Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và khả năng chống rối loạn trao đổi lipid của dịch chiết từ hạt loài đậu đen (vigna cylindrica (l )) trên mô hình chuột đái tháo đường thực nghiệm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN

PHẠM THỊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT VÀ
KHẢ NĂNG CHỐNG RỐI LOẠN TRAO ĐỔI LIPID
CỦA DỊCH CHIẾT TỪ HẠT LOÀI ĐẬU ĐEN • • •
('Vigna cylindricaịL.) TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT ĐÁI
THÁO ĐƯỜNG THỤC NGHIỆM
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC • • •
•

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Ngưòi hưóng dẫn khoa học TS.
TRẦ N THỊ P HƯƠ NG L IÊN


HÀ NỘI - 2015
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Trần Thị
Phương Liên khoa Sinh - KTNN trường Đại học sư phạm Hà Nội
2

đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cùng với các phương
pháp nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Sinh - KTNN - trường ĐHSP Hà

Nội 2, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, phòng Hóa sinh - bệnh viện Hữu nghị Việt
Xô, trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu khoa học và Chuyến giao công nghệ cùng với phòng
Thí nghiệm Hóa sinh - trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
giúp tôi trong suốt thời gian nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp
đỡ, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 13 thảng 05 năm 2015 Sinh viên thực hiện

Tôi xin cam đoan:

Phạm Thị Phương

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu và kết quả
nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và chưa có ai công bố sử dụng để bảo
vệ một học vị nào từ trước đến nay.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những nội dung được đề cập trong bản
khóa luận này.


Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2015 Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Phương



DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẤT
BP

:Béo phì

CHCL3

:Choloroform

ĐC
ĐTĐ

:Đối chứng
:Đái tháo đường

ĐTĐKĐT :Đái tháo đường không điều trị.
EtOAc

:Ethylacetat

EtOH

: Ethanol

HDL-C

:Lipoprotein tỷ trọng cao (High-density

lipoprotein cholesterol)

LDL-C

iLipoprotein tỷ trọng thấp (Low-density

lipoprotein cholesterol)

NO

iNitric oxide

PĐ

:Phân đoạn

STZ

:Streptozotocin

TC

: Cholesterol

TĐ

:Tiểu đường

TG

iTriglycerid

VLDL

iLipoprotein tỷ trọng cực thấp (very low - density lipoprotein)

WHO

:TỔ chức y tế Thế giới


MỞ ĐÀU
1. Lí do chọn đề tài
Bệnh ĐTĐ trong thời đại hiện nay là một trong những căn bệnh phố biến nhất,
đặc biệt ở các nước đang phát triến trong đó có Việt Nam.
Ở một số nước, số người mắc căn bệnh này chiếm tỉ lệ tới 10% dân số và số
người mắc bệnh ngày một tăng cao.
ĐTĐ là một trong những bệnh nội tiết và rối loạn chuyến hóa, có mức tăng
nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lượng cũng như chi phí điều trị, trở
thành gánh nặng về kinh tế và xã hội đối với nhiều quốc gia trên thế giới.
Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ người mắc bệnh làm cho ĐTĐ trở thành một vấn
đề lớn cho sức khỏe vì bệnh có tỷ lệ mắc, chết trầm trọng trong quá trình trị liệu lâu
dài, đặc biệt là ĐTĐ type2 một trong những bệnh phổ biến nhất trong bệnh ĐTĐ.
ĐTĐ loại 2 (type 2) là một chứng bệnh mãn tính phát triển khi tuyến tụy không
sản xuất đủ insulin hoặc khi các mô trong cơ thể không thể sử dụng insuliun một cách
bình thường [3].
Bệnh ĐTĐ là hậu quả của tình trạng béo phì và thừa cân quá mức.
ĐTĐ còn gây ra nhiều biến chứng như: mù mắt, nhồi máu cơ tim, tai biến
mạch máu não, suy thận, cưa chân...
Y học hiện đại ngày nay có nhiều loại thuốc chống ĐTĐ và rối loạn trao đổi
lipid khá hiệu quả như: Insulin, Metformin, Fluoxiten... Tuy nhiên chúng
thường có tác dụng phụ không mong muốn và chi phí điều trị đắt đỏ [10].
vấn đề đặt ra là cần nghiên cứu phát triển các loại thuốc nguồn gốc thảo dược
với nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền và ít có tác dụng phụ. Với nhiều người đậu đen không
chỉ là thực phẩm mà còn có nhiều công dụng phòng, chữa bệnh rất hiệu quả [ 6].
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và
khả năng chống rối loạn trao đối lipid của dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna

6


cylỉndrical(L.) trên mô hình chuột đái tháo đường thực nghiệm
2. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ hạt loài đậu đen đến hàm lượng glucose
huyết và một số chỉ số lipid máu ở chuột ĐTĐ type 2 nhằm tạo cơ sở cho việc tìm
kiếm và sản xuất thực phẩm chức năng từ thảo dược có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh
BP và ĐTĐ.
3. NỘÌ

dung nghiên cửu

3.1.

Tạo mô hình chuột béo phì và đái tháo đường

3.2.

Xác định liều độc cấp LD50 của dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna

cyỉỉndricaỉ(h.)
Đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến trọng
lượng, nồng độ glucose, lipid
NỘIDUNG Chương 1. TỐNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Hạt loài Đậu đen (Vigna cylindrical^L.)

1.1.1.

Nguồn gốc, đặc điểm hình thái, phân bố

Đậu đen (Vỉgna cỵlindrical(L.) có nguồn gốc ở Châu Phi, từ đó lan sang Trung
Á, Ân Độ và nhiều khu vực khác của Châu Á.
Đậu đen là cây thân thảo, sống hàng năm. Thân cao 50-100 cm, phân nhiều
cành, toàn thân không lông. Lá kép gồm 3 lá chét mọc so le, lá chét giữa to và dài hơn
lá chét hai bên. Hoa màu tím nhạt, quả giáp dài, đường kính tròn, trong chứa 7-10 hạt
màu đen. Hạt có vỏ màu đen, nhân hạt trắng hoặc xanh.
Hiện nay cây Đậu đen được trồng ở khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở
Châu Á, Châu Phi, Nam Mỹ và kể cả Hoa Kỳ.
1.1.2.

Thành phần hóa học

Thành phần chủ yếu của hạt Đậu đen: glucid 53%, protein 24%, lipid 1,7%,
các vitamin A, Bl, B2, pp, c, ngoài ra còn giàu acid amin và các nguyên tố vô cơ: Ca,
p, Fe...

7


1.1.3.

Công dụng và tác dụng

dược lý Có tác dụng khử độc
Sulfates
Giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Người ta nhận thấy những người ăn nhiều
đậu đen, rau xanh, ngũ cốc là nhóm người giảm được tới 82% nguy cơ mắc bệnh tim

mạch, so với nhóm người ăn ít nhóm thực phẩm nói trên, đặc biệt là thực phẩm họ
đậu, lý do là đậu đen có chứa nhiều chất xơ. Lợi thế của đậu đen là cung cấp chất xơ,
folate và magie giúp làm giảm hormocystein.

8


Tăng cường năng lượng cho cơ thể và ổn định lượng đường huyết. Ngoài lợi
ích cho hệ tiêu hóa, tim mạch, chất xơ hòa tan có trong đậu đen có tác dụng on định
lượng đường trong máu. Trường hợp cơ thể kháng insulinmắc bệnh ĐTĐ thì nên tăng
cường ăn đậu đen, nó sẽ giúp cơ thể tiêu thụ năng lượng một cách chậm hơn và cuối
cùng on định lượng đường huyết.
Theo y học cổ truyền có rất nhiều sách viết về tác dụng chữa bệnh của đậu
đen. Sách Bản thảo Đường tân tụ nói rằng đậu đen chữa được thủy thũng. Sách Bản
thảo Thập di nói rằng đậu đen còn chứa được chứng phong tê thấp, nếu ăn lâu ngày
thì đẹp nhan sắc. Bản thảo Cương mục cho rằng, nước đậu đen có thế bố thận, giải
được độc.
1.2.

Bệnh béo phì

1.2.1.

Định nghĩa

Theo WHO, BP là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại
một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khỏe
[9].
Người bị BP ngoài thân hình nặng nề, khó coi...còn có nguy cơ mắc nhiều
bệnh như rối loạn lipit máu, sỏi mật, ĐTĐ, ung thư, tăng huyết áp, xương khớp...

1.2.2.

Phương pháp đánh giá

Có nhiều phương pháp đánh giá bệnh béo phì như: Đo chỉ số trọng lượng cơ
thể BMI, đo vòng eo, tỉ lệ eo/hông (WHR)... Trong đó phương pháp sử dụng chiều
cao và cân nặng được sử dụng rộng rãi nhất là chỉ số BMI.
Công thức tính:

w

Trong đó:

-

-

W: Cân nặng cơ thể (kg)

H: Chiều cao (m)

1.2.3.

