞ bƯnh pellagra, thiÕu vitamin D bÞ bệnh về xơng [17]. Hiện
nay một thực tế khắc nghiệt đà xảy ra ở các nớc đang phát triển là phải
đơng đầu với gánh nặng kép già bệnh nhiễm trùng, tử vong trẻ em và
thiếu dinh dỡng với các bệnh mÃn tính không lây liên quan đến dinh
dỡng [16]. Thực tÕ ®· cho thÊy thiÕu vi chÊt dinh d−ìng ®· góp phần
không ít trong gánh nặng kép này. Vì vậy vai trò thực phẩm đợc đánh giá
vô cùng quan trọng, việc nghiên cứu ứng dụng thực phẩm chức năng đÃ
đang trở thành trào lu mang tính toàn cầu. Nói đến thực phẩm chức năng
chúng ta không thể nói đến thực phẩm bổ sung vitamin D, một loại vitamin
khá quan trọng để phòng chống bệnh còi xơng ở trẻ em, loÃng xơng ở
ngời lớn, hạ calci máu và một số bệnh ngoài da...
Hiện nay trên thị trờng có rất nhiều loại sữa, bột dinh dỡng, bánh
quy... có bổ sung viatmin D. Với lý do trên, đề tài này chúng tôi hy vọng

chuẩn hoá phơng pháp xác định hàm lợng vitamin D bằng phơng pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong một số loại thực phẩm nh sữa
chua, sữa bột, sữa nớc, bánh quy, bột dinh dỡng để đa ra quy trình phân
tích phù hợp, nhằm đánh giá đúng chất lợng, giá trị dinh dỡng thực của
các sản phẩm thực phẩm.

Trang 2/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

Phần 2: Tổng quan

1. Ngn gèc vµ tÝnh chÊt cđa vitamin D
VitaminD lµ chất tinh thể hình kim không màu, không mùi, không
tan trong nớc, hoà tan trong dầu mỡ, tan trong dung môi hữu cơ nh
ethanol, chlorofoc, methanol. Tên gọi khác của vitamin D lµ calciferol.
Vitamin D lµ mét nhãm gåm tõ D2 đến D7 song có hai hoạt tính mạnh nhất
là vitamin D2 còn gọi Ergocalciferol và vitamin D3 còn gọi Cholecalciferol.
Cholecalciferol - C27H44O

Ergocalciferol - C28H44O

Vitamin D3

Vitamin D2

Hình 1: Công thức hoá học, công thức cấu tạo của vitamin D2 và D3

Vitamin D có chủ yếu trong thức ăn nguồn gốc động vật nh trứng,
cá, đặc biệt dịch chiết từ gan cá, bơ, sữa, thịt...
Trong cơ thể ngời vitamin D3 (Cholecalciferol) đợc tổng hợp từ 7
dehydrocholesterol ở dới da nhờ ánh sáng tử ngoại.
Vitamin D2(Ergocalciferol) đợc tổng hợp từ ergosterol có trong nấm và
men bia.
Nói chung, hoạt tính sinh học của hai loại vitamin D2 và vitamin D3
không có sự khác nhau nhiều. Trong cơ thể vitamin D chuyển hoá ở gan vµ

Trang 3/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

thận tạo ra chất chuyển hoá có hoạt tính là 1,25- dihydroxycholecalciferol
nhờ enzim hydroxylase [14].

