ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN CÁC GIỐNG HOA CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
Trường Đại học Đà Lạt
-----------o0o------------










ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN
CÁC GIỐNG HOA CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH
HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT



ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM
MÃ SỐ:
B2005-29-41-TĐ

Cơ quan quản lý: Bộ Giáo dục và Đào tạo
Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Đà Lạt
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Kết





BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
Trường Đại học Đà Lạt
-----------o0o------------










ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN CÁC GIỐNG HOA
CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT


ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM
MÃ SỐ:

B2005-29-41-TD






Cơ quan quản lý: Bộ Giáo dục và Đào tạo
Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Đà Lạt
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Kết











NHểM THC HIN TI



Cỏn b tham gia thc hin ti:
1. TS. Nguyn Vn Kt
2. Th.S. Cao Th Ln
3. Th.S. Nguyn Thnh Sum
4. NCV. Phng Mai

5. NCV. Trng Th Lan Anh
Cỏc ti sinh viờn ó bỏo cỏo
1. Kho sỏt hiu qu c ch virus ca ribazole trờn nm ging cỳc nuụi cy in vitro.
inh Th Hnh. Sinh viờn Nụng hc khúa 27
2. Tỏc ng ca ribazole lờn s sinh trng ca cỳc (Farm traộng, Farm tớm, Nửừ
hoaứng tớm, Thoù ủoỷ, Thoù vaứng chanh) in vitro. Nguyn Th Thm. Sinh viờn T
i
chc Sinh hc khúa 13
3. Tỏc ng ca ribazole lờn s sinh trng ca cỳc (Chrysanthemum sp.) in vitro.
Phm Th Hng Hng. Sinh viờn Sinh hc khúa 27
4. Phc trỏng ging hoa cỳc (Farm hng, Pingpong vng, Nỳt vng, Nỳt tỡm, Tia
mung vng) bng ribazole. Cao Vit Tun. Sinh viờn Nụng Hc Khúa 27
5. Kho sỏt nh hng ca bin phỏp b tr ribazole trong vic lm sch virus lờn s
sinh trng v phỏt trin ca ba ging a lan ( B Mai, Tớm ht, Vng Ba
Rõu) ti Lt. V Th
Phng Thanh. Sinh viờn Nụng hc khúa 27
6. Kho sỏt v tỡnh hỡnh sn xut cỏc ging cỳc ti Lt hin nay. Nguyn Th
Nh Qunh. Sinh viờn Nụng hc khúa 28.



1

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tóm tắt
Qua điều tra thực tế các loại cúc và lan cắt cành tại Thành phố Đà Lạt cho thấy
hiện nay có khoảng 38 giống lan đang trồng với mục đích cắt cành, trong đó có
khoảng 14 giống có giá trị và được nhiều người tiêu dùng ưa chuộng. Các giống cúc
cắt cành nhập vào Đà Lạt có trên 72 giống, tuy nhiên nhiều giống đã bị lãng quên, chỉ

còn lại khoảng 54 giống còn có thể phục hồi. Nhằm bảo tồn các giống hoa này, chúng
tôi đã tiến hành các biện pháp kiểm tra hiện trạng lây nhiễm các loại virus, và đã phục
tráng thành công 14 giống địa lan, 54 giống cúc in vitro.

Abstrast
Lam Dong Province of Vietnam has an exceptional diversity of cutting flower of
Cymbidium and Chrysanthemum with approximately 38 and 72 varieties respectively.
Plant tissue culture and micropropagation techniques play an important role in
conservation programme and management of botanical collection.
Chrysanthemum and Cymbidium plants collected from farmers were identified the
highest virus infection rate among of these species. The results obtained by
observation samples of 54 varieties Chrysanthemum and 14 varieties Cymbidium.
Using meristem culture and treated with Virazol in vitro suggest that the possibility
could be obtained virus free plants through cultures.


2

Mở đầu
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việc du nhập ngày càng nhiều các giống hoa cắt cành là một xu hương cần thiết
đề đáp ứng nhu cầu thưởng thức hoa của người dân cũng như để xuất khNu. Tuy nhiên
song song với việc chạy đua thay đổi về giống trên thị trường sản xuất hiện nay thì
đồng thời cũng có rất nhiều giống dần dần bị lãng quên, không phải vì các giống hoa
này không đảm bảo chất lượng mà là do thị hiếu của người tiêu dùng. Việc nghiên
cứu các biện pháp công nghệ trong lĩnh vực nhân giống các loài hoa cắt cành có giá
trị kinh tế của địa phương nhằm mục đích bảo tồn nguồn gen trong tập đoàn hoa cắt
cành là một biện pháp cần thiết cho xu hướng phát triển đa dạng về hoa cắt cành trong
tương lai và tránh lãng phí một số lớn các giống hoa mà bản thân đất nước chúng ta
hiện nay chưa thể lai tạo được.

2. Mục tiêu đề tài
Đề tài thực hiện nhằm những mục đích sau:
- Điều tra tình hình sản xuất hoa cắt cành hiện có tại Đà lạt.
- Sưu tập và bảo tồn các nguồn gen quí về hoa cúc, hoa lan cắt cành, v.v...có giá
trị tại tình Lâm Đồng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
- Nghiên cứu các điều kiện môi trường sinh trưởng thích hợp của các giống cây
con bảo tồn trong điều kiện in vitro.
- Nghiên cứu các điều kiện môi trường giá thể sinh trưởng thích hợp của các
giống cây con vườn ươm.
- Tạo môi trường thực tập và nghiên cứu cho giáo viên và sinh viên.
3. Phạm vi và giới hạn của đề tài
Đề tài chỉ thực hiện nghiên cứu bảo tồn các giống cúc và các giống hoa lan cắt cành
hiện còn tồn tại và đang sản xuất tại Thành phố Đà Lạt.


3

CÁC TỪ VIẾT TẮT
BAP 6-benzyl-aminopurine
dSm
-1
deciSiemen per meter – Đơn vị biểu thị độ dẫn điện của dung dịch
EC Độ dẫn điện (Electrical conductivity)
IAA Indol-3-acetic acid
IBA Indolbutyride acid
KC Knudson (1946)
Kin Kinetin (6-furfuryl-aminopurine)
LM Lindemann(1970)
MS Murashige and Skoog (1962)
NAA -naphthalene acetic acid

NCV Nghiên cứu viên
PLB Protocorm like body
TDZ Thidiazuron (N-phenyl-N
,
-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)
VW Vacin and Went (1949)
2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid.
LSD 0.5: Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0.5
CV% Hệ số sai dị
FrW: Trọng lượng tươi
NTL: Đường Nguyên Tử Lực – Đà Lạt



4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Sơ lược về cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng
1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô thực vật (hay còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình
nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái
niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ
quan) thực vật trong môi trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng (15, 22, 29)..
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận khoa học về tính
toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật. Cuối thế kỷ 19,
nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi
tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của
cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển

thành cơ thể hoàn chỉnh (15, 22).
Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi
White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với
một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó
White chứng minh rằng có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại
vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic axit. Từ đó việc nuôi cấy
đầu rễ đã được tiến hành trên nhiều loại cây khác nhau.
Năm 1958, tính toàn năng của tế bào đã được khẳng định bằng công trình
nghiên cứu của Stewart và cs. (1958) trên mô rễ cây cà rốt. Các tác giả này đã nuôi
cấy mô rễ cà rốt trên môi trường đặc có nước dừa và đã thu nhận được khối mô sẹo
gồm các tế bào nhu mô. Khi chuyển mô sẹo này sang môi trường lỏng có cùng thành
phần và nuôi lắc thì nhận được huyền phù gồm các tế bào riêng lẽ và các nhóm tế bào.
Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường lỏng, không cấy chuyển thì thấy hình thành rễ.
Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart (1963), Wetherell và Halperin
(1963) cùng thông báo rằng tế bào cà rốt tự do khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã
tạo thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá
trình tạo phôi bình thường ở cà rốt, lúc này tính toàn năng của tế bào càng được
khẳng định.
Từ những khám phá trên, hàng loạt các báo cáo về tính toàn năng của tế bào đã
được thông báo, hầu như tất cả các cơ quan đều có thể phát triển phôi. Phôi soma đã
được ghi nhận ở nhiều giống như Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium,
Hordeum, Kalanchoe, Nicotiana, Panax, Ranumculus, Solanum, Oryza...
Ngày nay bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và
phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, lan, thuốc lá, dứa, các cây
lương thực, cây ăn quả.... Việc nhân giống này đã trở thành công nghệ và đã được áp
dụng ở nhiều nước trên thế giới (10, 11, 15. 22, 30).


5

1.2 Công nghệ sinh học thực vật trong nhân giống cây trồng
Công nghệ sinh học thực vật hình thành do áp lực tự nhiên của xã hội theo hai
khuynh hướng: áp lực gia tăng năng suất và áp lực giảm năng suất mùa màng. Trước
những xu hướng đó, đòi hỏi ngày càng phải đưa nhanh kỹ thuật mới vào công tác lựa
chọn, nhân giống cây trồng.
Sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật theo thời gian có thể được tóm
tắt như sau: từ những năm 1920 bắt đầu là lai chéo, năm 1960 là kỹ thuật gây đột biến,
năm 1970 là sự phát triển kỹ thuật cấy mô, đến năm 1980 là kỹ thuật dung hợp tế bào
trần và từ những năm 1990 đến nay là sự phát triển của kỹ thuật gen (10, 12, 15. 22,
30).
Nhờ sự kết hợp giữa nuôi cấy mô thực vật và công nghệ gen, người ta đã tạo ra
được những thuộc tính mới cho cây trồng một cách có định hướng và hiệu quả. Nhờ
thuộc tính totipotent của thực vật, người ta có thể hoàn toàn tái tạo nên một loạt các
cây mới hoàn chỉnh từ một tế bào mang đặc tính mới chỉ trong một thời gian ngắn.
Nhờ sự kết hợp này đã giúp cho công nghệ sinh học thực vật nói chung và nuôi
cấy mô nói riêng có những bước tiến mang lại hiệu quả kinh tế rất lớn. Có thể nói một
cách khái quát những ưu điểm của công nghệ này là:
- Chọn lọc nhanh những tính trạng mong muốn, nuôi cấy mô là con đường
nhanh nhất giúp chọn lọc và biểu hiện tính trạng.
- Nuôi cấy mô tạo nguồn nguyên liệu thực vật tuyệt vời cho quá trình chuyển
gen ở thực vật.
- Nuôi cấy mô kết hợp với kỹ thuật dung hợp tế bào trần và đột biến có thể tạo
ra các dòng lai khác loài.
- Giúp nhân giống vô tính với tốc độ và số lượng lớn.
- Giúp tạo được cây sạch bệnh.
- Thực vật nuôi cấy mô là nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất các chất quý hiếm,
đặc biệt là các dược chất.
- Các cây mô là đối tượng tốt và hiệu quả của những nghiên cứu về sinh lý,
sinh hóa, di truyền, bệnh lý, sinh học phân tử.
- Các cây mô giúp trao đổi quốc tế nguồn giống thực vật rất dễ dàng.

- Các cây mô có thể cung cấp quanh năm.
1.3 Vai trò của chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô
Chất điều tiết sinh trưởng hay còn gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật là
các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chất điều
tiết sinh trưởng thực vật có thể là những chất tự nhiên được sản sinh với một hàm
lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc là những chất được
tổng hợp nhân tạo. Những chất điều tiết sinh trưởng này được vận chuyển đến các bộ
phận khác của cơ thể gây nên những tác động điều tiết của cây.


6

Vai trò điều hòa của chất điều tiết sinh trưởng thực vật là khởi động cho sự
hình thành các phản ứng cá biệt hay các quá trình sinh lý nhất định hoặc trì hoãn quá
trình đó.
Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật gồm hai nhóm chính là auxin và
cytokinin, ngoài ra gibberelin và ethylen cũng có vai trò quan trọng đối với sinh
trưởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật.
1.3.1 Các auxin
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic axit (IAA).
IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, điều khiển sự hình thành rễ.
Ngoài IAA, còn có những dẫn xuất khác là naphtyl axetic axit (NAA) và 2,4 –
diclophenoxyl axetic axit (2,4-D). Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự
phân chia mô và trong quá trình tạo rễ (10, 12, 40, 41).
NAA, IBA, 2,4-D là những auxin tổng hợp, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự
nhiên IAA. Chúng có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ.
Đối với rễ, về cơ bản auxin ức chế sự phát triển của rễ, chỉ ở nồng độ cực thấp
(10
-9
-10

-12
g/ml) thì mới có tác dụng kích thích sinh trưởng của rễ, vượt qua ngưỡng
này (10
-8
mg/l) thì lại thể hiện tác dụng ức chế.
IAA kích thích sự ra rễ và kìm hãm sự phát triển callus. Ngược lại, 2,4-D kích
thích sự hình thành callus và kìm hãm sự hình thành rễ trong môi trường nuôi cấy.
Mặc dù cùng nhóm chất auxin nhưng hai chất này lại có tính chất đối kháng..
NAA được Went và Thimann (1937) tìm ra. Chất này có tác dụng làm tăng hô
hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi
chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy
(10, 12, 40, 41).
1.3.2 Cytokinin
Cytokinin là chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào.
Các cytokinin thường gặp là 6-benzyl aminopurin (BAP), Kinetin.
Kinetin được Shoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic.
Kinetin là dẫn xuất của base nitơ adenin. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng
có hoạt tính mạnh hơn kinetin.
Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian
hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào. Ngoài ra các
chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp
protein và tăng cường hoạt động của một số enzim (10, 40, 41).
Benjamin và cs. (1987) đã cho rằng nồng độ BA cao (1-5ppm) kích thích sự
phát triển của chồi đỉnh và đầu rễ của cây Atropa belladona. Lat và cs. (1988) cho
rằng khi sử dụng kinetin để nhân nhanh cây Picrohiza kurroa phải dùng nồng độ từ 1-
5mg/l.
Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các
chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với các chất điều tiết sinh

7

trưởng nội sinh. Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định
đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô.
Tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành rễ, tỷ lệ này thấp sẽ kích
thích quá trình phát sinh chồi, nếu tỷ lệ này cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển
mô sẹo. Barna và Wakhlu (1998) chỉ ra rằng tốc độ tái sinh chồi của cây Plantago
ovata tăng cao khi trên môi trường sử dụng KIN 4-6 µM phối hợp với NAA 0,05µM.
Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác động đồng thời của
auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN, dẫn đến quá trình
mitos và cảm ứng cho sự phân chia tế bào.
Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình
phân chia tế bào, cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha mitos và giữ cho
quá trình này diễn ra một cách bình thường (10, 12, 40, 41).
1.3.3 Các nhóm chất khác
Ngoài những nhóm chất điều tiết sinh trưởng kể trên, trong nuôi cấy in vitro
còn sử dụng một số nhóm chất khác như Abscicis acid, ethylen, các amino acid...
Abscisis acid sử dụng ở nồng độ cao là chất ức chế sinh trưởng và trạng thái
nghỉ bắt buộc. Ethylen được sinh ra trong quá trình nuôi cấy thực vật. Ethylen có thể
kìm hãm sự sinh trưởng tế bào và đNy nhanh sự lão hóa trong quá trình nuôi cấy mô.
Silver nitrat có thể được sử dụng để ngăn chặn ethylen hình thành trong quá trình
nuôi cấy mô (40, 41).
Amino acid có thể nâng cao sự tăng trưởng của tế bào và sự tái sinh cây. L.
Glutamine có thể được xem như là nguồn nitơ. Enzim hydrolyzed protein N-Z amin
Type A như casein hydrolyzate có thể được sử dụng hiệu quả đến 2g/l. Thêm vào đó
malate, citrate, pyruvate và acid vô cơ tương tự có thể có hiệu quả trong môi trường
nuôi cấy protoplast và có thể làm giảm bớt độc hại của muối amonium (Gamborg &
Shyluk, 1970; Gamborg, 1986).
Ngoài ra, các chất chiết của cây như coconut milk của cây quả hạch xanh có
thể rất hiệu quả trong việc cung cấp phức hợp chất dinh dưỡng vô cơ không xác định

và các nhân tố sinh trưởng.
1.4 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation)
Trong 5 thập kỷ qua đã có nhiều báo cáo về kỹ thuật vi nhân giống (Arditi và
Krikorian, 1996; Chakrabarty và cs., 2001; Rasai và cs., 1995; Rout và cs., 2000). Vi
nhân giống là sự nhân giống vô tính với số lượng của cây trồng thông qua nuôi cấy
mô in vitro. Kỹ thuật nuôi cấy này đã được ứng dụng rộng rãi trong việc nhân giống
các loài cây cảnh và những loài khác trên toàn thế giới (Chu 1992; Huetteman và
Preece 1993; Mantell và cs., 1985; Prerik, 1987).
Một trong những dạng thú vị và quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro là
khả năng tái sinh và sinh sản của cây từ nuôi cấy tế bào và mô. Dạng đơn giản nhất
của tái sinh cây in vitro là kích thích sự phát triển của chồi. Kỹ thuật này tận dụng sự
phát triển cá thể cho sự phát triển chồi bằng đỉnh sinh trưởng hoặc chồi bên. Trạng
thái ngủ của những chồi này bị phá hũy và sự phát triển của các chồi non được kích


8

thích bằng tổ hợp các chất điều tiết sinh trưởng (thường sử dụng cytokinin) để tái sinh
ra chồi con. Các chồi con này sau đó được tách ra cho phát triển rễ để tái sinh cây con.
Sự tái sinh cây từ nuôi cấy mô có thể được thực hiện bằng cách nuôi cấy từ
đỉnh sinh trưởng, từ callus và từ tế bào, hoặc chồi nách vì chồi nách là tiền thân của
đỉnh sinh trưởng. Ngược lại, sự tái sinh bất định diễn ra tại những vị trí khác như là
các đốt thân, từ lá mầm, vùng kéo dài ra của rễ. Sự tái sinh chồi bất định thường phụ
thuộc vào sự có mặt của gen cấu trúc. Nhưng sự tái sinh cây từ callus và từ tế bào
thường không có mặt của gen cấu trúc.
Sự phát sinh cơ quan là sự hình thành các cơ quan riêng biệt như chồi hoặc rễ.
Sự tái sinh phôi soma là sự hình thành cấu trúc lưỡng cực chứa cả chồi và rễ. Hầu hết
các cây trồng có thể tái sinh cây theo cách phát sinh cơ quan hoặc phôi soma nhưng
rất ít loài có thể được cả hai cách. Một số loài có thể tái sinh một cách dễ dàng từ nuôi
cấy mô và tế bào trong khi một số loài chỉ có thể tái sinh bằng quá trình bất định.

