Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của dung dịch thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin 0,3
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.15 MB, 46 trang )
BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC
Dược HÀ NỘI
BÙI THANH MAI
NGHIÊN CỨU MỘT s ố YÊU Tố ẢNH HƯỞNG
■
ĐẾN ĐỘ■ ỔN ĐỊNH
■ CỦA
DUNG DỊCH THUỐC NHỎ MAT CIPROFLOXACIN 0,3%
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1997- 2002
Người hướng dần : TS. NGUYỄN ĐĂNG HOÀ
DS. NGUYỄN NGỌC DƯƠNG
Nơi thực hiện
: BỘ MÔN BÀO CHẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Thời gian thực hiện: 2/2002-5/2002
HÀ NỘI, 5 - 2002
JẼỜ3@tẮMƠÌl
Em xin chân thành bày tở lòng kính trọng và H êt ơn eâu õắc tâ i:
TS. NGUYỄNĐĂNGHOÀ
TS. NGUYỄNVÃNLONG
DS. NGUYỄNNGỌCDƯƠNG
là những n0ưài thâỳ đ ấ h ể t lòng tậ n tình hướng dấn, giú p ắ â ổm trong su ốt
quá trìn h nghiên cứu và hoàn thằnh khoá luận tố t nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn cơ CHU THỊ LÔC Ị?ộ mon Vi einh ôinh học và
tơàn th ê ổđc thẩy giáo, cồ giáo, các co kỹ th u ậ t ựiên bộ mon 3àơ ch ê 'gia
đình ựà bạn bè đã tạ o diểu kiện giú p đỡ em trong th à i gia n nghiên cứu ựà
hoàn thành khoá luận.
Hà nội, thâng 5 năm 2 0 0 2
ôin h ựỉên
BÙI THANH MAI
MỤC LỤC
NHỮNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN Đ Ề..............................................................................................................1
PHẦN 1- TỔNG QUAN............................................................................................ 2
1.1. Khái quát vê dạng thuốc nhỏ mắt.....................................................................2
1.1.1. Định nghĩa.........................................................................................................2
1.1.2. Thành phần thuốc nhỏ mắt.............................................................................. 2
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của thuốc nhỏ mắt.............................4
1.1.4. Sinh khả dụng và một số biện pháp làm tăng sinh khả dụng của
thuốc nhỏ mắt..............................................................................................................6
1.2. Vài nét về ciprofloxacin...................................................................................9
1.2.1. Công thức hóa học............................................................................................ 9
1.2.2. Tính chất..........................................................................................................10
1.2.3. Đặc tính dược động học.................................................................................. 11
1.2.4. Phổ tác dụng và cơ chế................................................................................... 11
1.2.5. Chỉ định, liều dùng và cách sử dụng............................................................. 12
1.2.6. Tác dụng không mong muốn và độc tính......................................................12
1.2.7. Chống chỉ định............................................................................................... 12
1.2.8. Tương tác thuốc................................................................................. .......... 12
1.2.9. Các dạng thuốc chứa ciprofloxacin.............................................................. 13
1.2.10. Phương pháp định lượng............................................................................... 13
PHẦN 2- THỰC NGHIỆM VÀ KÊT q u ả ...................... .....................................14
2.1. Hoá chất, thiết bị thí nghiệm...........................................................................14
2.1.1. Hóa chất...........................................................................................................14
2.1.2. Thiết bị máy móc............................................................................................. 14
2.2. Phương pháp nghiên cứ u ...............................................................................14
2.2.1. Pha chế dung dịch thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin hydroclorid......................14
2.2.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng
duy trì độ tan của ciprofloxacin trong dung dịch thuốc nhỏ mắt 0,3%..................15
2.2.3. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến
độ ổn định của dung dịch thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin 0,3%................................ 17
2.2.4 Phương pháp thử in vitro của một số công thức thuốc nhỏ mắt
trên vi khuẩn gây bệnh..............................................................................................20
2.3. Kết quả thực nghiệm và bàn luận.................................................................. 21
2.3.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng
duy trì độ tan của ciprofloxacin trong dung dịch thuốc nhỏ mắt 0,3%..................21
2.3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến độ ổn định
của dung dịch thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin 0,3%...................................................23
2.3.3. Kết quả thử in vitro của một số công thức thuốc nhỏ mắt
ciprofloxacin 0,3% trên vi khuẩn gây bệnh............................................................. 36
PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT....................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 40
NHŨNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT
cip
: ciprofloxacin
CT
: công thức
CTBĐ
: công thức ban đầu
ĐK
: điều kiện
HPLC
: sắc kỷ lỏng hiệu năng cao
HPMC
: hydroxy propyl metyl cenllulose
MIC
: nồng độ ức chế tối thiểu
nt
: như trên
OXH
: oxy hoá
PVA
: alcol polyvinic
ĐẶT VÂN ĐỂ
Kháng sinh là nhóm thuốc quan trọng được sử dụng khá rộng rãi trong điều
trị ở một nước nhiệt đới như nước ta. Việc sử dụng các kháng sinh mới như nhóm
thuốc qụinolon (đặc biệt là quinolon thế hệ II) ngày càng được mở rộng để đáp
ứng nhu cầu điều trị, với nhiều dạng bào chế khác nhau, phù hợp với từng đường
dùng. Thuốc nhỏ mắt chứa kháng sinh nhóm quinolon thế hệ II cũng nằm trong
xu hướng như vậy.
Với phạm vi sử dụng trong chuyên khoa mắt, thuốc nhỏ mắt là dạng thuốc
dùng tại chỗ để điều trị hay chuẩn đoán các chứng bệnh trên bề mặt mắt cũng
như các tổ chức sâu bên trong mắt. Thuốc nhỏ mắt có nhiều ưu điểm như: dễ sử
dụng nên người bệnh có thể tự dùng theo sự chỉ định của thầy thuốc; hơn nữa
dược chất tập trung chủ yếu ở mắt và chỉ một phần nhỏ dược chất hấp thu vào
tuần hoàn máu nên hạn chế tác dụng không mong muốn.
Tuy nhiên, dạng thuốc nhỏ mắt có sinh khả dụng thấp và kém ổn định, nhất
là khi pha ở dạng dung dịch. Vì vậy, để một chế phẩm thuốc nhỏ mắt có độ ổn
định và sinh khả dụng cao cần nghiên cứu lựa chọn công thức thuốc thích hợp.
Từ những nhận thức trên và xuất phát từ nhu cầu thực tế, chúng tôi thực hiện
đề tài: "Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của dung dịch thuốc
nhỏ mắt ciprofloxacin 0,3%"Mục tiêu đề tài là:
- Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của ánh sáng và nhiệt độ, pH dung dịch,
chất điều chỉnh pH, nồng độ hệ đệm, chất chống oxy hoá, chất làm tăng độ nhớt
tới độ ổn định của dung dịch thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin 0,3%.
- Sơ bộ thử tác dụng in vitro của một số công thức thuốc nhỏ mắt trên các vi
khuẩn kiểm định.
1
!
PHẦN 1- TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về dạng thuốc nhỏ mắt
1.1.1. Định nghĩa
Thuốc nhỏ mắt là những chế phẩm lỏng vô khuẩn, có thể là dung dịch
hoặc hỗn dịch, chứa một hay nhiều dược chất, được pha chế và đóng gói thích
hợp để nhỏ vào túi kết mạc với mục đích điều trị hay chuẩn đoán bệnh ở mắt.
Thuốc cũng có thể được bào chế dưới dạng bột vô khuẩn và được pha với chất
lỏng vô khuẩn thích hợp ngay trước khi dùng [6], [22].
1.1.2. Thành phần thuốc nhỏ mắt
Một chế phẩm thuốc nhỏ mắt gồm 4 thành phần: dược chất, dung môi,
các thành phần khác và bao bì đựng thuốc [6], [20].
1.1.2.1. Dược chất
Có nhiều dược chất dùng để pha chế thuốc nhỏ mắt và có thể chia chúng
thành nhóm theo tác dụng dược lý: điều trị nhiễm khuẩn, chống viêm tại chỗ,
gây tê bề mặt, điều trị Glaucom, giãn đồng tử, thuốc dùng chuẩn đoán...
1.1.2.2. Dung môi
Dung môi để pha thuốc nhỏ mắt chủ yếu là nước cất vô khuẩn. Dầu thực
vật cũng được dùng làm dung môi (hay dùng dầu thầu dầu). Ngoài ra, người ta
còn sử dụng hỗn hợp dung môi để làm tăng độ tan, độ ổn định và thời gian lưu
của thuốc tại vùng trước giác mạc.
1.1.2.3. Các chất thêm vào công thức thuốc nhỏ mắt
-
Chất sát khuẩn: Dù đã được tiệt khuẩn, nhưng thuốc nhỏ mắt thường
được đóng gói với thể tích dùng nhiều lần mới hết một đơn vị đóng gói. Do đó
nguy cơ thuốc bị nhiễm khuẩn từ môi trường sau mỗi lần nhỏ thuốc rất cao.
Để giữ cho thuốc luôn vô khuẩn, việc thêm chất sát khuẩn vào công thức là
cần thiết (trừ trường hợp có chống chỉ định). Chất sát khuẩn có tác dụng tiêu
diệt ngay vi cơ thể rơi vào thuốc, thường dùng: benzalkonium clorid, các hợp
2
chất thuỷ ngân hữu cơ, clorobutanol, alcol phenyl etylic, clohexidin acetat, các
paraben...
- Chất điều chỉnh pH được thêm vào công thức thuốc nhỏ mắt với mục
đích tăng độ tan, tăng độ ổn định của dược chất, tăng khả năng hấp thu dược
chất qua giác mạc và tăng tác dụng diệt khuẩn của chất sát khuẩn. Ngoài ra,
pH phù hợp sẽ giảm kích ứng mắt, không gây phản xạ tăng tiết nước mắt,
giảm rửa trôi liều thuốc đã nhỏ. Một số dung dịch và hệ đệm thường dùng để
điều chỉnh pH thuốc nhỏ mắt là: dung dịch acid boric 1,9% (kl/tt), hệ đệm
borat, hệ đệm phosphat, hệ đệm acetat, hệ đệm citrat...
- Chất đẳng trương được thêm vào thuốc nhỏ mắt với mục đích tạo áp
suất thẩm thấu của thuốc nhỏ mắt bằng với áp suất thẩm thấu của dịch nước
mắt để thuốc không gây kích ứng mắt, không gây phản xạ tăng tiết nước mắt
và rửa trôi liều thuốc. Các chất đẳng trương hay dùng là: natri clorid, kali
clorid, các muối dùng trong dung dịch đệm, glucose và manitol...
- Chất chống oxy hoá là cần thiết với các thuốc nhỏ mắt có dược chất dễ
bị oxy hoá. Để tăng hiệu quả chống oxy hoá, người ta thường phối hợp các
chất chống oxy hoá (Na2S03, NaHS03 ...) với chất hiệp đồng chống oxy hoá
natri edetat. Natri edetat còn tăng hiệu quả sát khuẩn của các chất sát khuẩn
như benzalkonium clorid, clohexidin acetat, polymyxin B sulíat...
- Chất làm tăng độ nhớt là các polyme, như alcol polyvinic với ưu điểm
tương thích với nhiều chất thường gặp trong thuốc nhỏ mắt và có thể tiệt
khuẩn bằng phương pháp lọc và bằng nhiệt. Ngoài ra, hydroxypropyl
metylcellulose (HPMC), metylcellulose (MC), dextran, PVP, PEG 300 hoặc
PEG 400 cũng được dùng trong thuốc nhỏ mắt.
