nghiên cứu khả năng sử dụng cám gạo thủy phân trong nuôi cấy nấm men yarrowia lipolytica po1g
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.52 MB, 57 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA CÔNG NGHỆ
------------
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG
CÁM GẠO THỦY PHÂN TRONG NUÔI CẤY
NẤM MEN YARROWIA LIPOLYTICA PO1G
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. Hồ Quốc Phong
Ngô Tường Vi
MSSV: 2096802
Ngành: Công Nghệ Hóa Học - Khóa 35
Tháng 5/2013
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
KHOA CÔNG NGHỆ
Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2013
PHIẾU ĐỀ NGHỊ ĐỀ TÀI TỐT NGHIỆP CHO SINH VIÊN
NĂM HỌC: 2012 – 2013
1. Họ và tên cán bộ hƣớng dẫn: TS. Hồ Quốc Phong
2. Tên đề tài: Nghiên cứu khả năng sử dụng cám gạo thủy phân trong nuôi cấy nấm
men Yarrowia lipolytica Po1g
3. Địa điểm thực hiện:
Phòng thí nghiệm Công nghệ Hoá học, Khoa Công nghệ, Trƣờng Đại Học Cần Thơ.
4. Sinh viên thực hiện: Ngô Tƣờng Vi
MSSV: 2096802
5. Mục đích của đề tài: Khảo sát khả năng sử dụng cám gạo thủy phân trong nuôi cấy
Y. lipolytica Po1g để sản xuất chất béo phục vụ cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học.
6. Nội dung chính
Phần I: Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân cám gạo (nồng độ, tỉ
lệ, thời gian, nhiệt độ)
Phần II: Nuôi cấy nấm men Yarrowia lipolytica Po1g
+ Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian lên sự phát triển của sinh khối nấm men
+ Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng đến sự phát triển của nấm men
+ Phân tích thành phần acid béo từ lipid thu đƣợc
7. Các yêu cầu hỗ trợ: kinh phí, hoá chất và dụng cụ thí nghiệm.
8. Kinh phí dự trù thực hiện đề tài (dự trù chi tiết đính kèm): 1.000.000 đồng.
DUYỆT CỦA BỘ MÔN
CÁN BỘ RA ĐỀ TÀI
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG THI & XÉT TỐT NGHIỆP
PHIẾU NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
-----..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
PHIẾU NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
-----..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
LỜI CẢM ƠN
Luận văn tốt nghiệp đánh dấu kiến thức, kĩ năng của mỗi sinh viên trƣớc khi tốt
nghiệp. Chính vì tầm quan trọng của nó mà trong suốt quá trình làm luận văn tôi đã
gặp nhiều áp lực và trở ngại. Nhƣng bằng sự giúp đỡ, ủng hộ của thầy cô, gia đình, bạn
bè, tôi đã có thể hoàn thành đƣợc luận văn này.
Xin cảm ơn quí Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Hóa học, Khoa Công nghệ,
Đại học Cần Thơ đã chỉ dạy, cũng nhƣ tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn
này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Hồ Quốc Phong, Phó Trƣởng Bộ môn
Công nghệ hóa học, Khoa Công nghệ, Đại học Cần Thơ. Thầy đã cho tôi cơ hội cùng
nghiên cứu khoa học, đặc biệt gợi ý đề tài luận văn cho tôi. Không những vậy, Thầy đã
nhiệt tình hƣớng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình làm luận
văn.
Xin cảm ơn TS. Huỳnh Liên Hƣơng, Trƣởng PTN Công nghệ Hóa học đã tận
tình giúp đỡ, hƣớng dẫn kiến thức chuyên môn cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu.
Đồng gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Thị Vân, Trƣởng PTN Sinh Kỹ thuật môi
trƣờng, Khoa Môi trƣờng và Tài nguyên thiên đã chỉ dẫn, hỗ trợ thiết bị và hóa chất vi
sinh giúp tôi hoàn thành đề tài một cách thuận lợi.
Tôi cảm thấy rất vui mừng khi bên cạnh mình có những ngƣời bạn luôn quan
tâm, động viên những lúc tôi thất bại. Xin cảm ơn học viên Cao học: Lê Trang Nguyên
Thƣ, Trƣơng Thị Cẩm Tú,...cùng các bạn trong PTN Công nghệ Hóa học. Đặc biệt,
cảm ơn bạn Võ Trƣờng Giang đã chia sẻ kinh nghiệm, kiến thức giúp tôi hoàn thành
tốt luận văn này.
Cảm ơn Cha Mẹ luôn ở bên con, cổ vũ, động viên những lúc con khó khăn nhất.
Xin cảm ơn tất cả mọi ngƣời!
Sinh viên
Ngô Tƣờng Vi
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
i
TÓM TẮT
Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá khả năng sản xuất dầu từ Yarrowia
lipolytica Po1g phát triển trong môi trƣờng Cám gạo tách béo (CGTB) thủy phân.
CGTB đƣợc cung cấp từ nhà máy, sau đó thủy phân với acid ở những nồng độ khác
nhau (0 - 5% w/w), thời gian phản ứng (2 - 8 h), nhiệt độ phản ứng (60 - 90 °C) và tỉ lệ
DDA/CGTB khảo sát 5, 8, 10, 15 mL/g. Kết quả cho thấy rằng nồng độ đƣờng tổng
(NĐĐT) tăng tỉ lệ thuận với nồng độ acid, thời gian, và nhiệt độ thủy phân. Điều kiện
tối ƣu khảo sát đƣợc cho nồng độ đƣờng tổng tối đa là acid sulfuric 4% ở 90 °C trong
6 h, tỉ lệ DDA/CGTB là 8 mL/g.
NĐĐT từ quá trình thủy phân cám gạo tách béo đạt đƣợc là 57.43 ± 1.10 g/L.
Sản phẩm cám gạo tách béo thủy phân sau đó đƣợc khử độc bằng Ca(OH)2 để giảm
các chất ức chế nhƣ 5-hydroxy methylfurfural (HMF) và furfural, tăng tiềm năng nuôi
cấy Y. lipolytica Po1g. Hơn thế nữa quá trình khử độc bằng vôi hóa không gây ảnh
hƣởng nhiều đến hàm lƣợng đƣờng tổng. Điều kiện tối ƣu của quá trình nuôi cấy: thời
gian nuôi cấy 4 ngày, nồng độ đƣờng trong môi trƣờng nuôi cấy 30 g/L. Khối lƣợng
sinh khối thu đƣợc từ tế bào nấm Y. lipolytica nuôi cấy trong môi trƣờng cám gạo tách
béo thủy phân đạt 15.32 g/L. Hàm lƣợng chất béo tƣơng ứng khi nuôi cấy nấm men
trong môi trƣờng cám gạo tách béo với nồng độ 30 g/L là 24.59% (88.64% là lipid
trung hòa). Vì vậy chất béo từ tế bào nấm Y. lipolytica Po1g có thể đƣợc sử dụng làm
nguyên liệu tổng hợp biodiesel.
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
ii
MỤC LỤC
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
TÓM TẮT ................................................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ............................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THỊ..................................................................... vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... ix
CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu và giới hạn của đề tài .......................................................................... 2
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN ........................................................................................ 3
2.1 Cám gạo ............................................................................................................ 3
2.2 Tổng quan về lilpid............................................................................................ 6
2.2.1 Glyceride.................................................................................................... 6
2.2.2 Phospholipid .............................................................................................. 8
2.2.3 Steride và sterol .......................................................................................... 8
2.2.4 Sáp ........................................................................................................... 9
2.3 Vi sinh vật cho dầu .......................................................................................... 10
2.3.1 Vi tảo ....................................................................................................... 10
2.3.2 Nấm men .................................................................................................. 10
2.3.3 Nấm men Yarrowia lipolytica................................................................... 11
2.4 Phƣơng pháp thủy phân ................................................................................... 13
2.4.1 Thủy phân bằng acid loãng ....................................................................... 13
2.4.2 Thủy phân bằng enzyme ........................................................................... 14
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
iii
MỤC LỤC
2.5 Phƣơng pháp khử độc ...................................................................................... 15
2.5.1 Phƣơng pháp sinh học .............................................................................. 15
2.5.2 Khử độc bằng phƣơng pháp vật lí ............................................................. 16
2.5.3 Phƣơng pháp hóa học ............................................................................... 16
2.6 Phƣơng pháp trích ly chất béo ......................................................................... 17
2.6.1 Trích ly Soxhlet ........................................................................................ 17
2.6.2 Trích ly bằng dung môi ............................................................................ 18
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 19
3.1 Phƣơng tiện ..................................................................................................... 19
3.1.1 Hóa chất ................................................................................................... 19
3.1.2 Dụng cụ thiết bị ........................................................................................ 19
3.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 20
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 21
3.3.1 Thủy phân cám gạo tách béo .................................................................... 21
3.3.2 Khử độc ................................................................................................... 21
3.3.3 Nuôi cấy nấm men Y. lipolytica Po1g ...................................................... 22
3.3.4 Trích ly chất béo....................................................................................... 23
3.3.5 Khử sáp và gum ....................................................................................... 23
3.3.6 Phƣơng pháp phân tích ............................................................................. 23
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 25
4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch acid H2SO4 đến nồng độ đƣờng tổng ......... 25
4.2 Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng .......................... 26
