Thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virus dại phục vụ chuyển gen

MỞ ĐẦU
Bệnh truyền nhiễm là căn bệnh nguy hiểm cướp đi sinh mạng của rất nhiều người
trên thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển. Cho đến nay bệnh truyền nhiễm
vẫn chưa có thuốc điều trị hoặc nếu có thì giá thành vẫn còn cao so với mức thu nhập
của người dân ở các nước này. Vì vậy vaccine đã trở thành phương tiện quan trọng và
hiệu quả trong việc phòng và chống lại các căn bệnh truyền nhiễm [11].
Nằm trong số những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, bệnh dại vẫn còn là vấn đề
nghiêm trọng với các nước đang phát triển, gây ra tỷ lệ tử vong cao cho người và gia
súc. Hàng năm, có khoảng 50.000 người chết vì những căn bệnh này và có tới 10 triệu
liều vaccine được dùng. Hơn 99% người chết do bệnh dại là ở châu Phi, châu Á và Nam
Mỹ trong đó chỉ tính riêng Ấn Độ mỗi năm có tới 30.000 người chết (Theo báo cáo của
tổ chức y tế thế giới). Hiện nay, có hơn 2,5 tỷ người đang sống trong vùng có tiềm ẩn
bệnh dại, trong đó trẻ em ở vào độ tuổi từ 5 - 15 có nguy cơ mắc bệnh cao nhất [33].
Ở Việt Nam, bệnh dại vẫn đang là vấn đề nan giải. Theo số lượng thống kê của
Viện Paster chỉ tính riêng thành phố Hồ Chí Minh, năm 2001, trên địa bàn Thành phố có
82.000 người bị súc vật cắn phải đi tiêm phòng tại các cơ quan y tế. Nhưng hiện nay vẫn
chưa có thuốc đặc trị căn bệnh này, vì vậy việc phòng chống bệnh bằng vaccine là
phương pháp tối ưu nhất. Tuy nhiên, những loại vaccine trên thị trường hiện nay phổ
biến là loại vaccine bất hoạt. Vaccine này có nhiều hạn chế như phản ứng phụ cao,
không an toàn tuyệt đối, virus có thể phục hồi lại khả năng gây bệnh.
Sự phát triển của công nghệ sinh học đã cho phép tạo ra những loại vaccine hoàn
toàn mới. Những loại vaccine này có thể từ trước tới nay chưa hề có, hoặc đơn giản có
thể chỉ là những vaccine có hiệu lực cao hơn và phản ứng phụ ít hơn so với vaccine cổ
điển. Hiện nay, sử dụng phương pháp ADN tái tổ hợp trên các đối tượng khác nhau như
E. coli, nấm men… người ta đã tạo thành công một số loại vaccine thế hệ mới. Nhưng
đối với vaccine dại và một số loại vaccine khác việc biểu hiện trong các tế bào vi sinh
vật lại gặp nhiều khó khăn. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất vaccine trên các đối tượng
cây trồng (khoai lang, đu đủ, lạc, cà chua, thuốc lá…) đang được nhiều nhà khoa học
quan tâm vì tính hiệu quả của nó. Sản xuất vaccine tái tổ hợp trên các đối tượng cây
trồng sẽ giảm giá thành xuống rất nhiều so với vaccine đang được sản xuất trên tế bào
động vật. Vì vaccine thực vật có thể sản xuất được một lượng lớn, kỹ thuật đơn giản phù

1
hợp với trình độ các nước nghèo và đang phát triển. Hơn thế nữa, vì là vaccine ăn hoặc
uống được, nên vaccine thực vật đơn giản hoá các bước khi sử dụng và bảo quản [1, 13].
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Thiết kế Ti-
plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virus
dại phục vụ chuyển gen” với mục đích tạo ra vectơ tái tổ hợp mang gen mã hoá kháng
nguyên vỏ của virus dại có khả năng gây đáp ứng miễn dịch để chuyển vào thực vật,
nhằm tạo ra cây trồng chuyển gen có khả năng sản xuất vaccine tái tổ hợp ăn, uống
được.
2
Chơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Giới thiệu chung về Vaccine
1.1.1. Vaccine và hiệu quả phòng chống bệnh truyền nhiễm
Kể từ khi Edward Jenner (1749-1823) tìm ra phơng pháp tiêm chủng mủ đậu
mùa bò cho ngời để phòng bệnh đậu mùa đến nay đã hơn 200 năm. Cho đến nay
vaccine vẫn đợc coi là thành tựu vĩ đại nhất của y học hiện đại. Công tác tiêm chủng đã
đợc thực hiện ở tất cả các quốc gia trên thế giới và trở thành một tấm lá chắn hữu hiệu
chống lại nhiều bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus gây ra. Nhờ có vaccine mà
hàng trăm triệu ngời trên thế giới đã thoát khỏi bệnh tật và thần chết. Vaccine là chế
phẩm kháng nguyên chỉ gây phản ứng miễn dịch mà không gây bệnh. Vaccine dùng để
kích thích đáp ứng miễn dịch nguyên phát làm tăng tế bào ghi nhớ và khả năng đáp ứng
miễn dịch ghi nhớ khi tiếp xúc với kháng nguyên ấy trong tơng lai. Kháng nguyên
không nhất thiết phải là toàn bộ hạt virus, chúng có thể chỉ là một bộ phận của virus có
khả năng kích thích cơ thể sản xuất kháng thể hoặc xytokin trung hoà virus [2].
Đối với các nớc đang phát triển, vaccine đợc coi là biện pháp phòng và chữa
bệnh hiệu quả nhất, do tại đây bệnh truyền nhiễm vẫn còn là căn bệnh nguy hiểm, cha
có thuốc điều trị đặc hiệu hoặc nếu có thì giá thành lại quá cao so với thu nhập của ngời
dân. Còn với những nớc phát triển, tình hình mắc bệnh truyền nhiễm và tỷ lệ tử vong do
bệnh này đã giảm đáng kể, ở một số nớc, tỷ lệ tử vong chỉ còn chiếm 4 - 8% tổng số
các trờng hợp tử vong. Điều này không có nghĩa là vaccine không còn quan trọng ở các