Trong da

Trong gan

Trong thận

Dạng hoạt động

Hình 2: Sơ đồ chuyển hoá của vitamin D trong cơ thể ngời

Trang 4/46

Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

2. Tác dụng của vitamin D
- Vitamin D tham gia vào quá trình tạo xơng nhờ tác dụng chuyển hoá các
chất vô cơ chủ yếu là calci và phosphat, làm tăng hấp thu calci và phosphat
ở ruột, tham gia vào quá trình calci hoá sụn nên nó rất cần cho sự phát triển
xơng ở trẻ em.
- Làm điều hoà calci trong máu, ức chÕ tÕ bµo sinh ung th−.
- Khi thiÕu vitamin D ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm calci
máu giảm gây hậu quả trẻ em chậm lớn, còi xơng chân vòng kiềng, chậm
biết đi, chậm kín thóp, nguời lớn bị loÃng xơng, xốp xơng, xơng tha dễ
gẫy, phụ nữ cã thai thiÕu vitamin D dƠ sinh ra trỴ khut tật ở xơng [14].
- Nguyên nhân của sự thiếu vitamin D là do cơ thể hấp thu thức ăn kém, do
ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, do rối loạn chuyển hoá, do nhu cầu cao ở
phụ nữ có thai và cho con bú...
-Tuy nhiên dùng vitamin D quá liều cũng gây ra chứng tăng calci máu, tăng
calci niệu, đau nhức xơng khớp, tạo sỏi thận, tăng huyết áp, có thể gây suy
nhợc, mệt mỏi, đau đầu, buồn nôn, tiêu chảy, giòn xơng... [14].
Theo công trình nghiên cứu khảo sát tác dụng của vitamin D đối với
bệnh ung th ở bang Chicago trong 19 năm các tác giả nhận thấy tỷ lệ ung
th kết tràng ở nam giảm 55% nếu hàng ngày đợc bổ sung vitamin D là
3,75mcg [18]. Theo nghiên cứu của Danson - Hughes và các cộng sự tiến
hành trên đối tợng phụ nữ đợc bổ sung vitamin D 400 IU/ ngày và nhóm
phụ nữ khác không đợc bổ sung, cả hai nhóm đều có lợng vitamin D ăn
vào hàng ngày là 100 IU. Nhận thấy nhóm đối chứng bị giảm đáng kể mật
độ khoáng trong xơng so với nhóm đợc bổ sung [18]. Năm 1989 theo

khuyến c¸o cđa ủ ban dinh d−ìng Hoa kú (RDA) vitamin D cần bổ sung
là 10mcg/ ngày ở tuổi từ 51- 70 và 15mcg / ngày ở tuổi cao hơn [18]. Theo

Trang 5/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

nghiên cứu của trờng Y Harvard đợc đăng trên tạp chí của hiệp héi y häc
Mü cho thÊy vitamin D cã thĨ gióp giảm nguy cơ mắc bệnh đa xơ cứng.
Các nhà nghiên cứu đà so sánh lợng vitamin D ở 257 mẫu huyết tơng
trong số hơn 7 triệu mẫu của nhân viên quân đội Mỹ, họ phát hiện rằng
ngời da trắng nhóm có hàm lợng vitamin D cao nhất có nguy cơ mắc
bệnh đa xơ cứng thấp nhất. Bệnh đa xơ cứng là bệnh mÃn tính của hệ thần
kinh, bắt đầu với các triệu chứng nh mất trí nhớ, suy nhợc, mệt mỏi, đau
đớn hoặc liệt, chóng mặt...và sau đó ảnh hởng tới tim mạch.
3. Tình hình nghiên cứu trong nớc và trên thế giới
Cùng với sự phát triển của nền khoa học kỹ thuật tiên tiến, với sự
bùng nổ của ngành công nghệ thông tin, hiện nay hàng loạt các hệ thống
máy phân tích hoá học đà đợc cải tiến nâng cấp, nhằm xác định nhiều loại
chất hoá học và đồng thời nâng cao độ nhạy của phép phân tích cũng nh
độ lặp lại của kết quả kiểm nghiệm. Trên thế giới nhiều nhà phân tích hoá
học đà có nhiều công trình nghiên cứu xác định hàm lợng vitamin D trong
thực phẩm nh thịt, cá, sữa, trong máu... Đó là nghiên cứu hàm lợng
vitamin hoà tan trong chất béo của mẫu sữa chua bằng phơng pháp HPLC
với detector PDA của M.M Delgado Zamarreno, A. Sanchez Perez của
trờng đại học Salamanca Tây ban nha đà đa ra các yếu tố ảnh hởng đến
quá trình phân tích vitamin A, E, D nh điều kiện thuỷ phân, tách các chất

trong khi xử lý mẫu, kết quả của nghiên cứu này đa ra độ thu hồi vitamin
D3 là 91 5% với hàm lợng vitamin D3 trong mẫu là 0,09 mcg/100g
5% [11]. Theo nghiên cứu công bố trên Food Chemistry Vol.57, No.1. 9599, 1996 ở Anh các nhà nghiên cứu đa ra cách xử lý mẫu, điều phân tích
xác định hàm lợng vitamin D trong thực phẩm, kết quả nghiên cứu này
cho thấy hệ số biến thiên sau khi làm lặp lại ba lần ®èi víi vitamin D3 vµ D2
lµ <10%, ®é thu håi của phơng pháp là 90 -110% với D2 và D3, giíi h¹n

Trang 6/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

phát hiện là 1,5-2 ng [12]. Trong công trình nghiên cứu đăng trên tạp chí
Chromatography A của bộ môn thực phẩm, dinh dỡng Đại học Georgia
Athens Mỹ, bộ môn Dinh dỡng trên ngời và khoa học thực phẩm trờng
Bách khoa Virginia ngày 26 tháng 1 năm 1998 đà đa ra điều kiện và yếu
tố ảnh hởng quá trình phân tích hàm lợng vitamin A, E, D trong thức ăn
động vật bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Nghiên cứu này cho thấy độ thu
hồi của phơng pháp là 93-107% [19]. Trong bài báo của tạp chí Food
composition and analysis 16 (2003) có công trình nghiên cứu hàm lợng
vitamin D3 và 25 hydroxyvitamin D3 trong thịt lợn tơi và thịt lợn chín, đÃ
đa ra kết quả nồng độ vitamin D3 đối với thịt tơi là từ 0,05 đến 0,21
mcg/100g với thịt chín là 0,07-0,14 mcg/100g. Sau khi làm 49 thí nghiệm
lặp lại họ đà đa ra hệ số biến thiên là 7,0%, làm 51 thí nghiệm khác hệ số
biến thiên là 7,3% [7]. Ngoài ra còn nhiều công trình nghiên cứu xác định
hàm lợng vitamin D trong máu và huyết thanh, trong thực vật ... Một số
nghiên cứu đà đa ra hàm lợng vitamin D trong cá thu là 15mcg/100g,
trong gan bò 1mcg/100g, trong trứng gà 2mcg/100g, trong nấm rơm là

2mcg/100g [8].
Hiện nay ở Việt nam chúng tôi nhận thấy việc nghiên cứu vitamin D
trong thực phẩm cha đợc làm nhiều, trong bảng thành phần thức ăn Việt
nam cha đề cập đến hàm lợng vitamin D. Trong danh mơc tiªu chn
ViƯt nam (TCVN) chóng tôi cũng cha thấy một quy trình chuẩn nào để
xác định hàm lợng vitamin D bằng HPLC, vì vậy sau khi tham khảo các
tài liệu cùng với điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm chúng tôi đà tiến
hành nghiên cứu chuẩn hoá phơng pháp xác định hàm lợng vitamin D
trong mét sè lo¹i thùc phÈm b»ng HPLC.

Trang 7/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

Phần 3
Mục tiêu, đối tợng và phơng pháp nghiên cứu.

1. Mục tiêu
Nh đà đề cập trong phần tổng quan mục tiêu đề tài chúng tôi chọn
là chuẩn hoá phơng pháp xác định hàm lợng vitamin D (D2và D3) trong
thực phẩm bằng phơng pháp HPLC
2. Đối tợng
Trong khuôn khổ tổng kinh phí của đề tài là 20 triệu đồng, chúng tôi
chỉ có khả năng tiến hành trên đối tợng thực phẩm là mẫu sữa bột, sữa
chua, sữa đặc, bánh quy và siro
3. Nội dung và phơng pháp
Để đáp ứng với mục tiêu nói trên chúng tôi thực hiện các nội dung sau đây:

