Nghiên cứu tổng hợp thuốc chữa bệnh tiểu đường metformin hydrochiloride

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

======

NGUYỄN THỊ THU HẠNH

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP THUỐC
CHỮA BỆNH TIỂU ĐƢỜNG
METFORMIN HYDROCHLORIDE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
GS.TS Nguyễn Văn Tuyến

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này đƣợc hoàn thành tại phòng Hóa Dƣợc - Viện
Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, ngoài sự nỗ
lực của bản thân, em còn nhận đƣợc sự giúp đỡ của Ban giám hiệu nhà
trƣờng, các thầy cô giáo trong khoa Hóa học – Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà
Nội 2.
Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Văn Tuyến ngƣời đã tạo
điều kiện cho em đƣợc làm thực nghiệm tại phòng Hóa dƣợc, các chuyên viên
kĩ thuật phòng Hóa dƣợc - Viện hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện để em học tập và hoàn thành tốt khóa
luận này.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Văn Tyến,
ngƣời đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo em trong suốt thời gian học tập, hƣớng dẫn,
giúp chỉnh sửa và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến ngƣời thân và bạn bè đã chia
sẻ, động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm và hoàn thành khóa luận.
Do đây là lần đầu tiên em đƣợc làm quen với việc nghiên cứu, do điều
kiện thời gian và trình độ hạn chế, nên khóa luận này không tránh khỏi những
thiếu sót. Em rất mong nhận đƣợc sự đóng góp quý báu của các thầy giáo, cô
giáo để khóa luận của em đƣợc hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 08 tháng 05 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Thu Hạnh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC ........................................................................................................................
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Khái quát về bệnh tiểu đƣờng. .................................................................. 2
1.1.1. Phân loại bệnh tiểu đường. ............................................................................................................2
1.1.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết. ................................................................................3
1.1.3. Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường. ..............................................................5
1.1.4. Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường...............................................................................5
1.2. Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng Metformin hydrochloride. ........................... 5
1.2.1. Tổng quan về Metformin hydrochloride.....................................................................................5
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước. ................................................................................................7
1.2.3. Tình hình nghiên cứu ngoài nước.................................................................................................8
1.2.4. Các phương pháp nghiên cứu.................................................................................................... 10

1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ ........ 17
1.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)................................................................................................................... 17
1.3.2. Độ quay cực ([α]D)....................................................................................................................... 18
1.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ...................................................................................................... 18
1.3.4. Phổ khối lượng (Mass spectrocopy, MS) ................................................................................ 20
CHƢƠNG II. THỰC NGHIỆM ................................................................................21
2.1. Mục tiêu của khóa luận ............................................................................ 21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị.................................... 21
2.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng.. 24
2.4. Định lƣợng phản ứng ....................................................................................................................... 25
2.5. Phƣơng pháp thực nghiệm.................................................................25
2.6. Tổng hợp Metformin hydrochloride. ....................................................... 26
2.7. Nghiên cứu kết tinh metformin hydrochloride......................................................................... 26
2.8. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride.............. 27
2.9. Nghiên cứu hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC-MS) ..... 27
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..............................28


3.1. Tổng hợp metformine hydrochloride. ...................................................... 28
3.2. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride........................................................................ 31
3.3. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride. ..................... 32
3.4. Hàm lƣợng metformin hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC........................................ 34
KẾT LUẬN ..................................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................38
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
13

C- NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon-13
(13C Nuclear Magnetic Resonance Spectromotry)

DMSO

Dimethyl sulfoxide

1

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton

H- NMR

(1H Nuclear Magnetic Resonance Spectromotry)
HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

IR

Phổ hồng ngoại
(Infrared Spectroscopy)

MS

Phổ khối lƣợng va chạm điện tử
( Electron Impact-Mass Spectrometry)

Rf

Hệ số di chuyển

H, C

Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

Ppm

Phần triệu
( parts per million )

S

Singlet

CHCl3

Clorofom

EtOH

Etanol

MW

Microwave

MeOH

Metanol

OMe

Methoxy


DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
Bảng 1: Các thiết bị chính sử dụng trong phòng thí nghiệm .....................................22
Bảng 2: Các dụng cụ chính sử dụng trong phòng thí nghiệm ...................................23
Hình 1: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride. .......................................29
Hình 2: Phổ 13C-NMR của chất metformin hydrochloride. .....................................30
Hình 3: Đồ thị về mối tƣơng quan giữa liều dùng và số chuột chết..........................34
Hình 4: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride ............................................36


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid.................................................. 7
Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine ............................................. 7
Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride ................................. 8
Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theoShapiro ............. 9
Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi........ 9
Sơ đồ 1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin ......................................... 9
Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin .......................................... 10


