thực hiện bộ tiêu bản cố định tập đoàn volvox

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA SƯ PHẠM
BỘ MÔN SƯ PHẠM SINH HỌC

THỰC HIỆN BỘ TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH
TẬP ĐOÀN VOLVOX

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành SƯ PHẠM SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

ThS. PHẠM THỊ BÍCH THỦY

SƠN THỊ MỸ NƯƠNG
Lớp: Sư Phạm Sinh K35
MSSV: 3092225

NĂM 2013


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

CẢM TẠ
Với vốn kiến thức còn hạn hẹp nên trong quá trình thực hiện đề tài, tôi gặp
rất nhiều khó khăn. Tuy nhiên, những khó khăn đó dần dần được khắc phục và
vượt qua với với sự giúp đỡ tận tình của quý Thầy Cô cùng các bạn trong bộ môn

Sư phạm Sinh học đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn này. Để đáp lại sự giúp
đỡ đó, tôi xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:
Cô Phạm Thủy Bích Thủy đã tận tình hướng dẫn và cung cấp nhiều tài liệu
giúp tôi hoàn thành tốt đề tài này.
Cô Phùng Thị Hằng đã tận tình giúp đỡ và cho nhiều ý kiến giúp tôi hoàn
thành đề tài.
Cán bộ phòng thí nghiệm thực vật đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt cho
tôi trong suốt thời gian làm luận văn.
Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức quý báo cho tôi suốt bốn năm học qua.
Anh Nguyễn Phú Cường và tất cả các bạn học cùng khóa đã giúp đỡ động
viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Bạn Trần Thị Ngọc Giàu, Phạm Thị Bích Ngọc đã giúp đỡ tôi trong quá
trình thu mẫu.
Cha Mẹ đã ủng hộ cả tinh thần lẫn vật chất giúp cho con vượt qua những
khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống.
Rất mong quý Thầy Cô, bạn bè và Cha Mẹ nhận lời cảm tạ chân thành và
đầy thân ái này.
Cần Thơ, ngày 29 tháng 04 năm 2013
Sinh viên thực hiện

Sơn Thị Mỹ Nương

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

i

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM LƯỢC
Trong thời gian từ tháng 10/2012 đến 05/2013, tiến hành thử nghiệm các
nghiệm thức trữ mẫu, nhuộm mẫu, khử nước,… tại phòng thí nghiệm thực vật bộ
môn Sinh học khoa Sư phạm trường Đại học Cần Thơ, đã tìm ra được quy trình
thực hiện tiêu bản hiển vi cố định tập đoàn tảo lục Volvox, nhuộm mẫu với thuốc
nhuộm Methyl Green (1 giờ 30 phút), rửa lại với nước cất (30 giây), khử nước qua
các nồng độ cồn, n- butanol (30 giây), làm trong mẫu với dung dịch xylen (30
giây), dán mẫu bằng Baume canada pha trong xylen (1 : 1) . Hoàn thành được 30
tiêu bản hiển vi đạt yêu cầu về hình thức và nội dung, tiêu bản bắt màu tương đối
đẹp, quan sát rõ các cấu trúc của tập đoàn Volvox: các tập đoàn con, cầu nối
nguyên sinh chất, đồng thời thực hiện được bộ mẫu ngâm gồm 5 lọ 50 ml tập đoàn
Volvox trong formol 5%.

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

ii

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
CẢM TẠ ................................................................................................................i
TÓM LƯỢC...........................................................................................................ii

MỤC LỤC............................................................................................................iii
DANH SÁCH HÌNH............................................................................................vi
CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ..................................................................................1
1. Đặt vấn đề.......................................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................1
CHƯƠNG I. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..............................................................2
1. Đặc điểm chung của ngành tảo lục ..................................................................2
1.1. Tổ chức cơ thể..........................................................................................2
1.2. Cấu tạo tế bào...........................................................................................2
1.3. Sinh sản....................................................................................................3
1.4. Phân loại ..................................................................................................3
1.5. Volvox ......................................................................................................4
2. Kỹ thuật thực hiện tiêu bản hiển vi cố định .....................................................7
2.1. Cố định mẫu .............................................................................................7
2.2. Nhuộm mẫu..............................................................................................8
2.3. Khử nước .................................................................................................8
2.4. Dán lamelle ..............................................................................................9
3. Tình hình nghiên cứu .....................................................................................9
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........11
1. Phương tiện...................................................................................................11
1.1. Mẫu vật ..................................................................................................11
1.2. Thiết bị và dụng cụ.................................................................................11
1.2.1. Thiết bị............................................................................................. 11
1.2.2. Dụng cụ ...........................................................................................11

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

iii

Bộ môn Sư phạm Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

1.3. Vật tư và hóa chất...................................................................................12
1.3.1. Vật tư ............................................................................................... 12
1.3.2. Hóa chất ..........................................................................................12
2. Phương pháp.................................................................................................13
2.1. Thu mẫu .................................................................................................13
2.2. Trữ mẫu..................................................................................................13
2.3. Nhuộm mẫu............................................................................................ 14
2.4. Khử nước ............................................................................................... 15
2.5. Làm trong mẫu .......................................................................................16
2.6. Dán mẫu.................................................................................................17
2.7. Dán nhãn ................................................................................................ 18
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................19
1.

Thu mẫu và trữ mẫu...................................................................................19

2. Nhuộm mẫu ..................................................................................................19
3. Khử nước......................................................................................................21
4. Làm trong mẫu.............................................................................................. 23
5. Dán mẫu .......................................................................................................23
6. Quy trình tổng quát thực hiện tiêu bản cố định..............................................24
7. Tổng số tiêu bản đã thực hiện........................................................................25
8. Một số hình ảnh từ tiêu bản hiển vi cố định...................................................26
8.1. Hình ảnh từ các nghiệm thức thử nghiệm ...............................................26

8.2. Hình ảnh thu được từ qui trình thực hiện tiêu bản ...................................29
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................31
1. Kết luận ........................................................................................................31
2. Đề nghị .........................................................................................................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................32

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

iv

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Nghiệm thức nhuộm mẫu với thuốc nhuộm Methyl Green và Fast green ............. 15
Bảng 2: Các nghiệm thức khử nước sau khi nhuộm mẫu ......................................16
Bảng 3: Các nghiệm thức làm trong mẫu bằng xylen............................................16
Bảng 5: Kết quả nghiệm thức nhuộm mẫu với thuốc nhuộm Methyl Green và Fast Green.........20
Bảng 6: Kết quả các nghiệm thức khử nước mẫu nhuộm ......................................22
Bảng 7: Kết quả nghiệm thức làm trong mẫu bằng xylen......................................23
Bảng 8: Quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi cố định tập đoàn Volvox với thuốc
nhuộm Methyl Green............................................................................................ 24

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

v

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Cấu tạo của Volvox ................................................................................. 5
Hình 2: Leodorina californica.............................................................................. 5
Hình 3: Một phần tập đoàn Volvox globator với các tế bào sinh sản hữu tính ...... 6
Hình 4: Sinh sản vô tính và hữu tính noãn giao ở Volvox..................................... 7
Hình 5: Volvox năm 2013 ở vật kính 10X............................................................ 11
Hình 6: Volvox năm 2004 ở vật kính 4X.............................................................. 11
Hình 7: Nơi thu mẫu ở Huyện Phong Điền – Thành Phố Cần Thơ....................... 13
Hình 8: Cách đậy lamelle .................................................................................... 17
Hình 9: Hình ảnh tiêu bản hiển vi cố định sau khi hoàn thành ............................. 18
Hình 10: Bộ mẫu ngâm Volvox............................................................................ 26
Hình 11: Volvox trữ năm 2004 nhuộm với Fast Green ......................................... 26
Hình 12: Volvox thu năm 2013 nhuộm với Methyl Green trong thời gian 1 giờ 30 phút..... 26
Hình 13: Volvox năm 2004 nhuộm với Fast Green dễ bị vỡ khi tiến hành qui trình
thực hiện tiêu bản ................................................................................................ 27
Hình 14: Volvox năm 2013 nhuộm với Fast Green..............................................................27
Hình 15: Volvox bị đen do khô xylen trước khi dán Baume Canada..................... 27
Hình 16: Volvox năm 2004 nhuộm với Methyl Green trong thời gian 5 phút ....... 27
Hình 17: Volvox bắt màu rất nhạt với thuốc nhuộm Methyl Green ở thời gian 20 phút.....28
Hình 18: Volvox bắt màu nhạt với thuốc nhuộm Methyl Green ở thời gian 60 phút………..28
Hình 19: Volvox nhuộm với Methyl Green ở thời gian 20 phút mất màu sau 2 tháng……28

Hình 20: Volvox nhuộm với Methyl Green ở thời 60 phút mất màu sau 2 tháng ...............28
Hình 21: Volvox bị nhòe màu do khử nước chưa sạch.......................................... 29
Hình 22: Volvox bị teo ........................................................................................ 29
Hình 23: Cấu tạo tập đoàn Volvox ở vật kính 10X ............................................... 29
Hình 24: Cầu nối nguyên sinh chất ở vật kính 40X.............................................. 29
Hình 25: Các tộc đoàn con của Volvox ................................................................ 30

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

vi

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG I

GIỚI THIỆU
1. Đặt vấn đề
Tảo lục là một trong những ngành tảo lớn nhất được biết hiện nay. Cơ thể
được tổ chức từ cấp độ đơn bào đến đa bào. Phân bố rộng rãi khắp mọi nơi có ánh
sáng, chủ yếu ở nước ngọt một số ít ở nước mặn, trong đất ẩm … Sinh sản bằng
hình thức vô tính và hữu tính. Đặc biệt tảo lục Volvox có lối sống tập đoàn, tập
đoàn hình cầu có kích thước 0,5 - 2 mm, phân bố hầu hết trong các ao hồ. Ngày
nay, khi nền công nghiệp ngày càng phát triển, đất nông nghiệp càng thu hẹp, thì
khả năng tìm thấy Volvox ngày càng hiếm. Hơn nữa, tiêu bản cố định có nhiều ưu
điểm như có thể giữ mẫu trong thời gian dài, quan sát rất tiện lợi và không mất thời

gian để thực hiện tiêu bản nhiều lần. Bên cạnh đó, do nhu cầu sinh viên năm cuối
cần được trang bị một số kiến thức về kỹ thuật hiển vi, để khi ra trường biết cách
chủ động chuẩn bị mẫu vật, phục vụ cho bài giảng lý thuyết cũng như các bài thí
nghiệm thực hành sinh học ở trường phổ thông. Với những ý nghĩ trên đã thôi thúc
tôi chọn đề tài: “THỰC HIỆN BỘ TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH TẬP ĐOÀN VOLVOX”
2. Mục tiêu đề tài
Với đề tài “Thực hiện bộ tiêu bản cố định tập đoàn Volvox” nhằm bổ sung
cho phòng thí nghiệm thực vật lượng tiêu bản hiển vi cố định, phục vụ cho các sinh
viên học tốt các học phần phân loại thực vật, thực vật học và giảng dạy lý thuyết
của giáo viên. Đề tài được thực hiện với những mục tiêu sau:
Thực hiện bộ mẫu ngâm Volvox khoảng 5 lọ.
Tìm ra quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi cố định Volvox.
Hoàn thành được ít nhất 30 tiêu bản hiển vi cố định.

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

1

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG II

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1. Đặc điểm chung của ngành tảo lục

Ngành tảo lục là một ngành tảo lớn nhất, đa dạng nhất trong tất cả các ngành
tảo hiện nay đã biết. Cho đến nay người ta đã tìm thấy trong ngành này có khoảng
8000 loài, phần lớn là sống trong nước ngọt, còn ở nước mặn chủ yếu là những chi
sau: Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Cladophora, Valonia, Boergessenia, Caulerpa,
Bryopsis, Codium…Sự khác biệt giữa tảo lục với các tảo khác ở chỗ cơ thể luôn
luôn có màu xanh lục và chất dự trữ là tinh bột (bắt màu với iod) (Đặng Minh
Quân, 2011).
1.1. Tổ chức cơ thể
Tản có cơ thể đơn bào, tập đoàn hay đa bào hình sợi đơn, phân nhánh hoặc
hình bản mỏng, có khi có cấu tạo cộng bào (tản hình ống thông, trong chứa nhiều
nhân) (Hoàng Thị Sản, 1999).
1.2. Cấu tạo tế bào
Vách tế bào thường bằng celluloz, pectin hóa nhầy, một số ít dạng nguyên
thủy nhất mới là tế bào trần (màng ngoài là màng nguyên sinh chất), lạp có nhiều
hình dạng khác nhau: hình chuông, hình phiến, hình hạt, hình sao nhiều cạnh, đai
vành móng ngựa (hình nhẫn), xoắn lò xo, mắt lưới…, sắc tố (pygment) chủ yếu là
diệp lục tố a, diệp lục tố b, carotene, xanthophin (với 10 loại chất khác nhau), trong
đó diệp lục tố a,b chiếm ưu thế so với các sắc tố phụ trội khác nên tản bao giờ cũng
có màu xanh lục. Chất dự trữ là tinh bột quanh hạch lạp nằm trong lục lạp, đôi khi
chất dự trữ là những giọt dầu (giọt lipit). Tế bào tảo lục chứa một hay nhiều nhân,
nhân thường nằm giữa khoang túi dịch bào, hay sát bên thành lớp nguyên sinh. Một
số tảo lục đơn bào hoặc là tộc đoàn có thể di động được ở trạng thái dinh dưỡng
nhờ có roi, còn các tảo lục khác chỉ có bào tử hay giao tử mới có roi di động được
(Đặng Minh Quân, 2011).

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

2

Bộ môn Sư phạm Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

1.3. Sinh sản
Tảo lục sinh sản sinh dưỡng bằng phân đôi tế bào (đơn bào) bằng khúc tản
(dạng sợi), sinh sản vô tính bằng động bào tử, hình thành trong túi bào tử. Động
bào tử có cấu tạo rất giống với trùng roi: hình quả lê, có roi, mắt và không bào co
rút. Khi rời khỏi túi bào tử, các động bào tử bơi lội một thời gian trong nước, sau
định cư lại, mất roi, tự tạo lấy màng và nảy mầm thành cơ thể mới (Lương Ngọc
Toản và Võ Văn Chi, 1978).
Sinh sản hữu tính bằng cả ba hình thức: đẳng giao, dị giao và noãn giao, một
số sinh sản theo kiểu tiếp hợp giữa hai tế bào sinh dưỡng. Hợp tử hình thành
thường tiết ra màng bọc, sau một thời gian nghỉ, nảy mầm và phân chia giảm
nhiễm cho ra tản mới (Hoàng Thị Sản, 1999).
Tảo lục có quan hệ với tảo mắt vì động bào tử và chất màu của chúng giống
nhau (Hoàng Thị Sản, 1999).
1.4. Phân loại
Ngành tảo lục được chia làm 3 lớp (Phạm Hoàng Hộ, 1972)
- Lớp tảo lục (Chlorophyceae)
- Lớp tảo tiếp hợp (Zygophyceae)
- Lớp tảo vòng (Charophyceae)
Trong đó, lớp tảo lục (Chlorophyceae) là lớp quan trọng nhất của ngành tảo
lục, phân bố rộng (Phạm Hoàng Hộ, 1972).
* Đặc điểm chung của lớp tảo lục
Tản có thể là sống đơn bào, sống đơn độc hay tộc đoàn; hình sợi (chia nhánh
hoặc không), hình phiến mỏng (Đặng Minh Quân, 2011).
Lạp thường có hình chuông ở các tản đơn bào (ở Chlamydomonas,

Chlorella) hay hình sao (ở Asterococus) với hạch lạp ở giữa tế bào và nhiều nhánh
ra ngoại biên; hoặc lạp hình phiến quấn tròn, hình chiếc nhẫn (ở Ulva); hình sợi
tiếp giao cùng nhau (ở Oedonium). Mỗi lạp đều có hạch lạp trong lạp. Lạp ở đây là
lục lạp, có cơ cấu chi noãn cơ thực vật (Đặng Minh Quân, 2011).
Nhân: tế bào có một hoặc nhiều nhân (Đặng Minh Quân, 2011).

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

3

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Sinh sản vô tính bằng động bào tử có hai hoặc bốn tiêm mao, và bất động
bào tử, hình thành từ tế bào dinh dưỡng thông thường hay ở túi chuyển hóa với số
lượng ít hoặc cả một tập đoàn kiểu Volvox, gồm rất nhiều bào tử trong một túi (bào
tử phòng) (Đặng Minh Quân, 2011).
Sinh sản hữu tính bằng hình thức thụ tinh giữa các giao tử đực, cái giống
nhau về hình dạng, kích thước (đồng giao), giống nhau về hình dạng nhưng khác
kích thước (dị giao) hay giữa tinh trùng với trứng (noãn giao). Hợp tử trực tiếp phát
sinh từ cơ thể mới (sporophyte), nhưng thường chuyển thành bào tử nghỉ
(Zygospore), sau thời gian nằm im sẽ phát sinh hoặc lại hình thành bào tử động rồi
sau đó mới phát sinh thành cá thể mới (Đặng Minh Quân, 2011).
1.5. Volvox
* Vị trí phân loại
Ngành tảo lục: Chlorophyta

Lớp tảo lục: Chlorophyceae
Bộ: Volvocales
Họ: Volvocaceae
Chi: Volvox
* Đặc điểm
Tộc đoàn hình cầu có tới 20 ngàn tế bào, đường kính 0,5 – 2 mm nên có thể
nhìn thấy bằng mắt trần được. Tế bào có hai roi. Các tế bào xếp sát nhau phân bố
thành một lớp theo hình cầu, phần giữa chứa dịch nhầy. Tế bào có dạng sáu cạnh,
màng tế bào hóa nhầy, dày; các tế bào dính vào nhau nhờ các cầu nối chất nguyên
sinh tạo nên tộc đoàn hình lưới (Đặng Minh Quân, 2011).

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

4

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 1: Cấu tạo của Volvox

/>Tập đoàn có sự phân cực, ở cực chuyển động tập trung các cá thể dinh
dưỡng kích thước nhỏ, có điểm mắt và hai roi có cơ quan tử chuyển vận. Cả tập
đoàn chuyển vận theo hướng này. Ở cực đối diện, cực sinh sản, tập trung các cá thể
sinh sản có cấu tạo khác nhau gồm các thể sinh sản vô tính và các cá thể sinh sản
hữu tính (Đặng Ngọc Thanh, Trương Quang Học và ctv, 2001).

Hình 2: Leodorina californica

(theo Phạm Hoàng Hộ, 1967)
/>
Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

5

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Sự chuyên hóa ở đây rõ rệt vì khi sinh dục, tất cả các tế bào nhỏ của lớp ngoài của
tộc đoàn không thụ, mà chỉ có những tế bào to thường chôn ở trong, thụ và cho giao tử hay
bào tử. Vậy không thụ, không phân cắt được, các tế bào lớp ngoài phải chết đi, và vì rong
do lớp tế bào này làm ra, nên rong cũng chết theo (Đặng Minh Quân, 2011).
Volvox sinh sản vô tính khi gặp điều kiện thuận lợi, tế bào làm nhiệm vụ sinh sản
phân chia hình thành bản rồi uốn cong lại hình thành tộc đoàn hình cầu con. Tộc đoàn
Volvox mẹ có thể chứa tới 10 ngàn tộc đoàn con (Đặng Minh Quân, 2011). Cá thể sinh sản
vô tính thường có kích thước lớn (20- 30µm) (Đặng Ngọc Thanh và Trương Quang Học và
ctv, 2001). Khi màng tộc đoàn mẹ vỡ tộc đoàn con chui ra ngoài (Đặng Minh Quân, 2011).
Các tế bào sinh sản hữu tính cũng có cấu tạo tương tự như các cá thể sinh
sản vô tính. Các cá thể này sinh ra các giao tử đực và cái. Giao tử đực được hình
thành do sự phân cắt nhiều lần của các cá thể sinh sản (khoảng 100 giao tử từ một
cá thể) và có dạng dài với hai roi ở đỉnh. Giao tử cái là một tế bào sinh dục có kích
thước lớn (60- 75µm), nằm đơn độc và có màu xanh nâu. Giao tử đực và cái (của
cùng hay không cùng một tập đoàn) kết hợp thành hợp tử và được bao bọc trong

một lớp vỏ chắc. Khi một tập đoàn mẹ chết vỡ ra, hợp tử thoát ra ngoài và phát
triển thành tập đoàn mới (Đặng Ngọc Thanh, Trương Quang Học và ctv, 2001).

Hình 3: Một phần tập đoàn Volvox globator với các tế bào sinh sản hữu tính
1. giao tử cái, 2. giao tử đực

(theo Đặng Ngọc Thanh, 1980)
/>
Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

6

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 4: Sinh sản vô tính và hữu tính noãn giao ở Volvox

(theo Thái Trần Bái và Nguyễn Văn Khang, 2009)
/>* Ý nghĩa của tảo Volvox trong thiên nhiên
Tảo lục là nguồn thức ăn và nguồn cung cấp oxygen cho động vật trong thủy
vực nước ngọt, mặn. Tảo lục rất dễ tạo nên hiện tượng hoa nước như các giống loài
Chlorella, chlamydomonas, Ankistrodesmus, Scenedesmus hoa do tập đoàn
Eudorina, Volvox làm nước có màu lục hay Dunaliella làm nước màu đỏ
Cedogonium, Spirogyra, Zygnema, Hydrodictyon phát triển mạnh làm cản trợ hoạt
động của cá tôm. Tảo phát triển mạnh trong ruộng lúa làm hại lúa (Lam Mỹ Lan,
2000).

Volvox sống trôi nổi trên bề mặt môi trường nước làm thức ăn cho các động
vật nhỏ sống trong nước và những động vật nhỏ này cùng với tảo là nguồn thức ăn
chủ yếu cho cá. Trong quá trình quang hợp tảo tiết oxi vào nước, nhờ đó mà cá và
các động vật khác ở nước có thể hô hấp được (Lương Ngọc Toản, 1977).
2. Kỹ thuật thực hiện tiêu bản hiển vi cố định
2.1. Cố định mẫu
Cố định là giữ nguyên cấu trúc của mô cũng như của tế bào bằng cách giết
chết tức khắc đối tượng thực vật đang sống. Qua đó mà hình thái cấu tạo của nó ít

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

7

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

bị thay đổi nhất, còn giữ được trong tình trạng gần với lúc sống nhất. Một số
nguyên tắc khi cố định mẫu vật:
- Mẫu vật cố định phải thật tươi, làm ngay sau khi cắt khỏi cây (thực vật bậc
cao) hoặc tách khỏi nơi sống của nó (thực vật bậc thấp như tảo, nấm… )
- Dung dịch cố định cần đúng nồng độ và thể tích (thể tích dung dịch cố
định gấp 50- 100 lần thể tích vật cố định).
- Dùng dung dịch formol 4 - 5% để làm chất cố định hoặc ngâm các nguyên
liệu thực vật. Thời gian cố định thay đổi tùy theo mẫu vật, từ 30 phút (đối với tảo
nấm) đến 24 giờ (đối với thực vật bậc cao) (Trần Công Khánh, 1980).
2.2. Nhuộm mẫu

Tùy theo đối tượng và mục đích nghiên cứu mà người ta dùng các chất màu
khác nhau, cách nhuộm khác nhau, nhằm làm nổi rõ một số thành phần cấu tạo của
từng tế bào hoặc của từng mô trong cơ thể thực vật. Một số phương pháp nhuộm
màu (Trần Công Khánh, 1980):
- Nhuộm đơn: Chỉ dùng một loại chất màu.
- Nhuộm tăng dần: vật nhuộm đặt vào dung dịch màu cho đến khi màu sắc
đạt yêu cầu thì dừng lại, sau đó rửa hết chất màu dính rồi quan sát.
- Nhuộm giảm dần: vi phẫu được nhuộm màu quá đậm so với yêu cầu, sau đó
dùng chất lỏng thích hợp để tẩy bớt màu thừa cho đến khi màu sắc vừa đúng thì dừng
lại.
2.3. Khử nước
Sau khi nhuộm mẫu, nếu cần làm tiêu bản cố định thì phải khử nước trên mẫu
vật bằng cách ngâm các lame có dán mẫu vào các dung dịch sau (Trần Công Khánh,
1980):
Cồn 30 0

Thời gian 5 phút

Cồn 50 0

Thời gian 5 phút

Cồn 70 0

Thời gian 5 phút

Cồn 96 0

Thời gian 5 phút

Cồn tuyệt đối

Thời gian 5 phút

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

8

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Xylen - Cồn tuyệt đối

Thời gian 5 phút

Xylen - Cồn tuyệt đối

Thời gian 5 phút

Xylen - Cồn tuyệt đối

Thời gian 5 phút

Xylen (lần thứ nhất)

Thời gian 5 phút

Xylen (lần thứ hai)

Thời gian 10 phút

2.4. Dán lamelle
Sau khi nhuộm mẫu và vệ sinh tiêu bản cần dán lamelle bằng dung dịch
Baume canada ngay.
Lưu ý thao tác khi dán cần nhẹ nhàng và từ từ tránh bọt khí. Trong trường
hợp, nếu lớp keo gắn không chiếm hết toàn bộ lamelle thì cần phải nhỏ thêm vào
cho tới đủ. Ngược lại nếu keo gắn nhiều quá, tràn ra ngoài thì phải dùng dao nhỏ
cạo đi và dùng bông thấm xylen lau sạch các keo ở phía bên ngoài kính đậy (Đặng
Ngọc Thanh và ctv, 1980).
3. Tình hình nghiên cứu
Năm 1972, Phạm Hoàng Hộ với quyển “Tảo học”, ông đã mô tả đặc điểm
hình thái, cấu tạo cũng như phân loại của các loài tảo. Năm 1980, cuốn sách “Thực
tập động vật không xương sống” do Đặng Ngọc Thanh (chủ biên) trình bày hình
thái, giải phẫu ở mức độ cơ thể, cơ quan các động vật đại diện các nhóm phân loại
từ thấp tới cao trong hệ thống phân loại động vật, trong đó có đề cập đến Volvox.
Dương Đức Tiến và Võ Hành, năm 1997, đã viết cuốn sách “Tảo nước ngọt Việt
Nam” đi sâu phân loại các loài trong bộ tảo lục (Chlorococales) đồng thời nói lên
được mặt tích cực và tiêu cực của tảo đối với môi trường sống.
Kính hiển vi là một thiết bị dùng để quan sát các vật thể có kích thước nhỏ
bé mà mắt thường không thể quan sát được bằng cách tạo ra các hình ảnh phóng
đại của vật thể đó. Muốn qua sát được dưới kính hiển vi chúng ta phải thực hiện
tiêu bản hiển vi. Với tiêu bản hiển vi tạm thời, dễ thực hiện, quan sát ngay sau khi
thực hiện tiêu bản, tuy nhiên có hạn chế không thể lưu giữ lại, tốn thời gian thực
hiện tiêu bản để quan sát lại nếu cần. Vì thế, một số tác giả đã đưa ra phương pháp
thực hiện tiêu bản hiển vi cố định hay còn gọi là tiêu bản hiển vi “vĩnh viễn”, trong
đó có Trần Công Khánh, năm 1980, đã viết “Kỹ thuật hiển vi”, quyển sách đã mô

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

9

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

tả từng bước để thực hiện được một tiêu bản hiển vi cố định. Từ đó, đề tài tiêu bản
hiển vi cố định đã thu hút người người nghiên cứu thực hiện trên nhiều đối tượng
khác nhau. Ở trường Đại học Cần Thơ, có một số đề tài luận văn tốt nghiệp đại học
tiến hành trên đối tượng tảo như năm 2001, Nguyễn Thị Thanh Tú thực hiện luận
văn tốt nghiệp với đề tài “Thực hiện tiêu bản phương pháp dán vài đại diện trùng
roi (Lớp phụ: Phytomastigina) và trùng tiêm mao (Lớp phụ: Ciliata)”, Nguyễn Lê
với đề tài “Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định một số giống thuộc hai ngành tảo
lam (Cyanophyta) và tảo lục (Chlorophyta) nước ngọt”,….

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

10

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG III

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Phương tiện
1.1. Mẫu vật
Mẫu tảo tộc đoàn Volvox được trữ trong dung dịch Formol 5% của phòng thí
nghiệm thực vật từ năm 2004 và mẫu thu được trên địa bàn thành phố Cần Thơ.

Hình 5: Volvox năm 2013 ở vật kính 10X

Hình 6: Volvox năm 2004 ở vật kính 4X

1.2. Thiết bị và dụng cụ
1.2.1. Thiết bị
- Tủ lạnh
- Kính hiển vi
- Kính lúp
- Máy chụp hình kỹ thuật số
1.2.2. Dụng cụ
- Lọ sữa chua
- Kim mũi giáo
- Ống hút

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

11

Bộ môn Sư phạm Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

- Ống hút Pasteur pipette
- Ống đong 25ml
- Bercher 250ml
- Kẹp
- Lame
- Lamelle
- Khay đựng tiêu bản
- Đèn cồn
- Chai lọ thủy tinh, keo nhựa
- Dĩa đồng hồ
- Lưới phiêu sinh
1.3. Vật tư và hóa chất
1.3.1. Vật tư
- Giấy vệ sinh
- Giấy lọc
- Trứng gà ta
1.3.2. Hóa chất
- Nước cất
- Cồn tuyệt đối
- Xylen
- Formol
- Glycerin
- n- butanol
- Baume canada

- Methyl Green
- Fast Green

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

12

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

2. Phương pháp
2.1. Thu mẫu
Volvox sống trôi nổi ở các thủy vực nước ngọt, trong các ao nuôi ếch, cá …
Dùng lưới phiêu sinh vớt trên mặt nước vào buổi sáng lúc trời nắng trong khoảng
thời gian từ 9 giờ đến 11 giờ. Kéo lưới phiêu sinh nhiều lần để được mật độ tảo
nhiều nhất.
Thu mẫu ở các quận, huyện trên địa bàn thành phố Cần Thơ với số lượng
khoảng 30 ao, cụ thể:
- Các ao trong trường Đại học Cần Thơ.
- Các ao nuôi cá giống ở các quận huyện như Ninh Kiều, Bình Thủy, Cái
Răng, Phong Điền, Ô Môn
Các mẫu thu được trữ trong lọ có nắp đậy và ghi ngày thu nơi thu.

Hình 7: Nơi thu mẫu ở Huyện Phong Điền – Thành Phố Cần Thơ

2.2. Trữ mẫu

Sau khi thu, mẫu được mang về phòng thí nghiệm, tiến hành làm tiêu bản
tạm thời quan sát dưới kính hiển vi, nếu thấy có xuất hiện tảo lục Volvox thì cố
định và trữ trong formol 5%.
Theo dõi thời gian mất màu của lục lạp để từ đó đưa ra thời gian sử dụng
mẫu là tốt nhất để tiến hành thí nghiệm.

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

13

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

2.3. Nhuộm mẫu
Trước khi tiến hành nhuộm mẫu thì cần chuẩn bị lame và lamelle:
- Đối với lame và lamelle mới thì cần rửa bằng nước, tráng qua một lượt cồn
rồi lau khô.
- Đối với lame mới nhưng có nhiều vết bẩn thì cho vào dung dịch NaOH
1%, đun sôi một lúc. Sau đó rửa lại bằng nước có pha thêm một ít axit clohydric
(thật loãng) cuối cùng rửa lại bằng nước thường cho sạch hết acid rồi lau khô.
- Đối với lame và lamelle đã qua sử dụng cần ngâm vào dung dịch
sunfocromic (làm tan K2Cr2O7 bão hòa trong H2SO4 đậm đặc), hoặc ngâm vào hỗn
hợp giữa H2SO4 đậm dặc và KNO3 (có thể thay KNO3 bằng HNO3). Sau đó rửa
sạch nhiều lần bằng nước thường, tráng lại bằng nước cất, rồi lau khô.
Mẫu Volvox ngâm trong formol 5% được bắt dưới kính lúp bằng ống hút
Pasteur pipette, sau đó, chuyển mẫu lên lame theo 2 cách:

- Dàn một lớp thật mỏng dung dịch glixerin- lòng trắng trứng lên lame, để
lame gần khô, chuyển mẫu lên lame, để lame khô tự nhiên.
- Không sử dụng dung dịch glixerin- lòng trắng trứng, chuyển mẫu cùng với
giọt nước lên lame, để khô tự nhiên.
Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm lên lame tại vị trí có mẫu. Thí nghiệm được thực
hiện với hai loại thuốc nhuộm là Methyl Green và Fast Green.

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

14

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Bảng 1: Nghiệm thức nhuộm mẫu với thuốc nhuộm Methyl Green và Fast green
Thuốc nhuộm

Thời gian nhuộm
5 phút
10 phút
20 phút

Methyl Green
30 phút
60 phút
1 giờ 30 phút

3 giờ
Fast Green

6 giờ
12 giờ

Sử dụng phương pháp nhuộm tăng dần (theo Trần Công Khánh, 1980), đặt
Volvox vào dung dịch màu Methyl Green và Fast Green cho đến khi Volvox bắt
màu đạt yêu cầu thì dừng lại.
2.4. Khử nước
Mẫu sau khi bắt màu với thuốc nhuộm, tiến hành khử nước, bằng cách cho
các lame đã dán mẫu lần lượt vào các lọ chứa dung dịch cồn, n -butanol và để loại
bỏ nước từ mẫu vật như sau:
Lưu ý: Mỗi lọ đựng hóa chất phải có dán nhãn và sắp xếp theo thứ tự. Mỗi
lọ phải có nắp đậy để tránh bay hơi, khi chuyển từ lọ này sang lọ khác phải dựng
đứng tiêu bản khoảng hai giây để loại hết dung dịch ở lọ trước.

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

15

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

Bảng 2: Các nghiệm thức khử nước sau khi nhuộm mẫu
Các dãy hóa chất

Thời gian
(Giây)

1

2

3

10
20
30

30

40
50

50

50

60

60

70

10, 20, 30

70

70

80

80

90

90

90

Cồn tuyệt đối

Cồn tuyệt đối

Cồn tuyệt đối

Cồn tuyệt đối

Cồn tuyệt đối

n- Butanol 100%

n- Butanol 100%

n- Butanol 100%

n- Butanol 100%

n- Butanol 100%

2.5. Làm trong mẫu
Mẫu sau khi được khử nước qua các nồng độ cồn, cần được chuyển sang
xylen để khử sạch nước còn lẫn trong cồn, làm mẫu trong hơn, đồng thời đây là
dung môi làm tan chảy Baume canada .
Bảng 3: Các nghiệm thức làm trong mẫu bằng xylen
Thời gian
Các dãy xylen
(Giây)
1
10, 20, 30, 40, 50

2

Xylen 100%
Xylen 100%
Xylen 100%

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

16

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

2.6. Dán mẫu
Sau khi khử nước mẫu qua các dãy hóa chất, cần vệ sinh lame vì lớp lòng
trắng trứng- glycerin đã bắt màu với thuốc nhuộm và dán lamelle bằng dung dịch
Baume canada pha trong xylen với tỉ lệ 1 : 2.
Có hai cách dán Baume canada:
Cách 1: Đặt nghiêng một cạnh lá kính tỳ vào bề mặt của phiến kính, bên
cạnh giọt chất lỏng. Dùng kim mũi nhọn hay mũi giáo đỡ lấy cạnh đối diện rồi hạ
từ từ cạnh này xuống.
Cách 2: Nhỏ một giọt chất lỏng (cùng loại với chất lỏng trên phiến kính) vào
giữa lá kính. Lật ngược lá kính lại rồi hạ từ từ đậy lên giọt chất lỏng trên phiến
kính. Khi hai giọt chất lỏng chạm vào nhau thì lấy tay ra.

Cách 1

Cách 2
Hình 8: Cách đậy lamelle

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

17

Bộ môn Sư phạm Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35- 2013

Trường Đại học Cần Thơ

2.7. Dán nhãn
Sau khi nhuộm mẫu, khử nước và dán lamelle, ta tiến hành dán nhãn cho
tiêu bản với nội dung như sau:
Tên khoa học
Hóa chất
Phòng thí nghiệm (PTN)
Tháng và năm làm xong tiêu bản
Volvox
Methyl Green
PTN: Thực vật
04/2013

Hình 9: Hình ảnh tiêu bản hiển vi cố định sau khi hoàn thành

Chuyên ngành Sư phạm Sinh học

18

Bộ môn Sư phạm Sinh học