- Khảo sát điều kiện chạy dung dịch chuẩn vitamin D2 và vitamin D3
- Xác định giới hạn phát hiện (LOD)
- Xác định giới hạn định lợng (LOQ)
- Xác định khoảng tuyến tính
- Xác định độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (Cv %)
- Xác định độ thu hồi (R %)
Sau khi tham khảo các tài liệu [1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 13] chúng tôi nhận
thấy để phân tích hàm lợng vitamin D trong thực phẩm có nhiều phơng
pháp khác nhau. Trớc đây thờng sử dụng phơng pháp sinh học, phơng
pháp hoá học tạo phản ứng lên màu rồi tiến hành đo quang, song ngày nay
với sự phát triển của hệ thống sắc ký thì hầu nh các nớc trên thế giới đÃ
chọn phơng pháp HPLC để xác định. Hiện nay phòng thí nghiệm chúng
tôi có hai hƯ thèng HPLC víi c¸c detector hnh quang, detector UV,
Trang 8/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

detector PDA và các thiết bị phụ trợ khác nh máy cất quay, máy lọc hút
chân không... đáp ứng tốt cho việc phân tích nên chúng tôi đà chọn phơng
pháp này để nghiên cứu. Đây là phơng pháp có nhiều u điểm và hiện nay
đợc nhiều nhà phân tích lựa chọn.
4. Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao
4.1 Nguyên lý:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp, kỹ thuật
phân tích dựa trên cơ sở sự tách các chất trên pha tĩnh chứa trong cột nhờ
dòng chuyển động của chất lỏng (pha động) dới áp suất cao. Pha tĩnh có
thể là chất rắn hoặc chất lỏng đợc phủ trên chất mang. Chất phân tích đợc

ghi nhận bởi bộ phận phát hiện dới dạng các pic trên sắc đồ.
Quá trình sắc ký

Pha động

Pha tĩnh

Rửa giải qua cột

Sắc đồ

Hình 3: Mô tả quá trình chạy sắc ký
4.2 HƯ thèng HPLC:
HƯ thèng HPLC bao gåm c¸c bé phận chính đợc mô tả dới đây.

Trang 9/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

4

7

3

1

5

2

6

Hình 4: Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC
Trong đó:
1: Bình chứa pha động.
2: Bơm cao áp
3: Van bơm mẫu.
4: Cột sắc ký
5: Bộ phận phát hiện Detector
6: Bình chứa dung môi thải
7: Hệ thống máy tính ghi dữ liệu phân tích.
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng detector mảng diod (DAD) và
chạy sắc ký pha ngợc (pha động phân cực, pha tĩnh ít phân cực) để xác
định hàm lợng vitamin D.

Trang 10/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

5. Các phơng pháp định lợng bằng HPLC
Các phơng pháp định lợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc
nồng độ của chất tû lƯ víi diƯn tÝch hay chiỊu cao pic.
* Cã 4 phơng pháp định lợng thờng đợc lựa chọn đó là

- Phơng pháp chuẩn ngoại
- Phơng pháp chuẩn nội
- Phơng pháp thêm chuẩn
- Phơng pháp chuẩn hoá diện tích
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phơng pháp chuẩn ngoại để phân tích.
Phơng pháp chuẩn ngoại là phơng pháp định lợng cơ bản trong đó
dung dịch chất chuẩn và mẫu thử đợc tiến hành sắc ký trong cùng điều
kiện. Sau đó so sánh diện tích pic hoặc chiều cao của mẫu thử với diện tích
pic hoặc chiều cao dung dịch chÊt chn ®Ĩ tÝnh nång ®é chÊt cã trong mÉu.
Cã thể dùng phơng pháp chuẩn hoá một điểm hoặc nhiều điểm.
* Chuẩn hoá một điểm (phơng pháp so sánh):
Chọn nồng độ dung dịch chất chuẩn gần bằng nồng độ mẫu thử, tính theo
công thức sau.