MỞ ĐẦU
Tiểu đƣờng là căn bệnh nguy hiểm thuộc hệ nội tiết, đe doạ nghiêm

trọng sức khoẻ con ngƣời và gây nhiều biến chứng nguy hiểm, đặc biệt là tiểu
đƣờng tuýp II (chiếm tới 90-95%). Theo Hiệp hội thế giới về tiểu đƣờng, tử
vong của bệnh này đứng hàng thứ tƣ ở các nƣớc phát triển, bệnh có thể gây
nhiều tai biến nguy hiểm nhƣ: mù loà và giảm thị lực ở ngƣời trƣởng thành;
đoạn chi không do tai nạn nhiều hơn ngƣời bình thƣờng từ 15-40 lần; suy thận
giai đoạn cuối nên cần phải chạy thận hoặc thay thận nhân tạo; gây ra những
biến chứng tim mạch nguy hiểm. Theo ƣớc tính, hiện thế giới có 194 triệu
ngƣời mắc bệnh tiểu đƣờng chiếm tới 5,1% dân số thế giới, ƣớc tính đến năm
2025 số ngƣời bị bệnh tiểu đƣờng sẽ là 333 triệu ngƣời. Theo thống kê năm
2008, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đƣờng ở Việt Nam là 5% dân số (khoảng 4,5
triệu ngƣời) và 7,2% tại các thành phố lớn. TP. Hồ Chí Minh có hơn 800.000
ngƣời mắc bệnh. Trong danh sách thuốc thiết yếu của WHO 2007 và trong
danh mục thuốc thiết yếu của Bộ Y tế, metformin là một thuốc tiểu đƣờng
đƣợc sử dụng theo đƣờng uống chữa bệnh tiểu đƣờng tuýp II. Metformin làm
chậm hấp thụ đƣờng trong ruột non; ngăn cản gan chuyển đƣờng dự trữ vào
trong máu và giúp cơ thể sử dụng insulin tự nhiên hiệu quả hơn. Nhƣ vậy nếu
tổng hợp đƣợc metformin thì chúng ta có thể chủ động sản xuất đƣợc loại
thuốc thiết yếu nhất để chữa bệnh tiểu đƣờng tuýp II, làm tăng thêm sự lựa
chọn, tăng tính hiệu quả của việc chữa bệnh tiểu đƣờng và chủ động sản xuất
thuốc generic chữa bệnh tiểu đƣờng giá rẻ ở Việt Nam.
Vì vậy, tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp thuốc
chữa bệnh tiểu đường metformin hydrochloride” có ý nghĩa rất lớn về khoa
học và thực tiễn.

1


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về bệnh tiểu đƣờng.
1.1.1. Phân loại bệnh tiểu đường.

Bệnh tiểu đƣờng là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat
khi hoóc môn insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu
hiện bằng mức đƣờng trong máu luôn cao; trong giai đoạn mới phát thƣờng
làm bệnh nhân đi tiểu nhiều, tiểu ban đêm và do đó làm khát nƣớc. Bệnh tiểu
đƣờng là một trong những nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm nghèo,
điển hình là bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy
thận, liệt dƣơng, hoại thƣ, v.v.
Bệnh tiểu đƣờng đƣợc chia thành hai loại nhƣ sau:
Tiểu đƣờng tuýp I:
Tiểu đƣờng tuýp I là một bệnh tự miễn trong đó hệ thống miễn dịch
của cơ thể phản ứng lại và phá huỷ tế bào  sản xuất insulin của đảo tuỵ.
Sự thiếu hụt insulin dẫn đến tăng glucose máu và thƣờng dẫn đến các
biến chứng mãn tính.
Khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đƣờng thuộc loại I,
phần lớn xảy ra ở trẻ em và ngƣời trẻ tuổi (<20 tuổi). Các triệu chứng thƣờng
khởi phát đột ngột và tiến triển nhanh nếu không điều trị. Giai đoạn toàn phát
có tình trạng thiếu insulin tuyệt đối gây tăng đƣờng huyết và nhiễm Ceton.
Những triệu chứng điển hình của bệnh tiểu đƣờng loại I là: ăn nhiều,
uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhiều (4 nhiều), mờ mắt, dị cảm và sụt cân, trẻ em
chậm phát triển và dễ bị nhiễm trùng.
Tiểu đƣờng túyp II:
Bệnh tiểu đƣờng tuýp II đƣợc đặc trƣng bởi kháng insulin và giảm tiết
chế insulin dẫn đến mất khả năng duy trì mức glucose máu bình thƣờng.

2


Bệnh tiểu đƣờng loại 2 chiếm khoảng 90-95% trong tổng số bệnh nhân
bệnh tiểu đƣờng, thƣờng gặp ở lứa tuổi trên 40, nhƣng gần đây xuất hiện ngày
càng nhiều ở lứa tuổi 30, thậm chí cả lứa tuổi thanh thiếu niên.

Bệnh nhân thƣờng ít có triệu chứng và thƣờng chỉ đƣợc phát hiện bởi
các triệu chứng của biến chứng, hoặc chỉ đƣợc phát hiện tình cờ khi đi xét
nghiệm máu trƣớc khi mổ hoặc khi có biến chứng nhƣ nhồi máu cơ tim, tai
biến mạch máu não; khi bị nhiễm trùng da kéo dài; bệnh nhân nữ hay bị ngứa
vùng do nhiễm nấm âm hộ; bệnh nhân nam bị liệt dƣơng.
Các túyp tăng đƣờng huyết đặc hiệu khác:
- Đái tháo đƣờng thai kỳ.
- Thiếu hụt di truyền chức năng tế bào .
- Thiếu hụt di truyền về tác động của insulin.
- Bệnh tuyến tụy ngoại tiết ....
1.1.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết.
Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh tiểu đƣờng
đƣợc chia thành 3 nhóm chính nhƣ sau:
- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin.
- Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
- Các thuốc chống tăng đƣờng huyết sau bữa ăn.
1.1.2.1. Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin.
+ Insulin:
Insulin là hormon do tế bào  của tuyến tuỵ tiết xuất, đóng vai trò chủ
yếu trong cơ chế điều hoà đƣờng huyết của cơ thể. Insulin là một trong những
hormon quan trọng của cơ thể, không chỉ tác dụng trên chuyển hoá năng
lƣợng và phát triển cơ thể, mà còn là chất cần thiết cho sự sống. Tác dụng của

3


insulin bao gồm các đáp ứng phức tạp mà ảnh hƣởng cuối cùng là trên chuyển
hoá glucid, lipid và protid.
+ Thuốc kích thích bài tiết insulin
Các sulfonylurea:

Năm 1942, Janbon đã tình cờ phát hiện tác dụng hạ đƣờng huyết của dẫn
suất sulfonamid (1154RP) ở những bệnh nhân điều trị sốt thƣơng hàn. Từ
phát hiện này, nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đƣờng huyết của các
sulfonylurea đã đƣợc tiến hành. Các nghiên cứu ngày càng làm sáng tỏ cơ
chế tác dụng của thuốc. Nhiều thuốc thuộc nhóm sulfonylurea đã ra đời, bao
gồm các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các thuốc thế hệ II
(Glyburide, Glypizide). Các thuốc này đang đƣợc sử dụng rộng rãi trên lâm
sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho ngƣời bệnh.
1.1.2.2. Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
Các biguanide:
Năm 1926, Frank và cộng sự đã tổng hợp synthalin từ nhân guanidin.
Chính các synthalin là tiền thân của các biguanid sau này.
Công thức chung:
R-NH-C-NH-C-NH2
NH

NH

Các thuốc thuộc nhóm biguanide bao gồm: metformin, phenformin và
buformin. Hiện nay metformin là thuốc đang đƣợc sử dụng phổ biến nhất, vì
ít gây tăng axit lactic trong máu hơn. Các biguanide là thuốc chống tăng
đƣờng huyết, không gây hạ đƣờng huyết. Thuốc tác dụng chủ yếu ngoài tuỵ,
không có tác dụng kích thích tế bào  tuyến tuỵ bài tiết insulin.

4


1.1.2.3. Thuốc chống tăng đường huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym glucosidase).
Acarbose:
Acarbose là thuốc ức chế enzym glucosidase của tế bào niêm mạc ruột.

Do tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm quá trình hấp thụ
tinh bột, dextran và các disaccharide ở ruột non, tránh đƣợc tình trạng tăng
đƣờng huyết sau ăn. Thuốc có tác dụng tốt cho cả 2 tuýp bệnh.
1.1.3. Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường.
Theo quan niệm của Đông y, bệnh thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba
triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều.
1.1.4. Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường.
Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đƣờng chủ yếu là các thuốc có
nguồn gốc từ dƣợc liệu nhƣ sinh địa (Rehmania glutinosa Libosch,
Scrophulariaceae), cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, Asteraceae), mƣớp đắng
(Momordica charantia L.Cucurbitaceae), hoàng kỳ (Astragalus
membranaceus, Fabaceae), huyền sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl,
Scrophulariaceae)...
1.2. Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng Metformin hydrochloride.
1.2.1. Tổng quan về Metformin hydrochloride
1.2.1.1. Công thức
- Công thức phân tử:C4H11N5.HCl
- Phân tử lƣợng: 165.6
- Tên khoa học: 1,1 - dimethyl biguanid hydrochloride
1.2.1.2. Tính chất lý hóa
- Tinh thể màu trắng;