nớc này nữa. Thực tế cho thấy rằng, tỷ lệ bệnh truyền nhiễm giảm đáng kể là nhờ việc
sử dụng một cách rộng rãi vaccine cho việc phòng chống bệnh trong nhiều thập kỷ qua.
Ví dụ cụ thể đối với bệnh đậu mùa, năm 1967 có tới hơn mời triệu ngời mắc, bệnh này
đã lan truyền trên 30 nớc, nhng đến nay nhờ việc sử dụng vaccine trong nhiều năm mà
ngời ta đã loại bỏ đợc hoàn toàn căn bệnh này [2]. ở Việt Nam, sau một thời gian dài
thực hiện việc tiêm chủng liên tục, vào năm 2000 chúng ta đã tuyên bố với cả thế giới
về việc đã thanh toán xong bệnh bại liệt.
Hiệu quả của việc sử dụng vaccine không chỉ giới hạn ở mặt phòng và chữa bệnh
mà còn rất có lợi về mặt kinh tế. Chi phí cho tiêm chủng rẻ hơn rất nhiều so với để cho
ngời dân mắc bệnh rối mới chữa. Các thuốc kháng sinh cũng nh hoá trị liệu thờng rất
đắt tiền, đấy là cha kể tới chi phí về đi lại, giảm năng suất lao động, gây ra tác dụng phụ
cũng nh gia tăng chi phí về dịch vụ y tế [9].
3
Bên cạnh đó vaccine còn có vai trò quan trọng trong ngành thú y, đặc biệt đối
với các cơ sở chăn nuôi có mật độ gia súc cao làm cho khả năng lây nhiễm gia tăng
nhanh chóng. Nhất là trong tình trạng hiện nay, chúng ta đang phải đối phó với nhiều
loại dịch bệnh gây tổn thất nặng nề cho nên kinh tế quốc dân, điển hình là bệnh cúm
gia cầm xuất hiện gần đây ở nớc ta [4].
Hiện nay, nhiều loại accine giảm độc lực và vaccine bất hoạt đang đợc sử dụng
để dự phòng nhiều loại bệnh khác nhau. Vấn đề đáng lo ngại là các vaccine sống giảm
độc lực gặp phải là sự phục hồi trở lại khả năng gây bệnh của chúng. Chẳng hạn nh
vaccine Sabin (vaccine giảm độc lực để phòng bệnh bại liệt), trình tự axit nucleic của
chủng vaccine và chủng hoang dại chỉ khác nhau có hai nuclêotit vì vậy theo thời gian
chúng có thể đột biến ngợc trở lại thành chủng hoang dại có khả năng gây bệnh. Theo
thống kê gần đây cho thấy, từ năm 1973 đến năm 1984 khi sử dụng vaccine Sabin để
phòng bệnh bại liệt, cứ 520 nghìn trờng hợp sử dụng thì có một trờng hợp mắc bệnh bại
liệt do virus đột biến ngợc trở lại. Còn có một điều nguy hiểm nữa là vaccine giảm độc
lực là các virus sống, chúng có thể nhân lên hoặc tồn tại dới dạng tiểm ẩn trong cơ thể
và có thể gây hậu quả nghiêm trọng trong tơng lai. Một nguy cơ nữa là, tác nhân giảm
độc lực dùng trong sản xuất vaccine tuy không có khả năng gây bệnh đối với cơ thể ng-

ời khoẻ mạnh nhng lại vẫn có khả năng gây bệnh đối với ngời bị suy giảm miễn dịch.
Do đó, đối với một số nớc đang phát triển, vẫn đề sẽ là rất đáng lo ngại nếu có nhiều trẻ
em bị suy giảm miễn dịch do suy dinh dỡng đợc dùng loại vaccine này [6].
Công nghệ ADN tái tổ hợp và phơng pháp tổng hợp bằng phơng pháp hoá học có
vai trò rất lớn trong việc khắc phục những vấn đề trên, cho phép chúng ta sản xuất đợc
các vaccine phòng bệnh mà đối với phơng pháp cổ điển không thể tạo ra đợc.
1.1.2. Vaccine tái tổ hợp
Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, có rất nhiều loại vaccine mới đợc
tạo thành. Những loại vaccine này đã khắc phục đợc những bất lợi của các loại vaccine
cổ điển và có hiệu lực cao hơn, chúng đợc gọi là vaccine tái tổ hợp.
Vaccine tái tổ hợp không đợc sản xuất theo cách thông thờng, chúng đợc sản
xuất ra từ một loại cơ thể sống có thể đợc xem là hoàn toàn vô hại. Để tạo ra đợc một
loại vaccine tái tổ hợp trớc hết ngời nghiên cứu phải xác định đợc phân tử nào tạo ra
đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, những phân tử này có thể là các protein, glycoprotein hoặc
thậm chí là một đoạn phân tử ADN (DNA vaccine). Phơng pháp ADN tái tổ hợp có thể
4
đợc sử dụng để tạo ra hàng loạt phân tử này trong những vi sinh vật vô hại nh E. coli,
nấm men hoặc tế bào động vật với các vectơ là các virus không gây bệnh nh
Baculovirus, Vaccinia virus, Adenovirus [4]. Bằng phơng pháp này, ngời ta có thể tạo ra
đợc vaccine ngay cả khi các tác nhân gây bệnh không thể nuôi cấy đợc hoặc các tác
nhân có thể nuôi cấy đợc nhng trong điều kiện rất khó khăn đòi hỏi chi phí tốn kém.
Không những thế, vaccine tái tổ hợp có khả năng gây đáp ứng miễn dịch định hớng với
từng thành phần của virus, ổn định, có thể không cần bảo quản lạnh và rất an toàn vì
gen độc đã đợc loại trừ [27]. Các vaccine thế hệ mới bao gồm: Vaccine dới đơn vị
(subunit vaccines) chỉ chứa một số phân tử nhất định của tác nhân gây bệnh, ví dụ nh
vaccine viêm gan B đợc sản xuất bằng công nghệ ADN tái tổ hợp đang đợc sử dụng
rộng rãi trên thế giới, hoặc vaccine ADN là những phân tử ADN có khả năng gây phản
ứng miễn dịch. Mặc dù, công nghệ ADN tái tổ hợp và phơng pháp tổng hợp hoá học đã
có vai trò rất lớn trong việc khắc phục những bất lợi của các loại vaccine cổ điển, nhng
cho đến nay số vaccine tái tổ hợp đợc sản xuất và đa ra thị trờng không nhiều. Đối với