C

x

=

S

x

C
S

s
s

Trong đó: Cx nồng độ mẫu thử.
Cs nồng độ dung dịch chất chuẩn
Sx diện tích hoặc chiỊu cao pic mÉu thư
Ss diƯn tÝch hc chiỊu cao pic dung dÞch mÉu chuÈn

Trang 11/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

* Chuẩn hoá nhiều điểm:
Chuẩn bị dÃy dung dịch các chất chuẩn với nồng độ tăng dần tiến
hành chạy sắc ký. Vẽ đồ thị liên quan giữa diện tích hoặc chiều cao pic với
nồng độ mỗi chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đờng chuẩn để tính
nồng độ các chất cần xác định. Thực hiện việc tính toán này theo hai cách
- áp diện tích hoặc chiều cao pic vào đờng chuẩn ®Ĩ suy ra nång ®é cđa
chÊt trong mÉu.

S diƯn tÝch

Y= a + b C

C

nồng độ

Hình 5: Đồ thị tơng quan diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ.
- Xây dựng phơng trình hồi quy tuyến tính Y= a + b C

Trong ®ã :
Y DiƯn tÝch hay chiỊu cao pic
a Giao điểm của đờng chuẩn với trục tung.
b Độ dốc của đờng chuẩn
C Nồng độ của chất thử
Dựa vào phơng trình đờng chuẩn để tính nồng độ chất thử. Chú ý ®é lín
diƯn tÝch hay chiỊu cao pÝc cđa chÊt thử phải nằm trong đờng chuẩn.

Trang 12/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

6. Quy trình phân tích thử nghiệm
Sau khi đà tham khảo các tài liệu chúng tôi đà thống nhất xây dựng
quy trình phân tích dự kiến và sử dụng các hoá chất thiết bị nh sau phù
hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
6.1 Nguyên lý của phơng pháp
Mẫu đợc xà phòng hoá bởi dung dịch kali hydroxit trong môi
trờng ethanol ở nhiệt độ phòng qua đêm hoặc xà phòng nóng ở nhiệt độ
75oC trong 1 giờ. Sau đó các chất không xà phòng hoá (trong đó có vitamin
D) đợc chiết bằng ete dầu hoả. Vitamin D đợc xác định bằng cách làm
sạch dịch chiết rồi bơm vào cột sắc ký và phát hiện b»ng detector DAD ë
b−íc sãng 265nm.
6.2 Ho¸ chÊt sư dơng
- Dung môi methanol của Merck loại dùng cho HPLC.
- Dung môi tetra hydrofuran THF của Merck.
- Dung môi ethanol loại PA của Trung quốc.

- Dung môi ete dầu hoả loại PA cđa Trung qc (30-60).
- Dung dÞch mi natri clorid 5% lo¹i PA cđa Trung qc.
- Chn cholecalciferol cđa Merck.
- Chuẩn ergocalciferol của Merck.
- Dung môi ethanol tuyệt đối loại PA của Merck.
- Chất chống ô xi hoá Tert butyl hydroquinol (TBHQ) PA cña Trung quèc

Trang 13/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

6.3 Thiết bị vµ dơng cơ
- HƯ thèng HPLC cđa Thermo Finnigan víi detector DAD
- Cét Inertsil ODS -3, 5µm, 250 x4,0 mm cđa Japan
- Cét t¸ch chiÕt ODS 2 cđa Waters Spherisorb 5àm; 4,0 x150mm
- Cân phân tích XT 220 của Thuỵ sĩ độ chính xác 10- 4g
- Máy quang phổ UV-VIS của Nhật
- Máy cất quay chân không loại Eyela của Nhật.
- Bộ phận hút chân không cho cột làm sạch SPE.
- Máy siêu âm ultrasonic LC 30 của Nhật.
- Bình định mức 100, 50, 25 ml
- Pipet bầu 5, 2, 1 ml
- Cèc cã má 500, 250, 100 ml
- èng đong 100, 25 ml
- Bình cầu cất quay chân không.
6.4 Cách tiến hành
6.4.1 Pha dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn vitamin D2 gốc 100 ppm: Cân trên cân phân tích 0,0100g
vitamin D2 cho vào bình định mức 100ml và pha loÃng đến vạch bằng dung
môi ethanol của Merck.
- Dung dịch chuÈn trung gian vitamin D2 nång ®é 1ppm: LÊy 1ml dung
dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml pha loÃng bằng ethanol đến
vạch.

Trang 14/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

- Dung dịch chuẩn vitamin D3 gốc 100 ppm: Cân trên cân phân tích 0,0100g
vitamin D2 cho vào bình định mức 100ml và pha loÃng đến vạch bằng dung
môi ethanol của Merck.
- Dung dịch chuẩn trung gian vitamin D3 nồng độ 1ppm: Lấy 1ml dung
dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml pha loÃng bằng ethanol đến
vạch.
- Xác định lại nồng độ các dung dịch chuẩn trung gian trên.
Sử dụng máy quang phổ UV-VIS đo độ hấp thụ (Abs) của mỗi dung dÞch
chn trung gian vitamin D2, D3 ë b−íc sãng 265 nm. Tính nồng độ thực
của dung dịch chuẩn (C) víi hƯ sè ε = 18466 víi vitamin D3 vµ = 18843
với vitamin D2
- Pha loÃng các dung dịch chuẩn trung gian thành các dung dịch chuẩn làm
việc với nồng độ khác nhau để xây dựng đờng chuẩn.
6.4.2 Chuẩn bị mẫu phân tích
- Mẫu đợc đồng nhất kỹ trớc khi xử lý: Đối với mẫu rắn phải xay hoặc
nghiền kỹ và trộn đều. Mẫu dạng bột, lỏng, sệt phải đợc trộn khuấy kỹ.

- Cân khoảng 0,5- 50 g mẫu độ chính xác 0,1g cho vào lọ nhựa.
- Mẫu đợc xà phòng hoá bằng cách cho thêm 40 ml ethanol, 25 ml KOH
80 % , khoảng 0,1 g TBHQ, xà phòng hoá ở 75 0C trong 1 giờ hoặc ở nhiệt
độ phòng qua đêm.
- Chiết các chất không xà phòng hoá bằng ete dầu hoả, hai lần mỗi lần 25
ml. Tập hợp lớp ete vào phễu chiết khác
- Rửa sạch lớp ete bằng dung dịch NaCl 5 % đến khi dung dịch trung tính.
- Lớp ete cho vào bình cất quay và chng cất đến còn khoảng 5ml.
- Làm sạch qua cét SPE - Si lo¹i 6ml:

Trang 15/46


Báo cáo đề tài nghiên cứu

Hà nội 2007

Các bớc làm sạch:
+ Cột đợc ổn định bằng 4 ml dung môi ethyl acetat: n-hexan = 7:73.
+ Sau đó nạp dung dịch chiết mẫu ở trên vào cột.
+ Rửa giải bằng 20 ml dung dÞch ethyl acetat : n-hexan = 7:73 .
+ Dung dịch rửa giải đợc cất quay đến cạn.
+ Hoà cặn còn lại bằng 1ml pha động lấy dung dịch bơm vào cột HPLC
6.4.3 Điều kiện chạy sắc ký dự kiÕn nh− sau
- HƯ thèng HPLC cđa Thermo Finnigan
- Cét tách chiết pha ngợc Inertsil ODS 3 và Waters RP18
- Pha ®éng (MeOH : THF : H2O) = ( 92:3: 5)
- Detector DAD ở bớc sóng 265nm
- Tốc độ dòng 1; 1,2; 1,5 ml/ phút
6.5 Tính kết quả

- Bơm các chuẩn làm việc vào cột HPLC xác định diện tích hay chiều cao
pic của mỗi chất chuẩn, xây dựng đờng chuẩn tơng quan giữa diện tích
hoặc chiều cao pic với nồng độ dÃy chuẩn. Hoặc dùng một chất chuẩn để
làm theo phơng pháp so sánh.
- Căn cứ vào đờng chuẩn để tính hàm lợng vitamin D trong mẫu theo
công thức sau.
X (àg/g) = V x Cm/m
Trong đó:
V: Thể tích dịch chiết cuối cùng để chạy sắc ký HPLC (ml)
Cm: Nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đờng chuẩn (àg/ml).
m: Khối lợng của mẫu phân tích (g)
X: Hàm lợng Vitamin D trong mÉu thư (µg/g).
Trang 16/46