PROTEIN VÀ CÁC CHỨC NĂNG

LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật ứng dụng, đặc
biệt là các ngành cơng nghệ sinh học, y học và cơng nghiệp chế biến thực phẩm thì
việc đánh giá chất lượng thực phẩm đang rất được quan tâm và chú ý. Trong số các
chỉ tiêu dùng để đánh giá chất lượng thực phẩm như hàm lượng đường, hàm lượng
lipit, các chất khống, các chất Vitamin … thì hàm lượng protein chứa trong thực
phẩm là chỉ tiêu quan trọng hơn cả.
Trong những năm vừa qua, ở nước ta vấn đề vệ sinh và an tồn thực phẩm
đang trở thành một đề tài nóng bỏng, thu hút được sự chú ý của rất nhiều nhà khoa
học. Vì vậy, mục đích của khố luận này là bước đầu xác định hàm lượng các axit
amin và protein trong thực phẩm.
Nội dung nghiên cứu của bản khố luận này bao gồm:
* Xây dựng một phương pháp cho phép xác định nhanh và tương đối chính
xác hàm lượng các axit amin và protein trong thực phẩm.
* Ứng dụng phương pháp trên vào việc đánh giá sơ bộ chất lượng của một số
loại thực phẩm.












THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN

CHNG 1: TNG QUAN
1. PROTEIN V CC CHC NNG [1,2,3].
1.1. nh ngha.
Protein l polyme sinh hc ca L--aminoaxit kt hp vi nhau bng liờn kt
peptit.
1.2. Phõn loi.
Da vo thnh phn hoỏ hc cỏc protein c phõn thnh hai nhúm ln:
* Protein n gin:
- Cỏc L--aminoaxit.
- Polypeptit gm hai hay vi chc aminoaxit liờn kt vi nhau.
- Protein gm vi chc aminoaxit tr lờn liờn kt vi nhau.
* Protein phc tp: Phõn t ca nú bao gm phn protein v phn khụng phi
protein gi l " nhúm ngoi ". Tu theo bn cht hoỏ hc ca nhúm ngoi, cú th
phõn thnh cỏc nhúm nh nh :
- Metaloprotein (nhúm ngoi l ion kim loi nh Fe
3+
, Zn
2+
).
- Lipoprotein (nhúm ngoi l lipit).
- Glycoprotein (nhúm ngoi l gluxit).
- Phosphoprotein (nhúm ngoi l phosphat, vớ d casein sa).
- Nucleoprotein (nhúm ngoi l axit nucleic).
- Cromoprotein(nhúm ngoi l cỏc cht mang mu).
1.3. Hm lng.
ng vt cú hm lng cao hn thc vt, ngi protein chim ti 45%
trng lng khụ. T l protein cng khỏc nhau gia cỏc b phn trong c th sng.

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN





Bng 1: Hm lng protein trong mt s nguyờn liu ng vt v thc vt.

Nguyờn liu % Protein Nguyờn liu % Protein
Gan 18-19 Moi 13-16
Tim 16-18 c 11-12
Tht gia sỳc 16-22 Sũ 8-9
Trng gia cm 13-15 Hn 4-5
Sa bũ 3-5 u tng 34-40
Cỏ 17-21 Lc 23-27
Tụm 19-23 Ngụ 8-10
Mc 17-20 Go 7-8

1.4. Chc nng.
Protein l thnh phn khụng th thiu c ca tt c cỏc c th sng.
Protein l nn tng v cu trỳc v chc nng ca c th sinh vt. Di õy l mt
s chc nng quan trng ca protein:
1. Xỳc tỏc.
Cỏc protein cú chc nng xỳc tỏc cỏc phn ng sinh hc gi l enzim. Hu
ht cỏc phn ng ca c th sng t nhng phn ng n gin nht nh phn ng
hydrat hoỏ, phn ng kh nhúm cacboxyl n nhng phn ng phc tp nh sao

chộp mó di truyn u do enzim xỳc tỏc.
2. Vn ti.
Protein úng vai trũ nh l cỏc phng tin vn ti chuyờn ch cỏc cht
trong c th sng. Vớ d, hemoglobin, mioglobin ( ng vt cú xng sng),
hemoxiamin ( ng vt khụng xng sng) kt hp vi O
2
ri vn chuyn O
2
n
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN


khp cỏc mụ v c quan trong c th. Hemoglobin cũn vn ti c CO
2
v H
+
.
Glubolin li vn ti Fe.
3. Vn ng.
Nhiu protein trc tip tham gia trong quỏ trỡnh chuyn ng nh : co c,
chuyn v trớ ca nhim sc th trong quỏ trỡnh phõn bo, di ng ca tinh trựng.
ng vt cú xng sng, s co c c thc hin nh chuyn ng trt
trờn nhau ca hai loi si protein: si to cha protein miozin v si mnh cha cỏc
protein actin, troponiozin, troponin.
4. Bo v.
ú l cỏc khỏng th trong mỏu ng vt cú xng sng. Chỳng cú kh nng
nhn bit , "bt" nhng cht l xõm nhp vo c th nh protein l, virut, vi khun
hoc t bo l v loi chỳng ra khi c th. Vớ d, cỏc interferon l nhng protein
do t bo ng vt cú xng sng tng hp v tit ra chng li s nhim virut.
Tỏc dng ca cỏc interferon rt mnh, ch cn nng 10

-11
M ó cú hiu qu
khỏng virut rừ rt. Interferon kt hp vo mng nguyờn sinh cht ca cỏc t bo
khỏc trong c th v cm ng trng thỏi khỏng virut ca chỳng.
Cỏc protein tham gia trong quỏ trỡnh ụng mỏu cú vai trũ bo v cho c th
sng khi b mt mỏu.
mt s thc vt cú cha cỏc protein cú tỏc dng c i vi ng vt, ngay
c liu lng rt thp chỳng cng cú tỏc dng bo v thc vt khi s phỏ hoi
ca ng vt.
5. iu hũa.
Mt s protein cú chc nng iu ho quỏ trỡnh thụng tin di truyn, iu ho
quỏ trỡnh trao i cht. Protein iu ho quỏ trỡnh biu hin gen, nh cỏc protein
reprex vi khun cú th lm ngng quỏ trỡnh sinh tng hp enzim ca cỏc gen
tng ng. c th bc cao s iu ho hot ng biu hin gen theo mt c ch
phc tp hn nhng cỏc protein cng úng vai trũ quan trng.
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN


Cỏc protein cú hot tớnh hormon, cỏc protein c ch c hiu enzim u cú
chc nng iu ho nhiu quỏ trỡnh trao i cht khỏc nhau.
6. Truyn xung thn kinh.
Mt s protein cú vai trũ trung gian cho phn ng tr li ca t bo thn kinh
i vi cỏc kớch thớch c hiu. Vớ d vai trũ ca sc t th giỏc rodopxin mng
li mt.



7. Cu trỳc.
Cỏc protein ny thng cú dng si nh sclerotin trong lp v ngoi ca cụn
trựng, fibroin ca t tm, t nhn, colagen, elastin ca mụ liờn kt, mụ xng.

8. D tr dinh dng.
Protein cũn l cht dinh dng quan trng cung cp cỏc axit amin cho phụi
phỏt trin. Vớ d, albumin trong lũng trng trng, casein trong sa, gliadin trong ht
lỳa mỡ, zein ca ngụ
1.5. CU TO PHN T PROTEIN [1,2,3].
1.5.1. Thnh phn cỏc nguyờn t ca protein.
Tt c cỏc protein u cha cỏc nguyờn t C, H, O, N. Mt s cũn cú cha
mt lng nh S. T l phn trm khi lng cỏc nguyờn t ny trong phõn t
protein nh sau:

C: 50 - 55%
O: 21 - 24%
N: 15 - 18%
H: 6.5 - 7.3%
S : 0 - 0.24%

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN


Ngoi cỏc nguyờn t trờn, mt s protein cũn cha mt lng rt nh cỏc nguyờn t
khỏc nh: P, Fe,Zn, Cu, Mn, Ca
1.5.2. n v cu to c s ca protein: L--aminoaxit.
Tuy protein rt a dng v cu trỳc v m nhn nhiu chc nng nh vy
song hu nh u xõy dng nờn cỏc i phõn t ca mỡnh ch yu t 20 L--
aminoaxit bng liờn kt peptit. Do vy, cng cú th xem cỏc aminoaxit ny l sn
phm cui cựng ca s thu phõn peptit v protein.