Phân loại

9


Dựa vào nguyên nhân gây bệnh, BP được chia thành hai dạng chính:

1
0


-

Béo phì đơn thuần: Là do năng lượng được hấp thu vào cơ thể nhiều vượt
quá mức cần thiết dẫn đến tình trạng tích lũy mỡ.

-

Béo phì bệnh lí: Là do bệnh lí như một số bệnh nội tiết như hội chứng
Cushing khiến lượng hormon cortisosteroid trong cơ thể quá cao, buồng
trứng đa năng, suy tuyến giáp trạng...[8]
^

Bảng 1.1. Phân loại BMI của người trưởng thành Châu Au và Châu A
Mức độ thể trọng

Người trưởng thành Châu Âu

Người trưởng thành Châu

Nhẹ cân

< 18,5

Á
< 18,5

Bình thường

18,5-24,9

18,5-22,9

Quá cân

> 25 - 29,9

>23

Béo phì độ 1

30 - 34,9

>23 - 24,9

Béo phì độ 2

35 - 39,9

25 - 29,9

Béo phì độ 3

>40

>30

1.2.4.

r

Nguyên nhân gây béo phì

-

Ăn nhiều: vượt quá nhu cầu cơ thể thường là nguyên nhân BP (95%).

-

Hoạt động thể lực kém: ít vận động.

-

Nguyên nhân do thuốc: gần đây, thuốc được thêm vào danh mục nguyên
nhân của các yếu tố BP, bởi vì gia tăng dược liệu pháp.

-

Nguyên nhân di truyền: 69% người béo phì có bố hoặc mẹ béo phì; 18% cả
bố lẫn mẹ đều béo phì, chỉ có 7% là có tiền sử gia đình không ai BP.

-

Nguyên nhân nội tiết: Hội chứng Cushing, cường insulin do u tụy tiết
insulin, tăng ăn ngon, ăn nhiều và tân sinh mô mỡ, giảm hoạt tuyến giáp,
tăng tiêu glucid.

1.2.5.

Biển chứng của

1
1


béo phì Biến chúng về
chuyển hóa:
-

Chuyển hóa acid uric: acid uric máu thường tăng, có lẽ có liên quan đến tăng
triglyceride máu. cần chú ý đến sự tăng acid uric đột ngột khi điều trị nhằm
giảm cân, có thể gây cơn Gout cấp tính (do thoái giáng protein).

-

Chuyến hóa lipid: triglyceride huyết tương thường tăng trong BP. Sự tăng
lipoprotein có liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid nói trên làm cho gan
sản xuất nhiều VLDL hơn. Cholesterol máu ít khi ảnh hưởng trực tiếp bởi BP
nhưng nếu có tăng cholesterol trước đó thì dễ làm tăng LDL. HDL thường
giảm khi có triglyceride tăng.

-

Chuyển hóa glucid: có tình trạng kháng insulin, tăng tiết insulin, phát hiện qua
nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đường uống bị rối loạn, dễ dẫn đến bệnh
ĐTĐ, vì vậy BP là một yếu tố nguy cơ của ĐTĐ.
Biến chứng về nội tiết: tăng insulin máu, tăng đề kháng insulin và ĐTĐ type2,

giảm số lượng và chất lượng insulin, kích thích tế bào beta do ăn nhiều glucid. Chức
năng nội tiết sinh dục: giảm khả năng sinh sản.
Biến chứng ở phổi: giảm chức năng hô hấp. Hội chứng Pickwick: ngưng thở
khi ngủ, tăng hồng cầu.
Biến chứng về xương khớp: tại các khớp chịu lực cao (khớp gối, khớp hang,
cột sống) dễ bị đau, thoái khớp, thoát vị đĩa đệm, trượt đốt sống.
Biến chứng tim mạch: BP là một trong những yếu tố nguy cơ cho bệnh lý tim
mạch như: tăng huyết áp , huyết áp giảm khi giảm cân. Suy mạch vành, suy tim, tai
biến mạch máu não.
1.3.

Bệnh đái tháo đường

1.3.1.

Khái niệm

-

Theo WHO, ĐTĐ là một hội chứng rối loạn chuyến hóa cacbohydrat có đặc
tính biểu hiện bằng tăng glucose máu do có liên quan đến sự suy yếu trong bài

1
2


tiết và hoạt động của insulin hoặc do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn
toàn insulin.
WHO đã nhận định rằng: “Thế kỷ XXI là thế kỷ của các bệnh nội tiết và rối

loạn chuyến hóa mà điến hình là bệnh ĐTĐ. Những gì mà đại dịch HIV/AIDS đã
hoành hành 20 năm cuối thế kỷ XX, thì đó sẽ là ĐTĐ trong 20 năm đầu thế kỷ XXI”
[1].
1.3.2.

Phân loại

Dựa vào những tiến bộ khoa học trong những năm gần đây ĐTĐ được phân
loại dựa vào hiểu biết về nguyên nhân sinh bệnh.
-

ĐTĐ type 1 (còn gọi là tiếu đường phụ thuộc insulin): Chiếm 5 - 10%, thường
gặp ở người dưới 40 tuổi. Ở loại này, sự bài tiết insulin bị tiêu hủy do sự phân
hủy tự miễn tế bào p của đảo tụy Langerhans nơi tiết insulin. Các giai đoạn
trong ĐTĐ type 1:

•

Giai đoạn 1: Bản chất di truyền, nhạy cảm gene.

•

Giai đoạn 2: Khởi phát quá trình tự miễn.

•

Giai đoạn 3: Phát triến một loạt các kháng thế.

•

Giai đoạn 4: Tổn thương chức năng tế bào p đảo tụy.

•

Giai đoạn 5: ĐTĐ lâm sàng, phá hủy hoàn toàn hoặc gần như hoàn toàn tế bào
p đảo tụy. Biểu hiện lâm sàng là ĐTĐ phụ thuộc insulin có kèm biến chứng
[7].

-

ĐTĐ type 2 (còn gọi là tiểu đường không phụ thuộc insulin): Chiếm 90 -

95% tổng số bệnh nhân tiểu đường, thường xảy ra với những người lớn tuổi, hoặc
những người thừa cân, béo phì. Ở loại này, insulin được bài tiết bình thường, lưu
thông trong máu nhưng không có tác dụng do có quan hệ chặt chẽ vớitính
insulin ở cơ quan đích. ĐTĐ type 2 diễn biến
•

qua 3

kháng
giai đoạn:

Giai đoạn 1: Mặc dù nồng độ glucose trong máu vẫn bìnhthường, nhưng

1
3


có hiện tượng kháng insulin vì insulin tăng cao hơn mức bình thường trong máu.

•

Giai đoạn 2: Tình trạng kháng insulin có xu hướng nặng dần do có hiện tượng
tăng glucose huyết sau ăn.

•

Giai đoạn 3: Kháng insulin không đổi nhưng bài tiết insulin suy giảm gây tăng
glucose huyết lúc đói, bệnh ĐTĐ biểu hiện ra bên ngoài.

Cùng với hai dạng phổ biến trên còn có các dạng ít gặp hơn:
-

ĐTĐ thai kì: Chiếm khoảng 3 - 8% tổng số phụ nữ mang thai mắc ĐTĐ thai
kì. Là tình trạng rối loạn dung nạp glucose huyết lần đầu tiên phát hiện trong
thai kỳ. Bao gồm cả các trường họp đái tháo đường đã có từ trước nhưng chưa
được phát hiện. Phụ nữ bị ĐTĐ thai kỳ có nhiều khả năng phát triển thành
bệnh ĐTĐ type 2 sau này [1].

-

ĐTĐ thứ phát ở một số bệnh (bệnh về tụy hoặc phụ thuộc những hormon khác
với insulin), nhưng ĐTĐ gây ra do điều trị ĐTĐ liên quan đến dinh dưỡng.

Cũng có trường hợp dung nạp không hoàn toàn glucose, tình trạng trên có thể coi là
tình trạng tiền ĐTĐ.
1.3.3.

Biến chứng và tác hại của bệnh đái tháo đường

Neu không được điều trị tốt, bệnh tiểu đường gây ra nhiều biến chứng có thể
làm bệnh nhân tàn phế, thậm chí tử vong.
-

Biến chứng cấp tính: Do đường huyết tăng cao, có thể gây hôn mê nhiễm
cetone hay hôn mê do tăng áp lực thấm thấu. Neu không được điều trị kịp thời
có thể dẩn đến tử vong. Hạ đường huyết là biến chứng cấp tính, thường do quá
liều thuốc, insulin gây nên. Có thế do bệnh nhân nhịn đói, kiêng khem quá
mức hay do uống nhiều rượu. Neu không được điều trị kịp thời có thể hôn mê
và thậm chí tử vong.

-

Biến chứng mãn tính:

•

Tổn thương bàn chân: Tùy từng mức độ như loét, hoại thư, cắt cụt, phỏng rộp,

1
4


biến dạng...[l], [4].
•

Biến chứng mạch máu lớn: mạch vành (38%), đột quỵ (1,2%), tăng huyết áp
(27,6%)...

•

Biến chứng mắt: Bệnh lý võng mạc (27,8%), đục thủy tinh thể (6,1%),

tăng sinh gây mù lòa (1,1%)_____
•

Biến chứng thần kinh: Biến chứng thần kinh ngoại biên do ĐTĐ gây mất cảm
giác ở chân, gây đau nhức, tay hay dị cảm, tê .. .là nguy cơ của nhiễm trùng
chân đưa đến đoạn chi.

•

Biến chứng thận: microalbumin niệu (11,6%), macroalbumin (3%), suy thận
từ độ 1 đến độ 4 (3,5%)...

1.3.4.
Tiêu chí chẩn đoán đái tháo đường
Tiêu chí của WHO về chẩn đoán ĐTĐ
Bảng 1.2. Tiêu chỉ chẩn đoán ĐTĐ theo Tổ chức Y tế Thế giới
Kết luận

Đường huyết lúc Đường huyết 2 giờ sau Đường huyết tại
đói

khi làm nghiệm pháp thời điếm bất kì
tăng đường huyết

ĐTĐ

>7mmol/l

Rối loạn dung
nạp đường

>5,6mmol/l
và<7mmol/l

>1 l,lmmol/l

>1 l,lmmol/l

>7,8mmol/l vàcl

kèm theo triệu

l,lmmol/l

chứng uống
nhiều, đái
nhiều và gây

Bình thường

1.3.5.
*

<5,6mmol/l

<7,8mmol/l

Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam

Trên thế giói

1
5

sốt


Theo WHO: năm 1995 thế giới có 135 triệu người mắc bệnh ĐTĐ chiếm 4%
dân số thế giới, năm 2010 có 221 triệu người và dự báo đến năm 2025 là 350 triệu
người, chiếm 6%. Các nước đang phát triển sẽ phải hứng chịu hậu quả nghiêm trọng
của căn bệnh này bởi tốc độ phát triển của nó có thể lên tới 170%.
ĐTĐ là bệnh không lây nhiễm nhưng được coi là đại dịch bởi tốc độ phát triến
nhanh chóng nhất trên thế giới, chủ yếu là các nước đang phát triến (trong đó có Việt
Nam). Nó đang là gánh nặng cho sự phát triển kinh tế, xã hội và sức khỏe của con
người toàn thế giới trong thế kỷ 21.
*

Ỡ Việt Nam
Phần lớn người bệnh phát hiện và điều trị muộn. Vì vậy, mỗi năm có trên 70%

bệnh nhân không được phát hiện và điều trị kịp thời. Khu vực nông thôn trước đây
thường rất ít thì nay bệnh đã trở nên phổ biến do quá trình đô thị hóa.
Ở nước ta, đối tượng mắc bệnh ĐTĐ thường ở độ tuổi từ 30-65, tuy nhiên hiện
nay có những bệnh nhân ĐTĐ mới chỉ 9-10 tuổi, điều này phản ánh sự trẻ hóa của
bệnh. Bên cạnh đó, biến chứng tim mạch do bệnh ĐTĐ luôn là biến chứng phổ biến
và là nguyên nhân gây đột quỵ và tử vong hàng đầu ở người bệnh ĐTĐ.
1.3.6.

Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường

Có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến mối quan hệ giữa BP và ĐTĐ type 2 bao gồm:
chế độ dinh dưỡng, sự vận động thân thế, chỉ số khối cơ thế, thời gian béo phì. Một
thống kê đã chỉ ra rằng những người có chỉ số khối cơ thế >30kg/m 2 trong 10 năm có
nguy cơ mắc ĐTĐ type 2 cao gấp hai lần người BP dưới 5 năm, và nếu trọng lượng
cơ thế tăng lkg thì rủi ro về bệnh ĐTĐ type 2 tăng 4,5%. Đây chính là cơ sở để Reed
và cộng sự đưa ra phương pháp gây mô hình ĐTĐ thực nghiệm ở động vật bằng cách
tiêm STZ liều đơn cho chuột đã được vỗ béo nhiều ngày [12], [13].
Béo phì và ĐTĐ là hai căn bệnh không truyền nhiễm nguy hiếm nhất của thế
kỉ 21, chúng có mối quan hệ chặt chẽ với nhau. Một cuộc khảo sát ở Mĩ gần đây chỉ
ra rằng có tới 58% số người bị ĐTĐ type 2 được quy cho là do BP. Béo phì có liên

1
6


quan đến ĐTĐ type 2 thông qua sự đề kháng insulin. Nồng độ acid béo tự do cứ tăng
lên 100ỊJM thì mức đề kháng insulin tăng lên khooảng 5-10% [3].
1.4.

Rối loạn trao đỗỉ lipid

1.4.1.

Khái niệm

Rối loạn lipid máu là tình trạng tăng cholesterol, triglycerides (TGs) huyết
tương hoặc cả hai, hoặc giảm nồng độ lipoprotein phân tử lượng cao, tăng nồng độ

lipoprotein phân tử lượng thấp làm gia tăng quá trình xơ vữa động mạch.
1.4.2.

Phân loại

Đe đánh giá lượng mỡ trong máu người ta làm xét nghiệm với các chỉ
số:

-

Cholesterol toàn phần (2,9 - 5,2mmol/l)

-

Triglycerid (0,8 - 2,3mmol/l)

-

HDL-C (0,90 - 1,50mmol/l)

-

LDL-C (0,5 - 3,4mmol/l)

1.4.3.

Nguyên nhân và triệu chứng rối loạn lipid

Nguyên nhân gây rối loạn lipid máu có thể là thứ phát (do thói quen ăn uống,
sinh hoạt hoặc một số bệnh lý) hoặc nguyên phát (do các bệnh về gen). Rối loạn lipid

máu thường không có triệu chứng đặc trưng. Hầu hết là những triệu chứng “mượn”
của các cơ quan khác. Bệnh nhân có thể biểu hiện bằng các triệu chứng của bệnh tim
mạch như bệnh mạch vành, bệnh mạch máu ngoại biên.

1
7


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1.

Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.

Mau thực vật

- Đậu đen (Vigna cỵlindricaỉ(h.)

Hình 2.1. Hình thái hạt Đậu đen (Vigna cylindricalL.)
Bộ phận sử dụng hạt Đậu đen ( Vigna cylindricalL.)
2.1.2.

Mẩu động vật

Chuột nhắt trắng Mus musculus chủng Swiss 6 tuần tuổi (17 - 20g) và thức
ăn chuẩn cho chuột do viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.

Hình 2.2. Mẩu chuột nuôi vói hai chế độ ăn khác nhau (thí nghiệm)

1
8


2.2.

Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
2.2.1.

Hóa chất

-

Silicagel 60 (0.04- 0.063 mm) Merck.

-

STZ (streptozotocin) Sigma, ST. Louse.
2.2.2.

Các dụng cụ thí nghiệm

-

Cân kĩ thuật GM612, Đức.

-

Máy xét nghiệm tự động các chỉ số sinh hóa OLYMPUS AU 640, Nhật.

-

Máy quang phổ uv - VIS 1000.

-

Micropipet và các dụng cụ đo đếm khác.

-Tủ sấy Memert, Đức.
-

Máy đo đường huyết tự động OneTouch Ultra và que thử của công ty Johnson
- Johnson - tập đoàn Lifescan của Mỹ.

-

Máy li tâm eppendorf, li tâm lạnh.
2.3.

Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.

Tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ hạt loài đậu đen

Từ 3000g hạt Đậu đen (Vigna cỵỉindrical(L.) sấy khô được ngâm với ethnol 96% ở
nhiệt độ phòng 22°c trong vòng 14 ngày (quá trình được lặp lại
3

lần). Gộp dịch chiết lại, lọc qua giấy lọc 3 lần và cất loại dung môi dưới bóng
điện 220V- 220w chúng tôi thu được cao tổng số ethnol được hòa tan trong

nước nóng và chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, chloroform,
ethylacetate các dung môi dưới bóng điện 220V - 220W thu được các cao
phân đoạn dịch chiết tương ứng.
2.3.2.

Phương pháp nuôi chuột béo phì Chuột nhắt trắng chủng Mus

musculus (17 - 20g) được nuôi giống nhau về không gian và thời gian
nhưng với 2 chế độ ăn khác nhau, lô thí nghiệm cho ăn thức ăn giàu
lipid, còn lô đối chứng cho ăn thức ăn chuẩn của Viện vệ sinh Dịch tễ
Trung Ương.

1
9


Sau thời gian 4-6 tuần, tiến hành cân trọng lượng của các lô chuột nuôi thí
nghiệm, từ đó so sánh mức độ tăng trọng của các lô chuột được nuôi theo 2 chế độ ăn
khác nhau kể trên.
2.3.3.

Phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng theo type 2

Chuột cho nhịn ăn 16h trước khi tiêm STZ. STZ được pha trong đệm citrate
(0,0IM, pH 4,5) và giữ lạnh trong khi sử dụng.
Chuột gây bệnh được tiêm màng bụng dung dịch STZ ( lOmg/ml) với liều lượng
duy nhất lOOmg/kg thể trọng. Đối chứng chỉ tiêm citrate. Sau khi tiêm cho chuột ăn
bình thường.
Xác định nồng độ glucose huyết của chuột trước và sau 72h tiêm STZ. Chuột
xem như đã mắc ĐTĐ khi nồng độ glucose huyết lúc đói >13,9mmol/l.

Chuột nuôi béo phì được gây đái tháo đường type 2 bằng tiêm STZ dưới màng
bụng. Sau 3 - 4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ đường huyết >
18mmol/lit
2.3.4.

Phương pháp nghiên cúĩi tác dụng hạ glucose huyết của

dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna cylindrica(L.) trên mô hình
chuột đái tháo đường type 2
2.3.4.1.

Phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng type 2

Chuột nuôi béo phì được gây đái tháo đường type 2 bằng tiêm STZ (1
lOmg/kg pha trong đệm citrate 0.0IM, pH = 4,3) dưới màng bụng, gây rối loạn trao
đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm nhằm tạo mô hình chuột đái tháo
đường type 2 phát triến từ béo phì. Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đói 12 giờ.
Sau đó chúng được tiếp nhận nước và thức ăn bình thường. Sau từ 3-4 ngày những
con chuột bị bệnh với nồng độ glucose huyết được xác định > 18mmol/l [7], [ 8]. Tiến
hành phân các lô chuột đã bị bệnh để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết khi sử
dụng các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu đen.
Bảng 2.1. Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn

2
0


L
ô

dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna cylindrica(L.)
Chê độ ăn trước khi điêu trị
Phương pháp điêu trị

Liêu uông

1

Thức ăn chuân

Uông nước cât, không điêu trị

2

Thức ăn béo

Ưông nước cât, không điêu trị

3

Thức ăn béo

Ưông cao phân đoạn ethanol

2000mg/kg/ngày

4

Thức ăn béo

Uông cao phân đoạn n-hexan

2000mg/kg/ngày

5

Thức ăn béo

ưông cao phân đoạn EtOAc

2000mg/kg/ngày

6

Thức ăn béo

ưông cao phân đoạn nước

2000mg/kg/ngày

Chuột bị bệnh uống điều trị các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu đen và
metformin, được tiến hành đo nồng độ glucose huyết của chuột ở các thí
điểm khác nhau ( 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày) trong vòng 21 ngày (3 tuần).
2.3.4.2.

Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn

dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna cylindrica(L.)trên mô
hình chuột ĐTĐ type 2
Các lô chuột đái tháo đường type 2 (10 con/lô) được ăn thức ăn

thường và điều trị hàng ngày bằng cách cho uống phân đoạn dịch chiết từ
hạt đậu đen với liều 2000mg/kg. Đường huyết của các con chuột được đo
vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày
thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 7, 14, 21 khi điều trị.
2.3.5.

Phương pháp định lượng một số chỉ số lipid trong huyết

thanh
Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglyceride,
HDL- c, LDL-c) được xác định trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động
(Phòng hóa sinh - Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xô).
2.3.5.1.

Phương pháp định lượng glucose huyết

Máu sử dụng để định lượng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi chuột.

2
1


Định lượng glucose huyết bằng máy đo đường huyết tự động và bộ KIT thử tương
ứng (One Touch, Johnson & Johnson, USA).
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên phản ứng đặc hiệu của Glucose oxidase
(GOD) có sẵn bộ KIT thử với Glucose trong máu tạo thành acid gluconic và H202
(phản ứng 1). H202 tạo thành peroxydase phân hủy giải phóng oxi, oxi hóa

o

-

Dianisidin tạo phức chất màu vàng nâu (phản ứng 2) Glucose + H202 + 02 —> Acid
Gluconic + H202 (Phản ứng 1)

o - Dianisidin + H 0

2 2

—► Phức họp nâu vàng -I- H202 (Phản ứng 2)

Cường độ màu được xác định theo phương pháp đo quang tương ứng với lượng
glucose trong máu cần định lượng.
Phương pháp tiến hành
Ấn nút điều khiển để khởi động máy. Gắn que thử vào máy.
Dùng kim châm chuyên dụng châm vào mạch máu ở đuôi chuột, để máu chảy tự
nhiên, thấm bỏ giọt đầu tiên, phủ kín giọt máu lên vùng phản ứng của que thử. Sau 5
giây, kết quả nồng độ đường huyết sẽ hiến thị trên màn hình.
2.3.5.2.

Định lượng triglycerỉd huyết thanh theo phương pháp

enzyme Nguyên lý: Thủy phân triglyceride bang enzim lipase, định
lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của
quinonimin tạo thành từ 4 - aminoantipyryl và 4 - chlorophenol
phản ứng với hydrogen peroxidaza theo các phản ứng sau:
Kết quả: Đo mức độ quang học quinonimine ở bước sóng 546nm
(máy Olympus AU400) rồi so sánh với chuẩn.
Lipase
Triglycerid ------------------► Glycerol + acid béo

Glycerol kinase Glycerol +
ATP -----------------------------------►

2
2


Glycerol-3-P + ADP
Glycerol-phosphate oxidase
Glycerol-3-P + Ơ2 ------------------► Dihydroxyaceton phosphate + H2O2
peroxidaza
2H2O2+ 4-amino-Antipyrin + 4-chloro-Phenol -------------------► Quinonimin + HC1

+ 4H20

2.3.5.3.

Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết

thanh theo phương pháp enzyme
Nguyên lý: Thủy phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol
esterase (CHE) và oxy hóa bang cholesterol oxydase (CHO). Đo mật
độ quang của quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide
với 4- aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxydase theo
các phản ứng:
cholesterol esterase Cholesterol
este + H20

---------------------►

cholesterol + acid béo
cholesterol oxidase Cholesterol + O2
Cholesterol-3-one
+ H2 O2
--------------------► _______________________

peroxidase (POD)

2H2O2 + 4-aminophenazone + phenol

* Quinonimin +
H20

Kết quả: So mật độ quang học của quinonimin ở bước sóng 546nm (máy Olympus

2
3


AU400) với chuẩn.
2.3.5.4.

Định lượng HDL-C

Nguyên tắc: Xét nghiệm gồm 2 bước đặc hiệu. Bước thứ nhất cholesterol trong
chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phá hủy bằng các phản ứng enzyme đặc hiệu,
Bước thứ hai cholesterol trong HDL được định lượng bằng phản ứng enzyme với sự
có mặt của chat surfactant đặc hiệu cho HDL.
Bước 1:
CHE + CHO

Chylomicron, LDL, VLDL ---------------------------------►Cholestenon + H20
Điều kiện đặc biệt
Catalase
2H202

--------------► 2H20 + 02

Bước 2:
CHE + CHO
Surfactant đặc hiệu HDL

*

Cholestenon

+H202

Peroxidase
H2O2 + Chromogen -------------------------------------► sắc tố quynon
2.3.6.

Phương pháp xử tí số liệu

Tất cả các số liệu thu được được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± sai
số.
Tỉ lệ tăng glucose huyết được tính theo công thức:
Xj% = — x 100
Trong đó:
•
•

X!: Tỉ lệ % tăng glucose huyết
A: Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu

•

B: Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá

-

Tỉ lệ giảm glucose huyết được tính theo công thức:

2
4


x2% = — X 100
2

A

Trong đó:
•
•

x2: Tỉ lệ % giảm glucose huyết

•

B: Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá

A: Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu

Sự khác biệt được kiếm định bằng thuật toán t-test student với p<0,05 có ý nghĩa
thống kê.
Các tỉ lệ tăng, giảm các chỉ số cholesterol, triglycerid, HDL-C, LDL-C cũng tính
tương tự.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN cứu
3.1.

Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss (17 - 20g) được chia làm 6 lô thí nghiệm.
-

Lô 1: Cho ăn chế độ bình thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương).

-

Lô 2 - 6: Cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol (thức ăn béo).

Sau 6 tuần nuôi theo chế độ trên trọng lượng của chuột đã tăng lên đáng
kể. Ket quả được thể hiện qua bảng 3.1 và hình 3.1 dưới đây:
Bảng 3.1. Trọng lượng trung bình tính theo (g) cửa hai nhóm chuột nuôi

2
5