Chuyển gen GFP trên Gà (Gallus Gallus domesticus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HCM
KHOA SINH HỌC

Chuyển gen ở động vật

Sinh viên thực hiện

1.
2.
3.
4.
5.
6.

11/3/15

Mai Hữu Phương
Nguyễn Duy Hải
Ngô Thị Hoài Diễm
Lê Thị Thu Trang
Nguyễn Thanh Như
Lê Thị Hằng

1


Nội dung

Quy trình và các phương pháp chuyển gen ở động vật

1

2

3

11/3/15

Mô hình chuyển gen ở gà

Thử nghiệm chuyển gen GFP trên Gà (Gallus Gallus domesticus)

2


1.1. Quy trình chuyển gen ở động vật

11/3/15

3


1.2. Phương pháp chuyển gen ở động vật
Phương pháp vi tiêm

Chuyển gen vào tinh
1

trùng

6

Chuyển gen qua

2

liposome
5
Chuyển gen nhờ virus

Chuyển gen nhờ sử dụng tế bào gốc
Chuyển gen nhờ xung

4

phôi

điện
3
11/3/15

4


2.1. Giới thiệu

Quá trình chuyển gen ở động vật đã được tiến hành thành công trên nhiều đối tượng khác nhau. Đặc biệt, ở gà, do cấu tạo và sinh lý có
nhiều ưu thế để tiến hành chuyển gen. Đây chính là đối tượng tuyệt vời để sản xuất protein tái tổ hợp trong trứng. Đây là một bước quan trọng
để tiến đến mục tiêu nhân giống gà mái có thể đẻ những “quả trứng vàng” mang protein dược phẩm.

11/3/15

5


2.2. Những thuận lợi và khó khăn khi sử dụng gà làm đối tượng chuyển gen

Thuận lợi



Thời gian thế hệ ngắn, tốc độ sinh trưởng nhanh.



Năng suất trứng cao.



Kích thước thích hợp



Trứng có môi trường vô trùng tự nhiên.



TP protein đơn giản.



Sự di cư của tế bào mầm.
11/3/15

6


2.2. Những thuận lợi và khó khăn khi sử dụng gà làm đối tượng chuyển gen

Khó khăn



Trứng gà ngay khi vừa được đẻ ra, phôi đã bắt đầu phát triển và chứa khoảng 40.000-60.000 tế bào.



Trứng lớn, dễ vỡ và khó thao tác.



Khó tiếp cận giai đoạn phôi sớm của chúng.

11/3/15

7


3.1. Đối tượng nghiên cứu
Gà Leghorn là giống chuyên trứng cao sản nhất thế giới hiện nay:



Sản lượng trứng một năm khoảng 250 - 270 quả.



Trứng to, nặng 60 - 65 g.



Tỉ lệ lòng trắng so với lòng đỏ cao.



Vỏ trứng màu trắng, dễ kiểm tra phôi trong quả trứng ấp.

11/3/15

8


3.1. Đối tượng nghiên cứu
Gà Leghorn là giống chuyên trứng cao sản nhất thế giới hiện nay

Gà Leghorn là đối tượng rất thuận lợi cho các nghiên cứu chuyển gen ở gia cầm
với mục đích sản xuất protein dược liệu trong lòng trắng trứng.

11/3/15

9

3.2. Vector pT2/BH-CVpf-SB11

Vector transposon Sleeping Beauty (SB)
Hệ thống transposon SB chứa một gen đơn mã hóa cho enzyme
transposase và một transposon chứa đầu tận cùng lặp lại tại vị trí liên
kết với transposase.

11/3/15

10


3.2. Vector pT2/BH-CVpf-SB11

11/3/15

11


Nhân dòng vector pT2/BHNhân dòng vector pT2/BHCVpf-SB11
CVpf-SB11

Tạo phức hợp lipoplex
Tạo phức hợp lipoplex
(ADN- liposome)
(ADN- liposome)

Chuyển gen bằng PP vi tiêm

Chuyển gen bằng PP vi tiêm

Chuyển gen qua tinh trùng
Chuyển gen qua tinh trùng

Kiểm tra sự có mặt của gen
Kiểm tra sự có mặt của gen
cần chuyển
cần chuyển

11/3/15

12


3.2. Nhân dòng E.coli mang vector pT2/BH-CVpf-SB11



Vector pT2/BH-CVpf-SB11 được biến nạp vào E.coli nhờ xung điện → Nuôi cấy vi khuẩn E.coli mang gen biến nạp.