5


- Tan nhiều trong nƣớc, ít tan trong ancol, thực tế không tan trong
acetone và dichloromethane;
- Điểm nóng chảy: 2250C – 2260C.
1.2.1.3. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng
Metformin là một thuốc chống tiểu đƣờng nhóm biguanid, có cơ chế

tác dụng khác với các thuốc tiểu đƣờng nhóm sulfunylure, metformin không
kích thích giải phóng insulin từ các tế bào tuyến tụy. Metformin không có tác
dụng hạ đƣờng huyết ở ngƣời bình thƣờng, metformin làm giảm sự tăng
đƣờng huyết nhƣng không gây tai biến hạ đƣờng huyết. Metformin làm giảm
nồng độ glucose trong huyết tƣơng cả khi đói và sau bữa ăn của ngƣời bệnh
tiểu đƣờng tuýp II.
Cơ chế tác dụng ngoại biên của metformin là:
- Làm tăng sử dụng glucose ở tế bào.
- Cải thiện liên kết của insulin với thụ thể.
- Ức chế tổng hợp glucose ở gan và làm giảm hấp thu glucose ở ruột.
- Ngoài ra, metformin phần nào còn ảnh hƣởng tốt trên chuyển hóa
lipoprotein, thƣờng bị rối loạn ở ngƣời bị đái tháo đƣờng không phụ thuộc
insulin.
1.2.1.4. Dược động học
- Hấp thu: Metformin hấp thu chậm và không hoàn toàn ở đƣờng tiêu
hóa, sinh khả dụng tuyệt đối của 500mg metformin uống lúc đói là 50 – 60%.
Thức ăn làm giảm mức độ và tốc độ hấp thu của metformin.
- Phân bố: Metformin liên kết với protein huyết tƣơng với mức độ
không đáng kể, thuốc phân bố nhanh chóng vào các mô và dịch, cả vào trong
hồng cầu.
- Chuyển hóa: Metformin không bị chuyển hóa ở gan.

6


- Thải trừ: Metformin chủ yếu đƣợc thải trừ qua ống thận (90%), không
thải trừ qua mật
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.
Tổng hợp metformin từ CaO, ure và dimethylamin. Quá trình tổng hợp
đƣợc đƣợc tiến hành qua 3 bƣớc [2]:

* Bƣớc 1: Tổng hợp calci cyanamide:
CaO  2 H 2 N  CO  NH 2  Ca ( NCO) 2  2 NH 3  H 2O

130  1800 C

Ca ( NCO) 2  2 H 2 N  CO  NH 2  Ca[ H ( NCO)3 ]+ NH 3

180  3000 C

3Ca[ H ( NCO)3 ]  3H 2O  Ca3[( NCO)]2  3 NH 3  3CO2

180  3000 C

3Ca[ H ( NCO)3 ]  3H 2O  Ca3[( NCO)3 ]2  3HNCO

300  5800 C

Ca3 [( NCO)3 ]2  3Ca( NCO) 2  3CaCN 2  3CO2

600  7500 C

Calci cyanamide

Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid
Calci cyanamide đƣợc tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ phản
ứng. Theo tác giả Ngô Quốc Huy, quá trình phản ứng thực hiện theo 2 giai
đoạn:
- Giai đoạn 1: Nung CaO và ure ở nhiệt độ 180-300oC
- Giai đoạn 2: Tiếp tục nung hỗn hợp trên ở nhiệt độ 750oC
*Bƣớc 2: Tổng hợp 1-cyanoguanidine :

Từ calci cyanamide đã đƣợc tổng hợp trong bƣớc 1, đem đun nóng trong
dung môi H2O nhận đƣợc 1-cyanoguanidin đƣợc mô tả trong sơ đồ sau:
CaCN2

+

H2O

700C
30 phút

H2N C NH CN
NH

+

2 Ca(OH)2

1-cyanoguanidine
Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine

7


Điều kiện phản ứng thích hợp tổng hợp 1-cyanoguanidine là ở nhiệt độ
70 oC trong khoảng thời gian 30 phút. Phản ứng rất dễ bị polyme hóa nên khó
tinh chế, hiệu suất phản ứng phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng . 1Cyanoguanidine đƣợc tổng hợp từ nguyên liệu rẻ nhƣ CaO và ure rất có ý
nghĩa, tuy nhiên quá trình phản ứng phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, đặc biệt
cần phải thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 7500C nên khó kiểm soát và ít có ý
nghĩa thực tiễn.

* Bƣớc 3: Tổng hợp metformin hydrochloride:
1-Cyanoguanidine đƣợc phản ứng với dimethylamin hydrochloride ở
nhiệt độ cao nhận đƣợc metformin hydrochloride. Quá trình phản ứng đƣợc
mô tả trong sơ đồ sau:
H2N C NH CN
NH

+

t0C

(CH3)2NH.HCl

NH CH
3
H2N C NH CN
CH3
NH

.HCl

metformin hydrochloride
Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride
Mặc dù phƣơng pháp tổng hợp metformin từ những nguyên liệu rẻ tiền
nhƣ: CaO, ure và dimethylamin nhƣng do phản ứng cần tiến hành ở nhiệt độ
cao nên tạo ra sản phẩm polyme và khó tinh chế dẫn đến khó áp dụng ở quy
mô lớn để tổng hợp 1-cyanoguianidine (tên khác là dicyano diamide).
1.2.3. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Metformin đƣợc mô tả năm 1957 nhƣ chất có hoạt tính hạ đƣờng huyết
và năm 1979 đƣợc đƣa ra thị trƣờng ở Pháp nhƣng đến tận 1994 mới đƣợc

FDA cho phép lƣu hành để chữa bệnh tiểu đƣờng tuýp 2 ở Mỹ [5].
Metformin hydrochloride (N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamide
hydrochloride) đƣợc tổng hợp bởi Shapiro và các cộng sự [12] bằng cách
cho dimethylamine hydrochloride phản ứng với dicyano diamide ở nhiệt độ

8


140oC (sơ đồ 1.4). Bằng con đƣờng này Shapiro và cộng sự đã tổng hợp đƣợc
hàng trăm dẫn chất biguanid. Các dẫn chất này đã đƣợc nghiên cứu hoạt tính
hạ đƣờng huyết.
H2N

H3C
NH.HCl
H3C

NH
NH
H3C
N C NH C NH2 .HCl
H3C

C N C N

H2N

1400C

metformin hydrochloride

Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro
Năm 2008, Anvar Shalmashi [13] đã đƣa ra phƣơng pháp mới để tổng
hợp metformin hydrochloride. Phản ứng điều chế metformin đƣợc thực hiện
trên bản mỏng điều chế và đƣợc đặt trong thiết bị microwave ở bƣớc sóng
540W trong 5 phút đạt hiệu suất 92%.
H3C
NH.HCl
H3C

H2N

NH
NH
H3C
N C NH C NH2 .HCl
H3C

C N C N

H2N
MW 5min, 540W

Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi
Gần đây đã có một số công trình nghiên cứu tạo các dẫn xuất của
metformin nhằm tăng hiệu quả sử dụng của nó trong điều trị bệnh tiểu đƣờng.
Kristiina và các cộng sự [8] đã tổng hợp đƣợc một số tiền chất của
metformin nhƣ mô tả trong sơ đồ 1.6 và sơ đồ 1.7. Các chất này có khả năng
tan tốt trong dầu và tăng khả năng hấp phụ trong ruột.
NH NH

NH NH2
S R
N

N

N
H

N

N
H

NH2

Sơ đồ 1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin

9


O
R-S-S-R

+

NH NH2

O

S R
N

N-Br

N-S-R

O

O

N

N
H

R=cyclohexan
R=Ph

Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin
Nhằm làm tăng hiệu quả sử dụng của metformin, Rao và các cộng sự
đã nghiên cứu tổng hợp các phức chất của metformin với Cu và Ni. Các phức
này đã đƣợc nghiên cứu hoạt tính hạ đƣờng huyết. Kết quả nghiên cứu cho
thấy các chất này có hoạt tính cao hơn nhiều so với metformin [11].
Kết quả nghiên cứu của Bentefrit và các cộng sự về tổng hợp phức chất
của metformin với platin cho thấy phức chất tetrachloro (metformin) platin
(IV) có hoạt tính kìm hãm sự tăng sinh của dòng tế bào ung thƣ P388 tƣơng
tự nhƣ Cis-platin [4].
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của metformin cho thấy, hợp chất
metformin không chỉ có tác dụng chữa bệnh tiểu đƣờng tuýp 2 rất hiệu quả

mà cũng có khả năng chống ung thƣ tuyến tụy, ung thƣ vú [3,6,7,9,10,14,15].
Từ các tƣ liệu đã có có thể thấy rằng con đƣờng tổng hợp metformin từ
dicyano diamide là khả thi. Tổng hợp theo con đƣờng này chỉ có một bƣớc
phản ứng không cần những hóa chất đắt tiền nên rất khả thi và có thể thực
hiện đƣợc ở quy mô pilot.
1.2.4. Các phương pháp nghiên cứu
1.2.4.1. Phương pháp sắc kí bản mỏng
Sắc kí bản mỏng đƣợc sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm.
Thông thƣờng sản phẩm với giá trị Rf khác nhau màu sắc và sự phát quang
khác nhau... Dùng sắc kí lớp mỏng để biết đƣợc phản ứng xảy ra, không xảy
ra, kết thúc phản ứng.

