Tinh chế interleukin 2 của người tái tổ hợp cải biến trong escherichia coli ở quy mô nồi lên men và tạo công thức bán thành phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------

Đào Trọng Khoa

TINH CHẾ INTERLEUKIN-2 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP
CẢI BIẾN TRONG ESCHERICHIA COLI
Ở QUY MÔ NỒI LÊN MEN VÀ TẠO CÔNG THỨC
BÁN THÀNH PHẨM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số chuyên ngành: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS. TS. Trương Nam Hải
PGS. TS. Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2015


Lời cảm ơn
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Trương Nam Hải, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, và PGS. TS.
Nguyễn Quang Huy, Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên,
Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý
báu cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu.
Tiếp đến tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của trường Đại

học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy cho tôi
trong suốt thời gian tham gia khóa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các cán bộ nghiên cứu, nhân viên của phòng
Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học và Công ty TNHH Vắc xin và Sinh
phẩm số 1 (Vabiotech) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam đã tận tình chỉ bảo động viên và
cho tôi những lời khuyên quý giá trong công việc cũng như cuộc sống.
Tôi xin gửi lời cám ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, các thầy cô
giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh nói riêng cũng như trong toàn Khoa
Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung đã
tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin được gửi tới gia đình, bạn bè lời cảm ơn chân thành nhất vì
đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội ngày 16 tháng 06 năm 2015
Học viên cao học

Đào Trọng Khoa


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4
1.1. Tổng quan về bệnh ung thư ..................................................................................4
1.1.1. Khái niệm về bệnh ung thư ...........................................................................4
1.1.2. Tình hình ung thư trên thế giới và ở Việt Nam .............................................8
1.1.3. Các phương pháp điều trị ung thư ...............................................................10
1.2. Tổng quan về Interleukin-2 ................................................................................11
1.2.1. Cấu trúc của Interleukin-2 ...........................................................................11
1.2.2. Vai trò và chức năng sinh học của Interleukin-2.........................................13
1.2.3. Ứng dụng của Interleukin-2 trong điều trị ung thư .....................................15

1.3. Hệ thống lên men nuôi cấy E. coli tái tổ hợp .....................................................17
1.4. Tinh sạch protein dạng thể vùi ...........................................................................19
1.4.1. Tổng quan về tinh sạch protein ...................................................................19
1.4.2. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ..22
1.5. Công thức pha chế bán thành phẩm ...................................................................24
CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................28
2.1. Chủng giống và vật liệu nghiên cứu ...................................................................28
2.1.1. Chủng vi khuẩn E. coli BL21 DE3 ..............................................................28
2.1.2. Vector biểu hiện ..........................................................................................28
2.1.3. Hóa chất .......................................................................................................29
2.1.4. Máy móc và thiết bị .....................................................................................29
2.1.5. Các môi trường và dung dịch ......................................................................30
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................32
2.2.1. Biểu hiện protein Interleukin-2 trong E. coli ở quy mô nồi lên men 5 lít ...32
2.2.2. Phương pháp xử lý tiền tinh chế Interleukin-2 ............................................33
2.2.3. Phương pháp tinh chế Interleukin-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao .........34
2.2.4. Kiểm tra sản phẩm protein bằng điện di SDS-PAGE .................................35
ii


2.2.5. Phương pháp kiểm tra protein bằng phản ứng đặc hiệu miễn dịch Western
Blot ........................................................................................................................36
2.2.6. Phương pháp nghiên cứu lập công thức bán thành phẩm và đông khô .......38
2.2.7. Phương pháp xử lý kết quả điện di SDS-PAGE bằng phần mềm Quantity
One.........................................................................................................................40
CHƯƠNG III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................42
3.1. Nuôi cấy chủng E. coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men lớn.........................42
3.1.1. Nuôi cấy chủng E. coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men 5 lít ................42
3.1.2. Khảo sát thành phần dinh dưỡng .................................................................44
3.1.3. Khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng E. coli BL21 IL-2 .....................46

3.1.4. Lên men chủng E. coli BL21 IL-2 đợt 2 .....................................................47
3.2. Siêu âm phá tế bào và xử lý tiền tinh chế mẫu protein Interleukin-2 tái tổ hợp 48
3.3. Tinh chế mẫu protein Interleukin-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC ......................54
3.4. Xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng phần mềm Quantity One. ..............57
3.5. Nghiên cứu tạo công thức bán thành phẩm cho sản phẩm Interleukin-2 ...........58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................62
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................63

iii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Amp

Ampicillin

APS
AU
DNA

Ammonium persulfate
Absorbance unit
Deoxyribonucleotide acid

dOT
E. coli

Dissolved oxygene tension
Escherichia coli

EDTA

Ethylenediamin tetra-acetic acid

FDA

Food and Drug Administration

GnHCl
HIV
HPLC

Guanidine hydrochloride
Human Immunodeficiency Virus
High Performance Liquid Chromatography

HSA
IARC
IL-2

Human serum albumin
The International Agenecy for Research on Cancer
Interleukin-2

IPTG

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside

LAK
LB

LBA
NK
OD
PBS
PEG
PMSF

Lymphokine-Activated Killer cell
Môi trường Luria-Bertani
Môi trường LB có bổ sung Amp
Natural Killer
Optical density
Phosphate buffer saline
Polyethylene glycol
Phenylmethylsulfonyl fluoride

PVDF
rhIL-2
SDS
SDS-PAGE
TEMED
TBS
TFA
TMB

Polyvinylidene fluoride
Recombinant human Interleukin-2
Sodium dodecyl sulfate
SDS-polyacylamide gel electrophoresis
N,N,N’,N’-Tetramethyl-Ethylenediamin

Tris buffer saline
Trifluoroacetic acid
Tetramethylbenzidine

TTBS
WHO

Dung dịch TBS bổ sung Tween-20
World Health Organization
iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Tiêu bản nhuộm Wright-Giemsa tế bào thường và tế bào ung thư ác tính ở tủy
xương
Hình 2. Minh họa cấu trúc không gian 3 chiều của Interleukin-2
Hình 3. Đích tác động của Interleukin-2
Hình 4. Tác động của Interleukin-2 đến tế bào T
Hình 5. Hệ thống lên men bioreactor quy mô nhỏ
Hình 6. Hệ thống tinh sạch protein HPLC
Hình 7. Bản đồ vector biểu hiện pET22b(+) (Novagen)
Hình 8. Điện di protein tái tổ hợp IL-2 sau khi lên men bằng hệ thống lên men 5 lít
Hình 9. Điện di sản phẩm protein tổng số trong điều kiện thay đổi thành phần chất
dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy
Hình 10. Khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng tái tổ hợp so với chủng đối chứng
(E. coli BL21 không mang gene mã hóa IL-2)
Hình 11. Lên men chủng tái tổ hợp E. coli BL21 IL-2 đợt 2
Hình 12. Điện di mẫu siêu âm phá tế bào theo thời gian
Hình 13. Điện di SDS-PAGE mẫu protein sau khi biến tính bằng GuHCl, xử lý ly tâm
thu tủa không tan

Hình 14. Điện di SDS-PAGE mẫu protein sau khi biến tính bằng GuHCl, giảm nồng
độ GuHCl để thu hồi protein ở dạng tủa
Hình 15. Sơ đồ tóm tắt quá trình xử lý thô để thu hồi protein IL-2
Hình 16. Điện di kiểm tra các phân đoạn trong quá trình phá tế bào và xử lý thu
protein thô
Hình 17. Sắc ký đồ tinh chế protein IL-2 tái tổ hợp nhờ hệ thống HPLC
Hình 18. Điện di kiểm tra các phân đoạn trong quá trình tinh chế HPLC
Hình 19. Xác định thành phần độ tinh khiết của protein bằng phần mềm Quantity One
Hỉnh 20. Sản phẩm hoàn nguyên sau đông khô các hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm
Hình 21. Điện di kiểm tra các mẫu hoàn nguyên sau khi đông khô

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Phân biệt u lành và u ác theo đặc điểm sinh học
Bảng 2. Một số oncogene và tumor suppressor gene liên quan đến ung thư ở người
Bảng 3. Công thức cho 2 bản gel SDS-PAGE (gồm 2 lớp gel tách và gel cô)
Bảng 4. Bảng công thức pha chế bán thành phẩm
Bảng 5. Bảng tiêu chuẩn đánh giá độ đục của sinh phẩm
Bảng 6. Thông số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết của sản phẩm IL-2
bằng phần mềm Quantity One
Bảng 7. Độ đục của các hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm

vi


MỞ ĐẦU
Ngày nay, thế giới đang ngày càng nhận thức rõ mức độ nghiêm trọng của
các bệnh không lây nhiễm nói chung và bệnh ung thư nói riêng đối với sức khỏe

con người. Ước tính riêng ở Hoa Kỳ năm 2014, có 1 665 000 ca nhiễm ung thư mới
được phát hiện và gần 586 000 người tử vong do ung thư, trung bình 1600 ca mỗi
ngày [22]. Theo ghi nhận của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), số trường hợp mắc ung
thư mới đã tăng từ 12,7 triệu trường hợp năm 2008 lên 14,1 triệu trường hợp năm
2012, và vẫn có xu hướng tăng lên. Các quốc gia bị ảnh hưởng nặng nề nhất là các
nước có thu nhập thấp và trung bình, vì các nước này thiếu các trang thiết bị cần
thiết để đối phó với sự gia tăng của các trường hợp ung thư [23].
Hiện nay có 5 phương pháp điều trị ung thư chính đó là phẫu thuật, hóa trị
liệu, xạ trị liệu, liệu pháp gene và liệu pháp miễn dịch, trong đó liệu pháp miễn dịch
ngày càng được nghiên cứu sâu rộng và ứng dụng rộng rãi nhờ có nhiều ưu điểm là
an toàn, hiệu quả và không có tác dụng phụ. Liệu pháp miễn dịch là sử dụng các sản
phẩm có nguồn gốc từ hệ miễn dịch của cơ thể để tiêu diệt tế bào ung thư đồng thời
hỗ trợ sức sống cho các tế bào bình thường khác trong cơ thể. Một trong các loại
sản phẩm đó là cytokine, với nhiều loại khác nhau do nhiều loại tế bào tiết ra. Các
cytokine đã được nghiên cứu từ lâu với mục đích điều trị và hỗ trợ điều trị cả bệnh
truyền nhiễm và bệnh không truyền nhiễm của người, trong đó Interleukin-2 là một
trong những loại cytokine được nghiên cứu sớm nhất.
Interleukin-2 (IL-2) từ lâu đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc hỗ
trợ điều trị hai loại ung thư thận và ung thư hắc tố. Trước đây, IL-2 dùng cho điều
trị được tách chiết tự nhiên từ tế bào T hoặc là từ các tế bào động vật nuôi cấy,
phương pháp này có nhược điểm là hàm lượng IL-2 tách chiết được cũng như hoạt
tính riêng khá thấp không đáp ứng được yêu cầu điều trị. Để khắc phục những hạn
chế trên, IL-2 chủ yếu được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp. Hiện nay sản phẩm
Interleukin-2 tái tổ hợp dạng thương phẩm (Proleukin®) đã được bán rộng rãi ở trên
thế giới. Sự thử nghiệm chế phẩm Proleukin®IL-2 trên đối tượng động vật và trên

1


các bệnh nhân ung thư cho thấy chúng có hoạt tính sinh học với khả năng làm giảm

các tỷ lệ di căn của các khối u, không bị kết tủa và sử dụng dễ dàng nên được sử
dụng nhiều trong phương pháp miễn dịch trị liệu để điều trị ung thư [39, 45], tuy
nhiên giá thành của sản phẩm hiện tại khá cao (2532 USD/ ống 1,3mg) [19] đặc biệt
là so với thu nhập bình quân đầu người của các nước đang phát triển trong đó có
Việt Nam. Vì vậy hiện nay Nhà nước và Bộ Y Tế đang rất khuyến khích việc
nghiên cứu và sản xuất sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp của Việt Nam để hỗ trợ
điều trị ung thư.
Đề tài nghiên cứu KC.04.21/06-10 đã cho những kết quả nghiên cứu biểu
hiện Interleukin-2 tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli khá khả quan ở cả quy
mô phòng thí nghiệm và ở hệ thống lên men 5 lít. Tuy nhiên để đảm bảo sản phẩm
Interleukin-2 có cấu trúc hoàn toàn giống với sản phẩm thương mại Proleukin, tạo
điều kiện thuận lợi cho việc xin cấp phép sử dụng sản phẩm sau này, protein IL-2
cần được cải biến để loại bỏ amino acid alanine ở đầu N. Dự án “Hoàn thiện quy
trình công nghệ sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp trên dòng tế bào E. coli” giai
đoạn 2012-2015 được thực hiện nhằm hoàn thiện công nghệ sản xuất Interleukin-2
dạng cải biến.
Giai đoạn đầu của dự án đã cho kết quả biểu hiện thành công IL-2 dạng cải
biến ở quy mô phòng thí nghiệm. Tuy nhiên để hướng tới sản xuất quy mô lớn và có
khả năng ứng dụng thực tiễn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu biểu hiện Interleukin-2
ở quy mô lớn hơn trong hệ thống lên men. Sau khi protein đã được biểu hiện thành
công, cần có phương pháp thích hợp để tinh sạch sản phẩm Interleukin-2 và thiết
lập công thức bổ sung các tá chất cần thiết trước khi tiến hành đông khô sản phẩm
để bảo quản.
Trên cơ sở đó tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tinh chế Interleukin-2 người
tái tổ hợp cải biến trong Escherichia coli ở quy mô nồi lên men và tạo công
thức bán thành phẩm”. Mục tiêu của đề tài là nâng cao năng suất tổng hợp cũng
như tinh sạch IL-2 dạng cải biến với chi phí thấp để có thể sản xuất sản phẩm IL-2

2

người tái tổ hợp tiêu thụ trên thị trường. Nghiên cứu này được thực hiện nhờ sự hỗ
trợ kinh phí của Dự án: “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất Interleukin-2
người tái tổ hợp trên dòng tế bào E. coli” Mã số KC.04.DA02/11-15, và ứng dụng
kết quả thu được từ nghiên cứu và triển khai của các đề tài:
(1) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tạo Interleukin-2
tái tổ hợp dùng cho điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.33) do Viện Công nghệ sinh
học chủ trì, giai đoạn 2005-2007.
(2) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu đánh giá hiệu lực
của Interleukin-2 tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung
thư” (Mã số: KC.04.21/06-10) do Viện Công nghệ sinh học chủ trì, giai đoạn 20092010.
Đề tài được thực hiện tại phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Công ty Vacxin và Sinh
phẩm số 1 (Vabiotech), Bộ Y tế.

3


CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh ung thư
1.1.1. Khái niệm về bệnh ung thư
Ở hầu hết các mô và cơ quan của cơ thể trưởng thành, quá trình sản sinh ra
các tế bào mới và quá trình tiêu diệt các tế bào già được giữ ở trạng thái cân bằng.
Mỗi loại tế bào khác nhau trong cơ thể có một thời gian tồn tại nhất định, sẽ được
thay thế bằng bằng các tế bào mới có cùng chức năng khi tế bào đó chết đi. Dưới
các điều kiện bình thường, sự sản sinh của các tế bào mới được kiểm soát để số
lượng một loại tế bào bất kỳ nào trong cơ thể là tương đối ổn định [5].
Ung thư là sự phát triển không bình thường của tế bào do sai sót của quá
trình điều khiển ở mức độ phân tử xảy ra trong quá trình sống của tế bào. Tất cả các
loại tế bào trong cơ thể về nguyên tắc đều có thể biến thành tế bào khối u (tumor).

Các khối u này có thể là lành tính (benign) hoặc có thể biến thành ác tính
(malignant). Đặc điểm của tế bào ung thư là có thể nhân lên mà không cần các chất
điều hoà sinh trưởng của tế bào bình thường cần phải có và chúng không đáp ứng
với các tín hiệu chết theo chương trình của tế bào bình thường (apoptosis). Đặc tính
chung của các bệnh ung thư là sự sinh trưởng không kiểm soát của tế bào và khả
năng di căn hay lan rộng đến các vùng khác nhau trên cơ thể người bệnh [4].

Hình 1. Tiêu bản nhuộm Wright-Giemsa tế bào thường và tế bào ung thư ác tính
ở tủy xương [26].
4


Sự tăng sinh không kiểm soát của các tế bào bình thường dần tạo nên các
khối u gồm nhiều lớp tế bào chồng chất lên nhau. Nếu các tế bào khối u khu trú ở
một vùng duy nhất của cơ thể, không có biểu hiện xâm lấn các mô xung quanh thì
được gọi là khối u lành tính. Ngược lại nếu các tế bào khối u tách khỏi vị trí ban đầu
và xâm lấn ra các mô khác của cơ thể thì được gọi là khối u ác tính. Các khối u lành
tính thường khá an toàn trừ khi kích thước của chúng quá lớn dẫn đến chèn ép các
cơ quan hoặc các cấu trúc sống khác. Các khối u ác tính thì ngược lại, thường gây
hậu quả nghiêm trọng vì xâm lấn đến các cơ quan khác, lan ra những mô ở xa hơn
và hình thành những khối u thứ cấp (di căn) gây ảnh hưởng đến chức năng bình
thường của các cơ quan đó.
Bảng 1. Phân biệt u lành và u ác theo đặc điểm sinh học
U lành tính

U ác tính

Tế bào biệt hóa cao

Tế bào ít biệt hóa

Phân bào ít và chậm

Phân chia nguyên phân liên tục

Không xâm lấn xung quanh

Xâm lấn lan rộng

Không có hoại tử

Thường có hoại tử trung tâm

Có vỏ bọc

Không có vỏ bọc

Rất ít tái phát

Luôn tái phát

Không di căn

Di căn

Ít ảnh hưởng đến cơ thể

Ảnh hưởng lớn đến chức năng bình
thường đến cơ thể

Trước kia các nhà nghiên cứu tập trung vào việc phát hiện các nguyên nhân
gây bệnh, vì vậy ung thư được xếp vào 3 nhóm dựa vào nguyên nhân gây bệnh như
sau: (1) các virus gây ung thư, (2) các tác nhân lí hóa gây ung thư, (3) một số trường
hợp ung thư mang tính di truyền như bệnh ung thư ruột do di truyền có tên là
Familial Polyposis, bướu Wilms.
Vào các năm 1980 – 1990, khi các kỹ thuật di truyền được sử dụng lần đầu
tiên để nghiên cứu tế bào ung thư, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, dù ung
5


thư có biểu hiện rất đa dạng, nguyên nhân gây bệnh cũng rất khác nhau nhưng căn
nguyên của bệnh thực chất là do các sai hỏng của gene, hay nói cách khác là sự rối
loạn của bộ máy di truyền [29]. Tuy vậy, thông thường phải có vài sai hỏng xảy ra
đồng thời mới chuyển một tế bào bình thường sang trạng thái ung thư. Các nhà
nghiên cứu đã phân loại hai nhóm gene chính khi bị đột biến trực tiếp có liên quan
đến sự phát sinh các tế bào ung thư. Nhóm thứ nhất bao gồm các gene thúc đẩy quá
trình phân chia tế bào một cách không kiểm soát, được gọi là các gene gây khối u
(hay gene ung thư, oncogene). Các gene gây khối u điển hình nhất được tìm thấy
đầu tiên ở các retrovirut. Liên quan đến những gene này là các tiền gene gây khối u
(proto-oncogene) được tìm thấy ở các tế bào chủ. Các tiền gene gây khối u có thể
đột biến thành các gene gây khối u. Nhóm thứ hai bao gồm các gene khi ở dạng
bình thường có vai trò kiểm soát sự phân chia tế bào, được gọi là các gene ức chế
khối u (tumor suppressor gene, còn gọi là gene kiềm chế gene ung thư). Một nhóm
các gene này trực tiếp tham gia vào các cơ chế sửa chữa DNA, nên khi bị đột biến
chúng lại làm tăng tần số đột biến của những gene khác, vì vậy dạng đột biến của
chúng được gọi là các gene gây đột biến (mutator gene) [4].
Bảng 2. Một số gene ung thư và gene ức chế khối u liên quan đến ung thư ở người
[27]
Gene ung thư
Bcl-2

Mã hóa cho protein bất hoạt quá trình tự chết của tế bào, liên quan đến
ung thư bạch cầu.

c-myc

Liên quan đến ung thư vú, máu, dạ dày và phổi.

L-myc

Liên quan đến ung thư phổi.

PDGF

Mã hóa cho nhân tố sinh trưởng của tiểu cầu não, liên quan đến ung thư
não.

RET

Liên quan đến ung thư tuyến giáp.

Ki-ras

Liên quan đến ung thư phổi, buồng trứng, ruột, tuyến tụy.

6


Liên quan đến ung thư máu.

N-ras

Gene ức chế khối u
APC

Liên quan đến ung thư ruột và ung thư dạ dày.

DPC4

Mã hóa cho phân tử tín hiệu kích hoạt quá trình ức chế phân chia tế bào,
liên quan đến ung thư tuyến tụy.
Mã hóa cho protein p53, là gene điều khiển quá trình dừng phân chia và

p53

kích thích tế bào bất thường tự chết. Liên quan đến rất nhiều loại ung thư.
BRCA1

Liên quan đến ung thư vú và ung thư tử cung.

BRCA2

Liên quan đến ung thư vú.

VHL

Liên quan đến ung thư thận.

WT1

Liên quan đến khối u Wilm của thận.

Tế bào bình thường cần có tín hiệu sinh trưởng của tế bào để vượt qua các
điểm kiểm soát trong chu trình tế bào, một tế bào bình thường không thể tiến hành
quá trình phân chia nếu không có đủ các điều kiện như đạt đến kích thước và sinh
khối nhất định, tích lũy đủ chất dinh dưỡng, các quá trình nhân đôi DNA xảy ra
chính xác; nếu như những sai hỏng trong quá trình sinh trưởng của tế bào quá
nghiêm trọng và không thể sửa chữa được, các gene ức chế khối u sẽ khởi động quá
trình cho tế bào chết theo chương trình (apoptosis) để bảo vệ tình toàn vẹn của hệ
gene và duy trì số lượng tế bào ở một mức độ nhất định [36]. Ở các tế bào khối u,
một mặt các gene gây khối u hoạt động quá mức bình thường, dẫn đến việc tế bào
luôn luôn nhận được các tín hiệu cho phép vượt qua các điểm kiểm soát trong chu
trình tế bào, mặt khác các gene ức chế khối u bị sai hỏng, dẫn đến quá trình
apoptosis không xảy ra, các tế bào mang hệ gene sai hỏng vẫn tiếp tục tồn tại và
phân chia.

7


Douglas và Robert Weinberg đã đưa ra 6 cột mốc trong quá trình phát sinh
ung thư ác tính [42] là:
-

Các tế bào nhận được tín hiệu thúc đẩy tăng sinh tế bào (xuất hiện các gene

gây ung thư).
-

Các tế bào ung thư trở nên không nhạy cảm với các tín hiệu ức chế.

-

Đột biến xảy ra ở gene ức chế khối u, dẫn đến không còn hiện tượng chết

theo chương trình (apoptosis), các tế bào ung thư không còn bị kiểm soát.
-

Các tế bào ung thư phân chia không giới hạn.

-

Các tế bào ung thư phát triển hệ thống mạch máu dẫn đến khối u để tăng

cường chất dinh dưỡng nuôi khối u.
-

Các tế bào ung thư có khả năng xâm nhập vùng mô khác và hình thành ổ ung

thư mới (di căn).
1.1.2. Tình hình ung thư trên thế giới và ở Việt Nam
Hiện nay, bệnh ung thư được xem là một trong những bệnh nan y, đòi hỏi
các nhà nghiên cứu cần nhiều nỗ lực cố gắng để tìm ra các phương pháp phòng
ngừa và chữa trị hiệu quả. Đến nay trên thế giới đã nghiên cứu thành công một số
loại thuốc và phương pháp chữa trị hiệu quả trong điều trị ung thư vú, ung thư
máu… Tuy nhiên, với mức độ đa dạng của ung thư như hiện nay thì các nghiên cứu
về ung thư cần được quan tâm hơn nữa để có thể tìm ra cách điều trị hiệu quả và
phù hợp.
Sự biến đổi từ tế bào bình thường thành tế bào khối u có thể là do sự thừa
hưởng về mặt di truyền. Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, sự biến đổi ác
tính đó là do sự đột biến từ tế bào soma. Có vô số các khả năng có thể gây ra ung

thư có liên quan đến sự đột biến bao gồm như sự hoạt hóa các gene tiền ung thư
(proto-oncogene), sự bất hoạt gene ức chế khối u, hay sự đột biến ở gene sửa sai
DNA trở thành gene gây đột biến. Các đột biến đó có thể xảy ra trong quá trình
phân chia tế bào bình thường, sự tăng bất thường của các tín hiệu kích thích phân
8


bào để biệt hóa, hoặc do các tác nhân gây ung thư ngoài môi trường. Quá trình phát
triển thành khối u là sự phát triển quá mức của các tế bào ung thư và không chịu sự
kiểm soát thông thường của cơ chế điều khiển quá trình biệt hoá tế bào trong cơ thể.
Các tế bào ung thư mới nhân lên cũng giống với tế bào ung thư ban đầu và không
thực hiện chức năng thông thường của tế bào bình thường.
Theo ghi nhận của Cơ quan nghiên cứu thế giới về ung thư IARC (The
International Agenecy for Research on Cancer), trong năm 2008, có hơn 12,4 triệu
trường hợp mới mắc bệnh ung thư mới (trong đó 6 672 000 nam giới, 5 779 000 nữ
giới), 7,6 triệu trường hợp tử vong do ung thư (4 293 000 nam giới, 3 300 000 nữ
giới) và 28 triệu người bị mắc bệnh ung thư được phát hiện trong vòng 5 năm. Theo
ước tính đến năm 2030, khả năng mắc ung thư mới mỗi năm khoảng 27 triệu người,
17 triệu người khác bị chết vì ung thư và 75 triệu bệnh nhân bị ung thư được phát
hiện trong vòng 5 năm [7]. Số lượng bệnh nhân bị ung thư đang tăng dần tại các
nước đang phát triển do tỷ lệ tử vong ở trẻ em và số người chết do các bệnh nhiễm
trùng có xu hướng giảm và nhiều người có khả năng sống lâu hơn. Hơn nữa, người
dân ở những nước này đang ngày càng thích ứng với lối sống của các nước phát
triển như hút thuốc, uống rượu, ăn nhiều thực phẩm giàu calo và chất béo.
Cũng theo cơ quan này, trong số các trường hợp mắc bệnh ung thư và tử
vong do ung thư trên thế giới, các nước có thu nhập thấp và trung bình là những nơi
chiếm tỷ lệ ung thư cao (chiếm 2/3 trường hợp ung thư trên toàn thế giới). Tỷ lệ
dạng ung thư khác nhau cũng tùy thuộc vào mức độ thu nhập của các quốc gia, tập
quán của người dân. Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh ung thư chủ yếu tập trung vào các dạng
ung thư như: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư ruột già, ung thư dạ dày, ung thư

tuyến tiền liệt, ung thư thận, ung thư da, ung thư giáp trạng, ung thư buồng trứng…
Trước đây, ở Việt Nam, mô hình bệnh tật điển hình là của một nước thu nhập
thấp, kém phát triển, có đời sống chưa cao, ý thức vệ sinh thấp, vùng khí hậu nhiết
đới nóng bức ẩm ướt, nên các loại bệnh chủ yếu là những bệnh truyền nhiễm và các
bệnh suy dinh dưỡng. Hiện nay, cùng với sự thay đổi mạnh mẽ về kinh tế, mô hình

9


bệnh tật của Việt Nam đã có xu hướng của nước phát triển với các bệnh ung thư,
tim mạch… Hơn nữa, cùng với quá trình phát triển của nền kinh tế cũng kéo theo
một loạt các vấn đề nhức nhối khác, đặc biệt là vấn đề ô nhiễm môi trường, nguồn
thức ăn... Việc sống trong điều kiện môi trường ô nhiễm có thể là lý do chính để lý
giải tại sao tỷ lệ mắc bệnh ung thư đang có chiều hướng gia tăng nhanh chóng.
Những nguyên nhân gây ung thư chính có thể kể đến là việc hút thuốc lá, sử dụng
đồ uống có cồn, chế độ ăn không lành mạnh và thiếu những hoạt động thể chất [17].
Những loại ung thư phổ biến nhất người bệnh thường gặp là phổi, dạ dày, gan, đại
trực tràng, vòm họng, thận, da, vú, cổ tử cung…
1.1.3. Các phương pháp điều trị ung thư
Như đã đề cập ở trên, ung thư vẫn là một trong những căn bệnh nan y và gây
tử vong lớn. Vì vậy, việc phát hiện và điều trị ung thư là vấn đề hết sức quan trọng
và cấp thiết, đòi hỏi các nhà khoa học có rất nhiều đóng góp. Nếu không được chữa
trị sớm, hầu hết các loại ung thư có thể gây tử vong, đây là một trong những nguyên
nhân gây tử vong chính trong những nước phát triển. Hầu hết các bệnh ung thư có
thể chữa trị và nhiều bệnh có thể chữa lành, nếu được phát hiện và điều trị sớm. Các
phương pháp dùng trong điều trị ung thư có thể được chia thành 5 phương pháp như
sau: phẫu thuật, hóa trị liệu, xạ trị liệu, miễn dịch trị liệu hay còn gọi là liệu pháp
miễn dịch và liệu pháp gene. Liệu pháp gene có tiềm năng cao trong việc chữa trị
tận gốc nhưng hiện nay vẫn chưa được áp dụng phổ biến do tính phức tạp và đặc thù
với từng loại ung thư và cần được nghiên cứu thêm. Cả ba phương pháp phẫu thuật,

xạ trị và hóa trị đều nhằm mục đích loại bỏ các tế bào ung thư, phá hủy chúng bằng
thuốc hoặc các tác nhân khác. Tuy nhiên, việc điều trị ung thư bằng các phương
pháp này thường gặp phải các tác dụng phụ không mong muốn và hiệu quả điều trị
còn phụ thuộc vào vị trí và mức độ của khối u, giai đoạn của bệnh, cũng như tổng
trạng của bệnh nhân.
So với những phương pháp truyền thống như phẫu thuật, xạ trị, hóa trị, thì trị
liệu miễn dịch tế bào tự thân có thể được coi là một hình thức trị liệu đầy triển vọng

10


vì hiệu quả điều trị rất rõ rệt, không có tác dụng phụ, an toàn và dung nạp tốt. Liệu
pháp này đã mang lại cho bệnh nhân ung thư giai đoạn trung gian và giai đoạn cuối
thêm một hình thức điều trị hoàn toàn mới. Đối với những trường hợp bệnh nhân
không thể phẫu thuật hay xạ trị thì liệu pháp này lại có thể liên tục tiêu diệt tế bào
ung thư, tăng cường sức miễn dịch cho bệnh nhân, nâng cao hiệu quả lâm sàng, kéo
dài tuổi thọ, nâng cao chất lượng sống, giảm bớt những đau đớn do căn bệnh này
mang lại cho bệnh nhân.
1.2. Tổng quan về Interleukin-2
1.2.1. Cấu trúc của Interleukin-2
Interleukin-2 là một cytokine được tiết bởi tế bào lympho T của hệ thống
miễn dịch. Tên thương mại của sản phẩm Interleukin-2 là Proleukin hoặc
Aldesleukin. IL-2 được Morgan và các cộng sự phát hiện năm 1975 khi sử dụng
lectin để kích thích tế bào T hỗ trợ nhưng đến năm 1979, IL-2 mới được xác định
như là một nhân tố có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của tế bào T [47].
Interleukin-2 cũng là một trong những cytokine đầu tiên được xác định ở mức độ
phân tử. Gene il-2 được deVos và các cộng sự nhân dòng năm 1983 [35], sau đó cấu
trúc tinh thể của nó được làm sáng tỏ năm 1992 bởi Taniguchi và các cộng sự [54].
Về bản chất, IL-2 là một glycoprotein có cấu trúc dạng monome với khối lượng
phân tử xấp xỉ 15 kDa. IL-2 tồn tại với cấu trúc không gian có 4 xoắn α tạo thành

dạng khá điển hình của cytokine loại 1.

Hình 2. Minh họa cấu trúc không gian 3 chiều của Interleukin-2
11


Interleukin-2 (IL-2), cũng được gọi là yếu tố tăng trưởng tế bào T, lần đầu
tiên được mô tả như là một lymphokine có khả năng hoạt hóa in vitro các tế bào T
[12]. IL-2 cũng đã được quan sát thấy nhiều khả năng điều chỉnh miễn dịch khác
như tính chất gây độc của tế bào T, các tế bào giết tự nhiên (NK), kích hoạt tế bào
B, và hoạt hóa các tế bào giết (LAK). Trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã,
protein hIL-2 bị cắt đoạn trình tự tín hiệu tiết dài 20 amino acid và tạo thành hIL-2
hoàn chỉnh chứa 133 amino acid [53]. Các kết quả nghiên cứu cho thấy có 3 vùng
trên phân tử hIL-2 có vai trò quyết định hoạt tính sinh học của cytokine này đó là: i)
Vùng tận cùng đầu N (các gốc amino acid 1-20); ii) Vùng tận cùng đầu C (các gốc
amino acid 121-133) và iii) Cầu disulfide giữa các gốc Cys58 và Cys105. Nghiên cứu
của Grace (1987) cho thấy các đột biến mất 20 amino acid ở đầu N và 10 amino
acid ở đầu C có thể làm mất 99% hoạt tính của IL-2 và khả năng liên kết của chúng
với các thụ thể IL-2 [43]. Phân tích trình tự amino acid cho thấy IL-2 tự nhiên của
người có chứa 3 gốc Cys tại các vị trí 58, 105, 125 trong đó hai gốc Cys58 và Cys105
tạo cầu disulfide. Việc hình thành chính xác cầu disulfide này sẽ quyết định đến
hoạt tính sinh học của IL-2. Các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy đột biến ở
gốc Cys105 làm phá hủy cầu disulfide có thể làm giảm 8-10 lần hoạt tính của IL-2,
trong khi đó sự thay thế hoặc đột biến Cys58 làm hoạt tính của IL-2 giảm tới 250
lần. Tuy nhiên sự đột biến mất gốc Cys tại vị trí 125 chỉ ảnh hưởng rất ít đến hoạt
tính IL-2 và sự thay đổi gốc Cys tại vị trí đó thành Ser không ảnh hưởng tới hoạt
tính của IL-2. Do vậy, đột biến thay đổi Cys ở vị trí 125 thành Ser có thể ngăn cản
sự tạo thành cầu disulfide không mong muốn giữa gốc này với hai gốc Cys ở vị trí
58 và 105 [2, 3]. Ngoài ra, tại đầu N của protein IL-2 có điểm glycosyl hóa được
nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở 3 vị trí amino acid đầu tiên. IL-2 trong tự nhiên

tồn tại dạng glycosyl hóa có tính thấm cao với màng tế bào do vậy liều lượng lớn
IL-2 sẽ gây nên độc tính của protein này trong cơ thể. Vì vậy, IL-2 dạng thương
phẩm dùng làm thuốc tiêm sẽ bị loại bỏ các gốc amino acid ở đầu N.

12


1.2.2. Vai trò và chức năng sinh học của Interleukin-2
Các nghiên cứu trước đây cho thấy, với việc sử dụng IL-2 trong hỗ trợ điều
trị ung thư thận và ung thư hắc tố có thể làm tăng khả năng sống sót cho các bệnh
nhân. Theo nghiên cứu của Rosenberg (1980) tại Viện Ung thư quốc gia (National
Cancer Institute-NCI) Tây Ban Nha cho thấy, khi sử dụng IL-2 trong phác đồ điều
trị cho các bệnh nhân ung thư thận ác tính với các liều lượng khác nhau có thể làm
giảm tỷ lệ di căn của các khối u từ 15-20%. Ngoài ra, IL-2 còn có vai trò quan trọng
trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh ung thư ác tính khác như ung thư bạch cầu, ung
thư phổi [20],… Từ năm 1990, các nhà khoa học đã tiếp tục nghiên cứu làm tăng
hoạt động của IL-2 và sử dụng kết hợp nhiều phương pháp trị liệu khác như hóa trị
liệu và xạ trị liệu, kết quả là khoảng 5-10% bệnh nhân được điều trị có thể sống sót
sau 10 năm.
Lúc đầu người ta phát hiện ra IL-2 như là một yếu tố phát triển tế bào T,
nhưng thật ra IL-2 có nhiều chức năng trong đáp ứng miễn dịch thu được [49]. Thứ
nhất, sự sản sinh IL-2 chỉ là nhất thời, vì vậy khi không có sự kích thích của kháng
nguyên thì các tế bào T được hoạt hóa sẽ chết do mất đi các cytokine trong môi
trường. IL-2 do tế bào T tiết ra khi nhận diện kháng nguyên chịu trách nhiệm về
việc tăng sinh tế bào đặc hiệu kháng nguyên. Thứ hai, IL-2 khởi đầu một con đường
chết theo chương trình đã được định sẵn cho tế bào [48]. Thứ ba, IL-2 tăng cường
sự tăng sinh và hoạt hóa nhiều tiểu nhóm tế bào miễn dịch, gồm cả các tế bào T, tế
bào diệt tự nhiên, tế bào B, tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, các tế bào bạch
cầu đa nhân trung tính. IL-2 đơn thuần hoạt động trong một phần nhỏ của các bệnh
nhân có u ác tính các tế bào da (melanocyte) di căn và đã được dùng để hỗ trợ điều

trị in vitro ở bệnh nhân ung thư và nhiễm HIV. IL-2 vẫn dùng để điều trị cho bệnh
nhân ung thư tế bào biểu mô thận di căn.

13


Hình 3. Đích tác động của Interleukin-2
IL-2 giúp làm tăng hàm lượng các thành phần khác nhau của hệ thống miễn
dịch trong máu, bao gồm tế bào lympho T và các tế bào giết tự nhiên (NK) [38].
Khi tiếp xúc với tế bào khối u, tế bào NK đã hoạt hóa sẽ tấn công màng tế bào ung
thư và tiêm một số chất vào tế bào chất làm phân hủy tế bào đích. Cho dù kích
thước nhỏ hơn tế bào ung thư, các tế bào NK thường tác động đến 2 hoặc nhiều tế
bào ung thư cùng một lúc. Nó có thể cải tiến chức năng của hệ thống các tế bào
miễn dịch khác, như lymphokine có hoạt tính giết chết các tế bào và các tế bào
lympho xâm lấn khối u. Điều này giúp cho cơ thể chống lại bệnh ung thư.

Hình 4. Tác động của Interleukin-2 đến tế bào T
Do khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch, nên ngoài ứng dụng để điều trị
ung thư, IL-2 còn được nghiên cứu để chống bệnh nhiễm HIV. Kết quả ban đầu cho
thấy đây là dược phẩm an toàn và có hiệu quả khi phối hợp với các liệu pháp khác
14


trong điều trị chống HIV. Cơ chế của IL-2 trong điều trị bệnh nhân nhiễm HIV có
thể theo hai hướng: (i) Giúp bảo vệ hệ miễn dịch khỏi sự phá hoại do virus HIV gây
ra, (ii) Giúp cho hệ miễn dịch khống chế sự nhân lên của HIV. Theo Kovacs thì IL2 gây tăng sinh các tế bào T CD4 không phải là do gia tăng tổng hợp chúng từ tuyến
ức, mà chủ yếu là do sự tăng sinh các tế bào tồn tại trong hệ tuần hoàn máu [46].
1.2.3. Ứng dụng của Interleukin-2 trong điều trị ung thư
IL-2 được nghiên cứu rất nhiều trong điều trị ung thư bao gồm ung thư thận,
u hắc tố, ung thư da. Caligiuri và cộng sự đã chứng minh với liều lượng IL-2 thấp

ngăn ngừa chứng rối loạn tăng sinh các tế bào lympho [32]. Hai ứng dụng chủ yếu
của IL-2 là liệu pháp chống ung thư đối với các ung thư biểu mô thận và u hắc tố và
liệu pháp miễn dịch trong các bệnh nhân nhiễm HIV. Người ta cho rằng IL-2 ngoại
sinh có thể tăng cường một số đáp ứng kháng ung thư.
Đối với ung thư thận: do thận là một phần trong hệ tiết niệu với chức năng
chính là lọc máu và sản xuất nước tiểu để loại bỏ chất thải ra ngoài cơ thể, nên khi
ung thư thận phát triển, nó có thể xâm lấn vào các cơ quan ở gần thận như gan, ruột,
tụy. Tế bào ung thư thận có thể tách khỏi khối u ban đầu và di căn tới các bộ phận
khác trong cơ thể. Các triệu chứng ít gặp hơn như mệt mỏi, chán ăn, đau ở vùng thắt
lưng, sốt lặp đi lặp lại nhiều lần. Ung thư thận tăng theo độ tuổi, bệnh xuất hiện
nhiều nhất là ở độ tuổi 50-70. Bệnh xảy ra ở nam giới nhiều gấp đôi nữ giới.
Nguyên nhân của ung thư thận là do đột biến gene, sử dụng thuốc lá, béo phì, sự
phơi nhiễm trong nghề nghiệp, tia xạ,… Rosenberg đã thực hiện sử dụng
Interleukin-2 liều cao trong hỗ trợ điều trị đối với 283 bệnh nhân, kết quả cho thấy
7% bệnh nhân đáp ứng hoàn toàn với IL-2 và tế bào ung thư được kiểm soát và biến
mất toàn bộ, 13% số bệnh nhân có đáp ứng một phần, 76% trong số các bệnh nhân
có đáp ứng hết ung thư với thời gian trên 7 năm [50].
Còn đối với u hắc tố, đây là một loại ung thư thường gặp và đang có tần suất
mắc bệnh nhanh nhất trong một số loại ung thư hiện nay. Các nhà nghiên cứu dự
đoán tần suất mắc bệnh tiếp tục tăng trong 20 năm tới. Nguyên nhân làm tăng tần

15


suất mắc bệnh chưa được xác định. Một số yếu tố có thể có liên quan, như thói quen
phơi nắng và những thay đổi toàn cầu như thủng tầng ozon và sự ô nhiễm môi
trường. Theo thống kê, u hắc tố có thể gặp ở mọi lứa tuổi người trưởng thành và u
hắc tố thường có tính chất gia đình. Cắt bỏ khối u là lựa chọn điều trị dành cho u
hắc tố, sau khi phẫu thuật bệnh nhân được chỉ định dùng các chất điều trị bổ trợ như
interferon-α, Interleukin-2 nhằm ngăn ngừa hiện tượng di căn. Đối với ung thư da

ác tính nếu bệnh nhân có đáp ứng với IL-2 thì bệnh nhân kéo dài thời gian sống ít
nhất 10 tháng, trong đó tỷ lệ sống trên 5 năm là hơn 10% [44].
Năm 1992 cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc của Hoa Kỳ (FDA) đã chính
thức cho phép sử dụng IL-2 trong điều trị ung thư thận, u hắc tố và hỗ trợ điều trị
HIV. Hiện nay, IL-2 đang được thử nghiệm trong điều trị các loại ung thư buồng
trứng [31], ung thư vú [40], ung thư bàng quang [34], ung thư tuyến tiền liệt [30],…
Các nghiên cứu cho thấy, điều trị bằng IL-2 giảm 20% về tỷ lệ u bướu, 9% bệnh
nhân ung thư thận phản ứng hoàn toàn với thuốc.
Trong điều trị, từ những kết quả nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng đều
cho thấy, IL-2 có khả năng kích thích và phân triển các tế bào miễn dịch, tăng khả
năng tiêu diệt các tế bào ung thư, đặc biệt là 2 loại: ung thư biểu mô tế bào thận và u
hắc tố ác tính. Khả năng chữa trị cho 2 loại ung thư này có thể lên đến 18% với u
hắc tố ác tính và 37% với ung thư biểu mô tế bào thận nếu có liệu pháp điều trị IL-2
phù hợp. Trước đây, để có được IL-2 tinh khiết sử dụng trong điều trị, sản phẩm
này được tách chiết từ các dòng tế bào T tự nhiên hay bằng việc nuôi cấy dòng tế
bào động vật. Mặc dù có thể tạo ra được IL-2 tái tổ hợp nhưng sản phẩm này
thường có hàm lượng khá thấp [10]. Việc sản xuất sản phẩm IL-2 theo các con
đường này thường tạo ra sản phẩm có dạng glycosyl hóa cao, tạo ra hiệu ứng không
mong muốn tới sản phẩm khi sử dụng trong điều trị. Hơn nữa, do hiệu suất tạo sản
phẩm cũng như hiệu suất tinh chế thấp nên ảnh hưởng đến giá thành sản phẩm. Sản
phẩm IL-2 cuối cùng tạo ra thường có giá thành khá cao. Chính vì vậy, công nghệ
sản xuất IL-2 trên đã được thay thế bởi công nghệ mới hơn là công nghệ DNA tái tổ
hợp.
16


Trong tự nhiên, IL-2 là glycoprotein, có khả năng hoạt hoá tế bào NK và tế
bào CTL, biệt hoá LAK. Interleukin-2 có thể gây độc, sốt và sốc trong điều trị. Hiệu
quả gây độc được xác định là do hai nguyên nhân. Thứ nhất, IL-2 có điểm glycosyl
hoá được nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở 3 vị trí amino acid đầu tiên. Do vậy,

IL-2 tự nhiên có tính thấm cao với màng tế bào nên gây độc với cơ thể bệnh nhân
điều trị bằng IL-2. Thứ hai, độc tính của protein này là gián tiếp do hoạt tính của IL2 lên các tế bào lympho khác làm tăng quá trình tiết TNF, IFN và lymphotoxin.
Chính vì vậy, bằng việc sử dụng kỹ thuật di truyền, IL-2 có thể được cải biến mất vị
trí glylcosyl hoá, giảm độc tính IL-2 mà vẫn giữ nguyên được hoạt tính sinh học
vốn có.
1.3. Hệ thống lên men nuôi cấy E. coli tái tổ hợp
Hệ thống lên men bioreactor là tên chung của các thiết bị có chức năng tạo
một môi trường đặc trưng, được sử dụng để tiến hành một quá trình hóa sinh học
mà trong đó các vi sinh vật hoặc các tế bào và mô động thực vật có thể phát triển và
tăng trưởng nhờ sử dụng các nguyên vật liệu thô trong môi trường, đồng thời tạo ra
các sản phẩm trao đổi chất. Quá trình lên men có thể là kỵ khí hoặc hiếu khí. Hệ
thông lên men thường là các bình có dạng hình trụ, kích cỡ có thể từ hàng lít đến
hàng mét khối và được làm bằng thép không gỉ.

Hình 5. Hệ thống lên men bioreactor quy mô nhỏ

17


Vi sinh vật phát triển trong hệ thống lên men có thể ở dạng huyền phù trôi
nổi trong môi trường lỏng hoặc là bám trên bề mặt của môi trường rắn. Môi trường
lỏng có thể sử dụng để nuôi dưỡng cả đối tượng trôi nổi và đối tượng phải bám cố
định. Môi trường lên men dạng trôi nổi có thể sử dụng cho một phổ rất đa dạng các
loại sinh vật vì không cần có xử lý bề mặt bình lên men một cách đặc biệt, đồng
thời có thể tiến hành ở quy mô lớn hơn nhiều so với môi trường bám cố định. Tuy
nhiên, trong trường hợp lên men liên tục, các sinh vật lên men trong hệ thống lên
men trôi nổi có khả năng bị loại bỏ cùng với môi trường lấy ra. Điều này không xảy
ra với hệ thống lên men bám cố định, tuy nhiên hệ thống này lại bị giới hạn về quy
mô vì vi sinh vật chỉ sinh trưởng được trên bề mặt của chất giá.
E. coli là vi sinh vật kỵ khí tùy tiện, có thể sinh trưởng hiếu khí nhờ hô hấp

dùng O2 làm chất nhận điện tử cuối cùng, hoặc sinh trưởng kỵ khí nhờ hô hấp dùng
các chất như nitrate, nitrite, fumarate, dimethylsulfoxide và trimethylamine N-oxide
làm chất nhận điện tử cuối cùng, hoặc sinh trưởng kỵ khí nhờ lên men [55]. Trong
các hình thức sinh trưởng trên thì hô hấp sử dụng oxy là hiệu quả nhất về mặt năng
lượng, vì vậy E. coli tái tổ hợp được nuôi cấy trong hệ thống lên men loại hiếu khí
có khuấy trộn để tăng cường tối đa lượng oxy hòa tan trong môi trường. Hệ thống
lên men này có ưu điểm là dễ dàng điều chỉnh nhiệt độ, chi phí sản xuất, chi phí đầu
tư, chi phí hoạt động đều khá thấp, dễ dàng vệ sinh hệ thống, tuy vậy có nhược
điểm là thường xuyên bị bọt. Vấn đề bọt của hệ thống có thể được khắc phục bằng
dung dịch phá bọt (antifoam) phù hợp nhưng khi sử dụng cũng cần lưu ý lượng sử
dụng thích hợp do chính bản thân chất phá bọt cũng có thể trở thành chất ức chế sự
sinh trưởng của vi sinh vật.
Có 2 ưu điểm chính cho quá trình sản xuất protein tái tổ hợp trong các hệ
thống bình lên men: (i) Với hệ thống lên men, tất cả các thông số của quá trình lên
men như nhiệt độ, pH, lượng oxy hòa tan, tốc độ khuấy, lượng khí sục vào môi
trường,... đều được kiểm soát chặt chẽ qua hệ thống máy tính giúp dễ dàng theo dõi
diễn tiến của quá trình lên men, từ đó giúp tăng hiệu quả của quá trình lên men; (ii)
Hệ thống lên men đa dạng cho các quy mô khác nhau tùy vào mục đích lên men từ
18