Các hợp chất kaempferol phân lập từ lá cây kháo (phoebe tavoyana)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
-------------------------

CAO THỊ LIỄU

CÁC HỢP CHẤT KAEMPFEROL
PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY KHÁO
(PHOEBE TAVOYANA)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. NGUYỄN VĂN BẰNG

HÀ NỘI – 2015


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm
ơn đến TS.Hoàng Lê Tuấn Anh – Viện Hóa Sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng và hướng dẫn em tận tình trong suốt
thời gian em làm đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo và các anh, chị cán bộ Viện Hóa
Sinh biển đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện cho em được sử dụng các thiết bị
tiên tiến của viện để nghiên cứu, học tập và hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt

nghiệp của mình.
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn
Bằng người đã tận tình, chu đáo dạy bảo em trong suốt những năm học ở
trường, hướng dẫn và giúp em hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa học – Trường
ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ, dạy dỗ em trong quá trình học tập
tại trường. Xin cảm ơn gia đình và tất cả các bạn bè đã động viên, khích lệ giúp
đỡ trong quá trình học tập và làm khóa luận.
Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng
nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy em kính mong
nhận được ý kiến đóng góp chỉ bảo của các quý thầy, cô.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 05 tháng 05 năm 2015
Sinh viên

Cao Thị Liễu

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa
luận:
“ Các hợp chất kaempferol phân lập từ lá cây Kháo (Phoebe tavoyana)”
Dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng là hoàn toàn trung thực
và không trùng với kết quả của tác giả khác.

Sinh viên

Cao Thị Liễu

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Chú giải

[α]D

Độ quay cực Specific Optical Rotation

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

C-NMR

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
1

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

H-NMR

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
1

H-1H COSY

1

H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-

2D-NMR

Dimensional NMR
CC

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS

Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectroscopy

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

HR-FAB-MS

Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao

High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry
IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ
Trang
Hình 1.1: Cây Kháo ..................................................................................... 3
Hình 1.2: Hoa Kháo ..................................................................................... 3
Hình 1.3: Quả Kháo ..................................................................................... 4
Hình 1.4: Công thức của flavonoit .............................................................. 7
Hình 1.5: Dị vòng C của flavonoit .............................................................. 8
Hình 1.6: Kaempferol ................................................................................ 10
Hình 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn từ lá cây Kháo (Phoebe tovoyana).. 26
Hình 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn nước của lá cây Kháo
(Phoebe tovoyana) .................................................................................... 28
Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 .......................................... 351
Hình 4.1.2: Phổ 1H-NMR hợp chất 1 ........................................................ 32
Hình 4.1.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 1 ....................................................... 32
Hình 4.1.4: Phổ DEPT hợp chất 1 ............................................................. 33

Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 ............................................ 35
Hình 4.2.2: Phổ 1H-NMR hợp chất 2 ........................................................ 36
Hình 4.2.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 2 ....................................................... 36
Hình 4.2.4: Phổ DEPT hợp chất 2 ............................................................. 37
Hình 4.3.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 ............................................ 39
Hình 4.3.2: Phổ 1H-NMR hợp chất 3 ........................................................ 40
Hình 4.3.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 3 ....................................................... 41
Hình 4.3.4: Phổ DEPT hợp chất 3 ............................................................. 42
Bảng 1: Số liệu phổ NMR của chất 1 và chất tham khảo.......................... 34
Bảng 2: Số liệu phổ NMR của chất 2 và chất tham khảo .......................... 38
Bảng 3: Số liệu phổ NMR của chất 3 và chất tham khảo .......................... 42

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................... 3
1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Kháo............................................... 3
1.1.1. Mô tả ........................................................................................................ 3

1.1.2. Phân bố, sinh thái. .................................................................................... 4
1.1.2.1. Phân bố............................................................................................... 4
1.1.2.2. Sinh thái. ............................................................................................ 4
1.1.3. Thành phần hóa học. ................................................................................ 5
1.1.4. Hoạt tính sinh học. ................................................................................... 5
1.1.5. Công dụng. ............................................................................................... 6
1.2. Hợp chất Kaempferol, thành phần hoá học có trong lá cây Kháo. ................ 6
1.2.1. Giới thiệu flavonoit. ................................................................................. 6
1.2.2. Hợp chất Keampferol. .............................................................................. 8
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật ........................................................... 10
1.3.1. Chọn dung môi chiết. ............................................................................. 11
1.3.2. Quá trình chiết ........................................................................................ 12
1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ. ..................... 14
1.4.1. Đặc điểm chung. .................................................................................... 14
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí. .............................................................. 14
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí. ......................................................... 15

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.4.3.1. Sắc kí cột (C.C). ............................................................................... 17
1.4.3.2. Sắc kí lớp mỏng. .............................................................................. 19
1.5. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ…..19
1.5.1. Phổ hồng ngoại (IR). .............................................................................. 20
1.5.2. Phổ khối lượng (MS). ............................................................................ 20
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). ................................................... 21

1.5.3.1. Phổ 1H-NMR. ................................................................................... 21
1.5.3.2. Phổ 13C-NMR................................................................................... 22
1.5.3.3. Phổ DEPT. ....................................................................................... 22
1.5.3.4. Phổ 2D-NMR. .................................................................................. 22
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............24
2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 24
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất............................................................ 24
2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC) .......................................................................... 24
2.2.3. Sắc kí cột (CC) ....................................................................................... 24
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất........................... 24
2.4. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................... 24
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết ................................................................ 24
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ........... 25
2.5. Hoá chất........................................................................................................ 25
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ............................................. 26
3.1. Phân lập các hợp chất ................................................................................... 26
3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất. .................................. 28
3.2.1. Hợp chất 1. ............................................................................................. 28
3.2.2. Hợp chất 2. ............................................................................................. 29
3.2.3. Hợp chất 3. ............................................................................................. 29
CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ .......................................................... 31

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 ................................................... 31

4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 ................................................... 31
4.3. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 3 ................................................... 39
KẾT LUẬN ........................................................................................................ 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 46

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa hay còn
gọi là khí hậu nhiệt đới ẩm, địa hình ba phần tư là đồi núi chia cắt nên điều kiện
khí hậu cũng rất đa dạng, có nhiều tiểu vùng khí hậu khá đặc trưng thay đổi từ
điều kiện khí hậu nhiệt đới điển hình ở những vùng đất thấp phía nam đến các
đặc điểm mang tính chất cận nhiệt đới ở vùng núi cao phía bắc.
Những điều kiện thuận lợi trên đã tạo nên nguồn tài nguyên sinh vật dồi
dào, đặc biệt hệ thực vật Việt Nam rất phong phú, đa dạng. Theo ước tính số loài
thực vật bậc cao ở nước ta có thể lên đến 12000 loài, trong đó đã biết khoảng
4000 loài là cây thuốc mọc tự nhiên, được nhân dân dùng làm thảo dược [2].
Chính vì thế mà các ngành y tế, ngành hóa học và một số ngành khác ngày càng
phát triển. Các nhà nghiên cứu đã tổng hợp được nhiều hợp chất có tác dụng
chữa bệnh nhưng có một số hạn chế, gây ra tác dụng phụ không mong muốn.
Mặt khác, nước ta đang là nước phát triển, thu nhập còn thấp mà các thuốc chữa
bệnh gần như nhập khẩu từ nước ngoài và giá thành cao. Vì vậy, nhà nước ta
khuyến khích tăng cường sản xuất thuốc trong nước. Một trong các nguồn
nguyên liệu sản xuất thuốc được lấy từ thiên nhiên bởi đặc tính ít gây ra tác
dụng phụ, ít độc, dễ hấp phụ và không làm tổn hại đến môi trường. Do đó, vấn

đề đang được đặc biệt quan tâm là nghiên cứu các hợp chất được tách ra từ sản
phẩm thiên nhiên.
Cây Kháo (Phoebe tavoyana) thường phân bố ở miền nam Trung Quốc và
miền bắc Việt Nam. Theo kinh nghiệm dân gian thì lá của cây được dùng để tiêu
mụn nhọt và nước sắc vỏ cây được dùng để trừ phong thấp [5]. Trên thế giới đã
có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong cây Kháo
có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống kí sinh trùng đường máu, chống
lắng đọng tiểu cầu và hoạt tính chống ung thư.