một số loại vaccine do cấu trúc của phân tử kháng nguyên nên việc biểu hiện chúng ở
đối tợng vi sinh vật gặp rất nhiều khó khăn nh vaccine dại, vaccine viêm não Nhật Bản.
Vấn đề đặt ra ở đây là phải tìm ra đợc một hệ thống biểu hiện đầy đủ phân tử kháng
nguyên của virus. Trên thế giới, nhiều nhà khoa học đang tập trung nguyên cứu sản
xuất vaccine trên các đối tợng cây trồng nh: cây thuốc lá, cây lạc, khoai lang, cà chua,
chuối h ớng nghiên cứu này tỏ ra rất có triển vọng. Bởi vì, vaccine đợc sản xuất theo
cách này không những đã khắc phục đợc những nhợc điểm của các vaccine cổ điển mà
còn làm giảm đáng kể giá thành sản phẩm so với vaccine đợc sản xuất trên tế bào động
vật, vaccine thực vật có thể đợc sản xuất một lợng lớn với kỹ thuật đơn giản phù hợp với
trình độ của các nớc nghèo. Bên cạnh đó vaccine thực vật còn có giá trị sử dụng và bảo
quản, vì nó là loại vaccine ăn đợc hoặc uống đợc (edible vaccine, oral vaccine) [26].
1.2. Bệnh dại ( Rabies disease)
Virus dại thuộc họ Rhabdoviridae, chi Lysavirrus là loại virus hớng thần kinh
gây bệnh rất nặng cho các loài động vật máu nóng vì tế bào thần kinh không thể tái
sinh đợc, hơn nữa khi virus nhân lên sẽ làm mất tính gây độc của tế bào [10]. Virus có
hình viên đạn, trọng lợng phân tử 3,5 - 4,6 x 10
6
mol wt với chiều dài khoảng 180nm, đ-
ờng kính 75nm, chứa genome là ARN sợi đơn âm (-). Virus nhân lên trong tế bào chất
và nảy chồi từ màng sinh chất [16].
5
Hình 1. ảnh chụp virus dại dưới kính
hiển vi điện tử
Bệnh dại đợc truyền cho ngời thông qua các vết cắn của các loài vật trung gian.
Các loài thú ăn thịt hoang dã và súc vật nuôi trong nhà (chó, cáo, chó sói, chồn, mèo,
dơi ) đều có thể là ổ chứa virus dại. ở trung Mỹ và Nam Mỹ có những đàn dơi hút
máu, dơi ăn quả và dơi ăn côn trùng cũng bị nhiễm virus dại. Còn đối với nớc ta, nguồn
truyền virus dại cho ngời chủ yếu là chó, mèo nuôi trong nhà (khoảng gần 97%) [11].
Bệnh dại xảy ra hầu hết các nớc trên thế giới loại trừ một số hòn đảo vùng Caribê, nớc
Anh, Ireland, Nhật Bản, Đài Loan, Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha. ở vùng Tây Âu,

Canađa, US, và một vài nớc châu Mỹ Latin bệnh dại đã đợc phòng trừ đối với các vật
nuôi trong nhà, tuy nhiên virus dại vẫn còn tồn tại ở trong những loài động vật hoang dã
[32].
Khi ngời bị con vật nhiễm dại cắn, virus từ nớc bọt của con vật sẽ xâm nhập trực
tiếp vào hệ thống thần kinh ngoại biên và tấn công vào hệ thống thần kinh trung ơng
hoặc chúng cũng có thể nhân lên trong tế bào cơ. Thời gian ủ bệnh trong 2 - 8 tuần lễ
(có thể chỉ khoảng 10 ngày nhng cũng có thể kéo dài một năm, thậm chí lâu hơn). Thời
gian ủ bệnh tuỳ thuộc vào vị trí vết cắn và số lợng virus xâm nhập vào cơ thể qua vết
cắn. Nếu vết cắn gần đầu và cổ thì thời gian ủ bệnh sẽ rất ngắn. Cơn dại bắt đầu với
cảm giác sợ hãi, đau đầu, sốt, khó chịu và cảm giác dị thờng liên quan đến vết thơng do
súc vật cắn. Mỗi khi nhìn thấy nớc hoặc uống nớc, cơ nuốt co thắt làm cho bệnh nhân
sợ hãi. Sau đó bệnh tiến triển đến liệt, co cơn điên cuồng hoặc co giật. Bệnh thờng kéo
dài từ 2 đến 6 ngày, đôi khi lâu hơn. Nạn nhân chết do liệt cơ hô hấp. Tất cả những
bệnh nhân khi đã lên cơn dại đều dẫn đến tử vong [6].
Việt Nam, trớc 1999, mỗi năm có hàng triệu ngời bị chó dại cắn phải tiêm phòng
dại, 400 - 500 ngời chết do bệnh này: trong đó 30% là các cháu nhỏ dới 14 tuổi. ớc tính
mỗi năm, Việt Nam phải tốn tới vài chục tỷ đồng để mua vaccine cho ngời và chó mèo.
Hiện nay, số lợng tử vong do bệnh dại đã giảm 65%. Tuy nhiên, hàng năm vẫn có 50 -
6
60 trờng hợp tử vong do bệnh dại và hơn 650.000 ngời bị súc vật cắn phải đi tiêm
phòng. Bệnh dại xảy ra vào tất cả các mùa trong năm, nhất là vào mùa hè, tình hình
dịch bệnh càng tăng cao. Hầu hết các địa phơng trên cả nớc đều có ngời và súc vật mắc
bệnh dại, trong đó đồng bằng sông Hồng và trung du Bắc Bộ phổ biến hơn cả [11].
Gần đây, nguy cơ này càng tăng cao khi bệnh dại diễn ra phức tạp ở nhiều nớc
láng giềng. Từ năm 2001 đến nay số ngời tử vong do bệnh dại tại Trung Quốc liên tục
tăng từ 850 ngời lên tới 1.300 ngời nguyên nhân là số chó cảnh và số chó hoang dại gia
tăng, tỷ lệ đợc tiêm phòng thấp. Hàn Quốc đã đợc công nhận là thanh toán đợc hoàn
toàn bệnh dại nhng trong năm 2003 lại có 2 ngời chết vì bệnh dại. Việt Nam có quan hệ
mua bán súc vật với các nớc kể trên lại có khí hậu nóng ẩm nên rất rễ phát triển bệnh
dại [11].

1.2.1. Gen mã hoá cho kháng nguyên glycoprotein của virus dại
Virus dại thuộc họ Rhabdoviridae, chúng là những virus ARN, sợi đơn âm (-).
Chính vì thế, dạng ARN anti-sense của nó mang thông tin cần thiết để mã hoá cho
những protein virus. Điều này có nghĩa rằng, sợi ARN của hạt virus không trực tiếp
tham gia vào quá trình tổng hợp protein mà chúng đợc sao thành sợi dơng có vai trò là
ARN thông tin. Để làm đợc điều này, khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, virus phải mang
theo một enzym ARN polymerase phụ thuộc ARN (enzym tổng hợp sợi ARN bổ sung
từ sợi khuôn ARN) [30].
Giống nh tên gọi của chúng, những virus này có dạng hình que, có một đầu
tròn thờng đợc ví với hình viên đạn. Lớp màng ngoài có nguồn gốc từ màng tế bào
chất của tế bào vật chủ do chúng nhân lên trong tế bào chất và xuất bào bằng cách
nảy chồi ra từ màng sinh chất [10]. Một hạt virus bao gồm một lõi nucleocapsid là
ribonucleoprotein có vai trò quyết định đến tính lây nhiễm của virus. Đó là một cấu
trúc chuỗi xoắn nằm bên trong lớp màng của virus. Chuỗi ARN của virus dài 12 Kb,
mã hoá cho 5 loại protein đó là [33].
- Protein G (Glycoprotein): là những glycoprotein có trọng lợng phân tử 67kDa tồn tại
dới dạng trime đợc mã hoá bởi đoạn gen dài 1675bp. Glycoprotein tạo thành chồi gai
bề mặt dài khoảng 5 - 10nm, mang tính kháng nguyên kích thích cơ thể sản xuất ra
kháng thể trung hoà hạt virus.
7
Hình 2. Cấu trúc virus dại
- Protein M (matrix): đây là một protein màng ngoại vi có trọng lợng phân tử
26kDa. Về chức năng của chúng vẫn đang còn là vấn đề gây tranh cãi, cũng có thể nó
hoạt động với vai trò là cầu nối giữa nucleocapsid với màng tế bào hoặc lớp gai
glycoprotein bề mặt.
- Protein N (nucleoprotein) là cấu trúc bao quanh ARN genome virus có trọng l-
ợng là 55kDa. Tác dụng của protein này là bảo vệ genome tránh đợc sự phân cắt của
nucleases và giữ cho nó có hình dạng thích ứng trong quá trình dịch mã.
- Protein L (lagre) và NS (một loại protein phi cấu trúc, nó cũng đợc biết đến nh
phosphoprotein có khối lợng phân tử 38 kDa) hai protein này cùng nhau tạo nên dạng

ARN polymerase phụ thuộc ARN. Protein L có khối lợng phân tử 110kDa và đoạn gen
mã hoá cho nó chiếm khoảng 60% (6475bp) chiều dài của hệ gen [33].
Nhờ ứng dụng những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, đặc biệt là kỹ
thuật ADN tái tổ hợp, chúng tôi đang tiến hành thiết kế vectơ tái tổ hợp mang gen
mã hoá cho phân tử glycoprotein của virus dại để chuyển vào thực vật và thực vật
cải biến di truyền này sẽ sản xuất ra vaccine dại.
1.2.2. Phân tử glycoprotein của virus dại và cơ chế gây miễn dịch .
Phân tử glycoprotein của virus dại tạo thành một lớp gai bề mặt cắm sâu vào
màng của virus, có khối lợng là 65kDa, thờng tồn tại ở dạng cấu trúc trime, là một
protein vận chuyển màng (transmembrane). Một hạt virus có khoảng 1200 protein G
8
Hình 3. Hệ gen của virus dại
tạo thành 400 trime, giữ vai trò nh một kháng nguyên khi liên kết với tế bào đích đồng
thời có tác dụng dung hợp virus với màng tế bào vật chủ khi xảy ra quá trình nhập bào
[34]. Quá trình xâm nhập của virus xảy ra theo con đờng nhập bào bởi vì phân tử dạng
trime có thể chịu đợc pH 6,1. ở pH này cấu trúc trime của phân tử rất bền vững và có
thể cho phép một vùng kị nớc trên phân tử đợc bộc lộ và gắn vào màng của tế bào vật
chủ khi xâm nhập [18].
Virus dại cũng nh các loại khác thuộc chi lysavirus là một loại virus hớng thần
kinh gây ra bệnh viêm thần kinh cấp tính ở nhiều loài động vật có vú. Virus bền vững ở
từ pH 3 đến pH 11, và có thể sống nhiều năm ở -70
o
C hoặc đợc đông khô và giữ ở 0 -
4
o
C. Nhng nó cũng bị bất hoạt nhanh chóng khi bị sấy khô, dới tác dụng của tia UV, tia
X, ánh sáng mặt trời, trypsin, -proplolactone, hoặc các chất tẩy rửa khác [10]. Phân tử
glycoprotein liên kết với thụ thể đặc hiệu sẽ gây đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế
bào có sự tham gia của những tế bào T và T- bổ trợ. Khi đợc kích thích, tế bào T sẽ tiết
ra lymphokin hoạt hoá các đại thực bào, những đại thực bào này sẽ tới và diệt virus.

Còn tế bào T- bổ trợ, chúng sẽ kích thích tế bào B sản xuất ra kháng thể trung hoà virus
[9].
Liên kết đặc hiệu của phân tử glycoprotein với các phân tử trên bề mặt tế bào
thần kinh là một minh chứng, khẳng định sự tồn tại của thụ thể tế bào thần kinh đặc
hiệu cho phân tử glycoprotein. Trong một nghiên cứu gần đây, ngời ta sử dụng
glycoprotein dạng hoà tan để kiểm tra trên ngân hàng tế bào thần kinh phôi, và đã chỉ ra
đợc sự tồn tại của thụ thể nuerotrophin p75 murine với vai trò là một thụ thể của
glycoprotein. Thụ thể p75 nuerotrophin tồn tại bền vững trong động vật có xơng sống
và việc biểu hiện của nó tuỳ thuộc vào sự phát triển của bệnh. Trong quá trình phát sinh
phôi, p75 tồn tại ở cả tế bào nơron thần kinh và tế bào khác, nhng đến tuổi trởng thành
nó chỉ đợc biểu hiện ở tế bào thần kinh ngoại vi và tế bào thần kinh trung ơng. p75 có
chứa 4 miền giàu sistein (CRD) ở đầu N, đây là đặc điểm đặc trng của liên họ thụ thể
TNF. Nhng khác với cấu trúc trime của họ TNF, họ NGF của ligand neurotrophin lại có
cấu trúc dime. ái lực liên kết với p75 dao động trong khoảng vài nanogram, vị trí liên
kết đã đợc xác định là một vùng bao gồm cả CRD2 và CRD3. Vai trò sinh lý học của
liên kết này trong các nơron thần kinh ngày nay vẫn còn đang là một vấn đề tranh cãi. Một
vài hớng nghiên cứu mới đây khám phá ra rằng, tiền neurotrophin cũng có ái lực cao với
p75 [25].
9
1.3. Vi khuẩn agrobacterium timefaciens và hiện tợng biến nạp gen
vào thực vật.
Trong tự nhiên chúng ta thờng gặp ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm một
loại khối u gồm các loại tế bào không phân hoá và phát triển không có tổ chức. Những
khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giống nh tế bào ung th ác tính ở
động vật. Theo cơ chế hình thành ngời ta phân biệt hai loại khối u chính. Đó là khối u
di truyền và khối u cảm ứng. Khối u di truyền thờng xuất hiện ở một vài cặp lai có tính
chất hoà hợp không cao ở một nhiễm sắc thể riêng rẽ nào đó, đặc biệt khi lai các loài
khác chi của thuốc là Nicotiana hoặc chi rau cải Brasica. Loại khối u cảm ứng đợc biết
đến nhiều nhất là khối u crown gall do loại vi khuẩn đất a. tumefaciens gây nên. Cơ chế
chính hình thành khối u cảm ứng này đợc Braun và Schiperoort nghiên cứu kỹ năm

1960 và đa lại những thành tựu quan trọng cho việc phát triển kỹ thuật di truyền tế bào
thực vật [4].
Về bản chất phân tử của quá trình cảm ứng phát sinh khối u ở thực vật, trớc hết
là quá trình nhiễm vi khuẩn a. tumefaciens ở các vùng tế bào bị thơng của cây. Bởi vì,
các tế bào bị thơng ở cây tiết ra những hợp chất polyphenol là acetosingone (AS) có
chức năng dẫn dụ tế bào vi khuẩn a. tumefaciens. Các tế bào vi khuẩn không xâm nhập
vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển nạp cho chúng một loại plasmid gây nên tính trạng
phát sinh khối u đợc gọi là Ti-plasmid (Tumor inducing). Cho đến nay trình tự nuclêotit
của Ti-plasmid đã đợc xác định. Ti plasmid là một phân tử ADN vòng tơng đối lớn gồm
150.000 - 200.000 cặp nuclêotit. Tuy nhiên, chỉ có một đoạn gồm 2000 - 3000 cặp
nuclêotit có khả năng gắn vào hẹ gen của tế bào chủ đợc gọi là T-ADN. Những enzym
có trách nhiệm chuyển nạp đoạn T-ADN từ plasmid vào hệ gen của tế bào chủ đợc mà
hoá bởi các đoạn gen vir [17]. Bên cạnh những gen chức năng vừa kể trên Ti-plasmid
có mang gen tổng hợp indolyl acetic axit, một loại auxin tự nhiên, vì thế mà khi nuôi
cấy in vitro những tế bào thực vật cảm biến có thể sống trong môi trờng thiếu auxin và
cytokinin. Ngoài ra, Ti-plasmid còn mang gen tổng hợp những axit amin hiếm, ví dụ:
một loại u tạo octopin và loại khác tạo nopalin vì vậy ngời ta phân biệt 2 loại plasmid là
loại nopalin và octopin có trong các chủng a. tumefaciens khác nhau. Về trình tự
nuclêotit chúng chỉ khác nhau ở đoạn gen mã hoá cho các enzym tham gia vào quá
trình sinh tổng hợp nopalin và octopin [1].
10
Hiện nay, ngời ta đã thành công trong việc cải biến Ti-plasmid bằng cách cắt bỏ
hầu hết các đoạn gen gây phát triển khối u chỉ để lại đoạn gen vir và phần T-ADN tối
thiểu mang điểm ghép gen. Loại vectơ này đợc sử dụng rất có hiệu quả cho việc đa
ADN lạ vào tế bào thực vật không những đối với loại cây hai là mầm mà cả ở lúa là đại
diện của loại cây một lá mầm.
1.4. Giới thiệu chung về vectơ sử dụng trong chuyển gen
Để có thể chuyển gen vào thực vật thông qua a. tumefaciens ngời ta phải sử dụng
một hệ thống vectơ chuyển gen. Có hai loại vectơ chuyển gen đó là vectơ liên hợp và
vectơ nhị thể.

1.4.1. Vectơ nhị thể (binary vector)
Vectơ nhị thể ra đời đã khắc phục đợc tình trạng khó nhân bản trong a.
tumefaciens của vectơ liên hợp. Một vectơ nhị thể bao gồm những thành phần sau: 1) Vị
trí ghép nối đa điểm; 2) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả trong E. coli và a.
tumefaciens, ví dụ RK2; 3) gen chọn lọc hoạt động cả ở vi khuẩn và thực vật nh gen
kháng kháng sinh, gen - glucuronidase ; 4) có khả năng vận chuyển nh oriV, oriT,
trfA, chỉ cần khi chuyển thông qua a. tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp;
5) Đoạn T-ADN ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên bắt buộc phải có.
Ngoài ra còn có một số thành phần phụ trợ khác nh gen kích thích vận chuyển T-ADN
(T-DNA transfer stimulator sequence = TSS). Hệ vectơ nhị thể đợc thiết kế bao gồm hai
plasmid tự tái bản. Loại vectơ vận tải mang GOI giữa đoạn biên của T-ADN và một
plasmid bổ trợ có gen vir đảm nhận chức năng vận chuyển gen ngoại lai vào tế bào thực
vật. Plasmid bổ trợ đợc cải biến từ Ti-plasmid tự nhiên bằng cách loại bỏ gen kích thích
tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào
thực vật [1].
Hệ thống vectơ nhị thể luôn đợc cải tiến để có thể nâng cao hiệu suất chuyển gen
thông qua A. tumefaciens. Một trong những hớng cải biến là đa vào vectơ một chuỗi
COS để phân lập các đoạn gắn lớn hoặc th viên gen thực vật, trong đó điển hình là vectơ
pBI121.
11
1.4.2. Vectơ pBI121
Các vectơ chỉ thực hiện đợc chức năng của mình khi chúng có một số đặc tính
nh: có khả năng tự sao chép độc lập và tích cực trong tế bào vật chủ; có kích thớc nhỏ,
dễ nhận gen quan tâm, dễ xâm nhập và đợc sao chép; mang một số dấu hiệu chọn lọc
giúp phân biệt các tế bào mang plasmid tái tổ hợp với các tế bào không có plasmid tái
tổ hợp; tồn tại bền vững trong tế bào vật chủ. Các đặc tính này là cơ sở quyết định các
thành phần chính của plasmid với: Gen quan tâm đợc gắn thêm đoạn khởi động và đoạn
kết thúc; gen chỉ thị chọn lọc; các thành phần khác nh vùng khởi đầu sao chép và vùng
trình tự nhân dòng đa điểm cắt (MCS) [5]. Vectơ pBI121 có kích thớc khoảng 13Kb với
các thành phần chính nh sau:

* Đoạn khởi động gen (promoter)
Các gen ngoại lai có thể đợc biểu hiện thành protein cần phải có mặt các tín hiệu
điều khiển thích hợp ở những vị trí thích hợp. Những tín hiệu không thể thiếu trong quá
trình điều khiển biểu hiện gen bao gồm đoạn khởi động gen và đoạn kết thúc gen. Đoạn
khởi động bao gồm trình tự nuclêotit phía đầu 5 của các gen cấu trúc. Nó đóng vai trò
điều khiển quá trình phiên mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhận biết cho enzym
ARN polymeraza, cho các yếu tố hoạt hoá và khởi động. Cho đến nay một số promoter
đợc sử dụng trong chuyển gen nh: Chuỗi khởi động xây dựng, chuỗi khởi động cảm
ứng, chuỗi khởi động trong các mô đặc thù. Promoter 35S là một dạng chuỗi khởi động
xây dựng đợc tách từ virus khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic virus 35S promoter
CaMV35S-P), loại promoter nos [7]. Trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật,
CaMV35S-P đợc sử dụng rộng rãi nhờ khả năng hoạt động mạnh ở nhiều loại mô của
cây hai lá mầm, tuy nhiên nó lại ít hoạt động ở cây một là mầm. Để khắc phục nhợc
điểm này, CaMV35S-P đợc sử dụng kết hợp với các thành phần khởi động khác, chẳng
hạn vectơ pEmu chứa nhiều bản sao của các tiểu phần phản ứng kị khí của gen Adh1 từ
ngô và các tiểu phần của gen tổng hợp octopin từ A. tumefaciens đã làm gia tăng sự biểu
hiện của gen trong cây một là mầm lên hàng chục lần [12].
Promoter 35S dài 350bp, gồm 3 thành phần:
- Hộp TATA ( ở vị trí từ- 46 đến + 8).
- Vùng tăng cờng A (enhancer) từ vị trí - 90 đến - 46, làm tăng biểu hiện gen
ngoại lai ở rễ.
12
-Vùng tăng cờng B (enhancer) từ vị trí -343 đến -90, làm tăng biểu hiện gen
chuyển ở lá. Trong vùng B gồm 5 phần nhỏ từ B1 - B5 phân chia theo mức độ phản ứng
của mỗi vùng đối với các yếu tố dịch mã khác nhau [17].
Nếu xảy ra sự thay đổi trong vùng tăng cờng từ vị trí -207 đến -56 có thể dẫn
đến mất khả năng gây nhiễm của virus. Lợi dụng tính chất này, có thể gắn gen ngoại lại
vào vùng enhancer sẽ làm mất khả năng gây nhiễm của virus khảm súp lơ [17].
*Đoạn kết thúc.
Các đoạn kết thúc thờng chứa đuôi polyA nh AATTAA, hoặc AACCAA giúp

bảo vệ các phân tử ARN thông tin đợc bền vững hơn và tránh đợc sự phân huỷ. Hai
đoạn kết thúc đợc sử dụng nhiều trong công nghệ gen thực vật là đoạn kết thúc của
CaMV35S (có mặt trong 7 sản phẩm chuyển gen hiện nay) và đoạn kết thúc NOS có
mặt trong ít nhất 16 - 28 sản phẩm) [7].
*Gen chỉ thị
Các chỉ thị chọn lọc di truyền sử dụng trong biến nạp thực vật thờng có nguồn
gốc từ vi khuẩn hoặc thực vật, gồm 2 loại chính:
- Chỉ thị chọn lọc (selectable marker): kết cấu gen mang đoạn khởi động NOS
(nopaline synthase promoter-terminater) điều khiển sự biểu hiện gen kháng npt2
(neomycin phospho transferase gene), chỉ có những thể biến nạp sống đợc trên môi tr-
ờng có kháng sinh kanamycin. Việc sử dụng gen chỉ thị cần đạt một số yêu cầu sau:
chất chọn lọc ức chế sinh trởng các tế bào không đợc biến nạp, sự thể hiện của gen
chọn lọc không làm ảnh hởng tới trao đổi chất của các tế bào chuyển nạp, sự biểu hiện
của gen chọn lọc bảo vệ tế bào khỏi tác dụng của chất chọn lọc, không ảnh hởng tới cây
chuyển gen [4].
- Chỉ thị sàng lọc (screenable marker) không chỉ giúp nhận biết các thể biến nạp
mà còn dự đoán đợc mức độ biểu hiện gen quan tâm trong mô thực vật đợc chuyển gen.
Chẳng hạn, chỉ thị -glucuronidaza (GUS) cho phép sàng lọc hoạt tính của enzym dễ
dàng trên cơ sở kĩ thuật nhuộm hoá tế bào. Gen chỉ thị sàng lọc cần có một số đặc điểm
sau: sản phẩm của nó là độc nhất và không độc đối với tế bào thực vật, các enzym chỉ
thị phải có khả năng dịch mã ổn định cao, phơng pháp phân tích thuận tiện, rẻ tiền, độ
nhạy cao và có khả năng phản ứng với các polypeptit ngoài mà không ảnh hởng hoạt
tính enzym [7] .
13
* Vùng khởi động sao chép và MCS
- Vùng pUC ori: vùng khởi động sao chép trong E. coli, có nguồn gốc từ vectơ
pUC9.
- RK 2 ori V: vùng khởi động sao chép trong A. tumefaciens, có nguồn gốc từ
plasmid RK2.
- Vùng MCS có chứa trình tự điểm cắt của rất nhiều loại enzym nh HindIII, SphI,

PstI, EcoRV Trong đó chúng ta quan tâm đến hai loại enzym là BamHI và SacI, trình
tự điểm cắt của chúng ở hai đầu của gen GUS. Vì vậy khi cắt pBI121 bằng hai loại
enzym trên sau đó điện di chúng ta sẽ thu đợc hai băng tơng ứng với kích thớc khoảng
11,2Kb (vectơ) và 1,8Kb (gen gus). Nếu gắn vào đoạn gen ngoại lai mà ta mong muốn
thì gen GUS không đợc biểu hiện. Điều này rất có ý nghĩa trong việc chọn lọc thể biến
nạp [5].
Trong tơng lai, việc tối u hoá hệ thống chủ/vectơ và cải tiến các vectơ trên cơ sở
nghiên cứu tỉ mỉ các yếu tố tham gia vào quá trình chuyển nạp ổn định, các yếu tố đa
gen chuyển nạp vào vị trí nhất định trong genome thực vật và các điều kiện nuôi cấy tái
sinh cây chuyển gen vẫn là những vấn đề cần thiết trong nghiên cứu chuyển gen ở thực
vật.
14
Hình 4. Sơ đồ cấu trúc vectơ pBI121
1.4.3. Tình hình nghiên cứu vaccine thực vật trên thế giới
Cho dù hiện nay phần lớn thuốc chữa bệnh đợc tổng hợp bằng phơng pháp hoá
học, tuy nhiên 1/3 tổng số thuốc trên thị trờng đều có nguồn gốc từ thực vật. Cùng với
sự phát triển của công nghệ gen, thực vật lại đợc biết đến với một vai trò là một nguồn
nguyên liệu mới trong việc sản xuất thuốc phòng bệnh. Thực vật chuyển gen sản xuất
kháng nguyên phòng bệnh dịch tả, bệnh viêm gan B và bệnh dại đang đợc phát triển ở
rất nhiều phòng thí nghiệm trên toàn thế giới (Boyce Thompson Plant Research
institute, Thomas Jeferson institute, North Carolina State University) [27].
Vaccine ăn đợc (edible vaccine) sản xuất ở trong thực vật ( Dr. Charles Arntzen,
Boyce Thompson institute for Plant Research, USA) đã xoá bỏ những rào cản trong việc
sản xuất vaccine bằng phơng pháp nuôi cấy tế bào. Đặc biệt đối với các nớc đang phát
triển, những rào cản này trở nên khó khăn hơn rất nhiều, chúng bao gồm: những yếu tố
cần thiết cho công nghệ lên men, quy trình tinh sạch nghiêm ngặt, đòi hỏi bảo quản ở
nhiệt độ thấp trong suốt quả trình vận chuyển, giá thành cao Việc sản xuất vaccine
bằng thực vật cải biến di truyền có thể cung cấp sản phẩm với giá rẻ hiện đang đợc thực
hiện với các bệnh dại, bệnh dịch tả, bệnh viêm gan B, bệnh sốt rét, bệnh AIDS và chỉ
đơn thuần, khi ăn các loại thực vật này, cơ thể của chúng ta sẽ sinh kháng thể chống lại

bệnh tật [27].
Dr. arntzen cùng các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra cây thuốc lá sản
xuất vaccine phòng bệnh viêm gan B và chứng minh đợc rằng vaccine đợc sản xuất
trong thực vật có cấu trúc và chức năng tơng tự nh những vaccine đợc sản xuất từ huyết
thanh ngời hoặc từ tế bào nấm men. Chúng cũng gây đáp ứng miễn dịch rất mạnh khi đ-
ợc tiêm vào chuột. Khandelwal và cộng sự cũng công bố đã thành công trong việc
chuyển gen mã hoá cho protein ngng kết tố hồng cầu của virus dịch hạch ở bò vào cây
lạc, cây thuốc lá [23, 24].
Một loại vaccine khác cũng đợc tạo thành theo cách này, đó là vaccine phòng
bệnh tiêu chảy. Dr. arntzen cùng các cộng sự cũng đã tạo ra đợc cây thuốc lá và cây
khoai tây chuyển gen có chứa một lợng lớn các chất kháng nguyên hoạt động là các độc
tố trong ruột không bền với nhiệt của E. coli (E. coli heat labile enterotoxin = LT-B).
Độc tố này có cấu trúc tơng tự nh độc tố của virus tả. Những con chuột đợc ăn các loại
thực vật này đã bộc lộ phản ứng miễn dịch rất mạnh. Các cuộc thử nghiệm biểu hiện
lâm sàng trên những ngời tình nguyện bằng việc sử dụng khoai tây tơi chứa vaccine
15
phòng bệnh tiêu chảy sẽ sớm kiểm chứng hiệu quả của vaccine có nguồn gốc từ thực
vật [27].
Những nhà nghiên cứu ở trờng đại học Thomas Jefferson bang Philadelphia,
USA đã tạo ra cây cà chua có biểu hiện kháng nguyên của virus dại. Dr. Karaser và các
cộng sự tại phòng thí nghiệm Biotechnology Foundation của Thomas Jefferson
University cũng đã biểu hiện đợc vaccine dại trong cây rau bina (spinach). Dr. Karaser
thông báo rằng, đề tài nghiên cứu này đã đợc kiểm chứng bằng một cuộc thử nghiệm
gồm 16 ngời chia thành hai nhóm: một nhóm đối chứng và một nhóm thí nghiệm.
Nhóm thí nghiệm đợc ăn khoảng 150g lá rau bina. Kết quả khi kiểm tra thì những ngời
này có số lợng kháng thể tăng hơn so với nhóm còn lại. Vaccine dại từ thực vật sẽ đợc
phát triển một cách đầy đủ trong vòng từ 2 - 4 năm tiếp theo [13].
Xuất phát từ nhu cầu về vaccine ở nớc ta hiện nay, đồng thời để nhanh chóng
nắm bắt và tiếp cận với công nghệ mới trong việc sản xuất vaccine và các dợc chất chữa
bệnh cho ngời, động vật trên đối tợng cây trồng. Phòng công nghệ tế bào thực vật thuộc

Viện Công nghệ Sinh học đang thực hiện một số đề án chuyển gen mã hoá cho kháng
nguyên của một số virus nh virus dại và virus viêm não Nhật Bản vào cây trồng.
16
Chơng 2. Vật liệu v à phơng pháp
2.1.Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Các chủng vi sinh vật và cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
- Vi khuẩn A. tumefaciens chủng Cv58C1, pGV2206 và pGV3101 và vi khuẩn
E.coli chủng DH5 của hãng Gibco BRL, life Technologies, Mỹ.
- Chủng E. Coli Top 10 mang vectơ pBI121.
- Cặp mồi đặc hiệu RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacI hãng invitrogen tổng hợp.
- Plasmid (vectơ pCR

2.1+ gen GlyP) mang toàn bộ gen mã hóa cho phân tử
glycoprotein của virus dại chủng Vnucovo-32.
Các vật liệu trên đợc Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.1.2. Hoá chất, thiết bị
* Hóa chất
Hoá chất dùng trong nghiên cứu là của hãng: Invitrogen, Amersham Parmacia
Biotech, New England Biolabs Bao gồm một số hoá chất sau:
- Bộ hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR của hãng Applied Biosystem (Mỹ)
- Bộ kít thôi gel của hãng QIAGEN ( QIAquick Gel Extraction Kit)
- Bộ kit tinh sạch ADN của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Purification Kit)
- Thang ADN 1Kb của hãng MBI Fermantas, hai enzym BamHIvà SacI, dung
dịch đệm, BSA
- Dung dịch đệm 10X, rATP, T
4
ligase
- Pepton 10g/l, trypton 10g/l, Yeast extract
- NaCl, MgSO
4

.7H
2
O, 1mM HEPES
- Agarose, sucrose, 50mM glucose
- Glycerol , 0,1 M CaCl
2
, 5M acetat potassium, acetic acid, NaOH, SDS 1%
- Các loại kháng sinh kanamycin, ampecilin và rifamycin
- Cồn 70%, dung dịch chloroform : isopropanol (24 : 1), nớc khử ion, RNase
17
- 25mM Tris HCl pH 8, 10mM EDTA pH 8 (Ethylene Diamine tetraacetic)
* Thiết bị
- Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300
(Bio-Rad, Mỹ), máy soi ADN (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh
(Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức),
máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gene
Plulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện
Công nghệ sinh học.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu

18
Hình 5. Sơ đồ thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen GlyP
Sản phẩm PCR-GlyP

gus
NOST

GlyP
Sac
BamH I

I

Bam HI & Sac I

BamHI

SacI
T4 - ligase

35S
gus
NOST
35S
GlyP NOST

BamHI

SacI
35S
pBI121 ...
pBI121
pBI121 ... pBI121
pBI121 ...
pBI121