Tách chiết, thu nhận plasmid từ E.coli. Plasmid sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8 %.

11/3/15

13

3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp

Nhân dòng E.coli mang vector pT2/BH-CVpf-SB11

Trứng gà 0 giờ ấp

11/3/15

Trứng gà mang gen pT2/BH-CVpf-SB11

14


3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.1. Phương pháp rèn kim tiêm

 



Ống mao quản thủy tinh, d = 1 mm



Máy kéo kim để kéo được đầu kim tiêm có đường kính 30 – 40 8



Bẻ đầu nhọn để có chiều dài và độ vát phù hợp

11/3/15

15


3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.2. Phương pháp tạo phức hợp lipoplex (ADN- liposome)
 



Lắc nhẹ Lipofectamin



Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.



Nhỏ 0,8 g ADN lên vị trí nhỏ Lipofectamin



Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng để tạo thành phức hệ ADN-Liposome.

11/3/15

TM

2000, nhỏ 2 l lên bề mặt của 100 l môi trường Opti-MEM.

TM

2000 ở trên.

16


3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ
Chuẩn bị vỏ đậy cửa sổ
Vỏ đá vôi



Dùng máy khoan mini khoan vỏ trứng thành các mảnh tròn có đường kính 1 cm.



o
Rửa sạch bụi với cồn 70 → rửa bằng PBS.



Bảo quản trong PBS để sử dụng cho các TN.

11/3/15

17

3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ
Chuẩn bị vỏ đậy cửa sổ
Màng vỏ



Tách màng vỏ ra khỏi màng đá vôi.



Rửa như mảnh vỏ đá vôi và bảo quản trong PBS để dùng cho
các TN sau.

11/3/15

18


3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ

Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA

11/3/15

19

3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ
Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA



Trứng gà được khử trùng bằng cách xông KMnO4 + formon và đặt nằm ngang trước
khi tiến hành vi tiêm ít nhất 2h.



Dùng máy khoan mini cắt một vòng tròn nhỏ có đường kính 0,5 cm trên phần vỏ đá
vôi của trứng.

11/3/15

20


3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ
Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA



Bôi paraffin xung quanh mép cửa sổ.



Gắp phần vỏ đá vôi đã khoan ra và nhỏ 1 giọt PBS lên cửa sổ.



Trứng được đưa vào buồng thao tác vô trùng và được xé rách màng vỏ bằng panh.

11/3/15

21


3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ

 

Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA
Sử dụng kim vi tiêm tiêm 2 l ADN vào xoang dưới phôi (chú ý không để
bọt khí đi vào phôi).

11/3/15

22


3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.3. Phương pháp mở cửa sổ
Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA



Lấy 1 miếng màng vỏ đậy lên cửa sổ.



Đậy tiếp 1 mảng đá vôi lên màng vỏ đã đậy.



Hàn kín cửa sổ bằng keo Duco.



Trứng được đem đi ấp và đặt theo chiều thẳng đứng với đầu tù quay lên trên.

11/3/15

23


3.4. Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp
3.4.4. Phương pháp ấp trứng



Trứng 0 giờ ấp sẽ được xông khử trùng bằng KMnO4 và focmon.



Trứng sau khi đã khử trùng được xếp vào khay với đầu tù quay lên trên.



Khay trứng được chuyển vào tủ ấp với chế độ ấp như sau:



o
Nhiệt độ: 37,8 C.



Đảo trứng: 2h/lần. 10-12 lần/ngày.



Thông thoáng: vận tốc gió 77 cm/giây; tốc độ quạt: 300 vòng/phút.
11/3/15

24


3.5. Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng
Nhân dòng E.coli mang vector pT2/BH-CVpf-SB11

Gà trống

Tinh trùng

Tinh trùng mang gen pT2/BHCVpf-SB11

Gà mái

11/3/15

25