Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử b anthracis

Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng
nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B. anthracis

Nguyễn Thành Đạt

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: GS-TS Đỗ Ngọc Liên
Năm bảo vệ: 2012


Abstract: Nghiên cứu sử dụng một số phương pháp như: phương pháp gây
đáp ứng miễn dịch trên chuột, kỹ thuật ELIS, phương pháp tinh sạch IgG từ
huyết thanh chuột, kỹ thuật Western Blot … Tạo kháng thể đa dòng kháng
lại 1 protein đặc trưng trên vỏ bảo tử vi khuẩn Bacillus anthracis (protein
này được sản xuất theo con đường tái tổ hợp). Kiểm tra khả năng phản ứng
của kháng thể đa dòng này với protein đó trên vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus
anthracis.

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Kháng thể; Vi khuẩn than

Content
I. TỔNG QUAN
Trong lịch sử phát triển lĩnh vực công nghệ sinh học, nghiên cứu ứng dụng miễn dịch học đã
được đưa vào thực tiễn từ rất sớm. Cho đến nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng
thành công các sản phẩm của hệ miễn dịch vào các lĩnh vực trong cuộc sống như trong Y học điều
trị bệnh ung thư, chẩn đoán lâm sàng phát hiện bệnh, phát hiện các tác nhân vi sinh vật, các loại độc
chất, ma túy, khoa học hình sự, phát hiện ô nhiễm môi trường… với nhiều phương pháp như
ELISA, Western Blot, Dot Blot, miễn dịch huỳnh quang, sắc ký miễn dịch dòng bên (que thử nhanh
dạng sắc ký miễn dịch)…Các kỹ thuật trên đều sử dụng đến sản phẩm của hệ miễn dịch là kháng
thể đa dòng và kháng thể đơn dòng.

Ngày nay, các vi sinh vật nguy hiểm trong đó có vi khuẩn than (B. anthracis ) đã và đang
được sử dụng để chế tạo vũ khí sinh học nhằm mục đích khủng bố. Hiện nay, trên thế giới đã xuất
hiện nhiều test nhanh dạng sắc ký miễn dịch đã được thương mại hóa. Chúng có ưu điểm là thời
gian cho kết quả nhanh chóng, độ chính xác cao, nhưng giá thành của các loại test này còn ở mức
cao và thời gian nhập khẩu lâu. Mặt khác, ở Việt Nam, các vi sinh vật này chủ yếu được phát hiện
qua các phương pháp PCR, ELISA Nhược điểm của các phương pháp này là cần một thời gian lâu
để cho kết quả. Do đó, cần phải có công cụ để sàng lọc nhanh nhằm phát hiện sớm sự có mặt các tác
nhân vi sinh vật này.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“ Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B.
anthracis.”
Mục tiêu của đề tài bao gồm:
 Tạo kháng thể đa dòng kháng lại 1 protein đặc trưng trên vỏ bảo tử vi khuẩn
Bacillus anthracis (protein này được sản xuất theo con đường tái tổ hợp)
 Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng này với protein đó trên vỏ bào
tử vi khuẩn Bacillus anthracis.
Đây là bước đầu tiên trên con đường nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản
xuất kháng thể đơn dòng tại Viện Kỹ thuật Hóa sinh và Tài liệu Nghiệp vụ -Tổng cục Hậu cần Kỹ
thuật-Bộ Công An.
II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
- Chuột chủng dòng Swiss Mus musculus, được mua ở Viện Vệ sinh dịch tễ TW.
- Chủng vi khuẩn B. anthracis (Viện vệ sinh phòng dịch Quân đội)
- Cột sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP. (Hãng GE Healthcare)
- Kháng nguyên: Kháng nguyên là protein BclA tái tổ hợp, được tinh sạch qua cột Talon
(Niken) do nhóm nghiên cứu thuộc Phòng 3 Viện H57 Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật thực hiện.
- Kháng thể: Anti-Mouse IgG (Fab specific)–Alkaline Phosphatase antibody produced in goat,
Anti-Mouse IgG (Fab specific)–Peroxidase antibody produced in goat.
- BCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt), NBT (Nitrotetrazolium Blue
chloride) được mua của hãng Sigma. Các hóa chất còn lại đều được đặt mua của các hãng nổi