Sự tái sinh cây từ chồi nách hoặc chồi đỉnh được ứng dụng rộng rãi trong vi
nhân giống do có sự biến dị ít nhất. Ngược lại sự phát sinh chồi bất định và sự tái sinh
cây từ callus bởi sự phát sinh cơ quan hoặc bởi phôi soma có biến dị cao như tốc độ
tái sinh của nó.
1.4.1 Các bước thực hiện trong kỹ thuật vi nhân giống
Trong kỹ thuật vi nhân giống có 4 giai đoạn đặc trưng (Murashige 1974,
George và cs. 1984).
Giai đoạn 1: Lựa chọn mẫu cấy và nuôi cấy khởi đầu.
Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi con hoặc chồi mầm từ mẫu ban đầu.
Sự tái sinh chồi bất định là kỹ thuật nhân nhanh được sử dụng thường xuyên
nhất trong vi nhân giống (Chu 1992). Môi trường nuôi cấy và điều kiện sinh trưởng
trong giai đoạn này được cung cấp tối ưu để tỉ lệ nhân nhanh chồi đạt tối đa.
Giai đoạn 3 : là giai đoạn tái sinh rễ từ chồi con để tái sinh cây con. Giai đoạn
này cần môi trường đặc trưng hoặc không, điều này phụ thuộc vào kiểu gen của loài.
Giai đoạn 4: hoàn chỉnh cây con cho thích nghi trên điều kiện trồng trên hỗn
hợp đất trong nhà kính để sau đó chuyển ra đồng ruộng.
1.4.2 Các nhân tố trong môi trường nuôi cấy invitro
Mức độ thành công của bất kỳ một kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào hoặc nuôi cấy
cơ quan đều liên quan đến nhiều nhân tố. Nhân tố quan trọng là lựa chọn thành phần
dinh dưỡng và chất điều tiết sinh trưởng. Trong hai đến ba thập kỷ qua đã có nhiều
báo cáo về thành phần của các môi trường cơ bản (Sheet và Shillito, 1997; Perik
1987; Torres, 1989).
Môi trường nuôi cấy
Có hơn 50 công thức môi trường khác nhau được sử dụng cho nuôi cấy in vitro
nhiều loại cây khác nhau (Gamborg và cộng sự, 1976; Huang và Murashige, 1977).
Trong đó môi trường MS được sử dụng phổ biến nhất, có cải biên bằng sự thay đổi
thành phần các vi lượng (Chand và cs., 1977; Jha và Sen, 1985; Rout và cs., 1999;
Saxena và cs., 1988).

9

Môi trường dinh dưỡng bao gồm các loại muối vô cơ, nguồn cacbon, vitamin
và chất điều tiết sinh trưởng. Một số thành phần khác có thể được bổ sung thêm như
nitơ vô cơ, acid vô cơ và chất chiết cây trồng (Gamborg, 1986).
Các muối khoáng được sử dụng như là thành phần của môi trường nuôi cấy mô
tế bào. Hầu hết các môi trường chứa ít nhất 30mM nitơ vô cơ và kali vô cơ. Muối
amonium có thể được sử sụng từ 2-20mM. Ảnh hưởng của muối amonium có thể thay
đổi từ ức chế đến hiệu quả. Nồng độ Ca, SO
4
, photphat và muối Mg từ 1-3 mM là
thích hợp. Ngoài ra trong môi trường cũng cần bổ sung thêm một số khoáng vi lượng.
Môi trường MS (1962) hoặc Linsmainer và Skoog (1965) (LS) được sử dụng
rộng rãi, đặc biệt là trong quá trình tái sinh cây. Môi trường B5 (Gamborg và cs.,
1968), N6 (Chu, 1978), Nisch và Nitsch (1969) (NN) và các dẫn xuất từ các môi
trường này có thể được sử dụng rộng hơn cho nhiều loại cây. Theo Huang và cs.,
Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar (2000), cây dâu tây phát triển thích hợp trên môi
trường MS.
1.4.2.2 Các chất điều tiết sinh trưởng.
Liều lượng chất điều tiết sinh trưởng lên môi trường nuôi cấy quyết định rất
lớn đến sự thành công của nuôi cấy mô thực vật. Mor và Zieslin (1987), Rout và cs.
(2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và mối tương tác
giữa chúng lên vi nhân giống của nhiều loại cây khác nhau, trong đó đã có báo cáo rất
rõõ về ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự nhân nhanh chồi của nhiều loại cây
khác nhau. Cytokinin là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp cho việc nhân nhanh chồi.
Theo Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar khi sử dụng BA, Kinetin, 2-ip trên
môi trường MS, tốc độ nhân nhanh tốt nhất khi bổ sung BA. Theo kết quả nghiên cứu
của Kang và cs. (1994), BA là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp nhất cho sự nhân
nhanh chồi từ mẫu lá của cây dâu Fragaria x ananassa. Loại dâu này sẽ cho số lượng
chồi cao, hiệu quả nhất trên môi trường MS có bổ sung 4,0 µM BA kết hợp với 0,1

µM NAA. Tác động kết hợp giữa BA và auxin sẽ làm tăng số lượng chồi (Uppadhaya
và Chandra, 1983). Hu và Wang (1983) cho rằng nồng độ cytokinin cao sẽ làm giảm
số lượng chồi sinh sản, nhưng khi sử dụng nồng độ BA cao sẽ cho chất lượng chồi
không tốt, chồi hình thành dạng hoa thị hoặc những nốt nhỏ ở cuối gốc.
Trong nuôi cấy rễ in vitro, sự có mặt của cytokinin trên môi trường thường hạn
chế khả năng ra rễ. Cây sẽ hình thành rễ trong môi trường có bổ sung auxin hoặc
không cần bổ sung thêm auxin phụ thuộc vào kiểu gen của cây trồng (Rout và cs.,
2000).
1.4.2.3 Nguồn cacbon và những cơ chất khác
Nguồn cacbon được sử dụng trong môi trường thường từ 2-3 % đường saccaro
hoặc glucose (nhưng rất ít). Những nguồn cacbon khác có thể là lactose, maltose,
galactose nhưng rất ít sử dụng. Nguồn cacbon này đóng vai trò trong sự phát triển tế
bào. Hầu hết các cây trồng có thể tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự sinh trưởng
và phát triển nhưng với những vitamin đặc trưng như vitamin B1), vitamin B3,
vitamin B6 và myo- inositol cần được bổ sung vào môi trường trong nuôi cấy in vitro
để nâng cao sự sinh trưởng và sự phân hóa (Gamborg và cs., 1968).


10

Agar được sử dụng rộng rãi trên các môi trường đặc và bán đặc, nhưng một vài
egllin agent khác có thể sử dụng như gelatin, agrose, aglinate và gebrite.
Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường ở các giai đoạn khác nhau của
quá trình nuôi cấy in vitro. Than hoạt tính không phải là chất điều tiết sinh trưởng, nó
đóng vai trò như là chất hút Nm của môi trường. Than hoạt tính có khả năng hấp thụ
một số chất không có lợi cho sự phát triển của cây như các chất được sản sinh ra
trong quá trình khử trùng môi trường nuôi cấy hoặc một số chất do cây trồng tiết ra.
Đôi lúc than hoạt tính cũng đóng vai trò như chất điều tiết sinh trưởng (Ebert và cs.,
1993; Eymar và cs., 2000; George và Sherrington, 1984). Bổ sung thêm than hoạt tính
vào môi trường có thể có lợi cho việc hình thành rễ của cây do than hoạt tính có tác