- Chất diệrt hoạt được thêm vào công thức thuốc nhỏ mắt với mục đích
tăng độ tan dược chất ít tan, làm chất gây thấm khi pha hỗn dịch nhỏ mắt và
tăng sinh khả dụng thuốc. Chất diện hoạt có thể gây tổn thương mắt, do vậy
chúng được sử dụng hạn chế trong thuốc nhỏ mắt. Mức độ độc theo thứ tự:
3
chất diện hoạt anion > cation > không ion hoá. Các chất hay dùng:
benzalkonium clorid (đồng thời là chất sát khuẩn có trong thành phần của
60% thuốc nhỏ mắt), benzethonium clorid, chất diện hoạt không ion hoá như
Tween 20, Tween 80,
1.1.2.4. Bao bì đựng thuốc nhỏ mắt
Bao bì tiếp xúc trực tiếp với thuốc nên có thể tương tác với các thành
phần của thuốc, do nhả các chất hoặc để thẩm lậu khí từ bên ngoài vào thuốc.
Bao bì đựng thuốc nhỏ mắt thường đi kèm với ống nhỏ giọt tạo ra giọt thuốc
có dung tích 30- 50(0.1. Bao bì phải được xử lý và tiệt trùng trước khi đóng
thuốc.
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của thuốc nhỏ mắt
Độ ổn định của thuốc là khả năng thuốc giữ được những đặc tính vốn có
về vật lý, hoá học, vi sinh, đặc tính về dược lý, độc tính... trong điều kiện bảo
quản xác định [1].
Có nhiều yếu tố tác động đến độ ổn định của thuốc nhỏ mắt [6], [10]:
I.I.3.I. Yếu tố thuộc vê công thức
- Dược chất Dược chất yêu cầu phải có độ tinh khiết cao về lý, hoá, sinh
nếu có thể, đạt những yêu cầu như dùng pha thuốc tiêm. Nếu dược chất không
tinh khiết sẽ gây tương kỵ với các thành phần khác của thuốc, giảm độ ổn định
của thuốc. Các dược chất có thể tồn tại dưới các dạng (dạng acid, base, este,
dạng kết tinh hay vô định hình...) có độ tan và độ bền vững lý, hoá khác nhau.
Ví dụ, dạng base tan tốt trong môi trường acid, dạng estẹ dễ bị thuỷ phân
trong môi trường kiềm .. .v.v.
- Dung môi: Dung môi ảnh hưởng đến khả năng tan của các thành phần
trong thuốc. Ví dụ dung môi nước hoà tốt chất sát khuẩn benzalkonium clorid
nhưng ít hoà tan các paraben. Người ta có thể dùng hỗn hợp dung môi đồng
tan để tăng độ tan của dược chất. Ngoài ra, dung môi còn ảnh hưởng đến sự
phân huỷ dược chất. Dung môi nước và pH kiềm là điều kiện tốt cho phản ứng
4
thuỷ phân, nên với dược chất dễ bị phân huỷ có thể thêm dung môi đồng tan
với nước để hạn chế sự thuỷ phân.
- Các chất khác:
Chất điều chỉnh pH: Mỗi dược chất tan tốt trong khoảng pH nhất định.
Hơn nữa, pH là tác nhân xúc tác phản ứng phân huỷ thuốc (phản ứng thuỷ
phân, oxy hoá, quang hóa, racemic hoá...) nên mỗi dược chất chỉ ổn định
trong một giới hạn pH nào đó. Với dạng thuốc dung dịch, dược chất phân tán
ở mức độ phân tử, các biến đổi hoá học càng dễ xảy ra. Vậy cần cân nhắc,
điều chỉnh pH về giá trị tại đó thuốc ổn định và tan được ở mức nồng độ dược
chất đủ đảm bảo gây tác dụng điều trị.
Dược chất bị phân huỷ, đồng thời các thành phần của bao bì nhả vào
thuốc trong quá trình bảo quản làm pH thay đổi. Để khắc phục sự thay đổi cần
dùng hệ đệm để duy trì pH mà tại giá trị đó thuốc ổn định. Tuy nhiên, hệ đệm
nói chung như acetat, phosphat, borat đều có khả năng thúc đẩy tốc độ phân
huỷ thuốc nên người ta sử dụng hệ đệm ở nồng độ thấp tối thiểu có thể được.
Bên cạnh đó, mỗi loại hệ đệm có khả năng đệm tốt nhất ở pH xác định, ví dụ
hệ đệm acetat ở pH = 4,76, dihydrophosphat ở pH = 7,21...[18]. Do đó nên
lựa chọn loại hệ đệm thích hợp với pH của dung dịch thuốc.
Chất làm tăng đố nhớt và chất diên hoat ít nhiều làm tăng khả năng hoà
tan của dược chất, điều này thực sự có ý nghĩa với dược chất ít tan. Ngoài ra,
với dạng hỗn dịch nhỏ mắt, chất diện hoạt giúp tăng tính thấm của dược chất,
chất làm tăng độ nhớt tăng khả năng treo tiểu phân dược chất.
Chất chống oxv hoá: Với dược chất dễ bị oxy hoá, khi pha chế dưới dạng
dung dịch thuốc nhỏ mắt sự oxy hoá diễn ra càng mạnh. Để hạn chế sự oxy
hoá, người ta thường thêm chất chống oxy hoá phù hợp với pH đã chọn.
- Bao bì đựng thuốc: Mỗi loại bao bì có nhược điểm riêng. Chất dẻo dễ
thấm ẩm, thấm oxy và khí carbonic từ không khí. Thuỷ tinh nhả kiềm và ion
5
kim loại gây mất ổn định thuốc.. .Do vậy, cần lựa chọn loại vật liệu thích hợp
để làm bao bì thuốc.
1.1.3.2. Yếu tô thuộc về kỹ thuật bào chê
Có nhiều yếu tố kỹ thuật bào chế ảnh hưởng độ ổn định của thuốc như:
trình tự và thời gian pha chế, pha chế kín hay hở, sự có mặt của khí trơ, nhiệt
độ và thời gian tiệt khuẩn...Ví dụ, trong công thức thuốc nhỏ mắt
Cloramphenicol 0,4%, natri borat có khả năng làm tăng độ tan của
Cloramphenicol (nồng độ bão hòa trong nước là 0,25%). Nhưng dung dịch
natri borat có pH trên 7 nên làm giảm tính bền vững của Cloramphenicol. Vì
thế, để đảm bảo độ ổn định của Cloramphenicol người ta phải pha hệ đệm
boric- borat rồi mới hoà tan Cloramphenicol [6].
