Nghiên cứu và chế tạo hạt nano chitosan gắn peg bọc insulin ứng dụng điều trị bệnh tiểu đường

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
PTN CÔNG NGHỆ NANO

LÊ THỊ NỮ THANH

NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO HẠT NANO CHITOSAN GẮN PEG
BỌC INSULIN ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Thành phố Hồ Chí Minh - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
PTN CÔNG NGHỆ NANO

LÊ THỊ NỮ THANH

NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO HẠT NANO CHITOSAN GẮN PEG
BỌC INSULIN ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG
Chuyên ngành:

Vật liệu và Linh kiện Nanô

(Chuyên ngành đào tạo thí điểm)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS ĐẶNG MẬU CHIẾN

Thành phố Hồ Chí Minh - 2015


Luận Văn Thạc Sĩ

i

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày 12

tháng 7 năm 2015

BẢN XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA CÁC THIẾU SÓT CỦA LUẬN VĂN
Trường Đại học Công nghệ đã có Quyết định số 399/QĐ-ĐT ngày 19 tháng 6
năm 2015 về việc thành lập Hội đồng chấm luận văn Thạc sĩ cho học viên Lê Thị Nữ
Thanh, sinh ngày 29/05/1987, tại Bình Thuận, chuyên ngành Vật Liệu và Linh Kiện

Nano, ngành ……………………..
Ngày 26 tháng 6 năm 2015, Trường Đại học Công nghệ (ĐHCN) đã tổ chức cho
học viên bảo vệ luận văn Thạc sĩ trước Hội đồng chấm (có biên bản kèm theo). Theo
Quyết nghị của Hội đồng chấm luận văn Thạc sĩ, học viên phải bổ sung và sửa chữa
các điểm sau đây trước khi nộp quyển luận văn cuối cùng cho Nhà trường để hoàn
thiện hồ sơ sau bảo vệ:
1. …..
2. …..
3. …..
Ngày 12 tháng 7 năm 2015, học viên đã nộp bản luận văn có chỉnh sửa. Chúng
tôi nhận thấy rằng nội dung, hình thức của luận văn và tóm tắt luận văn đã được sửa
chữa, bổ sung theo các điểm trên của Quyết nghị.
Đề nghị Trường Đại học Công nghệ, ĐHQG HN cho phép học viên được làm
các thủ tục khác để được công nhận và cấp bằng Thạc sĩ.
Xin trân trọng cảm ơn!
XÁC NHẬN CỦA THÀNH VIÊN HỘI ĐỒNG/HỘI ĐỒNG
ĐỀ NGHỊ HỌC VIÊN SỬA CHỮA LUẬN VĂN

HỌC VIÊN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

XÁC NHẬN CỦA
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Lê Thị Nữ Thanh

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

PGS.TS Đặng Mậu Chiến

Luận Văn Thạc Sĩ

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

ii

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến


Luận Văn Thạc Sĩ

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

iii

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến


Luận Văn Thạc Sĩ

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

iv

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến


Luận Văn Thạc Sĩ

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

v

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến


Luận Văn Thạc Sĩ

vi

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Lê Thị Nữ Thanh, học viên cao học chuyên ngành Vật liệu và Linh kiện Nano
thuộc chương trình liên kết giữa Trường Đại học Công nghệ - ĐHQG Hà Nội và
Phòng Thí nghiệm Công nghệ Nano (LNT) - ĐHQG TP. HCM. Tôi đã thực hiện đề tài
thạc sĩ “Nghiên cứu và chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin ứng dụng trong
điều trị bệnh tiểu đường” tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ Nano (LNT) - ĐHQG
TP. HCM với sự hướng dẫn của PGS.TS. Đặng Mậu Chiến.
Tôi xin cam đoan những kết quả ghi nhận trong luận văn là hoàn toàn trung thực và
chưa có trong các công trình nào khác mà tôi không tham gia.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 05 năm 2015

Lê Thị Nữ Thanh

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

Luận Văn Thạc Sĩ

vii

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn đến Quý Thầy Cô giáo viên cho tôi
những kiến thức khoa học quý giá trong quá trình giảng dạy suốt những năm học qua.
Tôi đặc biệt cảm ơn Thầy PGS.TS. Ðặng Mậu Chiến - Giám đốc Phòng Thí nghiệm
Công nghệ Nano (LNT) - đã quan tâm tiếp nhận và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất
giúp tôi thực hiện Luận văn này.
Xin trân trọng cảm ơn ThS. Hồ Thanh Hà đã luôn theo sát, hướng dẫn cho tôi trong
suốt quá trình làm các thí nghiệm nghiên cứu, cho tôi những ý kiến đóng góp và cùng
tôi thảo luận những vấn đề liên quan đến Luận văn này.
Xin trân trọng cảm ơn các anh, chị, em, bạn bè đồng nghiệp tại Phòng Thí nghiệm
Công nghệ Nano (LNT) - ĐHQG TP. HCM đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá
trình tôi làm Luận văn.
Sau cùng, xin cám ơn các bạn lớp Cao học “Vật liệu và Linh kiện Nano” Khóa 8 đã
cùng tôi trao đổi và giải quyết những thắc mắc giúp tôi hoàn thành Luận văn.
Xin trân trọng cảm ơn!
Tp. Hồ Chí Minh, 25 ngày tháng 05 năm 2015