dụng hạn chế mức độ chiếu sáng hoặc than hoạt tính có khả năng hấp thụ các chất ức
chế sự ra rễ có trong môi trường nuôi cấy. (Dumas và cs.,1995; George và
Sherrington, 1984).
1.4.2.4 Nhân nhanh chồi
Đây là giai đoạn cốt lõi quyết định đến sự thành công trong nuôi cấy in vitro.
Có 3 cách thường được sử dụng trong vi nhân giống : thông qua callus, sự hình thành
chồi bất định và chồi nách (Bhojwani và cs., 1996). Trong trường thông qua nuôi cấy
chối nách, tốc độ nhân nhanh phụ thuộc vào nồng độ cytokinin thích hợp trên môi
trường và sự cấy chuyển trong quá trình tái sinh cây. Trên cây dâu tây Fragaria x
ananasa, tốc độ nhân nhanh chồi đạt kết quả tốt nhất khi bổ sung vào môi trường MS
các chất điều tiết sinh trưởng BA (4,0 µM) và NAA (0,1 µM) sau 60 ngày nuôi cấy.
Nhưng khi bổ sung vào môi trường nồng độ BA cao hơn 4,0 µM cùng với 0,1 µM
NAA sẽ làm cho chồi sinh trưởng không tốt và chất lượng chồi xấu, do đó tốc độ
nhân nhanh cũng giảm.
1.4.2.5 Sự hình thành rễ
Sự hình thành rễ của nhiều loài cây có thể không cần bổ sung thêm chất điều
tiết sinh trưởng (Saxena và cs., 1998). Rễ của nhiều loài cây có thể được hình thành
dễ dàng khi nồng độ các muối khoáng giảm đi một nữa hoặc giảm hơn, và nồng độ
đường giảm từ 2 hoặc 3% đến 0.5%. (Webb và Street, 1977). Theo Indra D. Bhatt và
Uppeandra Dhar khi nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA) lên sự hình thành
rễ của loài Fragaria x ananasa, cây ra rễ tốt nhất khi sử dụng NAA với liều lượng
thấp (0.1mg/l).
Rễ của một số loài cây có thể được hình thành dễ dàng hơn khi bổ sung thêm
than hoạt tính vào môi trường, đôi khi có bổ sung thêm auxin. Than hoạt tính làm
nâng cao sự phát triển của rễ khi rễ đầu tiên vừa được hình thành (Marthur và cs.,
1999). Sự phát triển của rễ tốt hơn khi trong môi trường có chất hút các chất ức chế ra
rễ hoặc làm giảm mức độ chiếu sáng bằng cách bổ sung than hoạt tính (Druart và cs.,
1993; George và Sherrington, 1984).
Sự phát triển sung mãn của hệ rễ của cây con trong nuôi cấy in vitro là điều
kiện thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà kính và trên đồng

ruộng.


11

2. Sơ lược về lịch sử nghiên cứu họ lan (Orchidaceae) và chi địa lan (Cymbidium
sw.)
2.1 Khái quát chung
Lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông vào 551-479 trước công nguyên
bởi Khổng Tử.
Cây lan được biết đến đầu tiên ở Trung Quốc là Kiến Lan (tìm ra ở Phúc kiến)
là Cymbidium enrifolium.
Theo Phrastus được xem là ông tổ của thực vật học và cũng có thể nói là cha
đẻ của ngành học về lan. Orchis được ông dùng để chỉ những cây lan tìm thấy ở vùng
Địa Trung Hải.
Thế kỷ thứ nhất sau công nguyên, Dioscorides dùng Orchis để mô tả 2 loài địa
lan trong quyển sách về dược liệu của ông và được Linnaeus ghi lại trong sách “Các
Loài Cây Cỏ” (Species Plantarum) vào 1753, rồi John Lindley sử dụng đầu tiên để đặt
tên cho họ lan là Orchidaceae từ năm 1836 và tồn tại cho đến nay.
Ở Việt Nam sự nghiên cứu về lan chưa rõ rệt lắm nhưng có lẽ người đầu tiên
tìm hiểu và nuôi trồng lan là vua Trần Anh Tông, kế đến là Joanis Loureiro, là nhà
truyền giáo người Bồ Đào Nha (1789) trong cuốn “ Thực Vật Chứng Nam Bộ ”
(Flora Cochinchinesis) các cây lan trong cuộc hành trình đến nam phần Việt Nam và
đã được Bentham và Hoocker ghi lại trong “ Các Giống Cây Cỏ” (Genera
Plantarum)(1862 – 1883). F. Gagnepain và A. Guillaumin mô tả 101 giống gồm 636
loài lan cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ “ Thực Vật Chí Đông Dương ” do
Hlecomte chủ biên.
Đáng kể nhất là quyển II bộ sách “ Cây Cỏ Miền Nam Việt Nam” của giáo sư
Phạm Hoàng Hộ với 289 loài lan được mô tả và vẻ hình. Mới dây giáo sư đã bổ sung
thêm 364 loài lan trong quyển III tập 2 của bộ sách “Cây Cỏ Miền Nam Việt Nam”

xuất bản 1993. Trong đó chi Cymbidium.sw có 15 loài:
C.aloifolium (Lindl.).sw, C.atropurpureum (Lindl.) Rolfe., C.banaense Gagn,
C. bicolor lindl, C.dayanum Reich.b.f, C.devonianum Paxt., C.enrifolium (Lindl.).sw,
C.erythrostylum Rolfe, C.filay sonianum Lindl., C.inrigne Rolfe, C.lancifolinum
Hookf, C.lowianum Reich.b.f, C.schroederi Rolfe., C.sinense (Jacks)Willd.,
C.macroshizon Lindl..
Theo Trần Hợp trong cuốn “Phong Lan Việt Nam” tập 1 và 2 xuất bản 1988-
1990 thì họ lan Việt Nam có khoảng 368 loài, trong đó chi Cymbidium có khoảng 10
loài sau:
C.aloifolium (Lindl.).sw, C.dayanum Hookf, C. devonianum Paxt.,
C.enrifolium (Lindl.).sw, C.evrardii Guillaum, C.grandiflorum Griff, C.inrigne Rolfe,
C.lancifolinum Hookf, C.parishii Reich.b., C.poilanei Gagnep.
Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến trong cuốn “Phân Loại Học Thực Vật –
Thực Vật Bậc Cao” xuất bản 1978 thì họ lan ở Việt Nam có 91 chi 463 loài, trong đó
chi Cymbidium có khoảng 12 loài sau:


12

C.aloifolium Swartz., C.cyperifolium Wallex Lindl, C.dayanum Reich.b.f, C.
devonianum Paxt., C.ebarneum Reich.b.f, C.enrifolium Swartz., C.erythrostylum
Lindl., C.giganteum Wall., C.inringne Reich.b.f., C.lancifolinum Hookf, C.polanei
Gagn., C.munronianum kinget plant.
2.2 Một vài nét về địa lan Đà Lạt.
Hiện nay, nhu cầu hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới và
trong nước đang ngày càng tăng. Trong năm 2000 kim ngạch xuất khNu hoa lan cắt
cành và giống cây lan trên thế giới đạt 150 triệu USD, trong đó chỉ riêng hoa lan cắt
cành đã chiếm 128 triệu USD. Do đó việc trồng lan đã trở thành một hướng phát triển
kinh tế của nhiều nước trên thế giới và đang phát triển mạnh mẽ ở khu vực Đông
Nam Á.

Thái Lan trở thành một nước xuất khNu hoa cắt cành và cây giống lan nhiều
nhất trên thế giới. từ 1990 đến 1995 số lượng lan cắt cành xuất khNu ở Thái Lan tăng
1.7 lần, từ 15.6 triệu cành lên 26.5 triệu cành.
Chính phủ Malaysia đã thấy hiệu quả kinh tế lớn của việc trồng lan nên đã giao
300 ha đất cho hiệp hội hoa lan Malaysia, với mục đích quy hoạch vùng này thành
trung tâm sản xuất hoa xuất khNu.
Trong những năm gần đây Nhà nước ta cũng định hướng phát triển việc trồng
lan không chỉ phụ vụ cho xuất khNu mà còn phục vụ cho ngành du lịch. Các cấp lãnh
đạo nhà nước từ Trung ương đến địa phương đã bắt đầu thấy được tầm quan trọng của
ngành xuất khNu hoa lan nên đã có những chủ trương khuyến khích phát triển. Năm
1978, ngành xuất khNu thành phố Đà Lạt đã xuất khNu lô đầu tiên sang các nước Châu
âu với 3000 cành lan., cho đến nay thì số lượng này đã tăng lên đáng kể.
Hiện nay việc trồng lan đem lại hiệu quả kinh tế cao, đây là một mặt hàng thu
nhiều ngoại tệ, nhưng bản thân nó lại chẳng yêu cầu phải có vốn đầu tư quá cao.
Điều kiện tự nhiên của Đà Lạt phù hợp với việc trồng nhiều loài hoa, đặc bệt là
hoa lan. Trong đó địa lan Đà lạt vốn nổi tiếng từ lâu về sự phong phú và vẻ đẹp độc
đáo mà chỉ có địa lan ở Đà Lạt mới có được. Những năm gần đây, ngành trồng lan Đà
Lạt đã có những biến chuyển đáng kể. Diện tích trồng hoa thay thế cho trồng rau ngày
càng tăng. Hiện nay Đà Lạt có 400 ha trồng hoa với 300 triệu cành hoa xuất khNu
hàng năm. Hướng phát triển đến năm 2010 tăng diện tích trồng lên 450 – 500 ha trong
đó ưu tiên phát triển trồng lan. Thêm vào đó, với sự trợ giúp của công nghệ nuôi cấy
mô, việc nhân giống và tạo ra những giống mới do lai tạo cũng dễ dàng hơn, từ đó mà
thời gian trồng lan được rút ngắn lại.
Hiện nay sản lượng hoa lan cắt cành đặc biệt là địa lan vẫn chưa đủ cung cấp
cho nhu cầu rộng lớn của thị trường. Trong khi đó dịch bệnh thối giả hành, và một số
bệnh do virus hoành hành đã làm giảm một lượng lớn số chậu địa lan có ở Đà Lạt. Do
vậy ngành trồng lan trong đó Cymbidium là chủ đạo sẽ còn tiếp tục phát triển. Từ một
vài dẫn liệu nêu trên, ta có thể mạnh dạn kết luận việc nuôi trồng Cymbidium ở Đà
Lạt có một ưu thế tuyệt vời. Và đây là một tiềm năng to lớn mà nếu chúng ra biết
cách tác động sẽ đem lại lợi nhuận cao.