Yêu cầu quan trọng với thuốc nhỏ mắt là vô khuẩn. Thực tế chỉ một số ít
dược chất trong dung môi nước thông thường ổn định ở điều kiện tiệt trùng
121°c trong 20- 30 phút. Do vậy, thuốc nhỏ mắt thường được sản xuất và lọc
vô khuẩn vào bao bì đã được tiệt trùng, cùng với chất sát khuẩn trong thành
phần thuốc đảm bảo thuốc ổn định về mặt sinh học [10].
* Điều kiện bảo quản: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng.. .đều ảnh hưởng đến độ
ổn định của thuốc. Nhiệt độ thúc đẩy quá trình phân huỷ của hầu hết các dược
chất. Với dược chất nhạy cảm ánh sáng, sự tiếp xúc với ánh sáng làm giảm độ
ổn định của thuốc.
1.1.4. Sinh khả dụng và một số biện pháp làm tăng sinh khả dụng của
thuốc nhỏ mắt
1.1.4.1. Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt
Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt được quyết định bởi sự phân bố thuốc trước
giác mạc, sự hấp thu thuốc qua giác mạc và hấp thu thuốc vào kết mạc [20].
* Phân bố thuốc trước giác mạc
Sự phân bố thuốc trước giác mạc chịu ảnh hưởng của hệ thống sinh lý
nước mắt. Nước mắt được tiết ra liên tục với tốc độ 1jLxl/phút, pH khoảng 7,4,
6
chứa một số chất điện giải nên có khả năng đệm nhất định, chứa 0,7% protein
[6].
Phân bố thuốc trước giác mạc là yếu tố quyết định sự hấp thu của thuốc
vào cấu trúc bên trong mắt. Nồng độ thuốc trước giác mạc chịu tác động bởi
các yếu tố: sự giảm thể tích thuốc nhỏ vào khi thể tích đó vượt quá sức chứa
của mắt; sự bài tiết và luân chuyển của nước mắt nhất là khi mắt bị kích ứng
do pH và dung lượng đệm của thuốc khác xa pH và dung lượng đệm sinh lý
của nước mắt; liên kết protein trong thành phần nước mắt với thuốc; sự hấp
thu thuốc vào kết mạc. Những yếu tố trên làm giảm nồng độ và thời gian tiếp
xúc của thuốc trước giác mạc dẫn tới giảm lượng thuốc hấp thu vào giác mạc,
giảm sinh khả dụng [20].
* Hấp thu thuốc qua giác mạc
Giác mạc gồm 3 lớp mô: biểu mô và nội mô nhiều lipid, lớp đệm ở giữa
có hàm lượng nước cao. Vậy dược chất phải có hệ số phân bố dầu/nước thích
hợp để có thể thấm sâu vào tổ chức bên trong của mắt, do đó làm tăng sinh
khả dụng của thuốc dùng điều trị các bệnh ở những tổ chức bên trong mắt[6].
Hấp thu dược chất qua giác mạc được quyết định bởi: sự luân chuyển của
dịch nước mắt, nồng độ thuốc trước giác mạc và sự thấm của dược chất qua 3
lớp mô giác mạc [20].
* Hấp thu thuốc vào kết mạc: Kết mạc có rất nhiều mạch máu và là
màng có tính thấm tốt với nhiều dược chất. Thuốc hấp thu vào kết mạc chủ
yếu đi vào tuần hoàn gây tác dụng phụ và làm giảm sinh khả dụng của thuốc
cần thấm sâu vào tổ chức trong giác mạc, trừ trường hợp đích tác dụng là kết
mạc. Tuy nhiên, hấp thu thuốc vào kết mạc nhìn chung không đáng kể so với
vào giác mạc [20].
Nói chung, sinh khả dụng thuốc nhãn khoa rất thấp, thường dưới 10%, có
khi 1% hoặc thấp hơn. Sinh khả dụng thấp do: cơ chế bảo vệ sinh lý của hệ
thống nước mắt, sự ngăn cản xâm nhập dược chất của cấu trúc giác mạc [20].
7
1.1.4.2. Các biện pháp làm tăng sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt
Để tăng sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt nsười ta có thê áp dụng các biện
pháp sau:
a) Tăng sự phân bô thuốc trước giác mạc (tăng thòi gian lưu thuốc trước
giác mạc)
Các biện pháp tăng thời gian lưu của thuốc trước giác mạc bao gồm:
* Han chế gây kích ứng mát
Dịch nước mắt sinh lý có pH 7,4 và có áp suất thẩm thấu nhất định. Khi
ta nhỏ thuốc có pH và áp suất thẩm thấu khác với nước mắt sẽ gây kích ứng
mắt, tạo phản xạ chớp mắt và tăng tiết nước mắt để trở về trạng thái ban đầu.
Do đó, liều thuốc bị pha loãng và rửa trôi. Như thế cần tác động vào 2 thông
số là pH và độ đẳng trương [6].
Điều chỉnh pH về giá trị trung tính hoặc gần trung tính, trong điều kiện
không ảnh hưởng độ ổn định và độ tan của dược chất. Với thuốc nhãn khoa,
pH = 4,5- 11,5 không gây tổn thương cho mắt. Nếu điều chỉnh pH bằng hệ
đệm thì hệ đệm phải có dung lượng đệm thấp để nước mắt có thể trung hoà pH
nhanh chóng. Dung lượng đệm thường từ 0,01 đến 0,1 là đủ, với nồng độ muối
và acid đệm từ 0,05 đến 0,5M [18].
Khi dung dịch thuốc nhỏ mắt quá nhược trương có thể gây phù nề giác
mạc, còn nếu ưu trương quá có thể gây mất nước ở biểu mô giác mạc (ngoại
trừ khi cần ưu trương để tăng hấp thu, tạo lượng dược chất đủ lớn để có hiệu
quả ngay tức thì). Thực tế, mắt chịu đựng nhược trương kém hơn ưu trương và
hàm lượng dược chất trong thuốc nhỏ mắt thường không lớn nên có thể pha
dược chất vào dung dịch đẳng trương, như dung dịch acid boric 1,9%. Khi đó
thuốc nhỏ mắt chỉ hơi ưu trương và không gây kích ứng mắt. Với dung dịch
rửa mắt phải pha đẳng trương vì thể tích sử dụng nhiều [6].
* Tăng đỏ nhớt dung dich: Các chất tăng độ nhớt làm Cịìora đáng kể sức
căng bề mặt nhưng mục đích chính của chúng là tãng thời gian lưu thuốc ở
8
trước giác mạc bởi làm giảm tỷ lệ tháo nước mắt, làm chậm tốc độ rút thuốc
khỏi mắt qua ống mũi lệ, do đó tăng sinh khả dụng của thuốc. Tuy vậy, nồng
độ chất làm tăng độ nhớt chỉ được sử dụng trong một giới hạn. Bởi vì độ nhớt
quá cao sẽ có phản xạ tăng tiết nước mắt, chớp mắt để lập lại độ nhớt bình
thường của nước mắt và gây tác dụng ngược lại [6]. Một ưu điểm nữa của
dung dịch polyme là chúng có tác dụng như chất làm trơn, điều này có thể
mang tính chủ quan nhưng được nhận thấy ờ nhiều bệnh nhân. Một nhược
điểm khi sử dụng các polyme trong thuốc nhỏ mắt là khả năng tạo màng chất
mỏng ở mí mắt, lông mi, tuy nhiên có thể lau sạch được bằng khăn ướt [10].
*
Chuyển dang bào chế thành dang hỗn dich nhỏ mát: Dạng đó dược chất
khó bị rửa trôi hơn, các tiểu phân dược chất khuếch tán dần dần như một kho
dự trữ, do vậy kéo dài thời gian tác dụng, tăng sinh khả dụng của thuốc. [6].
b) Tăng hấp thu thuốc qua giác mạc
Để tăng hấp thu thuốc qua giác mạc có các biện pháp sau:
Dùng chất diện hoạt làm giảm sức căng bề mặt giúp phân tử dược chất
khuếch tán qua giác mạc tốt hơn, thuốc hấp thu tốt hơn [6].
Dược chất ở dạng muối của acid hay base yếu có thể tồn tại dạng ion hoá
hoặc không ion hoá khi hoà tan. Dạng không ion hoá qua màng lipid (biểu mô
và nội mô) dễ dàng nhưng khó đi qua lớp đệm và dạng ion hoá thì ngược lại.
Mức độ ion hoá phụ thuộc pKa (do bản chất dược chất quyết định) và pH của
dung dịch thuốc. Như thế, ta có thể điều chỉnh pH để thay đổi mức độ ion hoá
từ đó thay đổi sinh khả dụng theo hướng tích cực [6].
1.2. Vài nét về ciprofloxacin
1.2.1. Công thức hoá học
Ciprofloxacin là kháng sinh thế hệ mới thuộc nhóm quinolon, thường
dùng
dưới
dạng
muối
hydroclorid,
có
công
thức
phân
tử
là
C|7H I8FN30 3.HC1.H20 , phân tử lượng là 385,82 và có công thức cấu tạo như
sau:
9
o
o
Tên khoa học: 3-Quinolincarboxylic acid, l-cyclopropyl-6-fluoro-l,4dihydro-4-oxo-7-(l -piperazinyl)-monohydroclorid, monohydrat.
1.2.2. Tính chất
* Tính chất vật lý
- Ciprofloxacin hydroclorid là chất kết tinh màu vàng nhạt, ít tan trong
nước, rất ít tan trong cồn, không tan trong aceton và ethylacetat [5].
- Độ tan của ciprofloxacin hydroclorid phụ thuộc vào pH môi trường hoà
tan như minh hoạ ở đồ thị dưới đây [13]:
-Hằng số phân ly: pKaj= 6 (chức -COOH), pKa2= 8.8 (nhóm piperazinyl)
* Tính chất hoá học [5].
- Phản ứng tủa: do có tính base nên ciprofloxacincho phản ứng tủa với
các thuốc thử chung của alcaloid và với acid tungstic.
- Phản ứng tạo phức: với các kim loại hóa trị IInhưFe++,Cu++
năng tạo phức kiểu chelat. Phức này có độ hấp thụ ở 410nm.
* Độ ổn định
10
có khả
- Ciprofloxacin nhạy cảm với ánh sáng, do vậy cần bảo quản thuốc tránh
ánh sáng. Ngoài ra, ciprofloxacin tương đối bền với nhiệt [5].
- Dung dịch ciprofloxacin hydroclorid pH = 1.5- 7.5 ổn định ít nhất trong
14 ngày ở nhiệt độ phòng [12].
1.2.3. Đặc tính dược động học
Dược động học của thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin 0,3%:
Sự hấp thu thuốc vào huyết tương là rất nhỏ so với đường uống và đường
tiêm. Hấp thu thuốc vào thể dịch tăng khi mắt bị viêm hay tổn thương. Trên
bệnh nhân và động vật gây nhiễm khuẩn thực nghiệm, nồng độ thuốc thấm
vào giác mạc và các mô mắt khác (như thể dịch) vượt quá nồng độ ức chế tối
thiểu (MIC) của hầu hết các vi khuẩn gây bệnh ở giác mạc và kết mạc. Trên
thỏ, thời gian bán thải của ciprofloxacin trong dịch thể là 1- 2h [12].
1.2.4. Phổ tác dụng và cơ chế
* Phổ tác dung r51.ri21.ri61.
Ciprofloxacin là kháng sinh nhóm quinolon thế hệ II (dẫn xuất
floroquinolon) nên phổ kháng khuẩn rộng. Tác dụng rộng, nhanh và mạnh hơn
dẫn xuất thế hệ I. Tác dụng trên cả vi khuẩn gram(-) và gram(+), nhưng trên
gram(-) mạnh hơn.