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

1


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Xuất phát từ các cơ sở trên nên tôi đã chọn đề tài khóa luận tốt nghiệp là
“ Các hợp chất kaempferol phân lập từ lá cây Kháo (Phoebe tavoyana)”
Nhiệm vụ của đề tài:
1. Xử lí mẫu và tạo dịch chiết methanol.
2. Nghiên cứu phân lập các hợp chất Kaempferol từ lá cây Kháo.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được.

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

2

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Kháo
1.1.1. Mô tả
Tên khoa học: Phoebe tavoyana.
Tên tiếng việt: Cây Kháo (Sụ lá to, Bời lời cơm).
Họ: Long não (Lauraceae).
Bộ: Long não (Laurales).
Lớp (nhóm): Cây gỗ nhỏ.
Là loại cây gỗ nhỏ, cao 10 m, cành nhỏ, phủ lông dày màu nâu chồi non có
vảy, nhánh non có lông sét. Lá có phiến thon gọn ở 2 đầu, hình mác ngược, dài
20- 27 cm, rộng 7- 13 cm, đầu nhọn, gốc hình nêm, mặt trên nhẵn, mặt dưới có
lông, có 8-11 đôi gân bậc hai. Cuống lá dài 1,5- 2,5 cm, có lông.
Chùm tụ tán ở nách lá, hoa trắng, cụm hoa chùy ở đầu cành, dài 6 – 10 cm, phủ
lông dày, cuống hoa dài 5 – 7 mm. Mảnh bao hoa 6, các mảnh của vòng ngoài
nhỏ hơn của vòng trong, phủ lông nâu. Nhị hữu thụ 9, 6 nhị ở hai vòng ngoài
không lông, 3 nhị vòng trong có lông, ở gốc chỉ nhị có hai tuyến hình tim có
chân. Nhị lép hình đầu mũi tên có lông. Bầu hình cầu, vòi hình đầu. Quả hình
cầu, đường kính khoảng 1 cm. Gỗ cứng, màu đỏ tươi.

Hình1.1: Cây Kháo

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

Hình 1.2: Hoa Kháo

3

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.3: Quả Kháo
1.1.2. Phân bố, sinh thái.
1.1.2.1. Phân bố.
Chi Kháo có khoảng 23 loài, phân bố ở miền nam Trung Quốc và miền bắc
Việt Nam. Cây thường mọc trong rừng lá rộng thường xanh nhiệt đới ở độ cao
700- 2500 m. Ở nước ta, cây Kháo phân bố ở Vĩnh Phúc (Tam Đảo) và Như
Xuân, Thanh Hóa. Ngoài ra, còn phân bố ở Ấn Độ, Malaixia, Myanmar, Lào,
Thái Lan, Inđônêxia [5].
1.1.2.2. Sinh thái.
Mọc rất rải rác dưới tán rừng mưa nhiệt đới thường xanh mưa mùa ẩm, ở độ
cao khoảng 300 m trở lên, cùng với một số loài của các họ khác như Na
(Annonaceae), Đậu (Fabaceae), Thầu Dầu (Euphoriaceae)...
Sinh học: Mùa quả chín vào tháng 12, cây tái sinh bằng hạt, mỗi quả chỉ có
một hạt giống duy nhất và chúng thường xuyên phân tán bởi các loài chim. Kết
quả là những hạt giống này trong điều kiện tốt sẽ nảy mầm.
Giá trị: Nguồn gen quý, hiếm.
Tình trạng: Loài hiếm. Loài vốn hiếm lại có thể bị đe dọa bị tuyệt chủng do
thu hẹp môi trường sống. Mức độ đe dọa: Bậc K [6].

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

4

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.1.3. Thành phần hóa học.
Ở Việt Nam có ít nghiên cứu và chưa có nghiên cứu chuyên sâu về cây
Kháo. Trên Tạp chí Hóa học (2005), Nguyễn Văn Hùng và Nguyễn Văn Tuyến
[3] đã công bố 7 hợp chất ancaloit phân lập từ vỏ thân cây Kháo là : Corydin,
Pronuciferin, Anonain, Norcorydin, Stepharin, N- metyllaurotetenin, Nmetyllaurolitsin.
Cho đến nay, thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về các loài
trong chi Kháo ( P.molocella, P. Pittier, P.formosana, P. Valeriana, P.
Grandis…) thuộc họ Long não. Người ta đã phân lập và xác định cấu trúc của
rất nhiều aporphin ancaloit từ các chi này [8],[9],[13],[14],[15],[16].
1.1.4. Hoạt tính sinh học.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của aporphin
ancaloit có trong cây Kháo. Một số aporphin ancaloit có khả năng kháng khuẩn,
kháng nấm, chống kí sinh trùng đường máu, chống lắng đọng tiểu cầu và hoạt
tính chống ung thư. Các hợp chất này được tìm thấy trong các loài của chi Kháo
(P.pittier, P. Chinensis…) [3].
Trong chương trình sàng lọc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ
thực vật Việt Nam của Viện Hóa Sinh biển đã thử hoạt tính sơ bộ dịch chiết
MeOH của lá cây Kháo Phoebe tavoyana ( Meisn.) Hook.f. Kết quả cho thấy,
dịch chiết MeOH này thể hiện hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính gây độc tế
bào với 2 dòng tế bào ung thư gan người (Hep- 2) và ung thư màng tim (RD).
Chính vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các hợp
chất được phân lập từ lá cây Kháo (Phoebe tavoyana ( Meisn.) Hook.f.) có ý
nghĩa quan trọng giúp làm sáng tỏ thành phần hóa học và tìm kiếm những hợp
chất có hoạt tính sinh học phục vụ cuộc sống.

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

5


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.1.5. Công dụng.
Theo kinh nghiệm dân gian thì lá của cây được dùng để tiêu mụn nhọt và
nước sắc vỏ cây được dùng để trừ phong thấp [5].
Theo Đông y, các bộ phận của cây đều có tác dụng làm thuốc. Ngoài ra vỏ
giã nát dùng đắp lên những nơi sưng, bỏng, vết thương, có nơi dùng cả lá giã
đắp. Vỏ còn dùng sắc nước uống chữa đi ỉa, lị. Nước ngâm vỏ mùa thành từng
mảnh mỏng có thể dùng bôi dầu cho tóc bóng. Dầu dùng làm sáp, chế xà
phòng...
1.2. Hợp chất Kaempferol, thành phần hoá học có trong lá cây Kháo.
1.2.1. Giới thiệu flavonoit.
Kaempferol là một trong nhiều flavonoit quan trọng nhất và phổ biến nhất
(có chứa các cấu trúc C6-C3-C6 điển hình).
Flavonoit là một trong những nhóm chất phân bố rộng nhất trong tự
nhiên, có mặt không những ở thực vật bậc cao mà còn ở một số thực vật bậc
thấp và các loài tảo. Chúng có mặt trong hầu hết các bộ phận của cây: hoa, quả,
lá, rễ, gỗ…và khu trú trong thành tế bào. Chúng tham gia tạo màu sắc cho cây,
nhất là hoa. Đó chính là một trong những chức năng sinh lý quan trọng của
flavonoit đối với cây cỏ [4].
Trong thực vật, flavonoit tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp hai lá
mầm. Động vật không tự tổng hợp được flavonoit, nhưng có thể lấy flavonoit từ
nguồn thức ăn.
Trong thực vật bậc thấp, flavonoit ít gặp hơn. Trong ngành rêu, chỉ phát

hiện được rất ít chất. Trong dương xỉ, số lượng flavonoit ít hơn nhưng có mặt
các nhóm: anthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon.
Ngành hạt trần có mặt các nhóm: anthocyanidin, leucoanthocyanidin,
flavanon, flavon, flavonol, isoflavon. Nét đặc trưng của ngành hạt trần khác biệt

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

6


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

với thực vật bậc thấp và hạt kín ở chỗ có sự hiện diện của nhiều dẫn chất
biflavonoit [1], [10], [11].
Flavonoit tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp hai lá mầm. Tuy
nhiên cũng có một vài nét đặc trưng cho một số họ, như họ Asteraceae. Một số
chi có nét đặc trưng riêng, như trong chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia
hay gặp các chalcon và auron. Chi Gymnosperma, Ageratum hay gặp các flavon
và flavonol có nhiều nhóm thế có oxy. Họ Fabaceae hay gặp các chất thuộc
nhóm isoflavonoid. Họ Rutaceae thường gặp các flavon và các flavonol có nhiều
nhóm methoxy. Họ Theacea hay gặp các flavan-3-ol. Họ Ranunculaceae và
Paeoniaceae hay gặp các dẫn chất flavonol 3,7 diglycosit. Trong quả của họ
Rosaceae chi Rubrus và Prunus hay gặp các anthocyanin có các mạch đường
phân nhánh. Họ Polygonaceae ở chi Hydropiper hay gặp các flavon và các
flavonol sulfat [4], [8], [10], [11].
Lớp một lá mầm có 53 họ nhưng đến nay chỉ tìm thấy khoảng trên 10 họ
có flavonoit: Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Iridaceae,
Lemnaceae, Liliaceae, Musaceae, Orchidaceae, Poaceae [1], [10].

Các flavonoit là một chuỗi polyphenolic dựa trên một khung cơ sở 15
nguyên tử cacbon gồm hai vòng benzen liên kết bởi một mạch có ba cacbon, có
thể được mô tả hệ thống như: C6 - C3 - C6 gồm hai vòng benzen A, B và một dị
vòng C, với vòng thơm B thứ 2 ở vị trí 2, 3 hay 4.

Hình 1.4: Công thức của flavonoit

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

7


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hidroxy tự do hoặc đã thay thế
một phần. Vì cậy về bản chất, các flavonoid là các polyphenol và các dẫn xuất
của polyphenol.
Dị vòng C có thể là:

Dihidropyran

-pyron

Dihidro -  - pyron

Pyrilium

Hình 1.5: Dị vòng C của flavonoit

Sự phân loại của flavonoit dựa vào vị trí gốc aryl (vòng C):
- Euflavonoit có gốc aryl ở vị trí C-2;
- Isoflavonoit có gốc aryl ở vị trí C-3;
- Neoflavonoit có gốc aryl ở vị trí C-4.
Người ta còn phân biệt biflavonoit là những flavonoit dimer, triflavonoit
cấu tạo bởi ba monomer flavonoit, flavoliganan là những flavonoit mà phân tử
có một phần cấu tử lignan [1],[4], [11].
1.2.2. Hợp chất Keampferol.
Kaempferol được phát hiện vào năm 1938 bởi các nhà hóa sinh học
Hungary Albert Szent-Gyorgyi. Keampferol như là một phần của gia đình
flavonoit.
Kaempferol là được biết đến nhiều do có hoạt tính chống ung thư [7]. Tuy
nhiên, nó còn có nhiều vai trò khác trong cơ thể con người: Keampferol hoạt
động như một chất chống oxy hóa và bảo vệ cơ thể khỏi các gốc tự do gây hại.
Cũng có những trường hợp Keampferol hoạt động như một thuốc chống trầm

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

8


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

cảm. Ngoài ra, nó có thể hoạt động như một phytoestrogen (một hợp chất điều
hòa mức estrogen trong cơ thể và có thể giúp ngăn ngừa ung thư, bệnh tim,
loãng xương (giảm mật độ khoáng của xương) và các triệu chứng mãn kinh tiêu
cực), tăng cường sự trao đổi chất (bằng cách thúc đẩy việc sản xuất hormone
thúc đẩy sự trao đổi chất triiodothyronine (còn được gọi là T3)). Kaempferol

ngăn ngừa xơ cứng động mạch (xơ cứng và mất độ đàn hồi bên trong động
mạch), ngăn ngừa một số loại ung thư khác nhau (bao gồm cả ung thư vú , ung
thư phổi , ung thư buồng trứng , ung thư tuyến tụy và ung thư tuyến tiền
liệt ). Ngăn ngừa các bệnh tim. [7]
Kaempferol phân bố rộng rãi trong nhiều loài thực vật như cây Kháo, Bạch
quả, Bạch thược, Bát giác liên, Bòng bong, Bóng nước, Bông, Cây cứt lợn,
Chàm lá nhỏ, Chè, Cỏ lào, Dầu giun, Đại táo, Đào, Đậu tây, Đơn lá đỏ, Địa liền,
Gai chống, Hành tây, Hoa ban, Hòe, Khoai lang, Khoai tây, Lão quan thảo,
Mạch ba góc, Màn màn trắng, Màn màn vàng, Măng tây, Me rừng, Mỏ quạ,
Móng rồng, Mơ, Muồng hôi, Muồng trâu, Nghể răm, Nhãn, Nho, Phan tả diệp,
Phù dung, Rau đắng, Rau má, Riềng, Riềng nếp, Sài hồ bắc, Sắn, Sắn thuyền,
Sen cạn, Thanh cao hoa vàng, Thảo quyết minh, Thầu dầu, Thiên môn, Thổ
phục linh, Thông nước, Thông thiên, Thục quỳ, Thuốc lá, Trà tiên, Tràm, Vối
rừng, Xoan, Xoan trà. Nhiều loài trong số này là những dược liệu có giá trị sử
dụng cao, được sử dụng trực tiếp, dưới dạng thuốc thang, hoặc đã được nghiên
cứu để chiết xuất cao dược liệu và đưa vào 13 dạng bào chế hiện đại.[17],[18].
Trong nghiên cứu này lá cây Kháo được lựa chọn để chiết xuất Kaempferol
vì cây Kháo là một cây phân bố rộng rãi ở Việt Nam, đã được các tác giả trong
nước nghiên cứu về hình thái thực vật, thành phần hóa học, sơ bộ nghiên cứu về
phương pháp chiết xuất và phân lập. Một số công trình nghiên cứu của các tác
giả nước ngoài cũng đề cập đến các phương pháp chiết xuất, phân lập

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

9


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Kaempferol từ một số dược liệu khác nhau, hoặc về các phương pháp định tính,
định lượng Kaempferol trong dịch chiết dược liệu và chế phẩm .
Công thức phân tử: C15H10O6. Khối lượng phân tử: 286,2
Danh pháp (IUPAC): 3,5,7- trihydroxy -2-(4-hydroxyphenyl)- 4H-1benzopyran-4-on
Tính chất lí – hóa: Kaempferol có dạng tinh thể hình kim hoặc vi tinh thể,
màu vàng rất nhạt. Tan tốt trong MeOH, EtOH, diethylether, tan trong dung dịch
kiềm, hầu như không tan trong nước lạnh, không tan trong benzen, cloroform. Ở
dạng tinh thể hình kim, Kaempferol có nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 276 –
2780 C. Ở dạng vi tinh thể, Kaempferol có nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 278
– 2800C. Kaempferol có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 266 nm và 362 nm
trong methanol, ở bước sóng 265 nm và 365 nm trong ethanol .
Tác dụng dược lí: Kaempferol có khả năng dập tắt các gốc tự do như
HO., ROO.… tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch,
chống viêm, chống dị ứng, ức chế sự hình thành và phát triển khối u trên da
chuột nhắt trắng gây ra bởi benzo-α-pyren và dầu ba đậu, ức chế enzyme
cyclooxygenase (COX-1 và COX-2) và quá trình peroxyd hóa lipid (flavan).

Hình 1.6: Kaempferol
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tùy thuộc vào đối tượng chất có
trong các mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình,
chất phân cực…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

10


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.3.1. Chọn dung môi chiết.
Trong quá trình chiết các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây được chiết
đóng vai trò quan trọng trong việc lựa chọn dung môi chiết, tránh được sự phân
hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn.
Vì vậy, việc lựa chọn dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải cẩn
thận. Điều kiện của dung môi là phải hòa tan được những chất chuyển hóa thứ
cấp đang nghiên cứu, dễ dàng loại bỏ, có tính trơ ( không phản ứng với chất
nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc. Dung môi có lẫn các tạp chất gây
ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung
môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Trong
quá trình sản xuất hoặc khâu bảo quản (trong các thùng chứa hoặc các nút đậy
bằng nhựa) thường thì có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl
phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat.
Dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)-phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] thường
có trong metanol và clorofoc. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong
các quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh
học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Trong quá trình chiết sơ bộ một phần
của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…, clorofoc, metylen clorit và metanol là
những dung môi thường được lựa chọn.
Một vài hợp chất như các ancaloit có thể phản ứng với những tạp chất của
clorofoc như CH2Cl2, CH2ClBr tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Tương
tự như vậy, sự phân hủy, sự khử nước hay sự đồng phân hóa với các hợp chất
khác có thể xảy ra bởi sự có mặt của lượng nhỏ axit clohidric (HCl). Khi làm
việc với clorofoc cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải
đeo mặt nạ phòng độc vì clorofoc có thể gây tổn thương cho gan và thận.
Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofoc.

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

11


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon
thế clo nên các dung môi này sẽ được sử dụng trong quá trình chiết vì các dung
môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên để thu được lượng
lớn các thành phần trong đó. Trái lại, khả năng phân cực của clorofoc thấp hơn,
nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hòa tan phần lớn các
chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì
vậy, các chất này cũng bị hòa tan đồng thời khi chiết bằng ancol. Thông thường
dung môi cồn trong nước có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
metanol trong suốt quá trình chiết. Trechlonolide A thu được từ trechlonaetes
aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân hủy 1hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết
trong metanol nóng là một ví dụ.
Nước thường ít được sử dụng để thu dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó
là dùng dung dịch nước của metanol. Trong quá trình chiết thực vật dietyl ete
hiếm khi được dùng vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, tạo thành peroxit
dễ nổ. Các hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid dễ
gây phản ứng oxi hóa với peroxit của dietyl ete. Trong môi trường axit, axeton
cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol. Quá trình chiết dưới điều kiện
axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi
xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong
muốn.

Sau khi chiết, ở nhiệt độ không quá 30- 400C dung môi được cất ra bằng
máy cất quay, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao
hơn.
1.3.2. Quá trình chiết
Quá trình chiết đơn giản được phân thành 4 loại như sau:

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

12


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

 Chiết ngâm
 Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
 Chiết sắc với dung môi nước.
 Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình
chiết thực vật là chiết ngâm bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian.
Để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi người ta sử
dụng một bình thủy tinh với một cái khóa ở dưới đáy, dung môi nóng sẽ đạt hiệu
quả chiết cao hơn. Ngày nay máy chiết ngâm có thể dùng bình thủy tinh mà
không đòi hỏi phải làm bằng kim loại như trước đây.
Quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục
bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết
sẽ được lấy ra và quá trình chiết một mẫu thường chỉ thực hiện qua ba lần dung
môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Có các cách
khác nhau để xác định sự kết thúc của một quá trình chiết.

Ví dụ:
- Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra
mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
- Đối với việc chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của các hợp
chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân
Đragendrofff và tác nhân Maye.
- Các lacton của sesquitecpen và glicozit trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng
để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ
cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào
quá trình chiết kết thúc.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và xuất
hiện của sự cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

13


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Như vậy, để đạt hiệu quả cao, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì
mà chúng ta cần lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết
hợp lí. Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các
lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ.
Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất
hữu nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.

1.4.1. Đặc điểm chung.
Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác
nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha
động và pha tĩnh.
Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa tính
chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…) tương ứng với pha động và pha tĩnh.
Tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với
một pha tĩnh có sự khác nhau. Nguyên nhân của sự khác nhau đó là do khả năng
bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của
các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực với pha động và pha tĩnh khác nhau.
Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này
đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết
quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống
sắc kí nhờ vào đặc điểm trên.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí.
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha
động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật hấp phụ đơn phân tử

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

14


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh
với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần):

n

n .b.C
1  b.C

Trong đó
n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đại cân bằng.
n∞: Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào
đó.
b : Hằng số.
C : Nồng độ của chất bị hấp phụ.
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí.
Trong các phương pháp sắc kí: pha động là các chất ở trạng thái khí hay
lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
 Theo bản chất của hai pha sử dụng :
 Pha tĩnh: Có thể là chất rắn hoặc chất lỏng.
 Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silica gel đã
được xử lý, nó có thể nạp vào trong một cột.
 Pha tĩnh là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng được tẩm lên
bề mặt một chất mang.
 Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí.
 Pha động là chất lỏng: Ví dụ trong kỹ thuật sắc kí giấy, sắc kí
lớp mỏng, sắc kí cột.
 Pha động là chất khí: Ví dụ trong kĩ thuật sắc kí khí. Trong
trường hợp này chất khí được gọi là khi mang hay khí vectơ.
 Theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình phân tách chất.
 Sắc kí phân chia (partition chromatography).

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

15


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

 Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc kí khí).
 Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng,
chất lỏng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.
- Sắc kí hấp thụ (Adsorption chromatography).
 Pha động là chất lỏng hoặc chất khí,
 Pha tĩnh là chất rắn: Đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính
trơ, được nối trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử
dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.
- Sắc kí trao đổi ion (Ion exchange chromatography)
 Pha động chỉ có thể là chất lỏng.
 Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo
hóa học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của các hạt mang các nhóm
chức hóa học ở dạng ion. Có hai loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi
cation.
- Sắc kí lọc gel (size exclusion chromatography), gel filtration
chromatography)
 Pha động chỉ có thể là chất lỏng.
 Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer,
trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng.
- Sắc kí ái lực (arrinicy chromatography)
 Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng
rãi trong việc tinh sạch protein.

 Sắc kí ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt
trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái
lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở.
- Sắc kí lỏng cao áp: Kĩ thuật sắc kí lỏng cao áp là một dạng mở rộng
của kỹ thuật sắc kí cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể.

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

16


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều
vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột
được làm từ vật liệu mịn hơn nên để có được một tốc độ chảy thích hợp, phải có
một áp lực tác động lên cột. Phân loại sắc kí theo cấu hình (chromatography
configuration).
- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng ( paper thin – layer chromatography).
Trong sắc ký giấy:
 Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos.
 Pha động: chất lỏng.
Trong sắc ký lớp mỏng:
 Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel,
là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực.
 Pha động: Luôn luôn là chất lỏng.
- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)
 Là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được

đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa.
 Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mẫu cần tách được
đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh.
 Theo trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai nhóm
lớn: Sắc kí lỏng và sắc kí khí.
 Theo cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành các nhóm nhỏ: Sắc
kí cột và sắc kí lớp mỏng.
1.4.3.1. Sắc kí cột (C.C).
Sắc kí cột là phương pháp sắc kí phổ biến, đơn giản nhất. Chất hấp phụ là
pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha
đảo YMC, ODS, Dianion. Chúng được nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh
hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ phản

Cao Thị Liễu, K37B- Khoa Hóa học

17