Lê Thị Nữ Thanh

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh


Luận Văn Thạc Sĩ

viii

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... vii
MỤC LỤC ............................................................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................... xi
DANH SÁCH CÁCHÌNH ....................................................................................... xii
DANH SÁCH CÁC BẢNG..................................................................................... xiv
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT ............................................................ 4
1.1 Công nghệ nano dược ......................................................................................... 4
1.1.1 Các thuốc tạo bởi công nghệ nano ................................................................ 4
1.1.2 Hệ dẫn thuốc nano ........................................................................................ 4
1.2 Bệnh tiểu đường ................................................................................................... 5
1.2.1 Giới thiệu về bệnh tiểu đường ....................................................................... 5
1.2.2 Phân loại bệnh đái tháo đường ...................................................................... 5
1.2.3 Điều trị bệnh ĐTĐ ........................................................................................ 6
1.3 Tổng quan về insulin ............................................................................................ 6
1.3.1 Sơ lược về ra đời của insulin......................................................................... 6
1.3.2 Cấu trúc insulin ............................................................................................ 7
1.3.3 Vai trò của insulin ........................................................................................ 8
1.4 Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 9
1.5 Hệ tải thuốc nano chitosan gắn mPEG ............................................................. 10
1.5.1 Giới thiệu về vật liệu chitosan .................................................................... 10
1.5.1.1 Cấu trúc của chitosan ................................................................... 10
1.5.1.2 Tính chất của chitosan .................................................................. 10
1.5.1.3 Ứng dụng của chitosan.................................................................. 11

1.5.2 Giới thiệu về nano chitosan ........................................................................ 11

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh


Luận Văn Thạc Sĩ

ix

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

1.5.3 Giới thiệu về TPP ....................................................................................... 13
1.5.4 Giới thiệu về mPEG.................................................................................... 14
1.5.5 Giới thiệu về chitosan gắn mPEG ............................................................... 15
1.6 Các phương pháp chế tạo nano chitosan .......................................................... 15
1.6.1 Phương pháp khâu mạch nhũ tương ............................................................ 16
1.6.2 Phương pháp giọt tụ/kết tủa ........................................................................ 17
1.6.3 Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương ........................................................ 17
1.6.5 Phương pháp mixen đảo ............................................................................. 19
1.7 Các thiết bị phân tích lý hóa[2] ......................................................................... 19
1.7.1 Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM ......................................................... 19
1.7.2 Thiết bị đo phổ truyền qua UV-Vis ............................................................. 20
1.7.3 Máy đo phổ hồng ngoại(IR) ........................................................................ 21
1.7.4 Máy phân tích kích thước hạt (particle size analysis) .................................. 22
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .............................................................................. 23
2.1 Hóa chất và dụng cụ- thiết bị ............................................................................ 23
2.1.1 Hóa chất ..................................................................................................... 23
2.1.2 Dụng cụ ...................................................................................................... 24
2.2 Phương pháp ...................................................................................................... 24
2.2.2 Quy trình tổng hợp gắn PEG lên chitosan .................................................. 24

2.2.2.1 Giai đoạn 1 ................................................................................... 24
2.2.2.2 Giai đoạn 2 ................................................................................... 25
2.2.2.3 Giai đoạn 3 ................................................................................... 26
2.2.3 Chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulin ................................................... 27
2.2.3.1 Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG.............................................. 27
2.2.3.2 Chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc Insulin .................................... 28
2.2.4 Hiệu suất bao thuốc .................................................................................... 30

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh


Luận Văn Thạc Sĩ

x

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

2.2.4.1 Dựng đường chuẩn nồng độ Insulin bằng UV-Vis ......................... 30
2.2.4.2 Xác định hiệu suất bao gói của hạt nano chitosan gắn PEG bọc
insulin bằng túi thẩm tách cellulose .......................................................... 31
2.2.4.3 Khả năng phóng thích ................................................................... 31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 33
3.1 Kết quả phản ứng tổng hợp gắn PEG lên chitosan .......................................... 33
3.1.1 Phản ứng bảo vệ nhóm chức amin của chitosan .......................................... 33
3.1.2 Phản ứng gắn PEG lên chitosan .................................................................. 34
3.1.3 Phản ứng hủy bảo vệ nhóm chức amin của chitosan ................................... 35
3.2 Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG ................................................................. 36
3.2.1 Kết quả chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG qua phổ hồng ngoại FTIR ....... 37
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan gắn PEG ................................... 38
3.2.3 Khảo sát độ ổn định của hạt nano chitosan.................................................. 40

3.3 Chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulin ........................................................ 42
3.4 Xác định hiệu suất bao gói và khả năng phóng thích ....................................... 43
3.4.1 Xác định hiệu suất bao gói bằng túi thẩm tách cellulose ............................. 43
KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN ............................................................... 46
A .Kết luận ............................................................................................................... 46
A1. Những công việc đã thực hiện....................................................................... 46
A2.Những kết quả đã đạt được ............................................................................ 46
B.Hướng phát triển .................................................................................................. 48
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 52
Phụ lục 1: Danh mục các công trình liên quan được công bố................................ 52
Phụ lục 2: Toàn văn các bài báo liên quan được công bố ...................................... 52

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh


Luận Văn Thạc Sĩ

xi

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ĐHQG TP. HCM

Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.

TEM

Transmission Electron Microscope - Kính hiển vi điện tử truyền
qua

UV-Vis

Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến

DLS

Phương pháp phân tích kích thước hạtbằng pp tán xạ ánh sáng
(Dynamic Light Scattering)

FTIR

Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại

CTS

Chitosan

mPEG

Methoxypolyethylene glycol amine

TPP

Tripolyphosphate

MeOH

Methanol

Et3N

Triethylamine

TsCl

p- Toluenesulfony chloride

Nước DI

Deionized water

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh


Luận Văn Thạc Sĩ

xii

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

DANH SÁCH CÁCHÌNH
Hình 1.1: Biến chứng của bệnh tiểu đường .................................................................. 5
Hình 1.2: Loại thuốc điều trị bệnh tiểu đường được 2 nhà sinh lý học người Canada là
Fred Bangting và Charles Best tìm ra năm 1922. ......................................................... 7
Hình 1.3: Cấu trúc phân tử insulin ............................................................................... 8
Hình 1.4: Cấu trúc của chitin và chitosan ................................................................... 10
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Sodium Tripolyphosphate và PGA ........................... 13
Hình 1.6: Sự tương tác giữa chitosan và tác nhân liên kết ngang ................................ 14
Hình 1.7: Cấu trúc mPEG .......................................................................................... 15

Hình 1.8: Một trong những cơ chế gắn mPEG lên chitosan ........................................ 15
Hình 1.9: Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương .............................. 16
Hình 1.10: Sơ đồ chế tạo bằng phương pháp giọt tụ ................................................... 17
Hình 1.11: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương .................. 18
Hình 1.12: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion ....................................... 18
Hình 1.13: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo ....................................... 19
Hình 1.14: Máy TEM JEM 1010 ............................................................................... 20
Hình 1.15: Máy đo phổ truyền qua UV-Vis, cary 100 Conc ....................................... 20
Hình 1.16: Máy đo phổ IR Tensor TM 37 .................................................................. 21
Hình 1.17:Dao động hoá trị và dao động biến dạng ................................................... 21
Hình 1. 18:Máy phân tích kích thước hạt. .................................................................. 22

Hình 2.1: Sơ đồ phản ứng bảo vệ nhóm chức amin .................................................... 25
Hình 2.2: Phản ứng bảo vệ gốc amin ......................................................................... 25
Hình 2.3: Sơ đồ phản ứng gắn PEG ........................................................................... 26
Hình 2.4: Phản ứng gắn PEG .................................................................................... 26
Hình 2.5: sơ đồ phản ứng hủy bảo vệ phản ứng gốc amin của chitosan ...................... 27
Hình 2.6: Phản ứng hủy bảo vệ gốc amin .................................................................. 27
Hình 2.7: Sơ đồ chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG ................................................... 28
Hình 2.8: sơ đồ chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulin .......................................... 29
Hình 2.9: Phản ứng chế tạo hạt cts gắn PEG bọc insulin ............................................ 29

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh


Luận Văn Thạc Sĩ

xiii

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

Hình 2.10: Phổ hấp thu UV-Vis của Insulin tại các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 75
µg/ml ......................................................................................................................... 30
Hình 2.11: Đồ thị đường chuẩn dung dịch insulin tại bước sóng 276nm .................... 31

Hình 3.1: Phổ hồng ngoại (FTIR) của chitosan trước và sau khi bảo vệ nhóm chức
amin .......................................................................................................................... 34
Hình 3.2 : Phổ hồng ngoại (FTIR) của chitosan trước và sau khi gắn PEG................. 35
Hình 3.3: Phổ hồng ngoại (FTIR) của chitosan, PEG và chitosan sau khi gắn PEG.... 36
Hình 3.4: Phổ hồng ngoại FTIR của TPP và hạt chitosan gắn PEG-TPP .................... 37
Hình 3.5: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 1:1 (w/w) .. 38
Hình 3.6: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 2:1 (w/w) .. 39
Hình 3.7: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 4:1 (w/w) .. 39
Hình 3.8: Ảnh của các dung dịch pha theo tỉ lệ chitosan gắn PEG:TPP lần lượt là 1:1,
2:1, 4:1 ...................................................................................................................... 40
Hình 3.9: Ảnh kích thước hạt của hạt nano chitosan gắn PEG theo thời gian theo bảng
3.1 ............................................................................................................................. 41
Hình 3.10: Ảnh của mẫu pha theo tỉ lệ 1:1 (w/w) sau 4 tuần ...................................... 42
Hình 3.11: Ảnh phổ DLS của hạt chitosan gắn PEG –TPP(a) và hạt chitosan gắn PEG
bọc insulin(b)............................................................................................................. 42
Hình 3.12: Ảnh TEM của hạt nano chitosao gắn PEG (a) và hạt chitosan gắn PEG bọc
insulin (b) .................................................................................................................. 43
Hình 3.13: Phổ UV-Vis của dung dịch ngoài túi thẩm tách trước và sau khi hiệu chỉnh
nồng độ...................................................................................................................... 44
Hình 3.14: Đồ thị nội suy giá trị nồng độ Insulin trong dung dịch mẫu sau khi hiệu
chỉnh .......................................................................................................................... 44
Hình 3.15: Khả năng phóng thích của insulin theo thời gian ...................................... 45

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

Luận Văn Thạc Sĩ

xiv

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm ............................................................ 23
Bảng 2.2: Phương pháp xây dựng đường chuẩn ........................................................ 30

Bảng 3.1: Kết quả sự ổn định của kích thước hạt theo thời gian ................................. 41

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh


Luận Văn Thạc Sĩ

1

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

MỞ ĐẦU
Ngày nay, với sự phát triển trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khỏe con người, nhiều
công nghệ mới đã được sử dụng rộng rãi mà tiêu biểu là ứng dụng của công nghệ nano
vào quá trình tổng hợp những chất dẫn thuốc mới, tạo ra những sản phẩm tốt hơn,
ngày càng đáp ứng được những yêu cầu cao trong lĩnh vực điều trị bệnh, sản phẩm tạo
ra có đặc tính phân hủy sinh học và không gây hại cho sức khỏe con người.
Với sự phát triển như vũ bão về kinh tế làm cho chất lượng cuộc sống ở nước ta cải
thiện rất nhiều. Tuy vậy, chính sự phát triển nhanh chóng kéo theo sự tăng lên đột biến

một số bệnh mang đặc thù của những nền kinh tế phát triển như: bệnh tiểu đường,
bệnh gút, bệnh rối loạn chuyển hóa lipid… Trong đó bệnh tiểu đường nằm trong nhóm
bệnh rối loạn chuyển hóa đang trở nên phổ biến và là vấn đề y tế nhức nhối hiện nay.
Hiện nay, hầu hết việc điều trị bệnh đái tháo đường được thực hiện bằng cách tiêm
insulin vào cơ thể mỗi ngày. Việc tiêm insulin vào cơ thể được cho là gây nhiều đau
đớn và nguy cơ nhiễm trùng. Các nhà khoa học của nhiều nước trên thế giới đã tích
cực nghiên cứu vấn đề này nhưng chưa đạt được kết quả như ý. Insulin bản thân là một
protein bị phân hủy nhanh chóng trong thành ruột bởi các men tiêu hóa và môi trường
pH thấp. Điều này cản trở việc đưa insulin vào cơ thể bằng đường uống. Viên uống
insulin có thể giúp bệnh nhân tiểu đường uống thuốc dễ dàng mà không cần phải tiêm.
Nhờ lớp vỏ bọc, chất insulin được bảo vệ cho đến khi tiếp cận ruột non và được hấp
thụ vào máu chứ không bị hủy hoại bởi axit ở miệng, họng và dạ dày. Cho đến hiện tại
chỉ có thuốc tiêm insulin, một số ít có dạng khác như hít, dán…. Chính vì vậy, lĩnh
vực thuốc uống insulin thu hút rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học.
Chitosan là một trong những polymer được ứng dụng rộng rãi trong quá trình truyền
dẫn thuốc. Việc dẫn truyền thành công những loại thuốc như protein, insulin,….. là
một trong những chủ đề được nhiều nghiên cứu nhiều năm nay trong ngành dược.
Trong số những phương pháp dẫn truyền khác nhau, dẫn truyền đường uống là cách
dẫn truyền thuận tiện nhất, đặc biệt khi quá trình điều trị bệnh kéo dài. Hơn nữa với hệ
tải này, còn có khả năng giúp quá trình tải thuốc chậm hơn, tăng khả năng hấp thụ
insulin vào trong máu, từ đó tăng khả năng trị bệnh tiểu đường của thuốc.
Những hạt chitosan gắn mPEG (Methoxypolyethylene glycol amine), là một polymer
được sử dụng rất phổ biến cho việc gắn lên bề mặt hạt nano với vai trò làm giảm sự
HVCH: Lê Thị Nữ Thanh