Họ lan là họ có số lượng loài lớn thứ 2 với khoảng 20000 - 25000 loài. Trong
đó Cymbidium được mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa, Cymbidium có những


13

đặc điểm nổi bật cả về giá trị thNm mĩ lẫn giá trị khoa học. Vẻ tao nhã, hài hòa của
chúng từ lâu đã hiện diện trong văn học nghệ thuật và gắn liền với đời sống văn hóa
của con người Phương Đông.
2.3 Hình thái bên ngoài của địa lan.
Về hình thái bên ngoài địa lan là những cây thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hàng
năm tạo thành những bụi nhỏ. Thân ngầm của địa lan (căn hành) thường ngắn nối
những củ với nhau, … các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành. Củ già,
khi bị tách khỏi căn hành cũ có thể phát sinh đoạn căn hành mới, từ đó mọc lên những
cây con, do đó người ta xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân.
Củ lan (giả hành) thường có dạng con quay hay dạng hột xoài. Đường kính của
giả hành từ 1cm đến 15cm. Giả hành được bao bọc bởi các bẹ lá xếp xít nhau, do đó
giả hành của địa lan không rõ ràng như một số loài lan khác như denrobium, catleya.
Rễ của một số loài địa lan bì sinh hay phụ sinh thường mọc bám trên vỏ cây,
mặt đất. Một số loài khác có rễ ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay
thực sinh). Những rễ mới thường chỉ mọc ở cây con, còn cây mẹ ít khi hình thành rễ
mới mà chỉ thấy những rễ phụ phân nhánh từ rễ củ.
Lá địa lan thường có hai dạng, dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng
thực đính trên giả hành. Lá ở dạng thực đính trên giả hành thường có cuống lá, giữa
bẹ lá và cuống lá có một phần phân cách, khi phiến lá rụng vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy
giả hành, một số loài không có cuống lá. Tùy theo từng loài mà hình dáng của phiến
lá, gân lá rất khác nhau, gân dọc nổi rõ hay gân chìm trong thịt lá. Một số loài ít chịu
rợp có phiến lá màu vàng xanh, còn lại thường là màu xanh đậm. Bản lá và độ dày
của lá thay đổi tùy theo từng loài, các loài sống ở trảng trống có lá hẹp và dày hơn các
loài ưa bóng rợp. Lá có dạng dải, dạng mũi mác hay dạng phiến. Đầu lá thường là

nhọn, hay chia thành hai thùy. Kích thước của lá biến động từ 0.5 cm – 6cm, chiều
dài thay đổi từ 10 cm – 150 cm.
Chồi hoa thường xuất hiện bên dưới của giả hành từ các nách lá, tách các bẹ
già đâm ra ngoài. Chồi hoa thường xuất hiện cùng với chồi thân mọc đâm ra hai phía
hình đuôi cá, nhưng chồi hoa căng tròn hơn, trong khi đó chồi thân thì hơi dẹt. Các lá
đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra hai phía hình đuôi cá, còn các lá bao ở chồi hoa thì
luôn ôm chặt quanh phát hoa.
Cành hoa không phân nhánh, có thể dựng đứng hay buông thõng. Cành hoa có
thể mang từ vài hoa đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo hình xoắn ốc. Búp hoa
khi đã đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cành hoa, xoay nửa vòng tròn để đưa cánh môi
xuống dưới, sau đó búp hoa bắt đầu bung cánh.
Hoa Cymbidium thoạt nhìn có 6 cánh với 5 cánh gần giống nhau và 1 cánh
môi. Thực ra 3 cánh bên ngoài chính là 3 lá đài, có màu sắc giống 2 cánh hoa ở trong.
Cánh hoa cuối cùng biến đổi thành cánh môi có màu sắc sặc sỡ hơn.
Hoa Cymbidium là hoa lưỡng tính, đặc biệt nhị đực và nhụy cái cùng gắn
chung trên một trục hợp nhụy (trụ nhị - nhụy). Trên trục hợp nhụy, thì nhị nằm ở trên
cùng mang hai khối phấn màu vàng, có gót dính như keo. Khối phấn được đậy bởi
một nắp màu trắng ngà, nắp này dễ mở rời và cách biệt với nuốm nhụy bởi một các
mỏ nổi lên. Do hoa có cấu trúc đặc biệt như vậy nên Cymbidium trong tự nhiên quá


14

trình thụ phấn chỉ xảy ra được nhờ côn trùng. Tận cùng phía bên trong hoa có dĩa mật
và đôi khi còn có tuyến tiết mùi thơm.
Sau khi thụ phấn xong, bầu hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu phình lên và tạo
thành quả. Quả của lan thuộc dạng quả nang có ba góc, bên trong quả chứa hàng trăm
ngàn hạt. Hạt lan có kích thước rất nhỏ trông như bụi phấn, màu vàng lụa. Khi chín,
quả mở theo 3 đường góc và phát tán hạt theo gió, hạt rơi vào nơi có điều kiện thích
hợp như Nm độ, ánh sáng,… thì hạt sẽ nảy mầm thành cây con. Trong tự nhiên tỷ lệ

hạt lan nảy mầm là rất thấp, do đó khi chưa có công nghệ nuôi cấy mô thì việc trồng
và nhân giống lan cần thời gian lâu và gặp nhiều khó khăn.
2.4 Phân loại địa lan.
Trong hệ thống phân loại họ lan là một họ lớn thứ hai với 20.000- 25.000 loài
chỉ sau họ cúc (A.L. Takhtajan). Loài địa lan thuộc
Ngành: Magnoliophyta- Angiospermae
Lớp: Liliopsida- monocotyledemes
Bộ: Orchidales
Họ: Orchidaceae
Chi: Cymbidium.
Theo các tác giả Võ Văn Chi và một số tác giả khác thì trong tự nhiên có chi
Cymbidium có khoảng hơn 50 loài, và ở Việt Nam có 15 loài trong đó chỉ riêng Đà
Lạt có tới 12 loài.
- Cymbidium aloifolium Swartz (Hay Cymbidium aimulans Rolfe; Cymbidum
Pubesecens Lindl).
- Cymbidium cyperifolium.
- Cymbidium dayanum Reichb.F
- Cymbidium devoniaum Paxt
- Cymbidium eburneum Reichb
- Cymbidium ensifolium Swartz (hay Cymbidium sudaicum Schltr)
- Cymbidium erythrostylum Lindl (hay Cymbidium longifolium Don;
Cymbidium Limodorum Angustiflorum Ham)
- Cymbidium gagiteum Wall (hay Cymbidium gradnifolium Griff; Cymbidium
hookerianum. R)
- Cymbidum insigne Rolfe
- Cymbidium Lancifolium Hook. F (hay Cymbidium gibsonii Paxt; Cymbidium
javancum Hook. F.)
- Cymbidium polanei Gagn.
- Cymbidium munronianum King et Plan.

15

Ở Đà Lạt ngoài 12 loài trên còn có nhiều biến chủng khác, nhưng hiện nay vẫn
chưa xác định rõ loài, thứ. Từ lâu đồng bào dân tộc ở Đà Lạt đã dùng từ Tòong Plăng
có nghĩa là “lan sả” để gọi những loài lan này. Nhưng cho tới khi người Pháp và
người Kinh đến Đà Lạt thì phong trào trồng lan và phát triển lan ở Đà Lạt mới bắt đầu
phổ biến và ngày càng phát triển.
Cuối những năm 50 của thế kỷ này, một số giống lan lai đã di nhập vào Đà Lạt
để thoả mãn về nhu cầu giống mới và thị hiếu của một số người chơi lan giàu có.
Trong quá trình nuôi trồng lan lai, giới chơi lan đã tích luỹ dần những kinh nghiệm
trong việc xác định các yếu tố giá thể, giàn che, cách tưới nước bón phân,… phù hợp
với điều kiện khí hậu ở Đà Lạt. Những cây lai đó đã phát triển tốt và cho ra hoa đều
đặn hàng năm. Từ đó phương pháp trồng “lan ngoại” đã được hình thành và được phổ
biến nhưng cũng chỉ dừng lại trong phạm vi hẹp của những người trồng lan tiêu khiển.
Trong mấy năm gần nay, phong trào trồng lan của người dân Đà Lạt đang có
chiều hướng phát triển mạnh các loài địa lan, đặc biệt là các loài lan nhập nội như:
Tím Hột, Miretta xanh, Xanh Chiểu, Trắng bệt, Trắng Bệt, Hồng Bệt, Miss Kim, Đỏ
Bà Mai, Vàng Ba Râu, Miretta xanh,… … Vì các giống lan này cho hoa rất đẹp, màu
sắc sặc sỡ, hương thơm và đặc biệt là lâu tàn nên đã làm thu hút các nhà vườn, các
nghệ nhân chơi hoa, họ đã chú ý nuôi trồng và nhân giống ngày càng nhiều.
2.5 Virus hại thực vật
Virus thực vật được phát hiện vào cuối thế kỉ 19 và đến đầu thế kỉ 20 có rất
nhiều virus gây bệnh cho thực vật lần lượt được phát hiện như virus khảm thuốc lá
dưa chuột, virus thoái hóa khoai tây, virus hại cà chua,…Virus thực vật gây nhiều
thiệt hại như làm giảm chất lượng nông sản, giảm năng suất và có khi là mất 100%
năng suất. Trên thế giới hàng năm bệnh virus gây thiệt hại khoảng 70 tỉ USD
(Nguyễn Văn Tỵ, 2002).
Tại nước ta, nhiều bệnh virus được truyền từ năm này qua năm khác gây thiệt
hại một vài phần trăm cho đến 80- 90% năng suất cây trồng, đặc biệt virus gây thoái