Valin, mt i din ca -aminoaxit dng khụng ion
-aminoaxit v lng tớnh pH trung tớnh
Hỡnh 1: Cu trỳc ca -aminoaxit

-Cacbon
C
H
H
H
C
H
C
H
H
H
C
N
H
H

H
C
O
O H
C
N
H
H

H

C
O
O H
R
Dạng không ion
C
N
+
H
H
H

H
R
C
O
O
_
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN



Biểu diễn trên không gian 3 chiều Các đồng phân lập thể

Hình 2: Cấu trúc lập thể của -aminoaxit
Như vậy cấu tạo của chúng giống nhau ở chỗ cùng có nhóm cacboxyl -
COOH và nhóm amin - NH
2
đều gắn vào nguyên tử C ở vị trí , còn khác nhau bởi
cấu tạo của mạch bên R.

Khi thiếu thậm chí chỉ một trong các axit amin cần thiết có thể làm cho
protein được tổng hợp ít hơn protein bị phân giải, kết quả dẫn đến mất cân bằng đối
với nitơ. Hàm lượng các axit amin không thay thế và tỉ lệ giữa chúng trong phân tử
protein là một tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá chất lượng protein.
Trong dung dịch, các aminoaxit thường ở dạng ion lưỡng tính mang cùng
một lúc điện tích dương (+) do nhóm -NH
2
ở dạng -NH
3
+
và điện tích âm (-) do
nhóm -COOH ở dạng -COO
-
. Chúng hấp thụ ánh sáng, đặc biệt là dung dịch của 3
aminoaxit chứa nhân thơm: Tryptophan, tyrozin và phenylalanin hấp thụ khá mạnh
ánh sáng UV ở bước sóng gần 280nm.
THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN


Trong dung dịch, tuỳ thuộc vào pH của môi trường nó có thể là ion lưỡng
tính, hoặc mang điện (+) hoặc (-). Giá trị pH mà ở đó amino axit tồn tại dạng ion
lưỡng cực được gọi là điểm đẳng điện và pH dược gọi là pI. Vì các mạch bên R
khác nhau giữa các aminoaxit nên mỗi aminoaxit có một điểm đẳng điện riêng. Tại
điểm đẳng điện, tổng điện tích của aminoaxit bằng 0. Còn ở bất kỳ điểm pH nào
thấp hơn pI hoặc cao hơn pI các aminoaxit đều mang điện tích dương hoặc âm,
điều này tuỳ thuộc điện tích mạch bên R của chính nó. Vì vậy, trong thực tế đặc
tính này được sử dụng để phân tách và xác định các aminoaxit.
1.5.3. Peptit.
Peptit là những phân tử sinh học cấu tạo từ một vài cho tới hàng chục amino
axit.

Peptit tạo thành từ các aminoaxit thông qua phản ứng nối đầu -NH
2
của phân
tử này với đầu -COOH của phân tử kia tạo ra liên kết peptit.















THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN

Hình 3: Sự hình thành của một dipeptit

Hì
nh 4: Sự hình thành của một tetrapeptit.
Glu
N-điểm
cuối
Gly
Ala
C-điểm
ố
Lys
THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN



Đặc trưng liên kết đơi của bộ khung peptit Các góc và độ dài liên kết

Hình 5: Cấu trúc của bộ khung peptit.

Cấu trúc của liên kết peptit cho thấy hầu hết các liên kết bất biến -C=O và -
N-H là song song hoặc gần song song và hơi bị xoắn xung quanh liên kết C-N.
Chính sự lai tạo của ocbital  trong liên kết đơi C=O với đơi điện tử còn lại của N
đã làm cho mặt phẳng liên kết trở nên vững chắc (xem hình 7) và nhờ các mặt
phẳng này đã tạo ra liên kết bậc 2 (phiến gấp ) đối với cấu trúc của protein.
Ngồi liên kết peptit, đơi khi giữa các aminoaxit còn có liên kết đisunfua nối 2
gốc xystein với nhau. Liên kết này có vai trò quan trọng giúp hình thành cấu trúc
khơng gian của rất nhiều protein, đặc biệt protein ngoại bào có chức năng sinh học
quan trọng như hocmon, immunoglobulin và kháng thể.
Peptit có tính chất lý hố khơng khác nhiều so với aminoaxit vì cùng chứa một

nhóm -NH
2
và -COOH tự do giống như aminoaxit. Sự khác nhau ở đây chỉ là do
các mạch bên R của gốc amino axit tham gia chuỗi peptit gây ra. Các peptit bị thuỷ
phân hồn tồn bởi dung dịch HCl 6N ở 110
0
C trong 24h, hoặc bởi dung dịch kiềm
để cho các amino axit tự do.
a-cacbon
a-cacbon
Ocbital

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN


Liờn kt peptit cũn b thu phõn bi enzim thu phõn protein gi l proteaz.
Chỳng cú mt tt c cỏc t bo v mụ t bo thc hin nhim v ch yu l
phõn gii protein.
1.5.4. Cu trỳc khụng gian ca protein.
Cu trỳc khụng gian ca protein l tp hp khụng gian ca tt c cỏc nguyờn
t trong phõn t. Ngi ta phõn bit 4 bc cu trỳc ca protein nh sau:
a. Cu trỳc bc 1 l trỡnh t sp xp cỏc aminoaxit v v trớ liờn kt isunfua
trong chui polypeptit. Cu trỳc bc 1 khụng cú cu hỡnh khụng gian c hiu.
b. Cu trỳc bc 2 phn ỏnh s sp xp cú quy lut trong khụng gian ca cỏc
aminoaxit trong chui polypeptit, ph bin hn c l cu trỳc xon v cu trỳc
phin gp np .
c. Cu trỳc bc 3 phn ỏnh tng quan khụng gian ca cỏc aminoaxit trong
chui polypeptit. Trong ú bao hm s xon hoc un ca cỏc cu trỳc bc 2 to
nờn cu hỡnh khụng gian c thự riờng cho tng loi protein.
d. Cu trỳc bc 4 phn ỏnh tng quan khụng gian gia cỏc si polypeptit (hay

cỏc phn di n v) trong phc hp phõn t protein.

1.5.4.1. Cu trỳc bc 1:
Cỏc gc aminoaxit trờn chui polypeptit c sp xp theo mt trt t nht
nh v liờn quan vi chc nng sinh hc ca protein mt cỏch ht sc cht ch.
Vi s t hp khỏc nhau ca 20 aminoaxit ó dn n cỏc loi protein khỏc
nhau. Cỏc protein cú chc nng sinh hc ging nhau thng cú cu trỳc bc 1 khỏ
ging nhau. Nh vy cú th thy trong bt k cu trỳc bc 1 no ca protein bao
gi cng cú nhng on quan trng bt buc phi cú trỡnh t sp xp amino axit
khụng thay i, ngoi ra mt s v trớ no ú cú th cú s thay i m vn khụng
nh hng n chc nng ca protein.
1.5.4.2. Cu trỳc bc 2: gm xon , phin gp np v xon colagen
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN


a. Cu trỳc xon : on mch polypeptit xon cht li lm cho nhng
nhúm peptit(-CO-NH-), C

to thnh phn bờn trong ca lừi xon, cỏc mch bờn R
quay ra phớa ngoi. Cu trỳc ny c gi vng ch yu nh liờn kt hiro c
to thnh gia nhúm cacbonyl ca mt liờn kt peptit vi nhúm -NH ca liờn kt
tip sau cỏch nhau 3 gc aminoaxit trờn cựng mt mch polypeptit. Tt c cỏc
nhúm -CO v -NH cú trong liờn kt peptit ca mch polypeptit u to thnh liờn
kt hiro vi nhau nh vy, ngha l c mi nhúm -CO-NH- u cú th to thnh 2
liờn kt hiro vi 2 nhúm -CO-NH- khỏc. Cỏc liờn kt hiro c to thnh vi s
lng ti a, bo m bn vng cu trỳc xon . Chiu xon cú th xon phi
(thun chiu kim ụng h) hoc trỏi, nhng xon trong phõn t protein thng l
dng xon phi. Chiu di cỏc on xon trong phõn t protein thng khụng
di, ngn hn 40.
b. Cu trỳc phin gp np : Xut hin trong fibroin ca t tm, nú khỏc

vi xon mt s im ch yu sau:
- on mch polypeptit cú cu trỳc phin gp np thng dui di ra ch
khụng cun cht nh xon . Khong cỏch trờn trc gia 2 gc aminoaxit k nhau
l 3,5, cũn xon l 1,5 .
- Liờn kt hiro cũn c to thnh gia 2 mch polypeptit khỏc nhau, k
nhau, cú th cựng hng hay ngc hng vi nhau. Trong phõn t ca nhiu
protein hỡnh cu cun cht cũn gp kiu cu trỳc quay . ú mch polypeptit b
o hng t ngt. ú l do to thnh liờn kt hiro gia nhúm -CO ca liờn kt
peptit th n vi nhúm -NH ca liờn kt peptit th n+2.
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN



Hỡnh 6a: Xon Hỡnh 6b: Phin gp np

c. Cu trỳc xon colagen : Kiu cu trỳc ny xut hin trong phõn t
colagen. Thnh phn aminoaxit ca colagen rt c bit so vi cỏc protein khỏc:
glixin chim khong 35%, prolin chim khong 12% tng s aminoaxit trong phõn
t. Ngoi ra colagen cũn cha 2 aminoaxit ớt gp trong cỏc protein khỏc l
hiroxiprolin v hiroxilizin. n v cu trỳc ca colagen l tropocolagen bao gm
3 mch polypeptit bn vo nhau thnh mt dõy cỏp siờu xon.
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN




Hình 7: Cấu trúc của sợi colagen
a. Cấu trúc bậc1 và 2 của phân tử tropocolagen.
b. Phân tử tropocolagen gồm 3 chuỗi polypeptit bện với nhau.
c. Sự sắp xếp của các phân tử tropocolagen trong sợi colagen.

d. Vết vằn ngang thể hiện các phân tử ở các dãy kề nhau xếp lệch nhau một
khoảng cách 64 nm.
e. Hình ảnh thu được qua kính hiển vi điện tử.
1.5.4.3. Cấu trúc bậc 3: Cấu trúc này phản ánh tương quan trên phạm vi tồn bộ
sợi polypeptit. Những aminoaxit nằm ở xa nhau và nằm trong những cấu trúc bậc 2
khác nhau lại thường hay tương tác tiếp cận với nhau trong cấu trúc bậc 3. Các liên
kết và tương tác yếu có vai trò quyết định giữ ổn định cấu trúc bậc 3. Với liên kết
này các phân tử có xu thế cuộn chặt lại, các gốc kỵ nước quay vào trong, các gốc
ưa nước ở trên bề mặt phân tử. Khi biến tính phân tử protein bằng các tác nhân hố
học hoặc vật lý tức là phá vỡ liên kết Van đe Van, liên kết hiđro, khử cầu sunfua,
phân tử protein sẽ bị duỗi ra đồng thời thay đổi một số tính chất của nó, đặc biệt là
(a)
(b)
(c)
(d) (e)
THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN


tớnh tan v hot tớnh sinh hc. S bin tớnh ny cú th thun nghch nu nh chỳng
cú th tr li trng thỏi cu trỳc ban u v khụng thun nghch nu nh vnh vin
khụng tr li trng thỏi cu trỳc ban u. Vi nhit cao thng phỏ v tt c cỏc
liờn kt lm cho phõn t protein b bin tớnh hon ton, vớ d nu riờu cua, canh
trng. Cỏc dung mụi hu c, mui amoni, cht ty ra thng tỏc ng nh nhng
hn ch phỏ v tng tỏc k nc. pH cng lm thay i tng in tớch ca
phõn t protein v phỏ v mt phn liờn kt hiro nờn cng c xem l mt yu
t gõy bin tớnh.


(a) (b)

Hỡnh 8: Cu trỳc bc 3 ca phõn t protein t nhiờn (a) v bin tớnh (b)

1.5.4.4. Cu trỳc bc 4:
Rt nhiu protein cha 2 hoc nhiu si polypeptit cũn gi l phn di dn
v (subunit) ging nhau hoc khỏc nhau. Do vy cu trỳc bc 4 phn ỏnh tng tỏc
khụng gian gia cỏc phn ny trong phõn t protein,


Bin tớnh nghch
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN



a b

Hình 9: So sánh cấu trúc của myoglobin (a) và cấu trúc của hemoglobin (b)




Hình 10: 4 bậc cấu trúc của protein

1.6. MỘT SỐ TÍNH CHẤT QUAN TRỌNG CỦA PROTEIN.
Cấu trúc bậc 1
Cấu trúc bậc 2
Cấu trúc bậc 3
Cấu trúc bậc 4
Nhóm hem
Đầu
Đầu N

Đầu N
Đầu C
THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN



1.6.1. Khối lượng và hình dạng phân tử protein.
Protein có khối lượng phân tử tương đối lớn, có dạng hình cầu hoặc dạng sợi.
Protein hình cầu tan trong nước hoặc dung dịch muối lỗng, rất hoạt động về
mặt hố học. Các protein hình sợi tương đối trơ về mặt hố học, chủ yếu có chức
năng cơ học. Ví du, colagen của da, xương, sụn, gân, răng; keratin của tóc, lơng,
fibroin của tơ, miozin của cơ... [1,2,3].
1.6.2. Tính chất lưỡng tính của protein.
Cũng như aminoaxit, protein cũng là chất điện ly lưỡng tính vì trong phân tử
protein còn nhiều nhóm phân cực của mạch bên. Có thể điều chỉnh pH để tách
riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. Khi pH = pI các protein dễ dàng kết tụ
lại với nhau làm cho protein kết tủa [1,3,6].
1.6.3. Tính chất dung dịch keo protein, sự kết tủa protein.
Khi hồ tan, protein tạo thành dung dịch keo. Các phần tử keo có kích thước
lớn, khơng đi qua màng bán thấm. Người ta sử dụng tính chất này để tinh sạch
protein khỏi các chất phân tử thấp bằng phương pháp thẩm tách. Hai yếu tố
đảm bảo độ bền dung dịch keo protein là:
- Sự tích điện cùng dấu của các phân tử protein ở (pH # pI).
- Lớp vỏ hyđrat bao quanh phân tử protein.
Người ta thường dùng các muối vơ cơ như (NH
4
)
2
SO
4

hay các dung mơi hữu cơ
như axeton, etanol để tạo kết tủa protein nhưng phải tiến hành ở nhiệt độ thấp. Các
yếu tố gây biến tính khơng thuận nghịch thường được sử dụng để loại bỏ protein ra
khỏi dung dịch: dùng nhiệt, các axit mạnh, các kim loại nặng...[1,3,5,6].
1.6.4. Khả năng hấp thụ tia tử ngoại của protein
Dung dịch protein có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng có bước sóng
180-220nm và 250-300nm [3,6].


THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN


1.6.5. Khả năng thuỷ phân của protein
Các phân tử protein có thể bị thủy phân bằng axit, kiềm hay enzim cho các
polypeptit và cuối cùng là các aminoaxit [1,3,6].
2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMINOAXIT VÀ
PROTEIN.
2.1. Các phản ứng màu của axit amin và protein.
2.1.1. Phản ứng Biure.
Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptit. Trong môi trường kiềm, các
hợp chất có chứa từ hai liên kết peptit trở nên có thể phản ứng với CuSO
4
tạo thành
phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ tuỳ thuộc vào số lượng liên kết peptit nhiều
hay ít. Các phản ứng xảy ra như sau:
* Phản ứng tạo biure.
C
OH
HN
NH

C
O
2H
2
N
NH
3
NH
2
NH
2
H
2
N
C
O
C
O
N
H
N
H
C
OH
Ure
Biure (xeto)
Biure (enol)

* Phản ứng với protein.
Cũng tương tự như trường hợp của biure, các liên kết peptit ở dạng enol (trong môi

trường kiềm) của các phân tử protein tạo phức với Cu
2+
:
2HN
C
OH
N
H
C
OH
Cu(OH)
2
NaOH
ONa
ONa
C
NH
C
O
CuHN
NH
HN
NH
C
O
+
+
NH
HN C

THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN


Dạng phức hợp như trên (với bốn ngun tử nitơ tham gia tạo liên kết phối trí)
thường có màu đỏ (hấp thụ cực đại ở bước sóng 520-535nm). Trong trường hợp chỉ
có hai hay ba ngun tử N tham gia tạo liên kết thì phức sẽ có màu tím hoặc màu
xanh (hấp thụ cức đại ở những bước sóng tương ứng là 540-580 và 615-670nm). Vì
vậy, thơng thường sản phẩm phản ứng của các polypeptit khác nhau sẽ có màu thay
đổi từ xanh tím đến đỏ tím. Phản ứng biure thường được ứng dụng để định lượng
protein [1,3,6,9].
2.1.2. Phản ứng với ninhiđrin.
Các aminoaxit khi phản ứng với ninhiđrin ở nhiệt độ cao cho sản phẩm có màu
xanh tím (hấp thụ cực đại ở khoảng bước sóng 570nm). Đây là phản ứng chung cho
tất cả các aminoaxit có chứa nhóm NH
2
ở vị trí C
ỏ
. Ngồi -aminoaxit, các peptit,
protein, muối amoni và amoniac cũng cho phản ứng này. Cơ chế phản ứng khá
phức tạp như sau:
Đầu tiên do tác dụng của các aminoaxit với ninhiđrin sẽ xuất hiện phức chất
dạng bazơ-schiff. Sau đó xảy ra sự chuyển nhóm, tiếp theo là sự đề cacboxyl hố
và sự phân tách phức chất thành anđehit và aminođixetohiđrinden.

O
O
O
H
2

N
CHR
CH
R
COOH
H
CO
2
-H
2
O
N
N
Ninhi®rin
Aminoaxit
Baz¬ - Schiff
Chun nhãm
vµ lo¹i
+
O
O
O
O
CH
R
COOH

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN

Aminoixetohirinden li ngng t vi mt phõn t ninhirin khỏc v hỡnh
thnh nờn mt hp cht mi, ng thi b enol hoỏ v chuyn thnh dng cú mu.

C
NH
2
CHR
R
H
H
+H
2
O
-H
2
O
N
N
Phức màu xanh tím
Aminoxetohiđrinden
+
+
O
O
O
H
O
O
NH
2

H
O
O
O
O
O O
O
O
O

Khi cú cỏc dung mụi hu c (axeton, etanol,piriin thng c dựng
pha ninhirin) thỡ s xy ra phn ng sau:

CH
CH
CH
R
R
H
-H
2
O
N
N
Phức có màu
+
O
O
O
O

O
O
O
-
O
O
-
CH
2


THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN


Sn phm ca phn ng ny cú cha gc R ca aminoaxit ban u. Gc ny
s quyt nh mu sc khỏc nhau (xanh da tri, ) ca cỏc hp cht khi phn
ng vi ninhirin.
c bit phc cht c to thnh gia prolin (cú cha nhúm imin) v
ninhirin cú mu vng ti, khỏc bit hn vi mu do cỏc aminoaxit khỏc to nờn
trong phn ng. Do vy, ninhirin cũn c s dng cho phn ng mu c trng
phỏt hin prolin:

COOH
+
+ +
O
O
O
O
HN

O
-
N
+
CO
2
H
2
O

Phc mu vng

Phn ng vi ninhirin cú nhy cao, do ú thng c dựng nh tớnh
v nh lng protein [1,3,6].
2.1.3. Phn ng vi axit HNO
2
.
Di tỏc dng ca HNO
2
, aminoaxit b deamin hoỏ to thnh nit dng
khớ. Phn ng ny c s dng nh lng cỏc -aminoaxit (phng phỏp Van
Slyke) [6].
Phn ng xy ra nh sau:

O
OH
H
2
O
H

2
N
CH
COOH
R
N
2
+
++
N
HO
CH
COOH
R


2.1.4. Phn ng Pauli phỏt hin histiin v tirozin.
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN


Khi tác dụng với axit điazobenzensunfonic (thuốc thử diazo), histiđin tạo
thành phức chất màu mận chín, còn tirozin tạo thành phức chất màu da cam [6].
Các phản ứng xảy ra như sau:



* Sự tạo thành axit điazobenzensunfonic:

O
H

2
N
N
N
+
+
+
+
O
O
S
HCl
NaCl
OH
NaNO
2
O
O
S
2H
2
O

* Phản ứng của tirozin:

O
CH
N N
+
+

+
N
O
COOH
N
S
Na
2
CO
3
H
2
CO
3
O
O
N
N
O
O
O
S
2
OH
CH
2
NH
2
ONa
ONa

CH
COOH
OH
CH
2
NH
2
S

THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN


Phức màu da cam.
2.1.5. Phản ứng Millon đặc trưng cho tyrozin.
Thuốc thử Millon chính là muối thuỷ ngân nitrat trong HNO
3
đặc. Khi cho
thuốc thử Millon tác dụng với nhân phenol của tirozin sẽ tạo nên hợp chất
nitrotirozin-thuỷ ngân có màu đỏ.
Phản ứng xảy ra như sau:
CH
COOH
OH
CH
2
NH
2
CH
COOH
CH

2
NH
2
+
+ +
HgNO
3
HNO
3
O
2
N
O
OHg
O
H
2
O
N


Phản ứng Millon được sử dụng để phát hiện tyrozin và các hợp chất phenol.
Chú ý không cho quá nhiều thuốc thử Millon vì HNO
3
có trong thuốc thử sẽ tác
dụng với protein cho màu vàng [6].

2.1.6. Phản ứng của các axit amin chứa lưu huỳnh (Phản ứng Folia).
Các axit amin chứa lưu huỳnh như xistin, xistein, methionin dưới tác dụng
của kiềm bị phân huỷ tạo thành natri sunfua (Na

2
S):

RSH + 2NaOH  Na
2
S + ROH + H
2
O

Thêm chì axetat vào Na
2
S sẽ phản ứng tạo thành kết tủa nâu đen của chì
sunfua (PbS) [6].

Na
2
S + Pb(CH
3
COO)
2
 2CH
3
COONa + PbS
(kết tủa nâu đen)

THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN


2.1.7. Phn ng Sakaguchi c trng cho acginin.
õy l phn ng dựng phỏt hin acginin. Khi cho acginin tỏc dng vi

hipobromua (NaBrO) v -naphtol s to thnh sn phm cú mu cam [6].
Phn ng cú th c trỡnh by nh sau:
C
O
COOH
NaBr
H
2
O
NaBrO
NH
2
(CH
2
)
3
1/2N
2
CHNH
2
NH
NH
+
+ + ++
HO
C
COOH
NH
2
(CH

2
)
3
CHNH
2
NH

2.1.8. Phn ng Adamkievic c trng cho tryptophan.
Trong mụi trng axit, tryptophan phn ng vi nhiu loi anehit to thnh
nhng sn phm ngng kt cú mu tớm c trng [6].
Cỏc phn ng xy ra nh sau:
O
H
H
H
+
+
O
CHOOC
H
2
SO
4
CO
2
Axit glioxilic
Focmanđêhit
C

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN

O
+
H
2
SO
4
Bis-2-triptophanylmetal
CH
2
CH
2
COOH
H
2
N
CH
+
+
+
NH
NH
H H
C
CH
2
COOH
CH
NH

CH
2
COOH
CH
CH
2
COOH
H
2
N
CH
NH
NH
2
NH
2
H
2
O


O
Bis-2-triptophanylmetal
Bis-2-triptophanylcacbinol
CH
2
CH
H
NH
CH

2
COOH
CH
CH
2
COOH
H
2
N
CH
NH
NH
2
Oxi hoá
NH
CH
2
COOH
CH
CH
2
COOH
H
2
N
CH
NH
NH
2

2.2.nh lng axit amin v protein.
2.2.1. Xỏc nh N-amin bng phng phỏp chun focmol.
Cỏc aminoaxit cú th phn ng vi focmol trung tớnh to thnh metyl -
aminoaxit. Focmol ó khoỏ nhúm amin (NH
2
) mang tớnh kim nờn cú th chun
nhúm cacboxyl trong phõn t aminoaxit bng kim. Da vo lng kim ó dựng
chun s tớnh c lng Nit ca aminoaxit [6,9].
Phn ng c biu din nh sau:
THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN