Phân lập các hợp chất Sterol, Flavonoid, Coumarin từ cây lược vàng tỉnh Quảng Nam

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 3(44).2011


133
PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT STEROL, FLAVONOID,
COUMARIN TỪ CÂY LƯỢC VÀNG TỈNH QUẢNG NAM
ISOLATION OF STEROLS, FLAVONOIDS AND COUMARINS
FROM THE LUOCVANG PLANT IN QUANGNAM PROVINCE

Phạm Văn Hai, Trần Thị Ánh Hồng

Đại học Đà Nẵng

TÓM TẮT
Bài báo này trình bày về kết quả chiết tách và phân lập các hợp chất chính có trong
thân lá của cây Lược vàng ở Tỉnh Quảng Nam. Qua thực nghiệm bằng phương pháp chiết
soxhlet với các dung môi có độ phân cực khác nhau như n-hexan, ethyl axetat, methanol và
bằng các phương pháp sắc ký, các phương pháp phổ hiện đại MS,
13
C-NMR,
1
H-NMR

đã phân
lập và xác định được cấu trúc các hợp chất có trong thân lá cây Lược vàng là: hợp chất
HLVE_1 có tên 3-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-sitosterol, hợp chất HLVH_1 có tên (24R-
stigmasta-5-en-3-β-ol) còn gọi là β-sitosterol, hợp chất HLVE_2 là (2S, 3S, 4R)-2-(2’R-
hydroxyhexacosanoyl)-amino-hexadeca-1,3,4-triol hay là Calliceramide và hợp chất HLVH_2 là
stigmasterol .
SUMMARY
This paper presents a study on the extraction and determination of the chemical

composition of the Luocvang plant from Quangnam Province. We first used the soxhlet
extraction method with different polarization solvents such as n-hexan, ethyl acetate, methanol
and then with Chromatography methods and the model spectro methods such as IR, MS,
13
C-
NMR,
1
H-NMR to isolate and determine its chemical structures. Our experimental results show
that there are four extracted chemical compounds such as 3-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-
sitosterol, 24R-stigmasta-5-en-3-β-ol or β-sitosterol, Calliceramide, and stigmasterol. This is the
first report on the successful isolation of the compound of (2S, 3S, 4R)-2-(2’R-
hydroxyhexacosanoyl)-amino-hexadeca-1,3,4-triol from the Luocvang plant in Quangnam
Province.
1. Đặt vấn đề
Cây Lược vàng có tên khoa học là Callisia fragrans, họ Thài Lài
(Commelinaceace). Gần đây, trên các thông tin đại chúng, cây Lược vàng được xem
như một “thần dược” trị bách bệnh. Thực vật Callisia fragrans là một cây cảnh di thực
từ Liên bang Nga sang Việt Nam, ban đầu nó được trồng ở Thanh Hóa, giờ đây cây
Lược vàng đã nhanh chóng phát triển đến các tỉnh, thành phố khác như Hà Nội, Hải
Dương, Bắc Giang, Ninh Bình, Quảng Nam,…[2,3] Cây Lược vàng được sử dụng theo
kinh nghiệm dân gian để điều trị rất nhiều bệnh từ những bệnh thông thường như mụn
nhọt, dị ứng, đau họng, đau răng, đến những bệnh nan y như ung thư, tiểu đường [2,4]...
Trong khi đó, cho đến nay trên thế giới và ở Việt Nam, chưa có công trình nào công bố
đầy đủ về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của loài cây này.
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 3(44).2011


134
Nhằm mục đích cung cấp thêm một số thông tin có ý nghĩa khoa học về loài
thực vật mà dân gian sử dụng làm thuốc chữa bênh bấy lâu nay, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu chiết tách, phân lập và xác định cấu trúc hóa học một số hợp chất chính có
trong thân lá của cây Lược vàng ở Tỉnh Quảng Nam.
2. Thực nghiệm
2.1. Nguyên liệu
Mẫu cây tươi thu hái về được thái thành miếng nhỏ, đưa đi sấy ngay ở nhiệt độ
110
0
C khoảng 10 phút để diệt men. Sau đó phơi và sấy khô ở 50-60
0
C cho tới khi độ
ẩm ≤ 10%. Mẫu khô được nghiền nhỏ và được ngâm chiết với các dung môi có độ phân
cực khác nhau. Mẫu cây đã được TS Đỗ Hữu Thư – Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh
học – Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia giám định tên khoa học là
Callisia fragrans [2].
2.2. Thiết bị và hóa chất
2.2.1 Thiết bị
1. Sắc ký cột, sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 100-400 mesh (0,040 đến
0,063mm hoặc 0,1 đến 0,16mm) và nhôm ôxit (Al
2
O
3
, Aluminiumoxid 150-PF
254+366
-
Typ T , Art. 1065 - Merck) với hệ dung môi rửa giải là n- hexan:etylaxetat có độ phân
cực tăng dần.
2. Sắc ký bản mỏng: Các tấm sắc ký lớp mỏng đế nhôm DC-Alufolien Kieselgel
60F
254
Art.5554 và đế nhựa (polyme) DC-Plastikfolien Kieselgel 60F

254
Art.5735 tráng
sẵn, độ dày 0,2mm cũng đã được sử dụng để xác định một số thành phần có trong các
dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được.
Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV-BIOBLOCK) ở bước
sóng λ=254nm (365nm) rồi được phun thuốc thử Vanilin 1% trong metanol H
2
SO
4
10%
và sấy trên 100
0
C, đưa vào buồng I
2
để xác định thành phần cấu tử.
3. Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm (các loại bình cầu chịu nhiệt thủy tinh,
thiết bị cất quay chân không, các thiết bị nghiên cứu thích hợp khác).
2.2.2 Hóa chất
- Dung môi: n-hexan, ethyl axetat, methanol, ... dạng tinh khiết (P) và phân tích
(PA);
- Thuốc thử : Dragendoff, Mayer, Wagner, Liebermann–Burchard và các hóa
chất: dung dịch H
2
SO
4
đặc, dung dịch H
2
SO
4
5%, dung dịch NaOH 10%, dung dịch

CH
3
COOH 5%, dung dịch HCl đặc, dung dịch FeCl
3
,…;
- Thuốc hiện hình: Vanilin trong H
2
SO
4
10%;
- Các hệ dung môi triển khai bản mỏng.
2.3. Phân tích thành phần hóa học thân lá Lược vàng Tỉnh Quảng Nam
Thành phần hóa học thân lá Lược vàng bằng phương pháp ngâm chiết soxhlet
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 3(44).2011


135
trong dung môi n- hexan được phân tích bằng các thiết bị phổ khối kết hợp sắc kí khí
(GC-MS).
3. Kết quả và thảo luận
3.1 Phân lập các hợp chất hóa học trong thân lá cây Lược vàng Tỉnh Quảng Nam
3.1.1. Hợp chất HLVH_1 (
β
-sitosterol)
Thân lá cây Lược vàng được ngâm chiết trong dung môi methanol và chuyển lên
sắc ký cột để rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan: ethyl axetat (30:1), thu được chất
rắn vô định hình và kết tinh lại trong n-hexan thu được những tinh thể hình kim, không
màu, nóng chảy ở 136-138
0
C.