Trên vi khuẩn gram(-): trực khuẩn đường ruột như E. coli, Salmonella
typhi, Shigella spp; Pseudomonas aeruginosa, kể cả chủng đã kháng penicillin
phổ rộng, cephalosporin và aminoglycosid; lậu cầu, màng não cầu.
Trên vi khuẩn gram(+): tụ cầu vàng, phế cầu, liên cầu.
* Cơ chế [51. [12].
Ciprofloxacin có thể tác dụng theo một trong hai cơ chế sau:
- ức chế enzym DNA- gyrase (DNA- topoisomerase): một trong những
enzym tham gia vào quá trình tổng hợp acid nhân của vi khuẩn. Cũng có thể
ciprofloxacin gắn vào một số vị trí đặc biệt trên phân tử ADN làm cản trở hoạt
động của enzym.
- Tạo chelat: do có cấu trúc Ị3- cetonic nên ciprofloxacin có thể tạo phức
hợp kiểu chelat với ion kim loại hoá trị II (Fe++, Ca++, Mg++, Cu++...) vì vậy
những protein có chứa kim loại trở thành đích thu hút của ciprofloxacin.
1.2.5. Chỉ định, liều dùng và cách sử dụng [5], [7], [12]
- Nhiễm khuẩn do các vi khuẩn nhạy cảm: xương khớp, đường hô hấp,
đường niệu, da, mô mềm, đường tiêu hoá...Thường dùng đường uống, nếu
nặng dùng đường tiêm.
- Nhiễm khuẩn mắt (loét giác mạc, viêm kết mạc) do các vi khuẩn nhạy
cảm dùng dạng nhỏ mắt hoặc thuốc mỡ tra mắt:
Nhiễm khuẩn cấp: 1-2 giọt/15- 30phút.
Nhiễm khuẩn vừa: 1-2 giọt X 2- 6 lần/ngày.
1.2.6. Tác dụng không mong muốn và độc tính
* Khi dùng toàn thân hay gặp các triệu chứng chóng mặt, buồn nôn, ỉa
chảy, thụ cảm với ánh sáng, mẩn ngứa, kết tinh đường niệu.. .Có thể gặp viêm
gân, đứt gân Achille [5], [21].
* Thuốc nhỏ mắt: khi nhỏ thuốc Ciloxan tác dụng không mong muốn hay
gặp nhất là cảm giác khó chịu, rát bỏng tại chỗ, 17% bệnh nhân có kết tủa tinh
thể màu trắng, cứng bờ mi, sung huyết giác mạc.. .[8].
1.2.7. Chông chỉ định
* Chống chỉ định khi dùng toàn thân là: Trẻ em dưới 15 tuổi, phụ nữ có
thai 3 tháng đầu và tháng cuối cùng, phụ nữ cho con bú. Người thiếu enzym
G-6PD vì có nguy cơ thiếu máu, người bị động kinh hoặc tiền sử co giật. Các
trường hợp dị ứng với quinolon [5].
* Với thuốc nhỏ mắt, chống chỉ định trên bệnh nhân có tiền căn quá mẫn
với ciprofloxacin hay các thành phần khác của thuốc, quá mẫn với các
quinolon khác [8].
1.2.8. Tương tác thuốc
12
*Khi dùng đường toàn thân có các tương tác sau: Antacids (chứa các ion
Al+++, Mg++, Ca++) làm giảm hấp thu ciprofloxacin do ciprofloxacin tạo chelat
với các ion. Cimetidin làm tăng nồng độ ciprofloxacin do cimetidin ức chế
men gan dẫn tới giảm chuyển hóa ciprofloxacin. Probenecid, azlocillin giảm
thải trừ ciprofloxacin gây tăng nồng độ ciprofloxacin huyết tương [4], [15]...
*
Chưa có nghiên cứu về tương tác thuốc được thức hiện với thuốc nhỏ
mắt ciprofloxacin [8].
1.2.9. Các dạng thuốc chứa ciprofloxacin [3], [8]
- Viên nén, viên nén bao phim, thuốc tiêm truyền, thuốc nhỏ tai, thuốc
mỡ tra mắt.
-Thuốc nhỏ mắt: Ciloxan 0,3% (Alcon), Ciplox 0,3% (Cipla),
Ciprofloxacin (Công ty cổ phần Dược phẩm Nam Hà).
Biệt dược Ciloxan có thành phần: Ciprofloxacin hydroclorid 350mg
(tương ứng với 300mg ciprofloxacin base), benzalkonium clorid 0,006%, natri
acetat, acid acetic, manitol 4,6%, natri edetat 0,05%, HC1, NaOH điều chỉnh
pH, pH xấp xỉ 4.5, độ thẩm thấu xấp xỉ 300 mOsm.
Biệt dược Ciprofloxacin (Công ty cổ phần Dược phẩm Nam Hà) gồm các
thành phần: Ciprofloxacin hydroclorid tương ứng 300mg, benzalkonium clorid
lOmg, dung dịch đệm phosphat, nước cất pha tiêm vừa đủ 100ml.
1.2.10. Phương pháp định lượng
- Để xác định hàm lượng ciprofloxacin trong chế phẩm có thể dùng
phương pháp môi trường khan (dựa trên nhóm chức acid hay base), phương
pháp quang phổ, phương pháp vi sinh vật, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao.
- Tuy nhiên, để theo dõi độ ổn định và xác định các sản phẩm phân huỷ,
người ta sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Pha động là dung
dịch H3P 0 4 0,025M và acetonitril (tỷ lệ 87 : 13) [22], hoặc acid acetic 2% và
acetonitril (tỷ lệ 85 : 15) [13], với detector u v đặt ở bước sóng 278nm.
13
PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Hoá chất, thiết bị thí nghiệm
2.1.1. Hoá chất
- Ciprofloxacin hydroclorid (Trung Quốc) đạt tiêu chuẩn BP 1993.
- Benzalkonium clorid, thimerosal, natri edetat, HPMC, PVA, natri
metabisulfit, acid citric, acid boric, natri clorid là các hóa chất dược dụng.
- Natri acetat, acid acetic, kali dihydrophosphat, acid clohydric, natri
hydroxyd, đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích.
- Acid acetic, acetonitril loại dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Nước cất pha tiêm.
2.1.2. Thiết bị máy móc
- pH mét: Mettler Toledo.
- Máy quang phổ tử ngoại HeẦIOSy.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Thermo Finnigan với:
. Hệ thống bơm cao áp 4 bơm P4000
. Hệ thống tiếp mẫu tự động và ổn định nhiệt độ cột AS3000
. Detector u v (UV 6000LP)
. Cột sắc ký là Hy PURITY C18, kích thước cột 150
X
4,6mm, kích
thước hạt 5ịim
. Hệ điều hành với phần mềm Chrom Quest Version 2.51.
- Màng lọc Cenllulose acetat, kích thước lỗ xốp là 0,45 Ịim.
- Tủ ấm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Pha chê dung dịch thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin hydroclorid
Qua tham khảo tài liệu, chúng tôi chọn công thức thuốc nhỏ mắt có thành
phần sau (ký hiệu là CTBĐ) để thực hiện các nội dung nghiên cún đã định.
14
Ciprofloxacin hydrocloriđ
0,357g
(tương ứng với 0,3g ciprofloxacin base)
Benzalkonium clorid
10mg
Natri edetat
20mg
Dung dịch đệm acetat
0,1M
Dung dịch HC1
vừa đủ đến pH = 4,5
Natri clorid
vừa đủ đẳng trương
Nước cất
vừa đủ 100ml
Các công thức thuốc nhỏ mắt đều được pha chế theo các bước ghi trong
sơ đồ sau:
2.2.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng
duy trì độ tan của ciprofloxacin trong dung dịch thuốc nhỏ mắt 0,3%
Vì ciprofloxacin hydroclorid là dược chất khó tan trong nước nên chúng
tôi nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến độ tan của nó như sau:
2.2.2.1.
Đánh giá ảnh hưởng của pH
15
Tiến hành pha các clung dịch ciprofloxacin 0,3% có thành phần như
CTBĐ trong dung dịch đệm acetat, dùng dung dịch natri acetat 0,1M và điều
chỉnh pH bằng HC1 để có các pH = 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0.
Các dung dịch được để đồng thời 2 điều kiện: Để trong tủ lạnh 4°c trong
3 ngày và điều kiện nhiệt độ phòng trong 6 ngày. Đánh giá độ trong các dung
dịch trên bằng cảm quan.
2.2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của chất làm tăng độ nhớt
Tiến hành pha 4 dung dịch ciprofloxacin 0,3% có thành phần như CTBĐ
trong dung dịch đệm acetat, điều chỉnh pH về 4,5. Một dung dịch không có
chất làm tăng độ nhớt. Ba dung dịch còn lại thêm chất làm tăng độ nhớt là:
PVA 1,4%, HPMC 0,5% hoặc Manitol 4,6%.
Bốn dung dịch sau khi pha như ở trên đem định lượng ngay bằng phương
pháp đo độ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 278nm. Sau đó, đưa pH của mỗi
dung dịch về pH sinh lý của nước mắt là 7,4 bằng cách thêm dần dung dịch
NaOH 0,1N. Lọc tủa qua màng Cenllulose acetat 0,45 |um, định lượng lại hàm
lượng ciprofloxacin trong dịch lọc. So sánh nồng độ ciprofloxacin còn lại
trong dịch lọc ở mẫu có và không có chất làm tăng độ nhớt.
Cách pha mẫu đinh ỉươns và tính toán:
Mẫu ban đầu: Pha dung dịch đệm acetat (có natri acetat 0,1M, pH = 4,5),
thêm chất làm tăng độ nhớt nếu mẫu nghiên cứu có chất làm tăng độ nhớt
(dung dịch A). Cân chính xác khoảng 0,089g ciprofloxacin hydroclorid cho
vào bình định mức 25ml, thêm dung dịch A đến đủ thể tích, lắc tan, được
dung dịch B. Lấy chính xác lml dung dịch B cho vào bình định mức 25ml,
thêm nước cất đến vạch. Lấy chính xác lml dung dịch vừa pha loãng cho vào
bình định mức 25ml, thêm nước cất đến vạch được mẫu ban đầu.
Mẫu sau khi lọc tủa: Lấy chính xác Iml dịch lọc cho vào bình định mức
25ml, thêm nước cất đến đủ thể tích được mẫu sau khi lọc.
Mẫu trắng', là nước cất.
16
Nồng độ ciprofloxacin tronq dịch ìọc lci cy
r=
C0. D ị . 25
1
D0 .25 .25
=
Q.D,
25 . D0
Trong đó: C0là nồng độ của cip trong dung dịch trước khi nâng pH
D0 là mật độ quang của cip trong mẫu ban đầu
Cị là nồng độ của cip trong dịch lọc
Dị là mật độ quang của cip mẫu sau khi lọc
2.2.3. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến độ ổn định
của dung dịch thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin 0,3%
2.2.3.1. Phương pháp đánh giá độ Ổn định dung dịch thuốc nhỏ mất
ciprofloxacin 0,3%
Để rút ngắn thời gian nghiên cứu mà vẫn có thể đánh giá sơ bộ được các
yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của dung dịch thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin
0,3%, chúng tôi tiến hành thúc đẩy quá trình phân huỷ ciprofloxacin trong các
dung dịch bằng tác động của ánh sáng.
Để đánh giá ảnh hưởng của ánh sáng chúng tôi treo các mẫu thuốc bọc
tránh ánh sáng và không tránh ánh sáng ở ngoài cửa sổ trong 1 tháng. Đồng
thời, có các mẫu song song để ở điều kiện phòng thí nghiệm bọc tránh ánh
sáng và không tránh ánh sáng và để trong tủ ấm 50°c tránh ánh sáng.
Để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố khác đến độ ổn định của dung
dịch thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin 0,3%, các mẫu thuốc được treo ngoài cửa sổ
không tránh ánh sáng đồng thời để trong phòng thí nghiệm không tránh ánh
sáng (và trong tủ ấm 50°c tránh ánh sáng nếu có điều kiện) trong thời gian 1
tháng hoặc 2 tháng.
Độ ổn định của các mẫu thuốc nghiên cứu được đánh giá trên các chỉ tiêu
- pH dung dịch: Đo pH của dung dịch thuốc ngay sau khi pha và pH sau
khi bảo quản ở các điều kiện đã nêu.
- Định lượng ciprofloxacin trong thuốc nhỏ mắt trước và sau khi bảo quản
ở các điều kiện đã nêu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Đánh giá độ ổn định của các dung dịch dựa vào các chỉ tiêu kiểm định
nêu trên. Từ đó, lựa chọn dung dịch có độ ổn định tốt hơn.
2.23.2. Phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao (phương pháp
HPLC)
*Nghiên cứu điều kiên tách ciprofloxacin
Qua tham khảo tài liệu, kết hợp với quá trình nghiên cứu tách
ciprofloxacin hydroclorid bằng phương pháp HPLC với điều kiện thiết bị như
đã nêu ở mục 2.1.2, chúng tôi chọn được pha động gồm: dung dịch acid acetic
2% và acetonitril với tỷ lệ 85 : 15, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, detector uv đặt ở
bước sóng 278nm.
Kết quả tách ciprofloxacin hydroclorid ra khỏi các thành phần khác trong
dung dịch thuốc nhỏ mắt được thể hiện ở các sắc đồ hình 1:
Mẫu chuẩn
o
LO
hCN
___________
1______
I
I
0
2
1_____________ L ?
í
4
Minutes
...n
3. 897
ỉ.807
1.770
:
_
L................ .
6
8
A
Mẫu thử
1
L
Ị
1
ì
1
■
\
^
1
./V
1... J ^ V_____ ị
■T
T
^
-...................................... ..... ...... — .....— . -
Hình 1: sắc ký đồ tách ciprofloxacin bằng HPLC
18
* Pha mẫu chuẩn, mẫu thử và tính toán
Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,089g ciprofloxacin hydroclorid cho
vào bình định mức 25ml, thêm acid acetic 2% đến vạch, lắc tan. Lấy chính
xác lml dung dịch trên cho vào bình định mức 50ml, thêm acid acetic 2% đến
vạch được mẫu chuẩn.
Mẫu thử: Lấy chính xác lml dung dịch thuốc nhỏ mắt nghiên cứu cho
vào bình định mức 50ml, thêm acid acetic 2% đến vạch được mẫu thử.
Nồng độ ciprofloxacin trong mẫu thử là Cth:
_
Qh •Sth
c th - ------------ . k
ch
Trong đó: Cthlà nồng độ cip trong mẫu thử
Cchlà nồng độ cip trong mẫu chuẩn
Sth là diện tích píc của mẫu thử
sch là diện tích píc của mẫu chuẩn
k là hệ số pha loãng
Nồng độ ciprofloxacin hydroclorid còn lại trong mẫu thử được tính theo
công thức:
Q
% cip =
cM)th.
. 100
Trong đó: Coth là nồng độ ban đầu (trước khi bảo quản ở các điều kiện)
của cip trong mẫu thử.
2.2.3.3. Nội dung đánh giá các yếu tô ảnh hưởng đến dộ ổn định dung dịch
thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin 0,3%
- Ảnh hưởng của ánh sáng và nhiệt độ: Đánh giá trên cùng một công thức
thuốc khi bảo quản ở các điều kiện ánh sáng và nhiệt độ khác nhau.
- Ảnh hưởng của pH: pha các dung dịch thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin
0,3% à các pH 4,0; 4,5; 5,0 trong dung dịch đệm acetat, từ đó lựa chọn pH
thích hợp.
19
- Ánh hưởng của chất điều chỉnh pH: pha các dung dịch thuốc nhỏ mắt
ciprofloxacin 0,3% trong các dung dịch đệm acetat, đệm phosphat, đệm
citrat và dung dịch acid boric với pH thích hợp. Xác định chất điều chỉnh pH
mà dung dịch thuốc ổn định nhất.
- Ảnh hưởng của nồng độ đệm: pha các dung dịch thuốc nhỏ mắt
ciprofloxacin 0,3% có cùng pH trong các dung dịch đệm có nồng độ đệm
khác nhau.
- Ảnh hưởng của chất chống oxy hoá: pha dung dịch thuốc nhỏ mắt
ciprofloxacin 0,3% có thêm chất chống oxy hoá natri metabisulfit.
- Ảnh hưởng của chất làm tăng độ nhớt: pha các dung dịch thuốc nhỏ mắt
ciprofloxacin 0,3% có chất làm tăng độ nhớt với nồng độ như sau: HPMC
0,2%, HPMC 0,1%, PVA 0,5%, PVA 0,25%.
2.2.4. Phương pháp thử in vitro của một số công thức thuốc nhỏ mắt trên
vi khuẩn gây bệnh
Để sơ bộ đánh giá ảnh hưởng của pH và thành phần thêm vào các dung
dịch thuốc nhỏ mắt có ảnh hưởng như thế nào đến tác dụng kháng khuẩn, thí
nghiệm được thực hiện với các công thức thuốc nhỏ mắt ciprofloxacin 0,3%
khác nhau.
Để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các công thức thuốc nhỏ mắt
chúng tôi xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên 2 vi khuẩn gây bệnh
là: Staphylococcus aureus ATCC 12228 và Pseudomonas aeruginosa VM 201.
Các chất thử được pha loãng theo cấp số nhân để có các nồng độ cuối
cùng là: 0,2;
0,4;
0,025; 0,05; 0,1;
0,8; 1,6; 3,2|j,g/ml với Pseudomonas aeruginosa và
0,2; 0,4|j,g/ml với Staphylococcus aureus.
Môi trường nuôi cấy là Mueller- Hinton. Các ống môi trường có thể tích
bằng nhau, được thêm các chất thử có nồng độ pha loãng khác nhau với những
20