tiếng như: Merck, BCE…đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Nghiên cứu sử dụng một số phương pháp như: Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên
chuột, Kỹ thuật ELIS, Phương pháp tinh sạch IgG từ huyết thanh Chuột, Kỹ thuật Western Blot….


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kiểm tra độ tinh sạch của protein BclA tái tổ hợp trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch
Trước khi tiến hành gây đáp ứng miễn dịch, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch của
protein BclA tái tổ hợp nhằm tránh khả năng làm giảm hiệu suất tạo kháng thể đa dòng kháng lại
protein quan tâm theo phương pháp điện di SDS-PEGE 12.5%.
Mẫu BclA tái tổ hợp được pha theo tỷ lệ 1:2 với hỗn hợp dye (950μl đệm SDS-reducing và
50μl β – mercaptothanol). Mẫu được đun nóng 95
0
C trong 5-10 phút và được đổ vào giếng. Cài đặt
máy chạy 100v, thời gian 1h30 phút.











Hình 1: Kết quả điện di protein BclA tái tổ hợp trên gel 12.5%
M: Marker prestain (Fermentas)
1: Mẫu BclA tái tổ hợp chưa tinh sạch qua cột Talon (Niken) HP

2: Mẫu rửa qua cột Talon (Niken) HP
3,4,5,6: Các phân đoạn qua cột
116 kDa
66 kDa
45 kDa
35 kDa
25 kDa
18.5 kDa


1 3 4 5 6 M
Kết quả điện di SDS-PAGE ở hình 1 cho thấy: ở cột thứ nhất tương ứng với dung dịch
protein tổng số có xuất hiện một băng khá đậm có kích thước vào khoảng 35kDa, đây là kích thước
của protein BclA, điều đó cho ta thấy trong dung dịch protein tổng số có chứa protein mong muốn.
Cột thứ hai tương ứng với dịch rửa qua cột Niken chỉ xuất hiện các băng rất mờ đó là các protein
không bám cột được đẩy ra bằng đệm rửa cột, tại vị trí 35kDa hầu như protein đã được giữ lại cột.
Từ cột thứ ba đến cột thứ 6, là các phân đoạn tinh sạch chỉ bao gồm một băng duy nhất có trọng
lượng 35kDa tương ứng với kích thước trọng lượng phân tử protein BclA được đẩy khỏi cột bằng
đệm đẩy Imidazol. Như vậy, protein BclA qua cột Niken có độ tinh sạch và hiệu suất qua cột cao.
Kháng nguyên BclA chỉ xuất hiện một băng duy nhất có trọng lượng khoảng 35 kDa đã đảm bảo
cho quá trình gây đáp ứng miễn dịch tiếp theo.
3.2. Kiểm tra mẫu huyết thanh chuột trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch
Chuột dùng cho thí nghiệm được kiểm tra miễn dịch trước khi gây đáp ứng miễn dịch để
đảm bảo lô chuột gây đáp ứng không bị nhiễm B. anthracis . Chúng tôi tiến hành thu 200µl máu
toàn phần của chuột theo phương pháp lấy máu từ tĩnh mạch đuôi chuột, sau đó để đông trong tự
nhiên rồi tiến hành thu huyết thanh.
Chúng tôi tiến hành cộng hợp huyết thanh của chuột với dung dịch hạt vàng nano có kích
thước 40nm, OD 15 để kiểm tra xem sự có mặt của kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp
cũng như dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis theo phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký
miễn dịch.

Kết quả thử nghiệm như hình 2. Trên các que thử số 1 và số 2, tại các vị trí T
1
và T
2
, tương
ứng với vị trí được trải protein BclA tái tổ hợp và dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than, không thấy xuất
hiện vạch mầu đỏ hồng. Điều đó cho thấy trong huyêt thanh của lô chuột thử nghiệm không chứa
kháng thể kháng protein BclA dạng tái tổ hợp cũng như dạng tự nhiên. Như vậy, lô chuột trước khi
gây đáp ứng miễn dịch đã đảm bảo không bị nhiễm bệnh bởi vi khuẩn B. anthracis, từ đó cho phép
chúng tôi tiến hành những bước nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo kháng thể đa dòng kháng lại
protein tái tổ hợp BclA.










Hình 2: Kết quả kiểm tra mẫu huyết thanh
1: T
1
được trải với mẫu protein BclA
2: T
2
được trải với dịch phá vỏ bào tử
3.3. Gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột.
Nhằm đánh giá khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp với

BclA tự nhiên trên vỏ bào tử B. anthracis, chúng tôi tiến hành gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể
kháng BclA tái tổ hợp với quy trình như sau: kháng nguyên BclA sau khi được tinh sạch bằng cột
Talon (Niken) được hòa với đệm PBS và tá dược Freund’s (toàn phần và không toàn phần) rồi tiêm
dưới da bụng chuột. Việc gây kháng thể ở chuột được thực hiện với hai lần tiêm, trong đó lần tiêm
đầu tiên chúng tôi sử dụng tá dược toàn phần, lần tiêm nhắc lại chúng tôi sử dụng với tá dược không
toàn phần. Khoảng cách giữa các lần tiêm là 2 tuần. Sau lần tiêm thứ hai 2 tuần chúng tôi tiến hành
thu máu chuột, ly tâm loại các tế bào máu, thu huyết thanh và tiến hành kiểm tra nhận mặt đặc hiệu
kháng nguyên của kháng thể có trong huyết thanh bằng kỹ thuật lai miễn dịch hoặc theo phương
pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch.
Thu nhận kháng huyết thanh từ lô chuột gồm 06 con được gây miễn dịch bằng BclA và
kiểm tra hoạt độ của kháng huyết thanh bằng phương pháp ELISA
Goat anti mouse
(C)
T
2


1 2
T
1


Hình 3: Biểu đồ Elisa về quá trình gây đáp ứng miễn dịch
Kết quả ở hình 3 cho thấy, lượng IgG của chuột tăng dần theo các tuần gây đáp ứng miễn
dịch. Đặc biệt, sau khi tiêm nhắc lại với hỗn hợp tá dược không đầy đủ và kháng nguyên BclA vào
tuần thứ 2 thì lượng IgG tăng nhanh và ổn định vào tuần thứ 4 và tuần thứ 5. Điều đó chứng tỏ lô
chuột được gây đáp ứng miễn dịch đã có phản ứng tích cực với kháng nguyên đưa vào và từ biểu đồ
Elisa cũng cho chúng tôi biết thời điểm tiến hành thu máu tổng số của chuột được gây đáp ứng
miễn dịch.
Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành cộng hợp dung dịch huyết thanh của chuột theo các tuần

theo dõi khả năng đáp ứng miễn dịch với dung dịch hạt nano vàng có kích thước hạt là 40nm với
OD 15, nhằm kiểm tra khả năng sinh kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA trong quá trình gây
đáp ứng miễn dịch.
Bằng phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch (Hinh 4) cho thấy kháng thể có
mặt trong kháng huyết thanh chuột sau khi gây đáp ứng miễn dịch và cộng hợp với hạt vàng nano
40nm OD 15 có khả năng nhận biết đặc hiệu với protein BclA tái tổ hợp với nồng độ 0.3mg/ml và
mật độ trải lên màng là 0,1μl/1mm.











Hình 4: Que thử dạng sắc ký miễn dịch kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng BclA
Vị trí C: Trải kháng thể đa dòng Goat anti mouse
Vị trí T: Trải protein BclA tái tổ hợp
1: Huyết thanh thu tuần 1
2: Huyết thanh thu tuần 2
3: Huyết thanh thu tuần 3
4: Huyết thanh thu tuần 4
Kết quả trên cho thấy, trong dịch huyết thanh của chuột thấy có xuất hiện kháng thể kháng
lại protein BclA tái tổ hợp được biểu hiện bằng sự hiện vạch mầu hồng tại vị trí T. Tại vị trí C
chúng tôi trải kháng thể đa dòng của dê kháng lại IgG của chuột (Goat anti mouse), nhằm mục đích
kiểm tra sự hoạt động của dung dịch kháng thể đa dòng kháng protein BclA cộng hợp hạt vàng nano
40nm. Tại que thử nhứ nhất, chúng ta thấy xuất hiện mầu hồng nhạt tại vị trí T cho ta thấy sau khi

tiêm kháng nguyên vào lô chuột gây đáp ứng miễn dịch thì ngay tuần thứ nhất chuột đã có phản ứng
đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên lạ khi tiêm vào dưới da chuột. Tại que thử thứ 2 vào tuần thứ
2 của quá trình gây đáp ứng miễn dịch đã có sự chững lại về lượng kháng thể sinh ra, bằng chứng

1 2 3 4
Goat anti mouse (C)
BclA (T)
của của kết luận trên là cường độ màu chỉ thị trên que ở vị trí T hầu như chênh rất ít so với tuần thứ
nhất. Tại que thử thứ 3, tại thời điểm này chúng tôi tiến hành tiêm nhắc lại với lô chuột thí nghiệm.
Tại que thử này đã thấy rõ sự khác nhau về màu sắc kết quả tại vị trí T với các que thử thứ nhất và
thứ 2, cho ta thấy rằng quá trình tiêm nhắc lại đã cho kết quả tốt về đáp ứng miễn dịch với chuột. Ở
que thử số 4, qua kết quả chỉ thị màu tại vị trí T, chúng tôi thấy rằng lượng kháng thể có tăng lên
nhưng không nhiều. Do đó, chúng tôi tiến hành thu máu lô chuột gây đáp ứng miễn dịch, tiến hành
thu huyết thanh chuột và tinh sạch kháng thể để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Ngoài ra, chúng tôi tiến hành thay màng cộng hợp có chứa kháng thể kháng protein BclA tái
tổ hợp với hạt vàng nano 40nm OD 15 vào que thử multi các loại thuốc gây nghiện là THC,
Morphine để kiểm tra đánh giá khả năng phản ứng chéo và khả năng phong bế (block) các hạt vàng
của dung dịch kháng thể kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano
.









Hình 5: Que thử miễn dịch kiểm tra khả năng phản ứng chéo và block hạt vàng
Kết quả (Hình 5) thu được cho phép kết luận rằng kháng thể đa dòng kháng protein BclA

không phản ứng chéo với các protein khác (ở đây là BSA – Bovine serum albumin). Mặt khác, trên
que thử tại hai vạch T
1
và T
2
không xuất hiện vạch màu hồng cũng đồng nghĩa chứng tỏ trong dung
dịch kháng thể đa dòng kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano hạt vàng đã được block hoàn toàn các
liên kết làm cho hạt vàng không còn khả năng phản ứng với các protein nào khác.

Goat anti mouse (C)
BSA conjugated THC (T
1
)
BSA conjugated Morphine (T
2
)
Từ đó cho phép chúng tôi kết luận rằng, việc gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng
kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột bạch đã thành công
3.4. Tinh sạch kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp
Tuy đã thu được huyết thanh có chứa chủ yếu là kháng thể IgG nhận biết đặc hiệu với
Protein BclA tái tổ hợp, nhưng thực tế trong huyết thanh vẫn còn rất nhiều các protein không mong
muốn khác. Vì vậy, chúng tôi tiến hành sử dụng hệ thống cột sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP
(hãng GE Healthcare) để loại các protein không mong muốn, nhằm thu được kháng thể IgG kháng
Protein BclA tinh sạch.
Cột HiTrap™ Protein G HP (1x5ml) được cân bằng với đệm rửa cột sodium phosphate 20
mM, pH 7.0. Dung dịch huyết thanh sau khi điều chỉnh pH về pH 7.0 được đưa lên cột với tốc độ là
1ml/phút. Rửa cột bằng đệm sodium phosphate 20 mM, pH 7.0 để loại các protein không đặc hiệu
với cột với thể tích đệm rửa bằng 5 lần thể tích cột
Sau đó, tiến hành rửa chiết kháng thể IgG (đặc hiệu với cột protein G-Sepharose) bằng đệm
Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7. Các phân đoạn rửa chiết kháng thể nhanh chóng được trung hòa về pH

7.0 bằng bằng cách bổ sung 200 μl thể tích đệm Tris-HCl 1 M, pH 9.0 trên 1ml phân đoạn, nhằm
tránh cho kháng thể bị biến tính và tiến hành xác định hàm lượng protein bằng phương pháp
Bradford khi đo độ hấp phụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. Kết quả thu được ở Hình 6 cho thấy các
phân đoạn cũng chứa các protein (protein không hấp phụ) nhưng với một lượng nhỏ, trong khi đó
phần dịch rửa chiết cho một đỉnh protein rất rõ rệt.







Hình 6: Đồ thị đẩy cột HiTrap™ Protein G HP bằng Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7
Để khẳng định độ tinh sạch của kháng thể thu được, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra
phân đoạn protein gắn đặc hiệu thu được từ cột protein G-Sepharose bằng kỹ thuật điện di biến tính
SDS-PAGE 12.5%. Kết quả (Hình 7) cho thấy đỉnh protein mà chúng tôi thu được (phân đoạn được
Protein
(A
280
)


rửa chiết bằng đệm Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7) có hai băng protein duy nhất với khối lượng phân
tử lần lượt là 53kDa và 25kDa, tương ứng với khối lượng của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kháng thể
IgG. Kết quả này chứng tỏ kháng thể thu được là tinh sạch.

Hình 7: Kết quả điện di tinh sạch kháng thể đa dòng kháng protein BclA
1: Marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder
2: Phân đoạn tinh sạch kháng thể đa dòng
Chúng tôi tiến hành định lượng kháng thể vừa tinh sạch bằng phương pháp định lượng
protein theo phương pháp Bradford. Kết quả nồng độ kháng thể chúng tôi thu được là 1.3mg/ml.
3.5. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng kỹ
thuật tạo que thử dạng sắc kỹ miễn dịch
53kDa
25kDa

1 2
6.0kDa
115.5kDa
181kDa
82.2kDa
64.2kDa
48.8kDa
37.1kDa
25.9kDa
19.4kDa
14.8kDa
Với mục đích tạo được kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng nhận biết

được protein BclA tự nhiên có trên vỏ bào tử B. anthracis , chúng tôi tiến hành phá vỏ bào tử B.
anthracis bằng cách cho bào tử vi khuẩn B. anthracis vào trong đệm PBS pH 7.4 rồi tiến hành siêu
âm bằng máy siêu âm Ultrasonic liquid processors trong vòng 15 phút. Tiến hành ly tâm dịch phá
vỏ bào tử vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch nổi. Trải các thành phần bao gồm: Goat
anti mouse, BclA tái tổ hợp, dịch phá vỏ bào tử lên màng Nitrocellulose, ủ màng ở 37
o
C trong
khoảng 8-10 tiếng, rồi tiến hành lắp các thành phần lên que thử. Kết quả tiến hành thử nghiệm được
trình bày ở hình 8.










Hình 8: Kết quả thử nghiệm trên que thử miễn dịch với dịch phá vỏ bào tử.
C: Vạch đối chứng (kiểm tra sự hoạt động của que thử)
T1: Kết quả hiện màu với protein tái tổ hợp
T2: Kết quả hiện màu với dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than
Từ kết quả trên cho chúng tôi thấy rằng, bước đầu chúng tôi đã tạo thành công kháng thể đa dòng
bắt được kháng nguyên tự nhiên của vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis bằng cách tạo kháng nguyên
trên vỏ bào tử (BclA) theo con đường tái tổ hợp. Để khẳng định một lần nữa kết quả trên chúng tôi
Goat anti mouse (C)
BclA tái tổ hợp (T1)
Dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn (T2)

tiến hành kiểm tra khả năng phát hiện của kháng thể đa dòng với kháng nguyên trên vỏ bào tử vi
khuẩn B. anthracis theo phương pháp Western blot.
3.6. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng
phƣơng pháp Western blot.
Sau khi có kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của kháng thể đa dòng với dung dịch phá vỏ
bào tử vi khuẩn than tự nhiên trên que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch, chúng tôi tiến hành thí
nghiệm đánh giá khả năng phản ứng kháng nguyên- kháng thể giữa kháng thể đa dòng kháng
protein BclA tái tổ hợp với dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than (BclA tự nhiên) bằng phương pháp
western blot. Đây là một bước quan trọng để có thể khẳng định được quá trình gây tạo kháng thể đa
dòng từ kháng nguyên tái tổ hợp có khả năng bắt cặp được với kháng nguyên tự nhiên từ vỏ bào tử
vi khuẩn B. anthracis.

Hình 9: Kết quả lai chuyển thấm kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể
1: Huyết thanh trước khi gây đáp ứng miễn dịch
2: Dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis có trọng lượng khoảng 70kDa

1 2 3 4
6.0kDa
115.5kDa
181kDa
82.2kDa
64.2kDa
48.8kDa
37.1kDa
25.9kDa
19.4kDa
14.8kDa
3: Protein BclA tái tổ hợp
4: Marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder
Kết quả lai chuyển thấm miễn dịch ở hình 9 cho thấy: ở giếng 1 tương ứng với huyết thanh

của chuột trước khi gây đáp ứng miễn dịch, không thấy xuất hiện băng điện chuyển nào. Điều này
chứng tỏ kháng thể có trong huyết thanh chuột trước khi được gây đáp ứng miễn dịch không có khả
năng nhận ra hay phản ứng chéo với protein BclA tái tổ hợp. Từ đó cho phép chúng tôi nhận định
rằng trong lô chuột thử nghiệm không bị nhiễm vi khuẩn than trước khi gây đáp ứng miễn dịch.
Mặt khác, kháng thể có mặt trong kháng huyết thanh chuột sau khi gây đáp ứng miễn dịch ở độ pha
loãng 1000 lần có khả năng nhận biết đặc hiệu với băng chứa BclA tái tổ hợp có kích thước vào
khoảng 35kDa (giếng 3). Ngoài ra, kết quả còn cho thấy kháng thể đa dòng có khả năng nhận biết
một băng tương tự của dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than có kích thước vào khoảng 70kDa (giếng 2)
tương ứng với kháng nguyên BclA tự nhiên . Kết quả thu được cho phép chúng tôi sơ bộ kết luận
rằng:
+ Thứ nhất: Việc gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ
hợp trên chuột bạch đã thành công.
+ Thứ hai: Kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng bắt cặp với
kháng nguyên trên vỏ bào tử vi khuẩn than.
3.7. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của các
chủng vi khuẩn B. anthracis , B.cereus, B.thuringiensis B. subtilis trên que thử dạng sắc ký
miễn dịch.
Như chúng ta đã biết, thành phần protein BclA có trong vỏ bào tử của cả ba chủng vi khuẩn
là B. anthracis , B.cereus, B. thuringiensis (hình 5) và chủng vi khuẩn không có protein BclA là B.
subtilis. Do đó sau khi đã tinh sạch kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái
lực Hitrap protein G- Sepharose HP, chúng tôi tiến hành kiểm tra sơ bộ khả năng bắt cặp kháng
nguyên kháng thể của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của cả ba chủng vi khuẩn B.
anthracis , B.cereus, B. thuringiensis.
Chúng tôi tiến hành phá vỏ bào từ vi khuẩn B. anthracis , B.cereus, B. thuringiensis, B.
subtilis bằng cách cho bào tử vi khuẩn của bốn loại vào trong đệm PBS pH 7.4 rồi tiến hành siêu
âm bằng máy siêu âm Ultrasonic liquid processors trong vòng 15 phút. Tiến hành ly tâm dịch phá
vỏ bào tử vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch nổi. Tiếp theo, trải các thành phần bao
gồm: goat anti mouse, BclA tái tổ hợp, dịch phá vỏ bào tử của 3 chủng vi khuẩn lên màng
Nitrocellulose, ủ màng ở 37
o

C trong khoảng 8-10 tiếng, rồi tiến hành nắp các thành phần lên que
thử.
Tiến hành thử nghiệm trên que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch cho kết quả (Hình 10) như
mong đợi.












Hình 10: Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của các
chủng vi khuẩn B. anthracis , B.cereus, B.thuringiensis, B. Subtilis.
1: Dịch phá vỏ bào tử B. subtilis
2: Dịch phá vỏ bào tử B. cereus
3: Dịch phá vỏ bào tử B. thuringiensis
4: Dịch phá vỏ bào tử B. anthracis

1 2 3 4
Goat anti mouse (C)
BclA tái tổ hợp (T1)
Dịch phá vỏ bào tử (T2)
Trên que thử với dịch phá vỏ bào tử của vi khuẩn B. subtilis, cho kết quả âm tính điều đó
chứng tỏ rằng kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp không phản ứng chéo với các
protein trên vỏ bào tử của B. subtilis. Điều đó phù hợp với những khảo sát rằng, vỏ bào tử vi khuẩn

B. subtilis không có chứa thành phần protein BclA trên vỏ bảo tử. Mặt khác, thử nghiệm trên que
thử nhanh với các chủng vi khuẩn B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, chúng tôi đều thu được
kết quả phản ứng tốt giữa kháng thể đa dòng với các dịch phá vỏ bào tử của các chủng vi khuẩn
này. Trên que thử kết quả phản ứng cho một màu đỏ nâu, điều đó một lần nữa có thể khẳng định
chúng tôi đã chế tạo thành công kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng
phản ứng lại được với protein BclA tự nhiên. Trên cơ sở đó, từ việc sản xuất thành công kháng thể
đa dòng kháng lại protein BclA trên vỏ của bào tử vi khuẩn than, chúng ta có thể tiến hành những
nghiên cứu tiếp theo để sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng lại BclA trên vỏ bào tử của vi
khuẩn Bacillus anthracis
KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
KẾT LUẬN:
Từ những kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra một số kết luận
như sau:
1. Bằng phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch, đã sản xuất thành công kháng
thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp.
2. Đã tinh sạch được kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp bằng hệ thống cột
sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP.
3. Kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có phản ứng với protein BclA tự
nhiên có mặt trong dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than.
HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
Chúng tôi đã thành công trong việc tạo ra kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ
hợp và kháng thể này có phản ứng tích cực với protein BclA tự nhiên. Do đó, trong hướng nghiên
cứu tiếp theo chúng tôi sẽ tiến hành sử dụng protein BclA tái tổ hợp làm kháng nguyên để tạo
kháng thể đơn dòng kháng lại BclA của vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis.


References
A. Tiếng Việt
1. Đỗ Ngọc Liên (2004), Thực hành Hóa sinh miễn dịch, Nhà xuất bản Đại học Quốc
gia Hà Nội.

2. Nguyễn Văn Mùi (2001), Hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
B. Tiếng Anh
3. Abrami, L. N. Reig, and F. G. van der Goot (2005), “Anthrax toxin: the long and
winding road that leads to the kill”. Trends Microbiol, 13:72-78
4. Antibody purification, Handbooks from Amersham Biosciences
5. Aronson, A. I., and P. Fitz-James (1976), “Structure and morphogenesis of the
bacterial spore coat”, Bacteriol. Rev, 40:360-402.
6. Burns R. (2004), Immunochemical protocols, Methods in molecular biology, vol.
295, 3rd ed, Humana Press.
7. Charlton, S., A. J. Moir, L. Baillie, and A. Moir (1999), “Characterization of the
exosporium of Bacillus cereus”, J. Appl. Microbiol, 87:241-245.
8. Christopher Steichen, Ping Chen, John F. Kearney, and Charles L. Turnbough, Jr.
(2002), Identification of the Immunodominant Protein and Other Proteins of the Bacillus
anthracis Exosporium, Department of Microbiology, University of Alabama at
Birmingham, Birmingham, Alabama 3529.
9. Cote, C. K., C. A. Rossi, A. S. Kang, P. R. Morrow, J. S. Lee, and S. L. Welkos
(2005), “The detection of protective antigen (PA) associated with spores of Bacillus
anthracis and the effects of anti-PA antibodies on spore germination and macrophage
interactions”, Microb. Pathog, 38:209-225.
10. Edwards, K. A., H. A. Clancy, and A. J. Baeumner (2006), “Bacillus anthracis:
toxicology, epidemiology and current rapid-detection methods”, Anal. Bioanal. Chem. ,
384:73-84.
11. Holtzhauer M. (2006), Basic Methods for the Biochemical Lab, Springer.
12. Petosa C., Collier R. J., Klimpel K. R., Leppla S. H., Liddington R. C. (1997),
"Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen.", Nature, 385 (6619): 833–838.
13. Rapid Lateral Flow Test Strips, Handbooks from www.millipore.com/diagnostics.
14. Redmond C., L. W. Baillie, S. Hibbs, A. J. Moir, and A. Moir (2004),
“Identification of proteins in the exosporium of Bacillus anthracis”, Microbiol., 150:355-
363.
15. Ronald E. (2003), Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley &

Sons, Inc.
16. Sylvestre P., E. Couture-Tosi, and M. Mock (2002), “A collagen-like surface
glycoprotein is a structural component of the Bacillus anthracis exosporium”, Mol.
Microbiol, 45:169-178.
17. Sylvie Salamitou, Ignacio Garcia-Verdugo, David J. S. Hulmes, Richard Chaby
and Anita Lewit-Bentley (2004), The Crystal Structure of the Bacillus anthracis Spore
Surface Protein BclA Shows Remarkable Similarity to Mammalian Proteins, The
American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.
18. Tijssen (1985), Practice and theory of enzyme immunoassays, Laboratory
techniques in biochemistry and molecular biology 4th, 15: 242 - 246.
19. Todd S. J., A. J. Moir, M. J. Johnson, and A. Moir (2003), “Genes of Bacillus
cereus and Bacillus anthracis encoding proteins of the exosporium”, J. Bacteriol.,
185:3373-3378.
20. Turnbough, C. L., Jr. (2003), “Discovery of phage display peptide ligands for
species-specific detection of Bacillus spores”, J. Microbiol. Methods, 53:263-271.
21. Van Weemen BK, Schuurs AH (1971), "Immunoassay using antigen-enzyme
conjugates.". FEBS Letters, 15 (3): 232–6
22. Welkos S., S. Little, A. Friedlander, D. Fritz, and P. Fellows.(2001), “The role of
antibodies to Bacillus anthracis and anthrax toxin components in inhibiting the early
stages of infection by anthrax spores”, Microbiology, 147:1677-1685.