10


Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng gồm pha tĩnh là 1 lớp mỏng các chất hấp
phụ, thƣờng là silicagel 60F254, aluminum oxide đƣợc phủ trên một mặt
phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích đƣợc hòa tan trong
dung môi thích hợp và đƣợc hút lên sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí
nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.
Dùng mao quản chấm một vết nhỏ dung dịch nguyên liệu đầu, một
vệt là sản phản phản ứng khoảng 1cm từ dƣới lên. Bản sắc kí sau đó đƣợc
nhúng vào một hệ dung môi thích hợp n-hexan/EtOAc đƣợc đặt trong bình
triển khai. Dung môi đƣợc chuyển lên bản sắc kí gặp phải mẫu thử và dung
dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các chất với Rf khác nhau dịch chuyển
với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau với pha tĩnh và độ tan
khác nhau trong dung môi. Hợp chất có tính phân cực sẽ di chuyển lên cao
hơn trên bản sắc kí. Đối với những chất có UV ta kiểm tra UV có thể nhận
đƣợc các vết khác nhau. Dựa vào các vết trên bản mỏng cùng với giá thị Rf
tƣơng ứng ta có thể nhận biết đƣợc phản ứng đã xảy ra hay chƣa, nguyên

liệu đầu còn hay hết.
Dựa vào tính chất đó chúng ta có thể tìm đƣợc dung môi hoặc hỗn hợp
dung môi để các chất tách ra khỏi nhau (Rf khác nhau) tìm đƣợc hệ dung môi
cần để tinh chế các chất.
Có thể sử dụng một hỗn hợp hai dung môi. Trong hai dung môi đó một
dung môi có khả năng hòa tan tốt chất kết tinh còn dung môi kia thì ngƣợc lại
hoặc ít tan. Hỗn hợp hai dung môi này phải hòa tan vào nhau tạo thành một
dung dịch đồng nhất trong suốt.
Thông thƣờng một chất dễ hòa tan trong dung môi có cấu trúc hóa học
gần gũi. Ví dụ các este dễ hòa tan trong cồn hoặc trong etylaxetat. Các

11


hidrocacbon dễ tan trong benzen, ete, dầu, n-hexan. Thƣờng dung môi có
nhiệt độ sôi từ 600C - 800C là thích hợp.
1.2.4.2. Chiết
Chiết là quá trình tách và phân li các chất dựa vào quá trình chuyển một
chất hòa tan trong một pha lỏng (thƣờng là nƣớc) một pha lỏng khác không
hòa tan vào nó (thƣờng là dung môi hữu cơ không hòa tan với nƣớc). Nhƣ vậy
ta có quá trình chiết lỏng.
Chiết là phƣơng pháp có ứng dụng rất có hiệu quả vào các mục đích
tách, phân ly, làm giàu các chất đặc biệt khi cần tách một lƣợng nhỏ các tạp
chất ra khỏi một lƣợng lớn các chất khác.
Ƣu điểm của quá trình là thực hiện nhanh. Các thiết bị chiết đơn giản
chỉ là phễu chiết thƣờng ngƣời ta không cần thiết bị gì thêm. Chọn đƣợc dung
môi (dung môi chiết CH2Cl2) và điều kiện chiết thích hợp với chất thử ngƣời
ta có thể tách đƣợc bất kì cấu tử nào ra khỏi hỗn hợp bất kì. Trƣờng hợp chất
chiết có màu ta có thể sử dụng phần chiết vào mục đích phân tích định lƣợng
theo các phƣơng pháp đo quang.

1.2.4.3. Loại bỏ dung môi ở áp suất thấp
Dùng máy cất quay chân không. Sau khi loại bỏ dung môi để thu đƣợc
chất khô hoàn toàn ta dùng máy hút chân không hút làm khô chất.
1.2.4.4. Sắc kí cột
Nguyên tắc sắc kí cột dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau của các chất
thử đối với chất hấp phụ để tách các chất riêng ra. Nhƣng trong sắc kí cột,
chất làm nền cho pha cố định đƣợc nhồi trong ống hình trụ và vì thế mà gọi là
sắc kí cột. Với cột hấp phụ ngƣời ta có thể triển khai một dung môi liên tục,
hoặc một hệ thống các dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.

12


Dụng cụ chủ yếu là cột để nhồi chất hấp phụ để làm thành cột kí. Cột
có thể là những ống hình trụ dài 30 – 100cm, đƣờng kính từ 1 – 8cm tùy theo
chiều dài cột tỉ lệ giữa đƣờng kính.
1.2.4.5. Phương pháp nhồi cột huyền phù
Cột đem dùng phải thật sạch, khi đối với chất hấp phụ là nhôm oxit, có
thể dùng phƣơng pháp nhồi cột khô, nghĩa là lắp cột thẳng đứng, chắc chắn.
Đổ lƣợng Al2O3 qua phễu, theo một ống đổ vào đáy cột. Rót từ từ đều
đặn để tạo nên một cột liên tục đều đặn, bằng phẳng không có chỗ rỗng, chỗ
dày, chỗ mỏng sau khi rót hết chất nhồi vào cột ngƣời ta có thể dùng một đũa
thủy tinh đầu gắn với một nút cao su và gõ nhẹ đều vào thành cột cho đến khi
nhận đƣợc một chiều cao nhất định.
1.2.4.6. Phương pháp lựa chọn chất hấp phụ và dung môi chạy cột sắc kí
Chọn chất hấp phụ
Thông thƣờng ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel, ngoài ra còn dùng
Sephadex, sắc kí trao đổi ion.
Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí
Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel ta phải

dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bƣớc cơ bản sau:
 Hoà tan hoàn toàn một lƣợng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi
thích hợp.
 Chuẩn bị 4÷6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi
tấm với lƣợng tƣơng đƣơng nhau.
 Mỗi bản mỏng đƣợc chạy với loại dung môi có độ phân cực khác
nhau. Tiếp theo hiện hình dƣới đèn UV hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ
dễ dàng thấy đƣợc dung môi nào thích hợp. Từ kết quả đó tìm đƣợc hệ dung

13


môi (trong đó có một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, (ví
dụ n–hexan/EtOAc) phù hợp để chạy cột sắc kí.
 Với mẫu chất đƣợc chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ không
phân cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy
vết kém phân cực nhất lên Rf khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc kí là
dung môi đẩy vết phân cực nhất lên Rf khoảng 0,2 trên bản mỏng.
Sau khi chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp ta thực hiện chạy cột sắc kí
với hệ dung môi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực.
Chú ý:
 Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột giống nhau.
 Dung môi ban đầu chạy cột là dung môi phù hợp đã chọn đƣợc ở trên
nhƣng cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hơn một ít. Vì chất hấp phụ, ví dụ
nhƣ silicagel tráng trên bản mỏng có kích thƣớc nhỏ hơn, độ mịn và độ chặt
chẽ lớn hơn so với silicagel khi thực hiện chạy cột sắc kí.
 Đối với sắc kí cột Sephadex ta thƣờng dùng một dung môi là MeOH.
Tỉ lệ giữa lƣợng mẫu chất cần tách với kích thƣớc cột
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lƣợng
silicagel (chất hấp phụ) phải lớn hơn khoảng 25 – 50 lần khối lƣợng của mẫu

chất cần tách. Với mẫu chất cần tách là những hỗn hợp chất khó tách riêng thì
tỉ lệ này còn cao hơn (khoảng 100 – 200 lần).
Tỉ lệ giữa chiều cao lƣợng silicagel và đƣờng kính trong của cột sắc kí
Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt thì
chiều cao của silicagel trong cột và đƣờng kính trong của cột cần đạt tỉ lệ
khoảng 10:1.
Muốn biết lƣợng silicagel có phù hợp với cột hay không thì cho
silicagel dạng khô (chƣa có dung môi) vào cột để quan sát.
Cách nạp silicagel vào cột

14


Để việc tách chất đƣợc tốt, silicagel phải đƣợc nạp vào cột một cách
đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thƣờng. Silicagel đƣợc nạp vào cột
theo hai cách.
Nạp silicagen ở dạng sệt
Cố định cột trên giá. Nếu đầu ra của cột không có lớp thuỷ tinh xốp thì
ta cho một lớp bông mỏng vào đáy để ngăn không cho silicagel chảy xuống
bình hứng. Cho hệ dung môi chạy cột ban đầu vào bình đựng (cốc, ca nhựa).
Cân lƣợng silicagel cần thiết (đã tính toán xác định đƣợc ở trên) cho vào bình
đựng đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ và khuấy đều.
Lưu ý:
 Không nên thực hiện ngƣợc lại nghĩa là rót dung môi vào silicagel
bởi vì silicagel khi gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, không
đồng nhất.
 Lƣợng dung môi phải vừa đủ để hỗn hợp không đƣợc quá sệt khiến
bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không đƣợc quá lỏng.
 Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung
môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục đƣợc dùng để rót trở lại

đầu cột).
 Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lƣợng, vừa rót vừa gõ nhẹ
thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
 Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột
đƣợc đồng nhất.
Lưu ý:
 Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi
phủ trên phần đầu cột.
 Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng. Nếu mặt
thoáng chƣa phẳng ta có thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung môi sát mặt

15


thoáng làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho silicagel lắng xuống từ
từ tạo nên mặt thoáng bằng phẳng.
 Với sắc kí cột sephadex ta thao tác tƣơng tự nhƣng cần ngâm
sephadex với dung môi một thời gian để sephadex trƣơng nở trƣớc khi cho
vào cột.
Nạp silicagen ở dạng khô
 Cột đƣợc giữ thẳng đứng trên giá. Cho miếng bông nhỏ vào đáy cột
(nếu cột không có lớp thuỷ tinh xốp), rót dung môi chạy cột ban đầu vào
khoảng hai phần ba cột.
 Cho từ từ silicagel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa
gõ nhẹ thành cột. Khi lớp silicagel trong cột cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ
khoá và cho dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục đƣợc rót
trở lại đầu cột).
 Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua vài ba lần để cột đƣợc ổn
định trƣớc khi nạp mẫu vào.
 Thông thƣờng ngƣời ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt.

Cách nạp mẫu vào cột
Có hai phƣơng pháp nạp mẫu vào cột sắc kí là phƣơng pháp khô và
phƣơng pháp ƣớt.
* Phương pháp nạp cột khô:
Mẫu đƣợc nạp ở dạng khô. Thƣờng áp dụng cho trƣờng hợp mẫu chất
không tan hoặc tan kém trong dung môi chạy cột ban đầu. Cách chuẩn bị
mẫu: Hoà tan hoàn toàn mẫu trong dung môi thích hợp, cho một lƣợng
silicagel vừa đủ (lƣợng silicagel cho vào càng ít càng tốt, nhƣng phải đủ để có
thể cô quay mẫu đƣợc khô hoàn toàn) vào rồi đem cất quay đuổi dung môi
đến khô hoàn toàn. Lấy mẫu đã gắn đều trên silicagel ra, nghiền thành bột
mịn. Cột sau khi nạp silicagel đƣợc điều chỉnh lƣợng dung môi vừa đủ (đủ

16


thấm ƣớt mẫu khô cho vào). Cho mẫu vào cột qua phễu một cách từ từ để
silicagel đã đƣợc gắn đều mẫu thấm đều dung môi tránh tạo bọt khí và tránh
để mẫu bị vón cục.
* Phương pháp cột ướt:
Thƣờng áp dụng khi mẫu tan hoàn toàn trong dung môi chạy cột ban
đầu. Lƣợng dung môi dùng hoà tan mẫu càng ít càng tốt, vì lớp dung dịch này
sẽ dàn trải một lớp mỏng trên cột.
Có thể áp dụng tính toán cụ thể nhƣ sau: thể tích dung môi cần lấy để
hoà tan mẫu = 0,4.d2ml, với d là đƣờng kính trong của cột tính bằng mm.
Mẫu đƣợc cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet). Cho mẫu
chảy vào từ từ theo thành cột. Với phƣơng pháp nạp mẫu này chúng ta cho
dung môi trong cột chảy xuống sát bề mặt silicagel trong cột rồi khoá cột. Sau
đó, mở khoá để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silicagel. Cho từng lƣợng nhỏ
dung môi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề mặt silicagel trong cột và rửa sạch
thành cột rồi tiến hành chạy cột (để lớp mẫu chất chảy xuống đƣợc đồng đều).

1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ
Cấu trúc của chất phân lập ra đƣợc xác định bằng sự kết hợp của nhiều
phƣơng pháp khác nhau. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất
mà ngƣời ta sử dụng các phƣơng pháp khác nhau. Cấu trúc càng phức tạp thì
yêu cầu phối hợp các phƣơng pháp càng cao.
1.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)
Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan
trọng. Thông thƣờng việc phân tích đầu tiên sau khi thu đƣợc một sản phẩm
kết tinh là việc xác định điểm chảy vì đó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ
tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lƣợng rất ít mẫu thử.
Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu đƣợc qua hai lần kết tinh chỉ
chênh lệch nhau không quá 0,50C thì có thể xem sản phẩm kết tinh là tinh

17


khiết. Khi điểm chảy xác định đƣợc, đối chiếu với tài liệu tham khảo để có thể
đƣa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu.
1.3.2. Độ quay cực ([α]D)
Ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trƣờng bất đẳng hƣớng, trong điều
kiện nhất định nào đó, do tác dụng của môi trƣờng làm cho cƣờng độ điện
trƣờng chỉ còn dao động theo một phƣơng nhất định đƣợc gọi là ánh sáng
phân cực thẳng hay ánh sáng phân cực toàn phần.
Mặt phẳng chứa tia sáng và phƣơng dao động của vectơ điện trƣờng
đƣợc gọi là mặt phẳng dao động, còn mặt phẳng chứa tia sáng và vuông góc
với mặt phẳng dao động gọi là mặt phẳng phân cực.
Khi cho ánh sáng phân cực thẳng đi qua dung dịch một chất quang hoạt
thì mặt phẳng phân cực sẽ bị quay một góc α. Tuỳ theo chất quang hoạt mà
góc quay này có thể sang phải (+) hay sang trái (-). Độ lớn củakk góc quay α
phụ thuộc vào nồng độ C (g/100ml dung dịch), chiều dài lớp dung dịch (dung

môi) l, nhiệt độ t và chiều dài sóng λ:

1.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(Nuclear Magnetic Resonancespectroscopy, NMR)
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phƣơng pháp phổ hiện đại và hữu
hiệu nhất hiện nay đƣợc dùng để xác định cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ
nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ
thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định
chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý
chung của các phƣơng pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng
hƣởng ở các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dƣới tác dụng của
từ trƣờng ngoài. Các tần số cộng hƣởng khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng độ

18