hóa nghiêm trọng các cây trồng nhân giống vô tính. Hiện nay, các cây đang trồng
cũng như cây mô ở Đà Lạt đều không hoàn toàn sạch bệnh, và virus là nguyên nhân
gây bệnh nghiêm trọng nhất cản trở sự phát triển của sản xuất trồng trọt hiện đại. Việc
nghiên cứu và phòng bệnh virus giúp giảm thiệt hại do bệnh virus gây ra là rất cần
thiết, đặc biệt là những nước có nền kinh tế dựa vào nông nghiệp là chính như nước ta.
Ivanopski là người đầu tiên khám phá ra thế giới virus khi nghiên cứu bệnh
trên cây thuốc lá vào năm 1892. Virus được phát hiện đầu tiên đó gây những vết
khảm trên lá cây thuốc lá là Tobaco Mosaic Virus và đây cũng chính là loài virus có
phổ cây chủ lớn nhất hiện nay. Cho đến nay, với sự phát triển của sinh học và sự trợ
giúp của trang thiết bị, phương tiện hiện đại, con người đã phát hiện được trên 4 ngàn
loại virus, trong đó có hơn 100 loại là virus hại thực vật và có tới hơn 25 loài virus
gây hại trên cây lan.
Như vậy, virus thực vật là những vi sinh vật có kích thước vô cùng nhỏ bé và
có những đặc điểm sau đây (PGS.TS Vũ Triệu Mẫn và PGS.TS Lê Lương Tề, 2002).


16

Virus là những nucleoprotein rất nhỏ bé do đó phải quan sát chúng trên kính
hiển vi điện tử. Virus có cấu tạo rất đơn giản: có hai phần chính là lõi axit nucleic và
vỏ protein.
Thông thường virus thực vật có vật chất di truyền là ARN, một số ít còn lại có
vật chất di truyền là ADN.
Virus là vi sinh vật kí sinh ở mức độ tế bào. Virus thực vật có thể nhiễm bệnh
cho một hay nhiều loài cây, và mỗi loại cây có thể nhiễm một hay nhiều loài virus.
Virus thực vật cũng như virus động vật, sau khi xâm nhiễm vào tế bào cây chủ
chúng bắt đầu tác động đến sự trao đổi chất của tế bào, virus sử dụng vật chất của tế
bào để tạo thành vô số virus con mới. Do vậy cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dần,
thoái hóa và suy tàn có khi bị chết. Khoảng thời gian từ lúc virus bắt đầu xâm nhiễm
đến khi cây thoái hóa và chết phụ thuộc vào đặc điểm gây bệnh của các loài khác

nhau và phụ thuộc vào từng loài cây cũng như sức chống chịu của từng cây.
2.5.1 Thành phần cấu tạo
Thông thường mỗi virus được tạo từ hai thành phần chính là protein và axit
nucleic, một số virus đặc biệt còn có cả polyanin, lipit, hoặc một số men đặc hiệu.
Dựa vào những hiểu biết về đặc điểm cấu tọa của virus mà các nhà khoa học đã tìm ra
những chất hóa học có tác dụng làm giảm sự nhân lên của virus trong tế bào cây chủ.
Protein của virus thực vật có tác dụng bảo vệ, bám giữ và có vai trò quan trọng
trong việc virus truyền bệnh qua môi giới. Protein của virus thực vật cũng được tạo
thành từ nhiều axit như alanin, acginin, glixin, triptophan, valin,…Các virus (ARN
hay ADN) sẽ quyết định bản chất protein của chúng.
Ở bên ngoài tế bào cây chủ có những điểm đặc biệt hay những thụ thể để virus
nhận biết mà bám vào, từ đó mới bơm nucleic vào tế bào. Do đó từ kết quả phân tích
vỏ protein của virus và biết được trình tự nhận biết đó thì sẽ tổng hợp được những
chất hóa học có cấu tạo giống các thụ thể để giảm tốc độ lan truyền virus trong cây
chủ.
Axit nucleic của virus giữ vai trò chủ yếu quyết định tính di truyền, khả năng
truyền nhiễm và gây bệnh. Phần lớn các virus thực vật có vật chất di truyền là ARN,
một số ít là ADN. Cả ARN và ADN đều là những đại phân tử chứa hàng trăm ngàn
các đơn vị nhỏ được gọi là các nucleotit. Mỗi nucleotit được cấu tạo từ một gốc
photphat, bazơ nitơ và đường 5 carbon. Có 2 nhóm bazơ nitơ là purin và pirimidin với
5 loại là uracil, adenin, guanin, xitozin và timin.
Dựa trên cấu tạo của các nucleotit mà con người đã tổng hợp nên những dẫn
xuất của chúng hoặc những hóa chất mà về mặt hóa học tương tự các nucleotit này.
Các hóa chất này sẽ cạnh tranh với các nucleotit để tham gia tạo thành các axit
nucleic, và do đó làm sai khác trật tự nucleotit và làm giảm tốc độ tái sản xuất của
virus.
2.5.2 Về cách gọi tên: tên virus thường được đặt theo qui tắc sau
Tên virus = Tên cây chủ + Đặc điểm bệnh + Virus

17

Ví dụ : Tobaco Mosaic Virus: đây là virus gây hại trên cây thuốc lá, đặc điểm
bệnh là gây khảm lá.
Odontoglossum Ringspott Virus: virus này gây hại trên cây lan thuộc chi
Odontoglossum, lá cây bị bệnh có các vết bệnh hình đốm vòng.
Virus là một loại kí sinh phân tử không có cấu tạo tế bào, nhưng cũng không
sinh sản bằng cách phân đôi như vi khuNn, virus sinh sản bằng cách kí sinh vài tế bào
sống và “ bắt ” tế bào cung cấp vật chất cần thiết cho virus tổng hợp thành protein và
vật chất di truyền của virus, sau đó các thành phần này lắp ráp với nhau tạo thành
virus con. Phương thức sinh sản này người ta gọi là sinh sản tái tạo (multiplication).
Như vậy sự sinh sản của virus hoàn toàn dựa vào vật chất của tế bào, làm cho tế bào
kiệt quệ và dẫn đến chết.
Virus thực vật muốn kí sinh và gây bệnh cho cây chủ thì virus phải bám được
vào thành tế bào và xâm nhiễm vào trong tế bào. Bản thân virus không chủ động di
chuyển và xâm nhập vào bên trong tế bào được. Sự xâm nhiễm của virus thực vật vào
cây chủ có thể thông qua các vectơ truyền bệnh như côn trùng, bét nhện,… hoặc qua
các vết thương cơ giới do con người gây ra trong quá trình cắt tỉa cây trồng. Sau khi
xâm nhập được vào bên trong tế bào, sự lây lan của virus từ tế bào này sang tế bào
khác có thể qua cầu nguyên sinh giữa các tế bào, hoặc qua dòng vận chuyển vật chất.
Người ta cũng phát hiện ra rằng trên tế bào có một số điểm nhận biết đặc biệt mà
virus có khả năng bám vào để từ đó xâm nhập vào tế bào, gọi là các thụ thể.
Sau khi xâm nhiễm vào tế bào cây chủ, virus sẽ giải phóng vật chất di truyền
(RNA, DNA) quá trình này gọi là sự lột áo (uncoating). Tiếp đó là quá trình tái tạo
vật chất di truyền và biểu đạt gen.
Đối với virus có vật chất di truyền là ARN (ARN virus), quá trình tái tạo ARN
gồm tái tạo ARN của virus và mARN protein của virus. “ARN virus ” lợi dụng
ribosom của cây chủ phiên dịch ra là enzym ARN- phụ thuộc ARN (ARN- dependent
ARN polymerasa, RdRp). Dưới tác dụng của RdRp tế bào sẽ tổng hợp ra hàng loạt
ARN con của virus và ARN tổ gen của virus, lúc này ARN tổ gen sẽ tiến hành phiên

dịch ra protein vỏ áo. Cuối cùng “ARN con” và “protein vỏ áo” lắp vào nhau tạo thể
virus con hoàn chỉnh. Vô số virus con được tạo thành sản sinh ra enzym phân giải
màng tế báo ký chủ để phóng thích virus con ra ngoài, từ đó tiếp tục xâm nhiễm sang
các tế bào bên cạnh.
Đối với virus có vật chất di truyền là ADN, sự tái tạo lại vật chất di truyền có
thể xảy ra theo con đường sau: đầu tiên là từ DNA sẽ phiên mã ra RNA , sau đó xảy
ra quá trình phiên mã ngược từ RNA qua DNA và quá trình tổng hợp protein từ RNA.
Cuối cùng là protein và DNA sẽ kết hợp với nhau để tạo thành virus mới hoàn chỉnh.
Như vậy virus sử dụng vật chất của tế bào để sinh sản. Do đó virus cũng gây ra
những biến đổi về sinh lí và hình thái bên ngoài của cây bị bệnh.
2.5.3 Virus gây biến đổi về sinh lí cây chủ.
Virus thực vật kí sinh bên trong tế bào và sử dụng vật chất của tế bào cây để
xây dựng cơ thể virus mới do đó gây ra những tác động lên quá trình tổng hợp và trao
đổi chất của tế bào cây chủ. Virus có thể kìm hãm sự tổng hợp, trao đổi chất này
trong khi đó lại kích thích sự tổng hợp và trao đổi chất khác.


18

Virus tác động lên quá trình hoạt động của hệ thống men trong tế bào để kìm
hãm enzym phản ứng tạo nên một số chất này hay kích thích tạo ra nhiều chất có lợi
cho virus. Trong cây bị bệnh virus, hoạt động một số men oxi hóa được tăng cường
như oxidaza (Woods, 1899), peroxidaza (Kokin, 1937), tirodinaza, xitocromoxidaza
(Martin, 1954), polyfenoloxida (Van Kammen và Drouwer, 1964), ngược lại thì hoạt
động của một số men khác bị kìm hãm như catalaza (Vager, 1955).
Virus gây bệnh cho cây cũng tác động lên quá trình hô hấp của cây. Những
thay đổi này không ổn định (có thể cao hay thấp) tùy thuộc vào giai đoạn sinh trưởng
của cây, điều kiện thời tiết hay tình trạng sinh lí của cây trồng.
Bệnh virus thường làm giảm số lượng diệp lục trong lục lạp, do vậy làm giảm
hiệu quả quang hợp của cây. Cùng với sự giảm số lượng diệp lục thì các sắc tố như

antoxianit, carotinoit sẽ tăng lên, làm cho lá cây nhiễm bệnh virus chuyển màu từ màu
xanh sang màu vàng hay nâu đỏ.
Bên cạnh đó, virus thực vật còn làm thay đổi tốc độ trao đổi gluxit trong cây.
Ban đầu cây bị bệnh ở bộ phận hoa, lá cây sẽ tích lũy các chất đường ở vị trí nhiễm
bệnh. Nhưng về sau hàm lượng đường ở các lá bị bệnh sẽ thấp hơn so với các lá khỏe.
Nguyên nhân là do virus ban đầu làm cản trở quá trình vận chuyển ở các bộ phận bị
bệnh đến các bộ phận khác dẫn đến việc tích lũy đường ở các bộ phận này. Sau đó,
virus sử dụng vật chất của tế bào, thúc đNy quá trình hô hấp nên hàm lượng đường ở
bộ phận bị bệnh sẽ thấp hơn các bộ phận khác trong cây.
2.5.4 Virus gây biến đổi về hình thái.
Thông thường cây chủ chỉ có biểu hiện bệnh ra bên ngoài khi mà đã bị nhiễm
bệnh khá nặng. Một số triệu chứng về hình thái do virus gây ra:
- Triệu chứng khảm lá: Là triệu chứng rất phổ biến của nhiều bệnh virus mới hại
thực vật. Lá cây loang lổ chỗ xanh đậm, chỗ xanh nhạt, chỗ biến vàng (Mosaic
- khảm lá). Khảm lá thường xảy ra ở các bệnh như: Virus khảm thuốc lá, khảm
ớt, dưa chuột, khảm lá đậu, khảm lá táo tây.
- Đốm chết hình nhẫn: Thương gặp là khảm và tạo ra đốm chết loại hình nhẫn
(đốm vòng) như bệnh đốm hình nhẫn ở cây đu đủ, cây mận, cây thuốc lá, cây
hoa cNm chướng.
- Triệu chứng hại gân lá: Là hiện tượng bệnh phá hoại ở gân lá dẫn đến gân sáng,
gân chết, gân biến dạng… như virus Y hại cây thuốc lá tạo gân sáng, virus Y
hại một số giống khoai tây (tạo gân biến dạng).
- Khảm lá, lùn cây: Là hiện tượng khảm lá kèm theo cây lùn như Maize mosaic
dwarf virus hay khảm sóc lá (Maize strerk trip mosaic virus) ở ngô, lúa, và các
cây đơn tử diệp.
- Xoăn, cuốn lá: Biến dạng lá như xoăn lá cà chua, cuốn lá khoai tây, xoăn lá
cây ớt, hồ tiêu.
- Biến màu và biến vàng: Là những triệu chứng gây biến vàng (ở lúa), gây hoá
xanh (ở cam, chanh).

19

- Lùn bụi, tàn lụi: Là hiện tượng khá phổ biến như lùn bụi ở cây lạc, cây chuối
rụt, cây cam bị bệnh tritera virus. Vết chết ở thân cây, vết lõm thân như hiện
tượng sưng cành táo, vết lõm thân cây cam, chanh.
- Biến dạng củ, quả: Như ở táo, mận, nho bị nhiễm virus, quả cà chua bị đốm
héo, củ khoai tây ở cây bị bệnh vàng lùn.
Các triệu chứng bệnh trên còn phụ thuộc vào giống cây kí chủ, điều kiện môi
trường và chủng loại virus gây bệnh mà có sự biến đổi. Cùng một loại virus mà ở ba
nhóm chủng khác nhau có thể thể hiện thành nhiều nhóm triệu chứng khác nhau.
Bên cạnh đó các triệu chứng bệnh này không mang tính đặc thù, ví dụ như
virus bệnh đốm vòng thì vết bệnh cũng tương tự như bệnh đốm do một số loài nấm
gây nên. Do đó bệnh virus không chỉ khó phát hiện khi mới chớm bị, mà khi bị nặng
và có biểu hiện bệnh ra bên ngoài thì cũng rất dễ nhầm với bệnh do bệnh sinh lí, bệnh
nấm, hay một số tác nhân khác gây ra.
Tóm lại virus gây bệnh hại ở thực vật có một số đặc điểm sau:
Cây bị bệnh virus hiện nay thì không thể chữa được mà chỉ có thể làm ức chế
sự sinh sản của virus trong cây.
Bệnh virus gây thiệt hại lớn cho người trồng. Đối với những cây ngắn ngày
virus gây thiệt hại nhanh chóng. Ví dụ ở nước ta hiện nay, bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá
ở cây lúa do virus gây ra và lan truyền nhờ rầy nâu đang bùng phát, gây hậu quả nặng
nề cho bà con vùng đồng bằng Sông Cửu Long. Nhưng thiệt hại nặng nề hơn cả là
virus không làm cho cây trồng bị chết ngay khi còn nhỏ mà làm thoái hoá, giảm sức
sống, dần dần dẫn đến tàn lụi sau khi người trồng đã đầu tư rất nhiều vào việc chăm
sóc và nuôi dưỡng cây. Ví dụ ở Đà Lạt, có nhiều gia đình trồng địa lan đã mất 70%
đến 100% chậu địa lan đang trong giai đoạn có hoa.
Bệnh virus tồn tại lâu, khó phát hiện và triệu chứng bên ngoài không đặc thù
dễ gây nhầm lẫn. Việc chuNn đoán bệnh thì phức tạp, đòi hỏi kĩ thuật cao. Biểu hiện
bên ngoài của cây bị bệnh virus có chu kì biến đổi theo chu kì phát triển của virus,

theo tác động của yếu tố môi trường, đặc điểm sinh lí của cây chủ. Do đó những biểu
hiện bệnh bên ngoài của cây cũng thay đổi gây nhầm lẫn cho người trồng. Và đến khi
cây chủ không còn khả năng phục hồi theo chu kì bệnh thì cây sẽ hoàn toàn tàn lụi. Ví
dụ bệnh virus hại địa lan tại Đà Lạt, trong điều kiện mùa khô, nhiệt độ cao diễn biến
bệnh virus chậm chạp, nhưng vào mùa mưa lại bùng phát.
2.6 Virus hại địa lan
Những triệu trứng bệnh virus đầu tiên được miêu tả vào năm 1943 trước khi
Ivanopski phát hiện ra sự tồn tại của thế giới virus. Virus thực vật gây hại trên rất
nhiều loại cây trồng, có thể thấy trong tự nhiên đa số cây đều bị nhiễm virus. Ở nước
ta mà đặc biệt ở Đà lạt, trong những năm gần đây cùng với sự gia tăng về nhu cầu và
qui mô trồng lan thì bệnh virus hại lan cũng bùng phát và đã gây ra nhiều thiệt hại
nặng nề về kinh tế cho người trồng lan.
Theo ước tính thì đến nay có khoảng 25 loài virus hại lan. Những triệu chứng
biểu hiện bệnh virus gây hại trên lan rất đa dạng và không theo qui tắc nào cả. Đa số
virus thực vật gây vàng, chết mô hay hoại mô (thối nhũn) và biểu hiện ban đầu của


20

virus nhiều khi giống với bệnh sinh lí. Ví dụ: Bệnh trên địa lan do Cymbidium Mosaie
Virus gây ra, ban đầu giống với biểu hiện khi bón quá nhiều urê cho cây.
Trong họ lan thì địa lan là cây đặc thù của xứ lạnh và được trồng khá lâu ở Đà
lạt và có giá trị kinh tế cao. Ngày nay, dưới sự phát triển của kĩ thuật nuôi cấy mô,
việc mở rộng qui mô sản xuất lan đang gặp nhiều thuận lợi, bên cạnh đó thì việc lây
lan bệnh virus cũng đang là nguy cơ số một cho người trồng lan nếu cây lan không
sạch bệnh virus.
Trong số những loài virus hại địa lan hiện nay thì tại Đà Lạt có một số loài gây
hại chủ yếu: Cymbidium Mosaic Virus (CyMV), Tobaco Mosaic Virus (TMV),
Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV), Cybidium Ringspot Virus (CyRV), Odotoglosum
(ORSV)...