Luận Văn Thạc Sĩ

2

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

đào thải của cơ thể đối với thuốc. Cấu trúc phân tử mPEG khá đơn giản và linh động.
mPEG gắn lên bề mặt hạt có vai trò tăng tính ái nước và ái hữu cơ, tính mềm dẻo và
tính tương thích sinh học và kéo dài thời gian phân hủy thuốc của hạt. Những hạt này
gây chú ý bởi khả năng dẫn thuốc và khả năng hòa tan thuốc vào cơ thể, vì chúng có
khả năng bảo vệ insulin khỏi sự phân hủy của enzyme trong có trong đường ruột. Do
kích thước nhỏ, những hạt này có tác dụng thấm sâu vào cơ thể, nâng cao hiệu quả trị
bệnh tiểu đường[3].
Mục đích của đề tài đề tài luận văn luận văn thạc sĩ ‘‘ Nghiên cứu chế tạo hạt nano
chitosan gắn PEG bọc insulin ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường’’ là tạo ra
một hệ dẫn thuốc insulin-chitosan-PEG thành công. Việc nghiên cứu này sẽ tạo ra một
tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo, nhằm mục đích năng cao hiệu quả dẫn thuốc, tạo
ra một tiềm năng to lớn cho việc sản sản xuất thuốc insulin dùng cho đường uống bởi
thị trường này vẫn chưa mở rộng. Đây là một lĩnh vực mới mở ra nhiều ứng dụng sau
này, ví dụ như việc bọc các loại thuốc khác, ví dụ như vaccine…, góp phần nâng cao
sức khỏe cộng đồng.
Vì vậy, đề tài luận này nhằm xây dựng hệ dẫn thuốc thu được hạt nano chitosan gắn
PEG có kích thước nhỏ, dưới 500 nm, hạt đồng đều, có khả năng dẫn insulin hiệu quả
nhằm ứng dụng trong dẫn truyền thuốc.
 Mục tiêu đề tài
Nghiên cứu quy trình tổng hợp hạt nano chitosan bằng phương pháp kết tủa-bay hơi
dung môi, để hình thành các hạt nano chitosan, từ đó tìm ra quy trình thích hợp cho
việc gắn polyethylen glycol. Với mục đích tạo ra các hạt nano chitosan gắn PEG tải
insulin ứng dụng cho việc điều trị bệnh tiểu đường. Với việc nghiên cứu thành công hệ
dẫn thuốc insulin-chitosan-PEG sẽ tạo ra một tiềm năng lớn cho việc sản xuất thuốc
uống insulin cho thị trường dược phẩm hiện nay.

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

Luận Văn Thạc Sĩ

3

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

Nội dung nghiên cứu của đề tài:
 Nội dung của đề tài bao gồm lời mở đầu, 3 chương kết luận và hướng phát
triển:
-Lời mở đầu: Mục đích nghiên cứu và hướng ứng dụng, phát triển của hạt nano
chitosan trong việc điều trị bệnh tiểu đường và trong ngành dược phẩm.
-Chương 1: Giới thiệu về nano dược hiện nay, các khái niệm về chitosan, nano
chitosan, insulin và bệnh tiểu đường, đồng thời giới thiệu khát quát về các phương
pháp chế tạo hạt nano chitosan, và các phương pháp đo đạc khi thí nghiệm.
-Chương 2: Trình bày quy trình chế tạo hạt nano chitosan, quy trình gắn PEG lên
nano chitosan và quy trình tải insulin vào hạt PEG gắn chitosan. Trong phần này cũng
giới thiệu các thiết bị và hóa chất dùng trong thí nghiệm.
-Chương 3: Trình bày kết quả nghiên cứu và đánh giá kết quả của các mẫu thí nghiệm
được chế tạo bằng hai phương pháp trên. So sánh kết quả phân tích kích thước hạt
(DLS), cùng với phương pháp phân tích phổ hồng ngoại(FTIR) và kính hiển vi điện tử
truyền qua (TEM) của các mẫu thí nghiệm, chúng tôi kết luận rằng đã chế tạo thành
công các hạt nano chitosan gắn PEG và thực hiện được quy trình tải insulin lên các hạt
chitosan gắn PEG có hình dạng rõ và kích thước ổn định theo thời gian tốt.
-Cuối cùng là phần Kết Luận và hướng phát triển, chúng tôi nêu lên những công
việc đã được thực hiện trong quá trình nghiên cứu và những kết quả nổi bật của luận
văn. Ngoài ra, hướng nghiên cứu phát triển tương lai của đề tài cũng được đề xuất.

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

Luận Văn Thạc Sĩ

4

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

CHƯƠNG 1: NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT
1.1 Công nghệ nano dược
Rất nhiều nghiên cứu đang được tiến hành nhằm ứng dụng công nghệ nano trong lĩnh
vực điều trị. Với kích thước siêu nhỏ, các hạt nano chỉ có thể cấu tạo từ một số rất it
các phân tử, khi kích thước của nguyên liệu giảm xuống dưới 100nm, vật chất sẽ thể
hiện bản chất của vật lý lượng tử với những đặc tính hoàn toàn mới. Ví dụ, vật chất có
thể mạnh hơn, nhẹ hơn và có độ hòa tan cao, ít hút ẩm, nói chung là thể hiện đặc tính
hóa lý hoàn toàn mới. Ngày nay, nhân loại hoàn toàn có thể, với công nghệ nano, tạo
ra nhiều vật liệu, thiết bị và cấu trục hoàn toàn mới. [8],[7]
Trong nghành nano dược, các sản phẩm ứng dụng công nghệ nano có thể phân thành 2
lĩnh vực chính: các thuốc tạo ra bởi công nghệ nano và hệ dẫn thuốc nano.[8]
1.1.1 Các thuốc tạo bởi công nghệ nano
Các nhà khoa học dược đã điều khiển các phân tử thuốc để tạo ra những đặc tính vật lý
mong muốn thông qua quá trình kết tinh, muối hóa hoặc sử dụng các phân tử nước của
dạng kết tinh. Nhờ vậy, các phân tử thuốc trở nên bền vững hơn về mặt hóa học, có
nhiều ưu việt hơn cho mục đích chế dược học, tăng sinh khả dụng hoặc tăng hiệu quả
điều trị.[8]
1.1.2 Hệ dẫn thuốc nano
Công nghệ nano đã tạo ra hàng loạt hệ vật chất có kích thước từ vài nanomet tới vài
trăm nanomet được sử dụng để vận chuyển dược chất đến các bộ phận trong cơ thể với
liều lượng thích hợp và theo đúng thời gian mong muốn, nói tóm lại là đảm bảo 3 yếu
tố góp phần tạo nên tính an toàn và hiệu quả của thuốc: đúng nơi, đúng lúc và đúng
liều. Các dược chất hoặc tác nhân chẩn đoán sẽ được đưa vào bên trong, liên kết hóa

học hoặc gắn vào bề mặt của các hạt. Hệ vận chuyển thuốc tiêu biểu có nhiều triển
vọng nhất là dạng thuốc liposome.[9]
 Tóm lại, các dược phẩm công nghệ nano và rộng hơn nữa là sản phẩm công
nghệ nano sử dụng trong chẩn đoán, phòng ngừa, điều trị bệnh, nâng cao chất
lượng sống con người ( ví dụ như mỹ phẩm, dược phẩm…) đã và đang góp
phần không những cho cuộc sống con người mà còn tạo ra những chuyển biến
lớn cho các ngành sản xuất.

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh


Luận Văn Thạc Sĩ

5

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

1.2 Bệnh tiểu đường
1.2.1 Giới thiệu về bệnh tiểu đường
Đái tháo đường, còn gọi là bệnh tiểu đường hay còn gọi là bệnh dư đường, là một
trong những nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbonhidrat khi hoóc môn insulin của
tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong
máu luôn cao; trong giai đoạn mới phát bệnh, nó thường làm bệnh nhân đi tiểu
nhiều,tiểu ban đêm và do đó làm khát nước. Bệnh tiểu đường là một trong những bệnh
hiểm nghèo, nó gây ra nhiều biến chứng cho bệnh nhân sau này như: bệnh tim mạch,
tai biến mạch máu não, suy thận, mù mắt,…..[6].

Hình 1.1: Biến chứng của bệnh tiểu đường

Theo thống kê của tổ chức Y Thế Giới (WHO), đái tháo đường (ĐTĐ) xếp thứ 9 trong

những bệnh có khả năng gây ra tử vong ở người và là một trong những bệnh có tốc độ
người mắc bệnh tăng nhanh nhất. Ước tính trong năm 2011, ĐTĐ đã lấy đi sinh mệnh
của hơn 1 triệu người, và dự đoán đến năm 2030 trên toàn cầu có thể có tới hơn 336
triệu người mắc bệnh ĐTĐ. Nguyên nhân chính gây ra con số tử vong lớn như vậy là
do khả năng gây biến chứng thành những bệnh như tai biến mạch máu não, suy thận,
hoại tử chi, nhiễm khuẩn,…..[6].
1.2.2 Phân loại bệnh đái tháo đường
Dựa vào các dạng rối loạn hoạt động của insulin, người ta chia bệnh ĐTĐ ra thành 2
type chính:
- ĐTĐ loại 1: các tế bào beta tại tuyến tụy không đủ hoặc không tiết insulin. Type 1
chiếm khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường, phần lớn xảy ra ở trẻ
em và tuổi thiếu niên. Các triệu chứng thường khởi phát đột ngột và tiến triển nhanh

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh


Luận Văn Thạc Sĩ

6

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

nếu không điều trị. Giai đoạn toàn phát có tình trạng thiếu insulin tuyệt đối gây tăng
đường huyết và nhiễm Ceton. Những triệu chứng thường thấy của bệnh ĐTĐ type 1
như: ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhiều, mờ mắt, dị cảm và sụt cân, trẻ em
chậm phát triển và dễ bị nhiễm trùng.
- ĐTĐ loại 2: xảy ra tình trạng kháng insulin, khi được tiết vào máu, insulin không
thực hiện được chức năng của mình do hoạt động của các tác nhân kháng insulin.
Thường gặp ở người trưởng thành và chiếm phần lớn trong trường hợp bệnh ĐTĐ. Đối
với bệnh ĐTĐ type 2, bệnh nhân thường ít có triệu chứng và thường chỉ phát hiện bởi

các triệu chứng của biến chứng, hoặc chỉ được phát hiện tình cờ khi đi xét nghiệm
máu…..
1.2.3 Điều trị bệnh ĐTĐ
Insulin được chỉ định dùng cho bệnh nhân ĐTĐ loại 1, nó chỉ dùng cho bệnh nhân
ĐTĐ loại 2 khi đã thay đổi chế độ ăn, luyện tập và dùng các loại thuốc điều trị ĐTĐ
tổng hợp mà không đạt hiệu quả.
Tuy nhiên, việc điều trị bệnh ĐTĐ bằng cách dùng insulin là một quá trình không dễ
chịu đối với người bệnh, vì:
 Việc tiêm insulin tùy tình trạng bệnh nhưng hầu hết đều phải tiến hành mỗi
ngày, trước mỗi bữa ăn. Điều này gây bất tiện cho người bệnh.
 Việc tiêm lâu dài khiến cho chỗ tiêm bị bầm tím, cứng lại.
1.3 Tổng quan về insulin
1.3.1 Sơ lược về ra đời của insulin
Bệnh tiểu đường từng được biết đến từ thời cổ đại. Những tài liệu cổ của người Ai Cập
từ 1500 năm trước Công nguyên đã mô tả một bệnh suy mòn với tình trạng nước tiểu
có vị ngọt[25]. Từ những năm 1850 trở đi, các cuộc khám nghiệm tử thi bệnh nhân bị
tiểu đường đã gợi ý, bệnh xuất hiện là do tuyến tụy không bảo đảm được chức năng
bình thường. Nhiều bác sĩ cho rằng tế bào biệt hóa, được gọi là tiểu đảo Langerhan,
sản sinh ra một hóa chất giúp cơ thể điều hòa nồng độ đường trong máu. Bệnh tiểu
đường xuất hiện khi hóa chất này không được sản sinh.

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh


Luận Văn Thạc Sĩ

7

CBHD: PGS.TS Đ
Đặng Mậu Chiến

Hình 1.2: Loại thuốc điều trị bệnh
nh tiểu
ti đường được 2 nhà sinh lý học ngườii Canada là Fred Bangting
và Charles Best tìm ra năm
ăm 1922.
1922

Năm 1922, Fred Bangting và Charles Best thu
thuộc
ộc đại học tổng hợp Toronto ((Canada)
thông báo họ đãã tìm ra insulin và ứng dụng thành công chất này
ày trong điều
đi trị bệnh
ĐTĐ ở người. Vào thời
ời điểm đó, ng
người bị tiểu đường
ờng phải vật lộn với căn bệnh để tồn
tại và chưa có biện
ện pháp điều trị hiệu quả nào.
n
Bệnh
ệnh nhân nhanh chóng trở thành
th
những bộ xương di động vàà thư
thường chết sớm do bị sút cân nghiêm trọng
ng [6].
Banting và Best đã cắt
ắt bỏ tuyến tụy của những chú chó, và
v hậu

ậu quả là
l chúng bị tiểu
đường ( thử nghiệm có vẻ tàn
àn nhẫn,
nh nhưng nó đã giúp cứu sống hàng
àng tri
triệu con người).
Họ đã cốố gắng tinh chế ra một hoóc môn hóa học từ tụy và
v chiết
ết xuất nhiều th
thành phần
từ tiểu
ểu đảo Langerhan. Sau đó, những chất này
n được tiêm vào chó bịị bệnh ĐTĐ để thử
nghiệm và họ
ọ nhận thấy bệnh ĐTĐ đã
đ bị đẩy lùi [6].
1.3.2 Cấu trúc insulin
Insulin là một
ột hoocmon protein
prote do các tế bào tuyến
ến tụy beta của đảo Langerhans sinh
ra. Phân tử insulin
lin tương đối
đ nhỏ, có khối lượng
ợng khoảng 6000 Dalton, đđược cấu tạo
bởi
ởi hai chuỗi polipeptit A và
v B. Các chuỗi A và B liên kết
ết nhau bằng cầu nối disulfua,

ngoài ra còn có một
ột cầu nối disulfua nằm trong chuỗi A.
Ở hầu hết các loài, chuỗi
ỗi A gồm 21 axit amin ccòn chuỗi
ỗi B gồm 30 axit amin. Mặc dù
d
trình tự
ự các axit amin khác nhau giữa các loài
lo những
ững một số đoạn nhất định của phân
tử
ử có tính bảo tồn cao, các đoạn có chứa 3 cầu nối disufua, cả hai đầu của chuỗi A và
v
các nhánh bên của
ủa đầu COOH của chuỗi B. Sự tương
t
đồng trong trình
ình ttự axit amin dẫn
đến
ến cấu trúc 3 chiều của insulin ở các loài
lo khác nhau rất
ất giống nhau. Insulin chiết rút
HVCH: Lê Thị Nữ Thanh


Luận Văn Thạc Sĩ

8

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

từ động vật có hoạt tính sinh học cao hơn các loài khác. Các phân tử insulin có xu
hướng tạo thành dạng dime trong dung dịch do hình thành các liên kết H giữa các đầu
COOH của các chuỗi B. Ngoài ra, khi có mặt ion kẽm, các dime insulin liên kết tạo
thành hexame. Các mối tương tác này có ý nghĩa rất quan trọng trong điều trị. Dạng
momone và dime dễ dạng khuếch tán vào trong máu, trong khi đó dạng hexame
khuếch tán rất kém. Do đó, sự hấp thụ các thuốc chứa hàm lượng hexame cao thường
bị chậm và ngừng hẳn. Vấn đề này đã thúc đẩy sự ra đời của một số chất insulin giảtái
tổ hợp. Loại chất đầu tiên như thế được bán trên thị trường là insulin lispro, phân tử
chất này có trật tự linsin và prolin trên đầu COOH của chuỗi B bị đảo ngược, làm giảm
khả năng hình thành dạng dime và hexame. [26]
Insulin ban đầu được tổng hợp ở dạng ‘‘ prepproinsulin’’ ( tiền insulin) trên ribosome
trong tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tụy. Preoroinsulin là một phân tử
dạng thẳng bao gồm: một peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptide C
với 31 acid amin (C) và chuỗi A nối với nhau theo thứ tự SP-B-C-A. Khi vận chuyển
qua lưới nội chất, peptide tín hiệu bị phân cắt tạo ra proinsulin (B-C-A). Proinsulin bị
phân cắt bởi enzym PC1/3 tại liên kết giữa chuỗi B và peptide C. Hai acid amin đầu N
của peptide nối vơi đầu C của chuỗi B khi bị phân cắt bởi PC1/3 sẽ được phân cắt ra
khỏi chuỗi B bởi enzyme carboxypeptidase H. Kết quả cuối cùng là tạo thành insulin.

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử insulin

1.3.3 Vai trò của insulin
Insulin là một trong những hoocmon điều hòa nồng độ Glucose trong máu. Chức năng
cân bằng nội môi và năng lượng sinh học này cực kỳ quan trọng bởi vì Glucose là
nguồn nguyên liệu chính của hô hấp tế bào và nguồn khung Cacbon quyết định cần
cho tổng hợp các chất hữu cơ. Cân bằng trao đổi chất phụ thuộc vào việc duy trì
Glucose máu ở gần một điểm ổn định, khoảng 90g/ml ở người [3].
HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

Luận Văn Thạc Sĩ

9

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

1.4 Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay có nhiều phương pháp để điều trị bệnh tiểu đường như uống, tiêm,hít,
dán,…Tuy nhiên trên thế giới ngày nay người ta thường dùng 2 phương pháp điều trị
chính là sử dụng insulin tiêm tĩnh mạch và uống thuốc để làm tăng nhạy cảm của các
tế bào với insulin hoặc tăng tiết insulin ở tuyến tụy. Ở ĐTĐ type 1 thì việc sử dụng
insulin tiêm tĩnh mạch là bắt buộc. Ở nhóm ĐTĐ type 2 có thể kiểm soát đường máu
thông qua thuốc uống, tuy nhiên nếu điều trị trong thời gian dài thì cuối cùng việc sử
dụng insulin là điều tất yếu.[5]
Nhưng các dạng thuốc tiêm lại có một số nhược điểm như có thể gây ra hiện tượng dị
ứng khi sử dụng lần đầu, nếu tiêm lâu dài có thể khiến chỗ tiêm bị bầm tím, cứng lại,
nếu tiêm quá liều có thể gây ra hiện tượng đường huyết đột ngột cao. Việc tiêm insulin
cũng cần phải thực hiện theo đúng thời gian, do vậy nó gây nhiều bất tiện cho bệnh
nhân.[5]
Xuất phát từ những nhu cầu trên cũng như để khắc phục những nhược điểm của việc
tiêm insulin, ngoài ra hiện nay trên thị trường vẫn chưa có thuốc uống insulin được thử
nghiệm thành công và lưu hành. Mặt khác tỉ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở Việt Nam nói riêng
và cả thế giới nói chung đang có xu hướng tăng mạnh. Nên vệc nghiên cứu hệ thuốc
đưa insulin vào cơ thể bằng đường uống đòi hỏi một hệ dẫn thuốc phù hợp. Nhưng có
một trở ngại cần đặt ra là việc bảo vệ insulin khỏi tác động của enzym và pH acid
đường ruột.Vì vậy yêu cầu chế tạo một hệ tải thuốc nano bao gói Insulin tránh sự tiếp
xúc không cần thiết giữa Insulin và enzyme phân hủy protein có trong đường ruột, hơn
thế nữa hệ tải này phải đảm bảo khả năng nhả thuốc chậm làm giúp lượng đường trong
máu luôn giữ ở mức ổn định trong thời gian dùng thuốc.[29]

►►► Vì vậy đề tài này chúng tôi nghiên cứu nhằm mục đích tạo ra một hệ tải thuốc

đáp ứng được những yêu cầu như trên, trong đó chất tải là polymer chitosan đã được
gắn Methoxypolyethylene glycol amine (mPEG), hệ này được sử dụng để tải insulin
ngoài ra, nếu thành công nó còn là tiền để để ứng dụng cho các đường truyền khác như
vaccine cho trẻ em,…. Mục đích của đề tài là tạo ra hệ tải thuốc insulin có kích thước
nano. Trong quá trình chế tạo hạt, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát để có được các
thông số cần thiết để tạo hạt tải có kích thước nằm trong khoảng vài trăm nanomet và
ổn định theo thời gian. Hệ tải thuốc này có thể nâng cao được hiệu quả tải thuốc do

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh