Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử b anthracis

Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THÀNH ĐẠT

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG
KHÁNG KHÁNG NGUYÊN ĐẶC HIỆU TRÊN VỎ
BÀO TỬ B. anthracis

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60. 42. 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. ĐỖ NGỌC LIÊN

HÀ NỘI, 2012

1


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
1.1.

Vi khuẩn B. anthracis ...................................................................................... 4

1.1.1.

Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis ..................................................... 4

1.1.2.

Đặc điểm bào tử vi khuẩn B. anthracis ......................................... 6

1.1.3.

Một số protein trên vỏ bào tử của vi khuẩn than .......................... 9

1.1.4.

BclA- kháng nguyên bề mặt vỏ bào tử để xác định sự có mặt của

vi khuẩn than ............................................................................................... 11
1.2.

Đại cương về kháng thể................................................................................. 15

1.2.1.

Kháng thể....................................................................................... 15

1.2.2.

Các domain hằng định .................................................................. 16

1.2.3.

Các domain biến thiên .................................................................. 17

1.2.4.

Các lớp kháng thể ......................................................................... 17

1.2.5.

Phân loại kháng thể ...................................................................... 18

1.2.6.

Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng ... 19

1.3.

Kháng nguyên ................................................................................................ 21

1.4.

Tá chất ............................................................................................................ 22

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 24
2.1.

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT ........................................... 24

2.1.1.

Nguyên liệu.................................................................................... 24

2.1.2.

Thiết bị nghiên cứu ....................................................................... 24

2.1.3.

Hóa chất......................................................................................... 24

2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU [1,2,4,6,11,13,15] .................................. 25

2.2.1.

Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột ........................ 25

2.2.2.

Kỹ thuật ELISA ............................................................................. 26

54

Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

2.2.3.

Phương pháp tinh sạch IgG từ huyết thanh Chuột .................... 27

2.2.4.

Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ....................... 28

2.2.5.

Điện di protein trên gel polyacrylamid 12,5% ............................. 29

2.2.6.

Kỹ thuật Western Blot ................................................................... 30

2.2.7.

Phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch . .............. 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 34
3.1.

Kiểm tra độ tinh sạch của protein BclA tái tổ hợp trước khi gây đáp ứng

miễn dịch ................................................................................................................... 34

3.2.

Kiểm tra mẫu huyết thanh chuột trước khi gây đáp ứng miễn dịch ........ 35

3.3.

Gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ

hợp trên chuột. ......................................................................................................... 36
3.5.

Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi

khuẩn than bằng kỹ thuật tạo que thử dạng sắc kỹ miễn dịch ............................ 44
3.6.

Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi

khuẩn than bằng phương pháp Western blot. ...................................................... 45
3.7.

Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào

tử của các chủng vi khuẩn B. anthracis , B. cereus , B. thuringiensis B. subtilis
trên que thử dạng sắc ký miễn dịch. ...................................................................... 47

KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ............................... 50
KẾT LUẬN: ........................................................................................................ 50
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ............................................................ 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 51

55


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học
MỞ ĐẦU

Trong lịch sử phát triển lĩnh vực công nghệ sinh học, nghiên cứu ứng dụng miễn
dịch học đã được đưa vào thực tiễn từ rất sớm. Cho đến nay, đã có rất nhiều công trình
nghiên cứu ứng dụng thành công các sản phẩm của hệ miễn dịch vào các lĩnh vực trong
cuộc sống như trong Y học điều trị bệnh ung thư, chẩn đoán lâm sàng phát hiện bệnh,
phát hiện các tác nhân vi sinh vật, các loại độc chất, ma túy, khoa học hình sự, phát
hiện ô nhiễm môi trường… với nhiều phương pháp như ELISA, Western Blot, Dot
Blot, miễn dịch huỳnh quang, sắc ký miễn dịch dòng bên (que thử nhanh dạng sắc ký
miễn dịch)…Các kỹ thuật trên đều sử dụng đến sản phẩm của hệ miễn dịch là kháng
thể đa dòng và kháng thể đơn dòng.
Ngày nay, các vi sinh vật nguy hiểm trong đó có vi khuẩn than (B. anthracis )
đã và đang được sử dụng để chế tạo vũ khí sinh học nhằm mục đích khủng bố. Hiện
nay, trên thế giới đã xuất hiện nhiều test nhanh dạng sắc ký miễn dịch đã được thương
mại hóa. Chúng có ưu điểm là thời gian cho kết quả nhanh chóng, độ chính xác cao,
nhưng giá thành của các loại test này còn ở mức cao và thời gian nhập khẩu lâu. Mặt
khác, ở Việt Nam, các vi sinh vật này chủ yếu được phát hiện qua các phương pháp
PCR, ELISA...Nhược điểm của các phương pháp này là cần một thời gian lâu để cho
kết quả. Do đó, cần phải có công cụ để sàng lọc nhanh nhằm phát hiện sớm sự có mặt
các tác nhân vi sinh vật này.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“ Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ
bào tử B. anthracis.”

2


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Mục tiêu của đề tài bao gồm:


Tạo kháng thể đa dòng kháng lại 1 protein đặc trưng trên vỏ bảo tử vi
khuẩn Bacillus anthracis (protein này được sản xuất theo con đường tái
tổ hợp)



Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng này với protein đó
trên vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis.

Đây là bước đầu tiên trên con đường nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ
hợp để sản xuất kháng thể đơn dòng tại Viện Kỹ thuật Hóa sinh và Tài liệu Nghiệp vụ Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật-Bộ Công An.

3


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Vi khuẩn B. anthracis

1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis
B. anthracis (vi khuẩn than) là vi khuẩn đầu tiên được xác định là vi khuẩn gây
bệnh. Vào năm 1877, R. Koch đã nuôi vi khuẩn này dưới dạng chủng thuần khiết,
chứng minh được khả năng hình thành bào tử của nó và gây được bệnh than thực
nghiệm bằng cách cấy nó vào cơ thể động vật.
Vi khuẩn than thuộc loài Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus là các trực
khuẩn Gram dương, có bào tử, kỵ khí tuỳ tiện. Các vi khuẩn này gồm nhiều loài, đa số
không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (B. cereus), một số có lợi
cho con người (B. subtilis , B. thuringiensis, B. mycoides). B. anthracis có đặc điểm
khác biệt với 3 loài trực khuẩn hiếu khí có bào tử trên là ở tính có độc lực của nó. B.
anthracis có plasmids pXO1; pXO2 và plasmid mã hoá capsule, vỏ chỉ hình thành
trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, hoặc được nuôi cấy trong môi trường dinh
dưỡng 0,7% Natri bicarbonat, ở nhiệt độ 37C trong điều kiện giàu CO2 (20%). [3]
Về mặt hình thái, vi khuẩn than hình thẳng, hai đầu vuông, có kích thước từ
11,5 310m, thường xếp thành từng chuỗi giống như cây tre, bắt màu Gram (+). Ở
điều kiện ngoại cảnh hoặc trong môi trường nuôi cấy nghèo dinh dưỡng, vi khuẩn hình
thành bào tử, nằm giữa thân và không làm thay đổi hình thể vi khuẩn. Trên động vật bị
bệnh hoặc môi trường nuôi cấy đặc biệt vi khuẩn có vỏ. Trong môi trường lỏng vi
khuẩn không di động. [5]

Vi khuẩn B. anthracis

Bào tử vi khuẩn B. anthracis

4

Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Khuẩn lạc có kích thước lớn, đường kính 0,3 - 0,5 cm. Màu khuẩn lạc trắng đến
trắng ghi. Bề mặt khuẩn lạc ướt, hơi dính, không gây tan huyết trên thạch máu cừu
(nhưng trên thạch máu thỏ có thể gây tan huyết).
Trong các chương trình về vũ khí sinh học (VKSH) vi khuẩn gây bệnh than B.
anthracis được coi là tác nhân sinh học thường đựơc chú ý quan tâm nhiều nhất vì trực
khuẩn than có thể tồn tại trong thiên nhiên dưới dạng nha bào (bào tử) trong thời gian
hơn 10 năm, có khả năng chịu nhiệt 160 độ C trong vòng 5 phút, chịu nước sôi đến 10
phút... .
Người bị nhiễm bệnh than qua 3 con đường: qua da, đường tiêu hoá và đường
thở. Bào tử than khi bị hít thở qua mũi chúng có khả năng vào tới các phế nang để gây
bệnh than thể hô hấp và cư trú ở các phế bào của phế nang, qua hệ thống mạch bạch
huyết chuyển tới hạch lympho của trung thất. Tại đó các vi khuẩn gây bệnh than này
sinh trưởng và xâm nhập theo đường máu gây nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn
nhiều nơi trong cơ thể, gây tỷ lệ tử vong rất cao [3].
Độc tố của vi khuẩn than có sự tham gia của 3 yếu tố cấu thành: kháng nguyên
bảo vệ (Protective Antigen-PA), giúp hai cấu tử khác là yếu tố gây phù nề (Edema
Factor -EF) và yếu tố gây chết (Lethal Factor -LF) xâm nhập được vào tế bào của vật
chủ và gây độc. Về bản chất đây là 3 peptid do bản thân vi khuẩn sinh ra. Yếu tố gây
phù nề làm bất hoạt tế bào bạch cầu trung tính của vật chủ làm cho các tế bào này
không có khả năng thực bào để tiêu diệt vi khuẩn. Các nhà nghiên cứu cho rằng yếu tố
gây chết của vi khuẩn than kích thích các đại thực bào sản sinh TNF-alpha và
interleukin-1-beta (cả hai yếu tố này là thành phần của hệ miễn dịch có tác dụng trong
phản ứng viêm và sốc phản vệ) và yếu tố này có thể gây chết vật chủ. Đây cũng là yếu
tố khác biệt chủ yếu của

so với các chủng

B. anthracis

cereus…[9,10]

5

tương tự

như

B.


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Hình 1: Nguyên lý gây bệnh than của vi khuẩn B. anthracis [3 ]
Trước đây việc chẩn đoán xác định B. anthracis trong phòng thí nghiệm chủ yếu
dựa vào việc phát hiện hình thái học và đặc điểm sinh học. Các kỹ thuật DNA gần đây
đáp ứng được yêu cầu phát hiện chính xác, cho phép phân biệt B. anthracis với các loại
trực khuẩn khác trong “nhóm B. cereus” như B. cereus, B. thuringiensis và B.
mycoides...Đó là dựa vào sự có mặt của hai plasmids lớn (pXO1; pXO2) của trực
khuẩn than chứa gen độc lực. [3,7]
1.1.2. Đặc điểm bào tử vi khuẩn B. anthracis .
Bào tử vi khuẩn B. anthracis được hình thành trong môi trường thiếu các chất
dinh dưỡng thiết yếu. Trong quá trình hình thành này sẽ có một sự phân chia không đối

xứng của tế bào sinh dưỡng tạo ra một phần lớn và một phần nhỏ tương ứng là tế bào
mẹ (mother cell) và tiền bào tử (forespore). Các tế bào mẹ sau đó bao lấy phần tiền bào
tử, các lớp của bào tử dần được hình thành. Do đó bào tử của B. anthracis bao gồm các
lớp chính sau: lõi (spore core), vỏ lõi (cortex), vỏ bào tử (exosporium). Cuối cùng tế
bào mẹ phân giải tạo nên các bào tử trưởng thành, các bào tử này không hoạt động
nhưng có khả năng sống sót trong môi trường khắc nghiệt qua nhiều năm [10].

6


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Hình 2: Quá trình hình thành bào tử vi khuẩn than B. anthracis [10]
Phần lõi dày là biến đổi của peptidoglycan, lớp vỏ lõi bao lấy phần lõi và chứa
khá nhiều protein, lớp vỏ bào tử là phần ngoài cùng có cấu trúc giống như quả bóng,
liên kết lỏng lẻo, được xem là nơi tiếp xúc bề mặt giữa bào tử và môi trường [12].
Trong khi ở B. subtilis , lớp áo (coat) là lớp ngoài cùng của bào tử thì ở vi
khuẩn B. anthracis , B. thuringiensis, B. cereus có vỏ bào tử là lớp ngoài cùng. Cả áo
bào tử và vỏ bào tử đều có cấu trúc linh hoạt, khả năng đàn hồi tốt. Mặt khác trên áo và
vỏ bào tử tập trung một số enzyme có tác dụng bảo vệ.

Hình 3: Cấu tạo bào tử quan sát dưới kính hiển vi điện tử [3,5 ]

7


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Ở hình 3a, là cấu tạo bào tử của vi khuẩn B. subtilis , có lớp ngoài cùng là áo
bào tử (Oc: outer coat layer). Ở lớp này tập trung chủ yếu các protein (chiếm khoảng
30% protein bào tử). Ước tính có khoảng 70 protein trên lớp áo bào tử, phần lớn các
protein này là đặc hiệu cho chủng B. subtilis , người ta thường dựa vào các protein đó
để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn này. Khác với vi khuẩn B. subtilis có lớp áo bào tử
dày với lớp bên trong sáng và lớp bên ngoài tối, vi khuẩn than có áo bào tử mỏng. Lớp
này được phân cách với lớp ngoài cùng bởi khoảng giữa (Is: interspace). Đối với các
chủng B. anthracis , B. cereus , B. thuringiensis, B. mycoides và một số thuộc nhóm
Clostridia thì lớp ngoài cùng là vỏ bào tử. Hình 3b và hình 4 mô tả cấu tạo bào tử của
vi khuẩn than.

Hình 4: Cấu tạo các lớp của bào tử vi khuẩn than [3,5]
Cấu tạo lớp ngoài cùng của bào tử gồm 2 lớp sau: lớp cơ bản (Bl: basal layer) và
một phần bên ngoài giống như các sợi lông (Hn: hair-like nap). Khi quan sát dưới kính
hiển vi điện tử và dùng nhiễu xạ X-quang, người ta thấy lớp cơ bản dày khoảng 190A0
được hình thành từ các lớp mỏng hơn. Lớp cơ bản gồm 4 tấm kết tinh, mỗi tấm có cấu
trúc lỗ có hình lục giác. Ở B. cereus và B. anthracis thì lớp cơ bản dày khoảng 2030nm. [14].
Phần lông bao quanh bên ngoài là một glycoprotein gọi là BclA (Bacillus
collagen-like protein of anthracis). Phần cấu trúc của BclA sẽ được mô tả cụ thể ở phần

8


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

sau. Vỏ bào tử chiếm khoảng 2% khối lượng của bào tử và có khoảng 50% protein,

20% lipid , 20% polysaccharides trung tính, và 10% là các thành phần khác. Chức năng
chính của vỏ bào tử là chống lại các tác nhân môi trường, do bề mặt kỵ nước nên làm
tăng khả năng kết dính của bào tử. Mặt khác trên vỏ bào tử chứa một số enzyme có
chức năng hoạt hoá sự hoạt động của bào tử. Vỏ bào tử cũng chính là điểm đầu tiên để
bào tử tương tác với tế bào vật chủ của hệ thống miễn dịch [8].
1.1.3. Một số protein trên vỏ bào tử của vi khuẩn than
Các protein trên vỏ bào tử B. anthracis là đối tượng thường được sử dụng để
phát hiện sự có của vi khuẩn than. Theo thống kê của một số tài liệu [14] thì có khoảng
gần 20 protein có mặt trên vỏ bào tử của vi khuẩn này. Có thể kể đến một số protein
sau: BclA, Alanine racemase (Alr), Inosine hydrolase (InH), Protein ExsF, Protein
CotY, Protein Cot E, Protein Cot H, Protein ExsY, Protein CotB, Protein giả thuyết
ExsK, Protein BxpB, Protein BclA, Protein BxpA...
Các protein nhóm D là các enzyme. Alanine racemase (Alr), Inosine hydrolase
(InH), Fe/Mn-SOD (Fe/Mn-superoxide dismutase). Các enzyme này có vai trò trong
việc bảo vệ bào tử khỏi phản ứng ôxy hoá đồng thời ngăn chặn sự nảy mầm sớm.
Người ta đã chứng minh được rằng những enzyme kể trên xuất hiện ở giai đoạn trưởng
thành của vỏ bào tử vi khuẩn. Alr chuyển hoá L-alanine thành D-alanine (một chất ức
chế sự nảy mầm), InH sẽ phân huỷ inosine ngăn cản quá trình nảy mầm bằng cách
giảm tối thiểu lượng inosine [14].
Các protein nhóm E như ExsY, CotY, CotB. Những protein này có thể được đính
ở lớp cơ bản hoặc lớp ngoài của áo bào tử. Chúng tham gia trong quá trình lắp ráp của
vỏ bào tử. Nhóm các protein bào tử bao gồm các protein có cùng nguồn gốc với các
protein của các protein của B. subtilis

có vai trò gắn với lớp áo (coat) hoặc các thành

phần phía ngoài áo.

9

Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Hình 5: Các protein trên vỏ bào tử của một vài loại vi khuẩn [ 14 ]

10


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Protein nhóm F như BclA, ExsB, ExsC, ExsD,BxpB,... là các protein có trọng
lượng phân tử cao. Có thể kể đến những đặc điểm cơ bản của một số protein thuộc
nhóm này. BxpB được tìm thấy ở lớp cơ bản nhờ đánh dấu miễn dịch huỳnh quang
bằng vàng. Protein này tạo phức liên kết hoá trị mạnh với BclA, các protein khác ở lớp
cơ bản và lớp lông bên ngoài gồm ExsY và CotY. Khi BxpB được tách chiết từ bào tử
bằng SDS, nó được tách ở cả dạng đơn phân và dạng phức hệ khối lượng phân tử lớn
với BclA. BxpB bị đột biến không có khả năng bám với lông bên ngoài, mặc dù BclA
vẫn được tổng hợp bình thường. Thiếu BxpB dẫn đến bào tử nảy mầm nhanh hơn. Một
nhóm các protein, như BxpA, BxpB (còn gọi ExsFA), BxpC, ExsC... chỉ được tìm thấy
ở các vi sinh vật thuộc B. cereus (Bảng 1, nhóm F). Điều này cho thấy vỏ bào tử ở các
sinh vật khác được gắn với lớp cơ bản bằng một nhóm các protein khác. Protein trên vỏ
bào tử của vi khuẩn mang tính đặc hiệu thường được dùng như maker chỉ thị sự có mặt
của vi khuẩn đó [14].
1.1.4. BclA- kháng nguyên bề mặt vỏ bào tử để xác định sự có mặt của vi khuẩn
than
Như đã nói ở trên, một trong những thành phần chính của vỏ bào tử là lớp lông

bên ngoài của vỏ bào tử có thành phần chủ yếu là BclA (Bacillus collagen-like protein
of anthracis). Phần lông và sự liên kết của các sợi lông này lần đầu tiên được mô tả
trong vỏ bào tử của B. anthracis vào năm 1966. BclA có cấu trúc giống như quả bóng
được tạo nên ít nhất bởi 20 protein khác nhau. BclA cũng được tìm thấy trong nhóm B.
cereus . Protein BclA (hình 6) bao gồm phần đầu N và vùng đầu C, thêm 1 vùng giống
collagen, vùng này là sự lặp đi lặp lại của bộ GPT glycine, proline, và threonine.
[12,16,17,20]

Hình 6: Các phần cấu trúc của protein BclA
Glycine là gốc acid amin đầu tiên trong các trình tự lặp lại 3 acid amin GXX
trong đó X là các acid amin bất kỳ. 39% các gốc không phải glycine trong các trình tự

11


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

lặp lại là proline, acid amin này có vai trò làm bền cấu trúc xoắn 3 sợi do giới hạn góc
quay của chuỗi polypeptid. Các dự đoán dựa trên mô hình máy tính cho thấy BclA tồn
tại dưới dạng xoắn.
BclA tái tổ hợp tạo dạng cấu trúc xoắn tự nhiên khi làm nóng hoặc làm lạnh
protein này. 35 acid amin vùng domain N của BclA có cấu trúc tương tự các thành viên
của họ nhân tố hoại tử ung thư (TNF) và vai trò của nó đến nay vẫn chưa được làm rõ.
Giải trình tự đầu N của protein tinh sạch từ bào tử cho thấy 19 gốc acid amin đầu tiên
của protein bị xử lý để loại bỏ đầu N sau sinh tổng hợp. Đầu N nằm phía trong lớp cơ
bản.
Protein vùng lông có tính kỵ nước với khoảng 70 bộ ba các acid amin lặp lại
giống collagen (GXX) và 54 bộ ba GPT. Tính chất kỵ nước của BclA có thể giải thích

cho tính kỵ nước của cả bào tử. Giữa các aa 41-232 là trình tự lặp lại
((GPT)5GDTGTT)2 đặc trưng cho BclA. Vùng lặp lại của BclA rất đa dạng, cũng như
phần đầu N và đầu C có trình tự đa hình, cho phép phân biệt giữa các loài và các
chủng. Sự khác nhau về số lượng lặp lại cũng tương ứng với độ dài của lông trên vỏ
bào tử. Các đột biến BclA sẽ làm mất khả năng nhìn thấy lông ở ngoài bề mặt vỏ bào
tử. Vùng kết thúc đầu C (CTD: C-terminal domain ) gồm 134 acid amin là yếu tố cần
thiết để hình thành cấu trúc xoắn ba lần (triple) của protein BclA. CTD có thể tạo thành
dạng xoắn gồm 3 phần CTD một cách tự nhiên. Domain này nằm hướng ra phía ngoài
lớp vỏ bào tử và là phần lộ ra ngoài chủ yếu của BclA. [17,19,20]

12


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Hình 7: Cấu trúc 3D của phân tử BclA [ 12,16,17 ]
BclA tái tổ hợp kháng được một số protease nhưng rất dễ bị tác động bởi collagenase,
trong khi đó BclA liên kết đường (glycosylated BclA) tự nhiên có thể kháng lại cả 2
enzyme này. Xử lý BclA tái tổ hợp bằng enzyme collagenase làm phân hủy các acid
amin ở hai đầu của vùng giống collagen nhưng vùng CTD không bị phân hủy.
BclA được dự đoán là có cấu trúc dạng kẹo que (lollipop), phần CTD tạo thành
đầu xoắn của quả cầu protein. Domain CTD có dạng hình cầu và có độ tương đồng cao
với protein bổ thể C1q và yếu tố hoại tử khối u. Cả BclA và bổ thể C1q đã được chứng
minh là có khả năng tương tác với thành phần SP-C (một thành phần chính trên bề mặt
phế nang phổi)
Cấu trúc và vai trò của BclA trong bệnh học của B. anthracis đã được làm sáng
tỏ. Khi điện di, BclA di chuyển giống protein có kích thước >70kDa, lớn hơn nhiều so
với kích thước 34 kDa khi giải trình tự acid amin. Điều này có thể là do thành phần

prolines khá nhiều, khiến sự di động của các protein giống collagen sẽ bị thay đổi. Các
protein giống collagen này rất hiếm thấy ở sinh vật nhân sơ. Các gốc threonine lặp lại
có thể là vị trí để đường hóa thông qua liên kết với nhóm OH của threonine. Các
protein này có thể tạo cấu trúc xoắn gồm 3 phân tử mà không cần hydroxyproline như
các protein ở sinh vật nhân chuẩn. Hai oligosaccharide được liên kết tại nhóm OH, một
tetrasacchareide 715 kDa và một disaccharide 324 kDa được giải phóng khỏi bào tử và

13


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

BclA bám vỏ bào tử sau khi xử lý phân giải với hydrazine (hydrazinolysis). Mỗi
oligosaccharide có thể đính vào BclA thông qua liên kết đường. Tetrasaccharide được
tìm thấy trong vùng giống collagen của BclA, disaccharide nằm ngoài khu vực này.
Disaccharide bao gồm 1 phần rhamnose và một phần 3-O-rhamnose-methyl.
Tetrasacchareide là 2-O-methyl-4-(3-hydroxy-3-methyl-butamido)-4,6-dideoxy-β-Dglucopyranosyl-(1

3)-α-L-rhamnopyransol-(1

3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1

2)-

L-rhamnopyranose (Hình 8). Hai phía của đường là 2-O-methyl-4-(3-hydroxy-3methylbutamido)-4,6-dideoxy-D-glucose có tên là anthrose. Đường anthrose của BclA
không tìm thấy trong các thành phần khác ngoài họ B. cereus mặc dù tất cả chúng đều
có chứa protein BclA. Người ta sử dụng đường như là đích để sản xuất các bộ Kit phục
vụ trong chẩn đoán. [20]

Hình 8: Cấu trúc của Tetrasaccharide [20 ]
Sự lặp lại của GPT được ổn định bởi sự glycosyl hoá. BclA tái tổ hợp được biểu
hiện trong E.coli không bị glycosyl hoá. BclA hiếm khi không bị glycosyl hoá vì nó
gián tiếp liên kết với sản phẩm của quá trình glycosyl hoá này. Khi các protein có

14


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

nguồn gốc ở bào tử được xử lý với acid trifluoromethanesulfonic (TFMS) nhằm loại
bỏ sự glycosyl hoá, protein vẫn giữ lại một phần đường.
Bản chất quá trình glycosyl hoá tự nhiên của BclA đóng một vài trò quan trọng
trong việc liên kết bào tử với các phân tử carbohydrate của màng các tế bào trình diện
kháng nguyên ở động vật. Điều này cũng có thể bảo vệ vỏ bào tử khỏi sự glycosyl hoá ,
tách enzyme ra khỏi bào tử để giúp loại trừ một số phân tử tiếp cận với bào tử.
Bào tử bị đột biến BclA cũng không thay đổi đáng kể độc tính với mô hình gây
bệnh ở chuột, tuy nhiên thời gian mang bệnh sẽ biến đổi. Trong đa số các tài liệu đã
được công bố thì BclA luôn là đích quan tâm của các nhà khoa học, vì kháng nguyên
bề mặt này hay được sử dụng để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn than [20].
1.2.

Đại cương về kháng thể

1.2.1. Kháng thể
Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein) có hình
dạng hơi giống chữ Y, do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (plasma cell biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ,

chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus. Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitope
kháng nguyên duy nhất.

Hình 9: Cấu trúc của một phân tử kháng thể.

15


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptid, gồm hai chuỗi nặng (H, heavy)
giống nhau và hai chuỗi nhẹ (L, light) cũng giống nhau. Có hai loại chuỗi nhẹ 
(kappa) và  (lambda), do đó hai chuỗi nhẹ của mỗi phân tử immunoglobulin chỉ có thể
cùng là  hoặc cùng là . Các chuỗi của immunoglobulin liên kết với nhau bởi các cầu
nối disulfide và có độ đàn hồi nhất định. Một phần cấu trúc của các chuỗi cố định
nhưng phần đầu của hai "cánh tay" chữ Y thì rất biến thiên giữa các kháng thể khác
nhau, để tạo nên các vị trí kết hợp có khả năng phản ứng đặc hiệu với các kháng
nguyên tương ứng, điều này tương tự như một enzyme tiếp xúc với cơ chất của nó. Có
thể tạm so sánh sự đặc hiệu của phản ứng kháng thể-kháng nguyên như ổ khóa và chìa
khóa [4].
1.2.2. Các domain hằng định

Hình 10: Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể.
Các domain hằng định (C, constant domain) đặc trưng bởi các chuỗi amino acid
rất ít biến đổi ở các kháng thể. Domain hằng định của chuỗi nhẹ ký hiệu là CL. Các
chuỗi nặng chứa 3 hoặc 4 domain hằng định, tùy theo lớp kháng thể CH1, CH2, CH3 và
CH4.
Các domain hằng định không có vai trò nhận diện kháng nguyên, chúng làm

nhiệm vụ cầu nối với các tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể. Do đó, phần "chân"
của chữ Y còn được gọi là Fc (tức là phần hoạt động sinh học của kháng thể F:
fragment, c: cristallisable) thường được liên kết với các thụ thể tế bào miễn dịch.

16


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

1.2.3. Các domain biến thiên
Mỗi immunoglobulin có 4 domain biến thiên (V, variable domain) ở đầu tận hai
"cánh tay" của chữ Y. Sự kết hợp giữa 1 domain biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và 1
domain biến thiên trên các chuỗi nhẹ kappa và lambda (VL) tạo nên vị trí nhận diện và
liên kết với epitope của kháng nguyên ( phần kháng thể liên kết với kháng nguyên còn
gọi là paratopee). Như vậy, mỗi immunoglobulin có hai vị trí gắn kháng nguyên. Hai vị
trí này giống nhau như đúc, qua đó một kháng thể có thể gắn được với 2 kháng nguyên
giống nhau. Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi là Fab (tức là phần liên kết kháng
nguyên, F: fragment, ab: antigen binding). Domain của kháng nguyên gắn vào kháng
thể gọi là epitope
Các domain sở dĩ gọi là biến thiên vì chúng khác nhau rất nhiều và biểu hiện đa
dạng giữa các kháng thể. Chính sự biến thiên đa dạng này giúp cho hệ thống các kháng
thể nhận biết được nhiều loại tác nhân kháng nguyên gây bệnh khác nhau [4].
1.2.4. Các lớp kháng thể
Các kháng thể được phân thành 5 lớp hay isotype. Tùy theo cấu tạo của các
domain hằng định của các chuỗi nặng: các chuỗi nặng , , ,  và  lần lượt tương
ứng với các immunoglobulin (Ig) thuộc các lớp IgG, IgA, IgM, IgE và IgD.Tất cả các
kháng thể đều chứa các chuỗi nhẹ là kappa và lambda
Ngoài ra, các khác biệt đặc trưng hơn cũng tồn tại bên trong một số lớp

immunoglobulin. Ở người, có 4 loại dưới lớp (subclass) IgG (IgG1, IgG2, IgG3 và
IgG4) và 2 loại dưới lớp IgA (IgA1 và IgA2).
Thông thường một tế bào B sản xuất đồng thời nhiều lớp kháng thể: chúng khác
nhau ở phần C các chuỗi nặng nhưng giống hệt nhau ở tính đặc hiệu với một kháng
nguyên.
Mỗi lympho B chỉ có thể sản xuất 1 loại kháng thể đặc hiệu đối với 1 epitope
kháng nguyên nhất định, do đó cần phải có hàng nhiều triệu lympho B khác nhau. Số
lượng này vượt quá số lượng gen của con người.

17


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Trong đó, IgG là loại immunoglobulin monomer, là kháng thể phổ biến nhất
trong máu và các dịch mô. Đây là isotype duy nhất có thể xuyên qua màng nhau thai,
qua đó bảo vệ trẻ sơ sinh trong những tuần lễ đầu đời sau khi sinh khi hệ miễn dịch của
trẻ chưa phát triển. Vai trò chính của IgG là hoạt hóa bổ thể và opsonine hóa. Có 4 thứ
lớp: IgG1 (66%), IgG2 (23%), IgG3 (7%) và IgG4 (4%) trong đó IgG4 không có chức
năng hoạt hóa bổ thể.
1.2.5. Phân loại kháng thể
a. Kháng thể đơn dòng
Các kháng thể đơn dòng chỉ nhận biết một epitopee trên một kháng nguyên cho
sẵn (hình 11). Theo định nghĩa, tất cả các kháng thể đơn dòng cùng một dòng thì giống
hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng tương bào.
Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong sinh học và y học, chúng vừa
là phương tiện chẩn đoán, vừa là công cụ điều trị. Thí dụ, chúng được ứng dụng trong
một phương pháp phát hiện có thai được sử dụng phổ biến hiện nay.

Hình 11: Kháng thể đơn dòng, liên kết với một epitope đặc hiệu.
b. Kháng thể đa dòng
Các kháng thể đa dòng là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope
khác nhau trên một kháng nguyên cho trước (hình 12). Trong đáp ứng miễn dịch, cơ

18


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

thể tổng hợp nhiều kháng thể tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên:
đáp ứng như vậy gọi là đa dòng [4].

Hình 12: Các kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitope khác nhau.
1.2.6. Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng
1.2.6.1.

Chuẩn bị kháng nguyên

Việc chuẩn bị kháng thể đa dòng đòi hỏi phải có kháng nguyên sạch. Còn kháng
thể đơn dòng được sản xuất từ kháng nguyên chưa sạch. Các protein hòa tan lộ ra sự
đáp ứng mạnh có thể biến hóa thành những kháng nguyên đặc thù bởi sự liên kết chúng
với cơ chất rắn. Acid nucleic bình thường không gây ra miễn dịch nhưng khi liên kế
với protein mang nó thì sẽ gây ra miễn dịch. Carbohydrate loại đơn giản thì thường có
tính miễn dịch yếu và cần thiết liên kết với một protein mang nó. Carbohydrate càng
lớn thì có thể gợi ra sự đáp ứng bình thường nhưng không gây ra đáp ứng thứ cấp.
Kháng nguyên có thể được chuẩn bị bằng nhiều cách như: (i) nghiền phá hủy các mô

(ii) tách chiết bằng các phân tử khi tủa muối hay chất tẩy rửa. Phương pháp được chọn
phụ thuộc vào kháng nguyên hòa tan hay không hòa tan và thành phần của kháng
nguyên là protein, carbohtydrate hay acid nucleic. Các kháng nguyên đó có thể được
tách chiế và làm sạch theo trọng lượng của chúng hoặc theo kích thước thông qua quá
trình điện di trên gel.

19


Luận văn thạc sỹ

1.2.6.2.

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

Sản xuất kháng thể đa dòng:

Các kháng thể đa dòng được tạo nên bằng cách tiêm chất gây miễn dịch (kháng
nguyê) vào sinh vật và sau một thời gian thích hợp thì sẽ tách huyết thanh tương ứng.
Sự đáp ứng miễn dịch sẽ phụ thuộc vào lượng và bản chất kháng nguyên cũng như khả
năng đáp ứng miễn dịch của vật được tiêm với kháng nguyên đó. Thông thường, trong
lần tiêm đầu tiên thì kháng thể sinh ra chứa IgM với nồng độ rất thấp, lần tiêm thứ hai
thì nồng độ kháng thể IgG đạt ở mức trung bình. Tuy nhiên, trong những lần kế tiếp sẽ
làm tăng nồng độ của kháng thể IgG đáng kể.
a. Chuẩn bị hỗn hợp tá dược kháng nguyên
Kháng nguyên được trộn với tá dược trước khi tiêm với mục đích là làm cho kháng
nguyên giải phóng từ từ để kích thích hệ thống sinh miễn dịch của sinh vật. Để chuẩn
bị tá dược kháng nguyên thì thường trộn dung dịch kháng nguyên với tá dược Freund
tương đương với nhau. Ngoài tá dược Freund thì cũng có thể dùng một số khác như
Titermax với liều 50-500ml/động vật. Tuy nhiên, với những tế bào sống thì không cần

thiết phải bổ sung tá dược.
b. Con đường gây miên dịch
Phương pháp chung thường là gây miễn dịch cho thỏ hoặc chuột là tiêm dưới da
bởi một lượng lớn có thể tiêm vào động vật và kháng thể đặc hiệu có thể được dẫn qua
bởi phương pháp này. Tiêm tĩnh mạch đã được thử trên thỏ, sự đáp ứng nhanh và mạnh
bởi vì kháng nguyên đi vào máu và nhanh chóng tới các cơ quan sinh miễn dịch như
gan, lách và phổi. Tuy nhiên, tiêm tĩnh mạch không thích hợp lắm cho lần tiêm đầu tiên
vì kháng nguyên đặc hiệu dễ bị loại trừ bởi những chất hóa học thô như azide sodium
đi qua đường phổi.
1.2.6.3.

Sản xuất kháng thể đơn dòng

Huyết thanh chứa một dãy các kháng thể và chúng đặc hiệu với các kháng
nguyên khác nhau. Khi động vật được gây miễn dịch thì khoảng 1/10 kháng thể tuần
hoàn đặc hiệu với kháng nguyên. Các kháng thể được sản xuất bởi tương bào từ tế bào
B được biệt hóa. Mỗi tế bào B bố mẹ có khả năng sản xuất các kháng thể đặc hiệu. Các

20


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

kháng thể được bài tiết bởi dòng tế bào lympho B thì giống hệt nhau và đây cũng là
nguồn gốc của các tế bào đồng nhất. Song các tế bào tương bào có đời sống tương đối
ngắn và cũng không thể lớn lên được trong nuôi cấy.
Năm 1975, Kohler và milstein đã phát triển kỹ thuật cho phép tương bào được
hòa vào các tế bào ung thư Myeloma để tạo ra các tế bào lai và lớn lên. Các tế bào này

có khả năng lớn lên không hạn chế mà vẫn sản xuất ra các kháng thể đặc hiệu gọi là
kháng thể đơn dòng. Các kháng thể đơn dòng có thể được sản xuất từ kháng nguyên
không sạch bằng cách chọn lựa các dòng tế bào đơn giản sau khi hợp nhất. chúng có
thể được chuẩn bị để chống lại sự thay đổi rộng rãi các phân tử gây miễn dịch như
protein, cacbohydrate, nucleic acid hoặc phối hợp giữa chúng. Các kháng thể đơn dòng
được hình thành chỉ đặc hiệu với một yếu tố quyết định của các phân tử gây miễn dịch.
Vì thế, có thể được dùng để tách yếu tố quyết định ấy. thêm vào đí dòng tế bào lai sẽ
cung cấp một cách không hạn chế kháng thể trong dịch nổi của tế bào [4].
1.3.

Kháng nguyên
Kháng nguyên (antigen) là chất có khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch khi đưa

vào cơ thể của động vật thích hợp hoặc một chất có khả năng phản ứng với một kháng
thể hoặc một tế bào của hệ thống miễn dịch. Như vậy, tất cả những chất tự nhiên hoặc
tổng hợp được sử dụng để tạo đáp ứng miễn dịch (kể cả các kháng thể) đều được gọi là
các kháng nguyên. Khi một kháng nguyên kể cả kháng thể khác loài xâm nhập vào cơ
thể của một loài, các lympho có thể nhận biết đặc hiệu bằng cách kết hợp với kháng
nguyên nhờ thụ thể đặc hiệu. Sự nhận biết gây cảm ứng sinh sản lympho-B và biệt hóa
quần thể tế bào này thành các tế bào plasma có khả năng sản xuất kháng thể chống lại
kháng nguyên xâm nhập. Đó là đáp ứng miễn dịch thể dịch. Đáp ứng miễn dịch cũng
có thể gây ra sự xuất hiện quần thể lympho-T miễn dịch mang các thụ thể đặc hiệu với
kháng nguyên. Đó là sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào.
Tính phản ứng của kháng nguyên hoặc khả năng nhận biết, khả năng liên kết
đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể hoặc với thụ thể của tế bào phụ thuộc vào

21


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

một phần cấu trúc giới hạn của kháng nguyên. Phần cấu trúc giới hạn này được gọi là
quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) hay epitope.
Tính kháng nguyên là đặc tính của một epitope có cấu trúc ba chiều của phân tử
kháng nguyên. Phần cấu trúc này của phân tử kháng thể hoặc của thụ nhận diện epitope
kháng nguyên gọi là paratope. Tính miễn dịch của một epitope kháng nguyên là đặc
tính gây ra một đáp ứng miễn dịch của phân tử kháng nguyên khi nó xâm nhập vào cơ
thể. Trong trường hợp kháng nguyên là các protein, người ta có thể nhận biết được kích
thước của một epitope kháng nguyên vào khoảng 5 đến 10 gốc acid amin bằng phương
pháp phân hủy hóa học hoặc phân hủy enzyme đối với kháng nguyên này. Người ta
cũng phân biệt một dạng epitope thứ hai, gọi là epitope gián đoạn. Loại epiotop này
được sắp xếp nhưng lại gần nhau về không gian của protein do sự gấp lại của chuỗi
polypeptid.
Sự nhận biết giữa kháng nguyên và kháng thể có tính đặc hiệu cao, một kháng
nguyên A chỉ có thể được nhận biết bởi một loại tế bào lympho có thụ thể liên kết đặc
hiệu với kháng nguyên A.
Nhiều chất hóa học có phân tử lượng nhỏ, phân cực mạnh có khả năng gây ra sự
tổng hợp một kháng thể đặc hiệu sau khi được kết hợp với phân tử mang có kích thước
lớn hơn. Các chất hóa học này được gọi là hapten và được coi là tương đương với
những quyết định kháng nguyên tách rời. Các hapten có khả năng phản ứng với các
kháng thể đặc hiệu của chúng. Tuy nhiên, để gây ra phản ứng miễn dịch in vivo, một
hapten cần phải liên kết với protein mang. Sự kết hợp của hapten và protein mang sẽ
tạo ra một cấu trúc kháng nguyên sinh miễn dịch có ít nhất hai quyết định kháng
nguyên khác nhau.
1.4.

Tá chất
Các tá chất (Adjuvants): Tá chất là một chất hoặc một hỗn hợp các chất có khả

năng làm tăng tính miễn dịch của các kháng nguyên và nói chung thường gây ra các
phản ứng viêm. Tá chất thường làm chậm quá trình loại bỏ kháng nguyên và tạo điều

22


Luận văn thạc sỹ

Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học

kiện cho việc bắt giữ và trình diện kháng nguyên. Tá chất được sử dụng thường xuyên
là hydroxid nhôm hoặc các chất có nguồn gốc vi khuẩn. Các tá chất có mặt trên thị
trường hiện nay có nhiều loại như: Tá chất Freund’s, ISCOMs, Toxin của vi khuẩn...
- Vai trò của tá chất trong phức hợp gây miễn dịch
+ Tá chất tăng cường khả năng phóng thích kháng nguyên cho tế bào APC, và thu
hút các tế bào của hệ thống miễn dịch tới chỗ viêm.
+ Thúc đẩy quá trình hoạt hóa tế bào APC bằng cách điều hòa, kích thích hệ thống
miễn dịch của động vật giải phóng cytokin.
+ Tăng cường khả năng chế biến và trình diện kháng nguyên của tế bào APC.
+ Thúc đẩy tế bào B sinh kháng thể và làm tăng ái lực của kháng thể.
+ Kích thích đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, tăng sinh tế bào lympho.

23