Trong phổ EI-MS chất HLVH_1 cho mảnh ion phân tử (m/z) M
+
= 414, như
vậy khối lượng phân tử bằng 414 đvc ứng với công thức phân tử C
29
H
50
O.
Trong phổ FT-IR cho biết có dao động của liên kết nhóm OH ở vùng 3430cm
-1
,
đặc trưng dao động hoá trị của các liên kết đôi (C=C) ở vùng 1640cm
-1
và dao động
vọng ở 3010cm

-1
.
Trong phổ
1
H-NMR cho biết: Tín hiệu δ
H
3,53 ppm đặc trưng cho proton trong
nhóm CH carbinol , tín hiệu δ
H
5,36 ppm của H trong liên kết olefin (C=C) với δ
C
lần
lượt là 140,8 ppm và 121,7 ppm.
Trong các phổ

1
H-NMR,
13
C-NMR và kết hợp với phổ DEPT đã cho biết trong
phân tử của chất HLVH_1 có 29 nguyên tử cacbon trong đó có 3 nguyên tử cacbon bậc
4, có 9 nhóm metin (CH), 11 nhóm metylen ( CH
2
) và 6 nhóm metyl (CH
3
). Từ đó có
thể quy kết hợp chất HLVH_1 có một nối đôi giữa vị trí C-5 và C-6. Ngoài ra, trong
phổ
13
C-NMR còn nhận thấy δ
C
71,8 ppm đặc trưng cho cacbon liên kết trực tiếp với
oxy của nhóm hydroxyl.
So sánh phổ
1
H-NMR và
13
C-NMR kết hợp với phổ DEPT của chất HLVH_1
với phổ β-sitosterol thấy hoàn toàn tương thích ở độ sai số cho phép.
Từ các kết quả phân tích thành phần hoá học, tính chất vật lý, tính chất quang phổ
và dựa trên cơ sở so sánh các số liệu phổ của chất HLVH_1 với phổ của chất β-sitosterol
chuẩn, kết hợp với việc xác định điểm chảy của hỗn hợp của HLVH_1 với β-sitosterol
không đổi, có thể cho phép quy kết chất HLVH_1 đã phân lập được từ lá cây Lược vàng
là 24R-stigmasta-5-en-3-β-ol hay β-sitosterol, và cấu trúc của HLVH_1 như sau:

β-sitosterol

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 3(44).2011


136
3.1.2 Hợp chất HLVH_2 (Stigmasterol)
Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan: ethyl axetat 5:1 từ cao hexan thu được
chất rắn màu trắng hình kim, tan trong clorofom và methanol. Nhiệt dộ nóng chảy của
chất HLVH3 ở 155-157
0
C.
Phổ
1
H-NMR có các tín hiệu đặc trưng ở δ
H
5. 35 ppm (1H, d, J = 5Hz và 2Hz)
là tín hiệu của proton trong liên kết olefin (C=C) trong vòng. Hai tín hiệu δ
H
5.14 (1H,
dd, J = 5 và 15 Hz) và δ
H
5.03 (1H, dd, J = 15 Hz và 5Hz) đặc trưng cho hai proton liên
kết với hai cacbon ở liên kết đôi ngoài vòng, điều này chứng tỏ liên kết C=C ngoài vòng
có cấu hình trans (E). Tín hiệu δ
H
3,49 (1H, m) thuộc proton H-3 ở nhóm carbinol trong
vòng.
Phổ
13
C-NMR có các tín hiệu đặc trưng ở δ
C

138.32, 129.31, 140.71, và 121.67
ppm là các tín hiệu cacbon trong các liên kết đôi C=C, tại δ
C
71.8 ppm là tín hiệu phổ
của C-3 liên kết với nhóm OH. Ngoài ra, có các tín hiệu phổ khá dày đặc trong vùng
trường mạnh nằm trong vùng từ 12.2 - 60 ppm đặc trưng cho tín hiệu của các nhóm
metyl (CH
3
), metylen (CH
2
) và metin (CH) của HLVH_2.
Trong các phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR và phổ DEPT cho biết thêm trong phân tử
HLVH_2 có 29 nguyên tử cacbon, trong đó có 3 nguyên tử các bon bậc 4, có 11 nhóm
nhóm metin (CH), 9 nhóm metylen (CH
2
) và 6 nhóm CH
3
.
Từ các kết quả phân tích thành phần hoá học, tính chất vật lý, tính chất quang
phổ nhất là dựa trên cơ sở so sánh các số liệu phổ của chất HLVH_2 với phổ của chất
stigmasterol hoàn toàn có thể cho phép quy kết chất HLVH_2 đã phân lập được từ lá
cây Lược vàng là stigmasterol và cấu trúc của HLVH_2 là:

Stigmasterol
3.1.3. Hợp chất HLVE_2 (Calliceramide)
HLVE_2 là chất rắn màu

trắng, vô định hình thu được từ dịch
chiết ethyl axetat của cây Lược vàng,
nóng chảy ở 116-118
0
C, không tan
trong nước, tan rất tốt trong hệ dung
môi CHCl
3
/MeOH (tỷ lệ 1:1). Phổ
HR-MS của nó (Hình 1) cho pic ion
giả phân tử với (m/z) 684,6713
[M+H]
+
, (tính theo công thức:
C
42
H
86
NO
5
), do vậy khối lượng phân
Hình 1. Phổ HR-MS của HLVE 2
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 3(44).2011


137
tử làm tròn số của HLVE_2 sẽ là M =
683, điều này chứng tỏ chất HLVE_2
có chứa nitơ và công thức nguyên sẽ là
C

40
H
85
NO
5
. Phân tích các số liệu phổ
1
H,
13
C-NMR, DEPT-135, DEPT-90,
HMQC và HMBC của nó cho thấy,
chất HLVE_2 là một amit, có gốc
alkyl mạch dài no không phân nhánh
(đặc trưng cho các cerebrozit). Các
phổ DEPT-90 và DEPT-135 cho biết,
phân tử HLVE_2 có 4 nhóm metin (CH), với các độ dịch chuyển hóa học ở: δ
C
51,3(C-
2); 70,9(C-4); 71,0(C-2’) và 74,5ppm (C-3). Phổ HMQC cho biết, ở phía trường yếu
nhất có 3 nguyên tử C liên kết trực tiếp với ôxi, như vậy trong phân tử của nó có 3
nhóm hydroxyl thuộc 3 nguyên tử C bậc 3, nguyên tử C còn lại δ
C-2
51,3 liên kết trực
tiếp với nguyên tử nitơ. Phổ
1
H-NMR (hình 2) của nó cho thấy ở δ
H
7,3ppm là một
dublet (J=8,9Hz), đây là tín hiệu của nguyên tử H thuộc nhóm amit; Ở δ
H

3,95ppm (m)
là tín hiệu của nguyên tử H-2, các nguyên tử H-2’ và H-4 có cùng độ dịch chuyển hóa
học ở 3,42ppm (br, s), còn các nguyên tử H-1 có độ dịch chuyển hóa học ở 3,6 và 3,7
ppm (2H, dd, J=6,1 và 12,5Hz, H-1a và H-1b), H-3 có độ dịch chuyển hóa học ở
3,85ppm (1H, dd, J=4,2 và 4,6Hz, H-3). Các nguyên tử Hω1 và Hω1' có độ dịch
chuyển hóa học ở khoảng 0,9ppm (t) và độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử
Cω1, Cω1' là 13,2ppm. Các nguyên tử H còn lại trong phân tử thuộc các nhóm CH
2
có
độ dịch chuyển hóa học trong khoảng từ 1,2 - 2,0 ppm đối với các nguyên tử H và
khoảng 22-35ppm đối với các nguyên tử C. Các phổ
13
C-NMR, DEPT -135, DEPT- 90
(hình 3), và HMQC (hình 4) còn cho biết thêm trong phân tử HLVE_2 có một nhóm
CO (cacbonyl) với δ
C-1’
=173,2ppm (s), có một nhóm metylen (CH
2
) liên kết trực tiếp
với ôxi có độ dịch chuyển hóa học ở 60,4ppm.

Hình 2. Phổ
1
H-NMR của HLVE_2
Hình 3. Phổ
13
C-NMR và DEPT của HLVE_2 Hình 4. Phổ HSQC của HLVE_2