2.6.1 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Cymbidium Mosaic Virus trên cây
địa lan
Trên lá cây nhiễm bệnh ban đầu có nhiều chấm đen nhỏ, sau đó phát triển
thành vệt màu đen. Những vết bệnh lớn liên kết với nhau tạo thành những mảng đen ở
cả mặt trước và mặt sau.
Khi bệnh nặng thì những chấm đen ban đầu phát triển trên cả phần bẹ lá, toàn
bộ lá khô đi nhanh chóng và gây ra hiện tượng khô xám giả hành.
Trên những cây lan nhiều năm tuổi, trong cùng một chậu thì tất cả giả hành,
chồi non và phát hoa đều bị bệnh.
CyMV ngoài tác động làm khô lá thì còn gây thối theo đám từ gân lá ra ngoài
mép lá.
2.6.2 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Tobaco Mosaic Virus orchid trên
cây địa lan
TMV orchid theo dòng vận chuyển vật chất lây lan khắp hệ thống cây trồng và
gây ra hiện tượng khảm lá, lùn cây, cây còi cọc.
Vết bệnh thường xuất hiện ở phần lá, ban đầu trên lá non xuất hiện một vài
đốm vàng xanh, sau đó các đốm xuất hiện ngày càng nhiều và gây hoại lá.
Với các lá bị nhiễm nhẹ, phiến lá nhỏ hẹp và mặt lá sần sùi.
Đặc điểm của vết bệnh là các tế bào biểu bì trên phần sáng của vết bệnh nhỏ
hẹp, xếp sít nhau, ở phần xanh lam của vết bệnh tế bào biểu bì lớn hơn bình thường.
2.6.3 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Tomato Spotted Wilt Virus trên cây
địa lan
Cây nhiễm virus TSWV có biểu hiện bệnh rõ rệt ở phần hoa, trên cả nụ non và
hoa đã nở, nhưng chủ yếu là hại ở phần nụ hoa. Các vết bệnh thường to và có màu
đen.


21

2.6.4 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Cybidium Ringspot Virus (CyRV)

trên cây địa lan
Phần lá trên cây bị bệnh do virus CyRV thường có nhiều sọc vàng nhạt phân
biệt rõ với cùng xanh của phiến lá. Cây bị bệnh nặng thì các vết bệnh liên kết lại với
nhau làm cho cây bị vàng, các lá xếp sít với nhau và dựng thẳng đứng.
Bệnh thường xuất hiện ở cây con 6 tháng tuổi với bộ lá dày có màu vàng nhạt.
Trên cây lớn thì bệnh khiến cho phát hoa thấp ngắn, tuy có nụ hoa nhưng lại
không nở được.
2.7 Một số biện pháp đã được áp dụng để có cây sạch bệnh virus
Ngày nay, việc tạo ra các cây giống sạch bệnh để cung cấp cho người trồng là
vô cùng quan trọng và cần thiết. Hiện nay chỉ có hai phương pháp được sử dụng để có
cây trồng sạch bệnh là cây gieo từ hạt không bị tổn thương và phương pháp phục
tráng giống bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
2.7.1 Về phương pháp gieo hạt
Phương pháp nhân giống bằng hạt hiện nay là phương pháp nhân giống thường
được sử dụng cho lan. Đây là phương pháp tạo ra được số lượng lớn các cây con và
chủ yếu áp dụng với những cây mà thời gian tạo cây con bằng phương pháp nhân
giống vô tính là rất lâu và khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên. Bên cạnh đó để
nâng cao tỉ lệ hạt nảy mầm cho những cây có thể nảy mầm trong điều kiện tự nhiên
như lan, người ta gieo hạt trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Vấn đề quan trọng nhất trong phương pháp này là tìm ra môi trường gieo hạt
tối ưu để rút ngắn thời gian và tăng tỉ lệ hạt nảy mầm.
2.7.2 Về phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Đây là một trong những phương thức nuôi cấy mô trong phòng thí nghiệm
(nhân giống in- vitro). Nhân giống in- vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả
các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường
xác định ở điều kiện vô trùng. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như
muối khoáng, các hormone tăng trưởng, carbon, và một số chất bổ trợ khác. Kĩ thuật
nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mô
như lá, thân hoặc rễ.
2.7.3 Một số biện pháp bổ trợ khác

2.7.3.1 Phương pháp nhiệt độ
Thông thường, để ức chế sự tái bản của virus thì các mẫu thực vật được xử lí
với nhiệt độ ở 30 – 37
o
C trong thời gian từ 10 - 14 ngày hay ở 40 – 55
o
C trong 5 - 10
phút (Nguyễn Văn Tỵ, 2002).
Tuỳ vào loại mẫu cấy, kích thước mẫu cấy mà có thời gian và nhiệt độ xử lí
thích hợp. Sau đây là một số thí nghiệm đã tiến hành của nhiều tác giả với mục đích
ức chế sự nhân bản của virus bằng nhiệt độ là:
Để ức chế virus PVY - Potato Virus Y trên cây khoai tây, năm 1956 Thomson,
năm 1998 Leonhardt và cộng sự, tiến hành xử lí mẫu ở 35 – 38
o
C trong 30 - 40 ngày.


22

Walkey và Freeman xử lí mẫu với nhiệt độ 40
o
C trong 16h có chiếu sáng và
22
o
C trong 8 h tối, trên cây Nicotiana Rustica, để ức chế virus CMV - Cucumber
Mosaic Virus.
2.7.3.2 Phương pháp hoá học
Một trong những phương hướng khác trong việc ức chế sự tái bản virus trong
tế bào là sử dụng hoá chất mà đó là những dẫn xuất halogen tiền thân của sự trao đổi
chất axit nucleic.

Trong giai đầu của quá trình tìm kiếm, các nhà khoa học đã tìm thấy một số
hoạt chất như: Iot deoxyuridin, 2 - thiouracil,… Đây là những chất đồng dạng với
purin, pirimidin. Những chất này có tác dụng làm rối loạn sự tổng hợp bình thường
của các axit nucleic của virus. Bên cạnh đó những hoạt chất được tìm thấy trong thời
gian này tuy có tác dụng ức chế tác động của virus nhưng đồng thời cũng gây độc cho
tế bào.
Hợp chất được sử dụng sớm nhất trong là 2 – thiouracil, đựơc tìm ra vào năm
1952 do hai nhà khoa học là Commoner và Mercer. Từ lâu người ta đã biết đa số
virus có vật chất di truyền chứa uracil là một phần của acid nucleic. Do đó Commoner
và Mercer đã ức chế sự tái bản của virus trong cây thuốc lá bằng cách sử dụng 2 -
thiouracil.
Vào năm 1953, Jeener và Rosseels nhờ việc sử dụng đồng vị của sulfua (S
35)

của 2 - thiouraci và chứng minh được rằng S
35
đã tham gia vào acid nucleic của virus.
Sau đó hàng loạt những chất hoá học khác thuộc nhóm này được nghiên cứu.
Một số chất chất khác như 5- Fluorouracil (Heidelberger và cộng sự, 1957), 5 -
Chlorouracil, Azaguanin (Matthews, 1953),…
8 - Azaguanin là một hợp chất không có trong tự nhiên và được tổng hợp do
Matthews vào năm 1953. Matthews đã sử dụng 8 - Azaguanin trong thí nghiệm ức
chế sự nhân bản của virus CMV (Cucumber Mosaic Virus) và virus TMV (Tobaco
MosaicVirus).
Và thực tế là việc sử dụng 2 - thiouracil và một số chất hoá học khác thời kì
này đều không hiệu quả (Tam, 1959). Những chất này không chỉ ức chế sự tái bản
của virus mà đồng thời ức chế sự sinh trưởng và thậm chí gây chết đối với tế bào.
Nhưng dù sao, 2 - thiouracil khi sử dụng ở nồng độ phù hợp cũng thu được một số
thành công trong việc ức chế được sự tái bản của virus (Holmes,1955).
Ngày nay, ribazole là một hóa chất do con người tổng hợp được sử dụng rộng

rãi trong ức chế virus ở động vật và cả thực vật mà ít gây ảnh hưởng xấu lên tế bào
vật chủ nhất.
Ribazole là hợp chất thuộc nhóm kháng chuyển hoá nucleotide của virus do đó
có tác dụng ức chế sự nhân bản của virus trong tế bào.
Ribazole có công thức hoá học là C
18
H
12
N
4
O
5
và cấu tạo hoá học như sau: