Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5 1 tái tổ hợp biểu hiện trong escherichia coli

Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả
năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5.1
tái tổ hợp biểu hiện trong Escherichia coli


Trần Thị Nhài

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Ngƣời hƣớng dẫn: GS.TS Trƣơng Nam Hải
Năm bảo vệ: 2012


Abstract: Tổng quan về virus cúm và biểu hiện gen: cấu trúc và khả năng gây bệnh của
virus cúm; Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ; Cấu trúc,
chức năng của HA và NA; Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A; Vaccine phòng
cúm A/H5N1; Hệ biểu hiện E. coli; Chủng biểu hiện E. coli BL21; Vector biểu hiện
pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin. Trình bày các phƣơng pháp nghiên
cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5-1
tái tổ hợp biểu hiệu trong Escherichia Coli. Đƣa ra kết quả và thảo luận: thiết kế vector
biểu hiện PET22TRXHA5-1; biểu hiện GEN HA5-1 trong chúng vi khuẩn E. COLI
BL21; lựa chọn điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp TRXHA5-1 trong E. COLI; tinh
chế sơ bộ protein tái tổ hợp TRXHA5-1; kiểm tra tính sinh đáp ứng miễn dịch của protein
tái tổ hợp HA5-1

Keywords: Miễn dịch; Virus cúm; Protein tái tổ hợp; Sinh học


Content
MỞ ĐẦU

Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) dovirus cúm
A/H5N1 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ gây chết cao
trong đàn gia cầm bị bệnh.
Virus cúm A/H5N1 là một phân type trong nhóm virus cúm A thuộc họ
Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) trên bề mặt
capsid của hạt virus mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn dịch. Kháng
nguyên HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến H16) và kháng nguyên NA có 9 type (ký hiệu từ N1
đến N9).
Tính đến năm 2011 dịch cúm A/H5N1 đã xuất hiện ở hơn 50 quốc gia khác nhau ở châu Á,
châu Âu, châu Phi và có nguy cơ lan rộng khắp thế giới. Theo thông báo của WHO, tính đến
tháng 01/2012 đã có tới 583 trƣờng hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó 344 trƣờng hợp tử vong,
120 triệu gia cầm chết do nhiễm virus hoặc bị tiêu hủy. Virus lây lan nhanh và có độc lực rất cao
ở các vật chủ khác nhau.
Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm do virus cumsA/H5N1 bắt đầu xuất hiện từ những
tháng cuối năm 2003 đầu năm 2004 và đã nhanh chóng lan rộng ở hầu hết các địa phƣơng trong
cả nƣớc. Hàng chục triệu gia cầm và thuỷ cầm đã bị chết hoặc bị tiêu huỷ gây thiệt hại kinh tế
nặng nề cho ngành chăn nuôi.
Tiêm vaccine phòng virus cúm A/H5N1 cho gia cầm đƣợc coi là một cách phòng chống hiệu
quả, đỡ tốn kém và không ảnh hƣởng nguy hại tới môi trƣờng.
Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của
protein HA5-1 tái tổ hợp biểu hiện trong Escherichia coli”


Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan chung về virus cúm
1.1.1. Một số đặc điểm vê
̀
câ
́

u tru
́
c của virus cúm
Đặc tính cấu trúc chung của tất cả 4 nhóm virus trong họ Orthomyxoviridae là hệ gen của
chúng chỉ chứa duy nhất ribonucleic acid (RNA) sợi đơn âm, ký hiệu là ss(-) RNA.
Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đƣờng kính 80 -120 nm,
đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lƣợng phân tử khoảng 250 triệu Da.
V virus với bản chất là protein có ngun gốc từ màng tế bào nhiễm đã đƣợc đặc hiệu
hóa để gắn protein màng của virus vào , bao gồm mô
̣
t số protein đƣơ
̣
c glycosyl ho
́
a va
̀
mô
̣
t số
protein da
̣
ng trần không đƣơ
̣
c glycosyl ho
́
a .

Hình 1.1. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B) và phức hợp ribonucleoprotein RNP
(C) của virus cúm A. A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dƣới kính hiển vi điện
tử; B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A; C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP

(Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge).
Hệ gen của virus cúm A đƣợc cấu tạo từ 8 đoạn đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA,
PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong v virus, mã hóa cho 11 protein tƣơng
ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hóa cho
2 protein là NS1 và NS2, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1-F2.
1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ
Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A đƣợc mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể
thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào biểu mô và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào
trong bào tƣơng của tế bào nhiễm (Hình 1.2).


Hình 1.2: Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ

1.1.3 Cấu trúc, chức năng của HA và NA
Protein HA (hemagglutinin)
Protein hemagglutinin là một glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả năng
gây ngƣng kết hng cầu gà trong ống nghiệm, kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong ta sự
ngƣng kết đó, đƣợc gọi là kháng thể ngăn trở ngƣng kết hng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory
antibody).
Protein NA (neuraminidase)
Protein neuraminidase còn gọi là sialidase có bản chất là glycoprotein đƣợc gắn trên bề mặt
capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trƣng theo từng phân type NA.
Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào
nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA trong quá trình giải phóng hạt virus mới khi
tế bào nhiễm và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào.
1.1.4 Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A
Do kháng nguyên HA và NA của virus thƣờng xuyên biến đổi mà bệnh cúm rất khó kiểm
soát.
Có hai phƣơng thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A
Hiện tượng lệch kháng nguyên

Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các phân đoạn gen/hệ
gen của virus do virus cúm A không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình
phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích.
Hiện tượng trộn kháng nguyên
Hiện tƣợng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) giữa các gen kháng
nguyên của virus cúm với gen khác ở một số rất ít virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép
virus có khả năng biến chủng rất cao.
1.1.5 Vaccine phòng cúm A/H5N1
Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine đƣợc coi là biện pháp có tính chiến lƣợc, nhằm ngăn
chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch.
Hiện nay có 3 loại vaccine đƣợc bán và sử dụng rộng rãi tại Việt Nam là: Vaccine vô hoạt
nhũ dầu H5N2 (Trung Quốc: đây là loại vaccine dị chủng; vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N1 (Trung
Quốc): là loại vaccine đng chủng; vaccine vô hoạt Nobilis Influenza H5 (Hà lan): là loại
vaccine dị chủng.
Hiện có 3 cơ sở đang nghiên cứu thử nghiệm loại vaccine virus phòng bệnh cúm gia cầm
H5N1 cho cả ngƣời và gia cầm nhƣ:
+ Công ty Vắc xin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) của Viện Vệ sinh & Dịch tễ Trung
Ƣơng;
+ Viện Pasteur TP.HCM,
+ Viện Vaccine & Chế phẩm sinh học Nha Trang.
1.2 BIỂU HIỆN GEN
1.2.1 Hệ biểu hiện E. coli
Việc sử dụng rộng E. coli dựa vào những ƣu điểm nổi bật là: thao tác trên vật liệu di truyền
dễ, có thể biểu hiện các protein ngoại lai lên đến 50% protein tổng của tế bào, biểu hiện lƣợng lớn
protein ngoại lai khi tốc độ tăng trƣởng của tế bào cao và mật độ tế bào đủ lớn, môi trƣờng nuôi cấy
đơn giản và rẻ.
1.2.2 Chủng biểu hiện E. coli BL21
Chủng biểu hiện E. coli BL21, gen lon protease (một protease nội bào) và ompT protease (một
protease định khu ở màng ngoài) đã bị đột biến. Vì vậy, protein ngoại lai sẽ ít bị phân cắt bởi
protease của tế bào chủ.

1.2.3 Vector biểu hiện pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin
+ Gen ngoại lai đƣợc điều khiển bởi promotor T7
+Phiên mã đƣợc điều khiển bởi lac operator, có cơ chế cảm ứng IPTG.
+ Sau vùng đa nối có đoạn trình tự mã hóa cho 6 aa Histidin
Ngoài ra Thioredoxin đƣợc biết:
+ Nhƣ là tá chất làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên khi gây miễn dịch cho gia
cầm.
+ Giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân cắt bởi protease
+ Hình thành cấu trúc bậc 3 chính xác hơn

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1 Các chủng sinh vật và plasmid
- Chủng vi khuẩn E. coli DH5α đƣợc sử dụng để tách dòng gen trxha5-1;Chủng vi khuẩn
E. coli BL21 đƣợc sử dụng để biểu hiện gen ha5-1; Plasmid pET22b(+)mang gen trx; Plasmid
pCR2.1 mang gen ha5-1 (pCRha5-l).
2.1.2 Hóa chất và enzym
* Hóa chất:
SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức); X-Gal (Sigma, Mỹ); phenol, metanol isoamylalcohol,
EtBr, glyxerol, IPTG, etanol, chloroform (Roth, Đức); agan (Fluka, Đức); d-NTP (Promega, Mỹ);
ampicillin (Merk, Đức); agaroza (Gibco, Mỹ); MgS0
4
(BioLabs, Anh).
* Enzyme
Các enzyme hạn chế (BioLab, Anh); Taq-DNA polymeraza (BioLabs, Anh); rionucleaza
(Sigma, Mỹ); phosphataza kiềm, T4-DNA ligaza (BioLabs, Anh).
2.1.3 Máy móc và thiết bị
Máy PCR (MJ Research, Mỹ); máy ly tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ); máy ổn nhiệt (Mỹ); máy
điện di, máy xác định DNA trên gel agaroza (Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ);
máy ly tâm Eppendorf; Bộ tinh sạch DNA từ gel agarose.

2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy
2.1.4.1 Môi trƣờng và dung dịch sử dụng trong biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli DH5α
2.1.4.2 Các dung dịch đƣợc sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli DH5α
2.1.4.3 Các dung dịch đƣợc sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose
2.1.4.4 Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide-SDS
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Xử lý cắt DNA plasmid bằng enzym cắt giới hạn
2.2.2 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào plasmid
2.2.3 Biến nạp sản phẩm ghép gen vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
2.2.4 Tách chiết plasmid DNA từ tế bào E. coli
2.2.5 Điện di DNA trên gel agarose
2.2.6 Thu nhận băng DNA từ gel agarose
2.2.7 Điện di protein trên gel polyacrylamide
2.2.8 Biểu hiện protein tái tổ hợp
2.2.9 Tinh sạch sơ bộ protein tái tổ hợp bằng dung dịch đệm urê
2.2.10 Kiểm tra tính kháng nguyên của TrxHA5-1
2.2.11 Kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà
2.2.11.1 Gây miễn dịch và thu huyết thanh gà
2.2.11.2 Phản ứng ngăn trở ngƣng kết hng cầu (HI)

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET22TRXHA5-1
3.1.1. Chuyển gen ha5-1 vào vector biểu hiện pET22trx
Thu nhận đoạn gen ha5-1 từ plasmid pCRha5-1 và mở vòng vector pET22Trx bằng cặp
enzym cắt giới hạn NcoI và BamHI. Sau đó nối đoạn gen ha5-1 vào vactor biểu hiện pET22Trx
để tạo nên vector tái tổ hợp pETTrxha5-1.

Kết quả trên điện di đ cho thấy cả 4 dòng plasmid đƣợc tách chiết (1,2,3,4) đều là dòng
plasmid tái tổ hợp pET22Trxha5-1 và có kích thƣớc lớn hơn kích thƣớc vector pEt22Trx.
3.1.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-l bằng enzyme cắt giới hạn
Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme cắt giới hạn NcoI và BamHI. Vector
pET22trx cũng đƣợc xử lý bằng cặp enzyme này để làm đối chứng.

Trên các đƣờng chạy từ số 2 đến số 5 tƣơng ứng với sản phẩm cắt của dòng plasmid tái tổ
Hình 3.2: Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid trên gel agarose 0,8%.
1-4: Plasmid ta
́
i tô
̉
hơ
̣
p pET22Trxha1; 5: Plasmid đối chƣ
́
ng (pET22Trx)


pET22Trxha5-1
1 2 3 4 5

pET22Trx
5.9 kb



pET22Trx
Ha5-1
1 kb
1 2 3 4 5 M
Hình 3.3: Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp (pET22Trxha5-1)
bằng enzym cắt giới hạn NcoI và BamHI . 1: plasmid pET22Trx (Đối chứng) ; 2-
5: các dòng plasmid tái tổ hợp; M: Thang ADN chuẩn 1Kb (Fermentas).

hợp xuất hiện hai băng DNA có kích thƣớc tƣơng ứng khoảng 1 kb và 5,9 kb. Dòng đối chứng
khi cắt bằng 2 enzyme chỉ tạo ra đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng đƣơng 5,9 kb đúng nhƣ tính
toán lý thuyết
3.2. BIỂU HIỆN GEN HA5-1 TRONG CHỦNG VI KHUẨN E. COLI BL21
Tế bào vi khuẩn E.coli mang plasmid tth đƣợc nuôi cấy cảm ứng với nng độ IPTG
0,5mM ở 37
o
C. Kết quả phân tích protein tổng số của tế bào E. coli tái tổ hợp cho thấy, ở đƣờng
chạy số 3 protein TrxHA5-1 đã đƣợc biểu hiện với kích thƣớc khoảng 57,5 kDa đúng nhƣ dự
đoán. Dòng đối chứng là chủng E. coli BL21 mang vector pET22Trx cũng tổng hợp ra protein
Trx có kích thƣớc 22 kDa.















3.3. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 TRONG
E. COLI
3.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện của gen ha5-l

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy cảm ứng ở nhiệt độ 22°C, 28°C, 30°C, 37°C và thu mẫu sau 4
giờ nuôi cấy cảm ứng.










Hình 3.6: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E. coli BL21 mang vector
pET22Trxha5-1 đƣợc cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở các nhiệt độ khác nhau; 1-4 :
Nhiệt độ cảm ứng tƣơng ứng 22
o
C, 28
o
C, 30
o
C, 37
o
C; 5:Thang protein chuẩn

kDa
116
66
45
35
25

18.4
14.4

1 2 3 4 5
TrxHA5-1
Hình 3.4: Protein tổng số từ các chủng tái tổ hợp E. coli BL21; 1:
Thang Protein chuẩn (Fermentas); 2: E. coli BL21 mang vector
pET22Trx; 3: E. coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1
TrxHA5-1
Trx

1 2 3
kDa
116
66
45
35

25

18.4
14,4






3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG đến sự biểu hiện của gen ha5-l
Khảo sát khả năng biểu hiện của protein TrxHA5-l ở nồng độ IPTG khác nhau (0,1;

0,5; 1,0; 1,5; và 2 mM).










Nhƣ vậy để đảm bảo thu đƣợc lƣợng lớn protein, đng thời tiết kiệm chi phí sản xuất chúng
tôi lựa chọn nng độ IPTG là 0,5 mM để biểu hiện protein tái tổ hợp.

3.3.3. Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp
Thu tế bào theo thời gian để kiểm tra lƣợng TrxHA5-1.











Hình 3.8: Protein tổng số từ chủng E.coli BL21 mang vector
pET22Trxha5-1 đƣợc cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở các thời gian thu
mẫu khác nhau; 1-5 : Thời gian thu mẫu 1, 2, 3, 4, 5 giờ; 6: Thang

protein chuẩn


Hình 3.7: Protein tổng số từ chủng E. coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 đƣợc
cảm ứng ở các nng độ IPTG khác nhau; 1-5 : Nng độ chất cảm ứng IPTG tƣơng
ứng 0,1mM, 0,5mM, 1 mM, 1,5 mM: 2 mM; 6: Thang protein chuẩn

kDa
116
66
45
35

25
18.4
14.4
TrxHA5-1

1 2 3 4 5
6

TrxHA5-1
1 2 3 4 5 6
kDa
116
66
45
35

25

18.4
14.4

Kết quả (Hình 3.8) cho thấy lƣợng protein thu đƣợc cao nhất sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng .
3.4 TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1










Kết quả (Hình 3.9, đƣờng chạy 3) cho thấy protein tái tổ hợp thu đƣợc sau khi loại b pha tan là
khá sạch, đƣợc thể hiện một băng protein có kích thƣớc khoảng 57,5 kDa khá đậm và sạch hơn
rất nhiều so với protein ban đầu.
Đối với protein tái tổ hợp sử dụng trong vaccine, một điểm rất quan trọng là phải có
tính kháng nguyên giống với tính kháng nguyên của protein tự nhiên. Vì lý do này, protein
sau khi tinh chế sẽ đƣợc tiến hành thử khả năng đáp ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus
cúm A/H5N1 thu đƣợc từ th bằng kỹ thuật Western blot.

Trên hình 3.10 (B) thấy đƣờng chạy số 3 là protein tổng số tách chiết từ chủng vi khuẩn
E. coli BL21 mang vector pET22trx không mang gen ha5-l, không thấy sự xuất hiện của băng

Hình 3.9: Điện di kiểm tra Trxha5-1 tinh chế trên gel polyacrylamide; 1-
Protein tổng số E. coli BL21 mang plasmid pETT22Trxha5-1;2-Thang
protein chuẩn; 3: phân đoạn chứa Trx-HA5-1 hòa tan trong urê 2 M.


kDa
116
66
45
35
25
18.4
14.4
1 2 3
TrxHA5-1
A
B
Hình 3.10: Kiểm tra tính kháng nguyên của protein TrxHA5-1 tái tổ
hợp; (A) Phân tích protein trên gel điện di polyacrylamide; (B): Phân
tích khả năng bắt cặp đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp với kháng
thể kháng lại HA5 của virus cúm A/H5N1; 1- phân đoạn chứa TrxHA5-
1 sau khi tinh chế; 2 - Thang protein chuẩn; 3 - Protein tổng số E. coli
BL21 mang plasmid pETT22Trx.
1 2 3

TrxHA5-1
kDa
116
66
45
35
25
18.4
14.4
1 2 3
TrxHA5-1
kDa
116
66
35
25
18.4
14.4

màu có kích thƣớc tƣơng ứng với gen TrxHA5-l. Trong khi đó trên đƣờng chạy số 1 xuất hiện
băng protein rất rõ nét, kích thƣớc khoảng 57,5 kDa có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể
kháng virus cúm A/H5N1. Điều đó chứng t kháng nguyên tái tổ hợp TrxHA5-l đƣợc tổng hợp
trong E. coli với trình tự amino acid chính xác chứa các quyết định kháng nguyên nằm trên tiểu
phần ha5-1.
3.5 KIỂM TRA TÍNH SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP HA5-
1
Protein TrxHA5-1 sau khi tinh chế đƣợc trộn với tá chất Freund dùng để tiêm, tá chất Cbt
dùng để nh mũi (gà 2 tuần tuổi). Lƣợng kháng nguyên TrxHA5-1 sử dụng để tiêm và nh mũi
là 100 µg. Sau khi gây miễn dịch lần 1 đƣợc 14 ngày, gà đƣợc gây miễn dịch lần 2. Huyết thanh
của gà sau khi tiêm và nh mũi, mắt đƣợc thu lại sau mỗi tuần trong 5 tuần.

Kết quả trên hình 3.11 cho thấy, ở lô đƣợc gây miễn dịch với PBS đã không tạo kháng
thể kháng lại TrxHA5-1, lô gà gây miễn dịch với chủng đối chứng, hiệu giá HI ở mức thấp
Hiệu giá kháng thể của gà đƣợc tiêm và nh mắt, mũi với TrxHA5-1 tăng dần từ tuần thứ
1 đến tuần thứ 4 và đạt giá trị lớn nhất sau 3, 4 tuần, sang tuần thứ 5 hiệu giá kháng thể ở lô tiêm
giảm xuống rất nhanh trong khi ở lô nh mắt, mũi hiệu giá có xu hƣớng giảm nhƣng vẫn duy trì
ở mức cao hơn so với lô tiêm. Nhƣ vậy, sơ bộ có thể thấy độ dài miễn dịch của kháng nguyên
đƣợc đƣa vào bằng đƣờng nh mắt, mũi tốt hơn là bằng đƣờng tiêm.

KẾT LUẬN

Với các kết quả thu đƣợc ở trên, chúng tôi đi đến một số kết luận sau:
PBS Dịch lên men TrxHA5-1, tiêm TrxHA5-1, nhỏ
chủng đối chứng mắt, mũi
Hình 3.11: Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của TrxHA5-1 trên gà
- Protein tái tổ hợp TrxHA5-l đƣợc biểu hiện tốt trong tế bào E. coli BL21 dƣới sự điều kiến
của promoter T7 và chất cảm ứng IPTG có trong môi trƣờng.
- Protein tái tổ hợp TrxHA5-l đƣợc tổng hợp tốt nhất ở điều kiện lên men là 30°C, 0,5 mM
IPTG và thời gian thu mẫu sau khi cảm ứng là 4 giờ.
- Protein tái tổ hợp TrxHA5-l đã đƣợc tinh chế thành công bằng siêu âm và hòa tủa trong urê
2 M.

- Protein tái tổ hợp đảm bảo tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch trên gà. Tuy nhiên
hiệu giá kháng thể thu đƣợc sau khi gây miễn dịch với liều 100 g TrxHA5-1 còn thấp. Hiệu giá
tối đa thu đƣợc khi gây miễn dịch bằng đƣờng tiêm là 2,7 log2, gây miễn dịch qua đƣờng nh
mắt, mũi là 2,2 log 2.
ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu liều vaccine thích hợp để thu đƣợc đáp ứng miễn dịch cao trên gà với hiệu
giá HI ngang bằng với vaccine thƣơng phẩm.



References
Tiếng Việt
1. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Nguyễn
Thị Bích Nga và Lê Trần Bình (2006), “Molecular characterization of the H5 gene for the
highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during”, 68-71. Proceedings of
International Workshop on Biotechnology in Agriculture (20.10.2006). Nong Lam
University Ho Chi Minh City.
Tiếng Anh
2. Aoki F.Y., Boivin G., Roberts N. (2007), “Influenza virus susceptibility and resistance to
oseltamivir”, Antivir Ther 12(4B), PP. 603-616, Review.
3. Baigent S. J., McCauley J. W. (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of
neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture”,
Virus Res 79(1-2), PP 177-185.
4. Basler C. F. (2007), “Influenza viruses: basic biology and potential drug targets”, Infect
Disord Drug Targets 7(4), PP 282-293, Review.
5. Bender C., Hall H., Huang J., Klimov A., Cox N., Hay A., Gregory V., Cameron K., Lim W.
and Subbarao K. (1999), “Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1)
viruses isolated from humans in 1997 – 1998”, Virology 254, pp 115-123.
6. Bosch F. X., Garten W., Klenk H. D., Rott R. (1981), “Proteolytic cleavage of influenza virus
hemagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2

determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avian influenza viruses”, Virology
113, pp 725-735.
7. Bublot M., Pritchard N., Swayne D. E., Selleck P., Karaca K., Suarez D. L., Audonnet J.
C., Mickle T. R. (2006), “Development and use of fowlpox vectored vaccines for avian
influenza”. Ann N Y Acad Sci, pp 193-201.
8. Castrucci M. R., Kawaoka Y. (1993), “Biologic importance of neuraminidase stalk length in
influenza A virus”, J Virol67, pp 759-764.
9. Chen H., Deng G., Li Z., Tian G., Li Y., Jiao P. (2004), “The evolution of H5N1 influenza
viruses in ducks in southern China”, Proc Natl Acad Sci USA 101, pp 10452-10457.
10. Chen L. M., Davis C. T., Zhou H., Cox N. J., Donis R. O. (2008), “Genetic compatibility and
virulence of reassortants derived from contemporary avian H5N1 and human H3N2
influenza A viruses”. PLoS Pathog 4(5), e1000072.
11. Conenello G.M., Zamarin D., Perrone L.A., Tumpey T., Palese P. (2007), “A single mutation
in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased
virulence”, PLoS Pathog 3(10), pp 1414-1421.
12. Doherty P. C., Turner S. J., Webby R. G., Thomas P. G. (2006), “Influenza and the
challenge for immunology”, Nat Immunol 7(5), pp 449-55, Review.
13. Ellebedy A. H., Webby R.J. (2009), Influenza vaccines, Vaccine 27, D65-D68.
14. Fouchier R. A., Smith D. J. (2010), “Use of antigenic cartography in vaccine seed strain
selection”, Avian diseases, PP 220-223.
15.Glick B.R. and Pasternak J.J. (2003), Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC.
16. Hilleman M. (2002), “Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis,
epidemiology and control”, Vaccine 20 (25-26), PP 3068-3087.
17. Horimoto T., Kawaoka Y. (2001) “Pandemic threat posed by avian influenza A viruses”,
Clin Microbiol Rev 14(1), PP 129-149.
18. Ito T., Couceiro J. N., Kelm S., Baum L. G., Krauss S., Castrucci M. R., Donatelli I., Kida
H., Paulson J. C., Webster R. G. and Kawaoka Y. (1998), “Molecular basis for the
generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential”, J Virol 72, PP 7367-
7373.
19. Kamp B. S., Hoffmann C., Preiser W. (2006), Influenza report .

20. Kash J.C., Goodman A.G., Korth M.J., Katze M.G. (2006), “Hijacking of the host-cell
response and translational control during influenza virus infection”, Virus Res 119(1), PP
111-120, Review.
21. Keawcharoen J., Amonsin A., Oraveerakul K., Wattanodorn S., Papravasit T., Karnda S.,
Lekakul K., Pattanarangsan R., Noppornpanth S., Fouchier R. A., Osterhaus A. D.,
Payungporn S., Theamboonlers A. and Poovorawan Y. (2005), “Characterization of the
hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different
avian species in Thailand”, Acta Virol 49(4), PP 277-280.
22. Li S., Liu C., Klimov A., Perdue M. L., Mo D., Ji Y, Woods L., Hietala S., Bryant M. (1999),
"Recombinant influenza A virus vaccines for the pathogenic human A/Hong Kong/97
(H5N1) viruses", Infect Dis 179, PP 55-60.
23. Macken C.A., Webby R.J., Bruno W.J. (2006), “Genotype turnover by reassortment of
replication complex genes from avian influenza A virus”, J Gen Virol 87(10), PP 2803-
2815.
24. Matrosovich M., Zhou N., Kawaoka Y., Webster R. (1999), “The surface glycoproteins of
H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have
distinguishable properties”, J Virol 73, PP 1146-1155.
25. Murphy B. R., Webster R. G. (1996), Orthomyxoviruses, In Fields BN, Knipe DM, Howley
PM, (eds.), Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PP 1397-
1445.
26. Nayak D., Hui E., Barman S. (2004), “Assembly and budding of influenza virus”, Virus Res
106(2), PP 147-165.
27. Neumann G., Hatta M., Kawaoka Y. (2003), “Reverse genetics for the control of avian
influenza”, Avian disease 47, PP 882-887.
28. Nicholson K. G., Wood J. M., Zambon M. (2003), “Influenza”. Lancet 362 (93970), PP
1733-1745.
29. OIE - World organisation for animal health (2005), “Avian influenza. Manual of diagnostic
test and vaccines for terrestrial animals.
30. Robertson B. H., Bhown A.S., Compans R.W., and Bennett J. C. (1979), “Structure of the
membrane protein of influenza virus. Isolation and characterization of cyanogens bromide

cleavage products”, J Viro, 30(3), PP 759-766.
31. Suarez D. L., Schultz-Cherry S. (2000), “Immunology of avian influenza virus”, Dev Comp
Immunol 24, PP 269-283.
32. Subbarao K., Luke C. (2007), “H5N1 viruses and vaccines”. PLoS Pathog 3(3): e40, Review.
33. Suzuki Y. (2005), “Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range variation of
influenza viruses”. Biol Pharm Bull 28(3), PP 399-408, Review.
34. Treanor J.J., Campbell J.D., Zangwill K.M., Rowe Thomas and Wolff Mark (2006), “Safety
and Immunogenicity of anInactivated Subvirion Influenza A (H5N1) Vaccine” ,NEJM, PP
1343-1351.
35. Uiprasertkul M., Kitphati R., Puthavathana P., Kriwong R., Kongchanagul A., Ungchusak
K., Angkasekwinai S., Chokephaibulkit K., Srisook K., Vanprapar N, Auewarakul P.
(2007), “Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans”,
Emerg Infect Dis 13(5), PP 708-712.
36. Wagner R., Matrosovich M., Klenk H. (2002), “Functional balance between
haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections”, Med Virol 12(3), PP
159-166.
37. Weber T. P., Stilianakis N. I. (2007), “Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in
migratory birds”, Emerg Infect Dis 13(8), PP 1139-1143, Review.
38. Webster R. G. (1998), “Influenza: an emerging disease”, Emerg Infect Dis 4, PP 436-
441.
39. Webster R.G., Guan Y., Peiris M., Walker D., Krauss S., Zhou N. N., Govorkova E. A., Ellis
T. M., Dyrting K. C., Sit T., Perez D.R., Shortridge K.F. (2002), “Characterization of
H5N1 influenza viruses that continue to circulate in geese in southeastern China”, J Virol
76(1), PP 118-126.
40. Weiss R.A. (2003), Cross-species infections. Curr Top Microbiol Immunol 278, PP 47-
71.
41. WHO (2005), “Avian influenza A (H5N1) infection in humans”, NEJM, 1374
42. Wu C., Cheng X., He J., Wang J., Deng R., Long Q., Wang X. (2008), “A multiplex real-
time RT-PCR for detection and identification of influenza virus types A and B and
subtypes H5 and N1”, J Virol Methods 148(1-2), PP 81-88.

43. Yamada S., Suzuki Y., Suzuki T., Le M. Q., Nidom C. A., Sakai-Tagawa Y., Muramoto Y.,
Ito M., Kiso M., Horimoto T., Shinya K., Sawada T., Kiso M., Usui T., Murata T., Lin Y.,
Hay A., Haire L. F., Stevens D. J., Russell R. J., Gamblin S. J., Skehel J. J., Kawaoka Y.
(2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A
viruses to human-type receptors”, Nature 444(7117), PP 378-382.
44. Zhou J. J., Fu J., Fang D. Y., Yan H. J., Tian J., Zhou J. M., Tao J. P., Liang Y., Jiang L. F.
(2007), “Molecular characterization of the surface glycoprotein genes of an H5N1
influenza virus isolated from a human in Guangdong, China”, Arch Virol 152(8), 1515-
1521.