4.3 Ảnh hƣởng của tỉ lệ DDA/CGTB thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng ............. 27
4.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng ........................... 29
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
iv
MỤC LỤC
4.5 Ảnh hƣởng của các hợp chất ức chế đến nồng độ đƣờng ................................. 30
4.6 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trƣởng của Y. lipolytica ........... 32
4.7 Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng đến sự sinh trƣởng của Y. lipolytica ................ 32
4.8 Thành phần lipid tích lũy ................................................................................. 33
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .................................................................. 35
5.1 Kết luận ........................................................................................................... 35
5.2 Hạn chế ........................................................................................................... 35
5.3 Kiến nghị......................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 36
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
v
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Một số loài vi sinh vật cho dầu .......................................................... 10
Bảng 2.2: Một số chủng nấm men có khả năng tích lũy dầu .............................. 11
Bảng 2.3: Hàm lƣợng và thành phần chất béo trong sinh khối của một số loại
nấm men .......................................................................................... 12
Bảng 4.1: Điều kiện tối ƣu cho giai đoạn thủy phân CGTB ............................... 30
Bảng 4.2: Thành phần mạch carbon cấu trúc nên chất béo của nấm men ........... 34
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
vi
MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THỊ
Hình 2.1 Cám gạo ............................................................................................... 3
Hình 2.2 Cấu tạo của hạt lúa ............................................................................... 3
Hình 2.3 Cấu trúc phân tử cellulose .................................................................... 4
Hình 2.4 Cấu trúc phân tử hemicellulose ............................................................. 5
Hình 2.5 Các đơn vị phenylpropene .................................................................... 5
Hình 2.6 Cấu trúc amylose và amilopectin .......................................................... 6
Hình 2.7 Cấu trúc cholesterol .............................................................................. 8
Hình 2.8 Cấu trúc cholesteride ............................................................................ 9
Hình 2.9 Hình ảnh nấm men Yarrowia lipolytica dƣới kính hiển vi ................... 12
Hình 2.10 Sản phẩm của quá trình thủy phân lignocellulose bằng acid .............. 14
Hình 2.11 Quá trình chuyển hóa cellulose thành glucoses bằng enzymes .......... 15
Hình 2.12 Hệ thống trích ly Soxhlet .................................................................. 18
Hình 3.1 Quy trình thí nghiệm cơ bản ............................................................... 20
Hình 3.2 Mẫu CGTB sau khi sàng..................................................................... 21
Hình 3.3 Quy trình khử độc ............................................................................... 22
Hình 3.4 Nấm men Y. lipolytica trên đĩa thạch agar ........................................... 22
Hình 3.5 Phản ứng tạo màu của DNS với đƣờng khử ........................................ 24
Hình 4.1 Sản phẩm CGTB thủy phân với những dung dịch acid nồng độ khác
nhau ................................................................................................. 25
Hình 4.2 Sự ảnh hƣởng của nồng độ acid đến nồng độ đƣờng tổng ................... 26
Hình 4.3 Sản phẩm thủy phân CGTB ở những thời gian khảo sát ...................... 26
Hình 4.4 Sự ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng ............... 26
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
vii
MỤC LỤC
Hình 4.5 Mẫu CGTB thủy phân với tỉ lệ DDA/CGTB khác nhau ...................... 26
Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn sự tối ƣu về tỉ lệ DDA/CGTB, độ chuyển hóa thu
đƣợc (g đƣờng/g CGTB) .................................................................. 28
Hình 4.7 Sản phẩm thủy phân ở những nhiệt độ khảo sát .................................. 29
Hình 4.8 Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng .............. 30
Hình 4.9 Sản phẩm CGTB thủy phân trƣớc và sau khử độc ............................... 32
Hình 4.10 Ảnh hƣởng của chất ức chế đến nồng độ đƣờng tổng ........................ 31
Hình 4.11 Sự ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy ................................................ 32
Hình 4.12 Sự ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng đến nồng độ sinh khối và hàm
lƣợng lipid tích lũy của Y. lipolytica ................................................. 33
Hình 4.13 Sắc kí đồ thành phần acid béo trong tế bào nấm Y. lipolytica đƣợc
nuôi cấy trong môi trƣờng thủy phân CGTB .................................... 34
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
viii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
SCO............................................... single cell oil (Dầu đơn bào)
HMF .............................................. hydroxymethyl furfural
YPDA............................................ Yeast Peptone Dextrose Agar
YPD ............................................. Yeast Peptone Dextrose
w/w ............................................... weight/weight (phần trăm khối lƣợng)
DNS ............................................. 3,5-dinitrosalicylic acid
UV-Vis .......................................... Ultraviolet – visible
GC ................................................. Gas chromatography (Sắc kí khí)
FID ................................................ Flame Ionization Detector (Đầu dò ion hóa ngọn
lửa)
TAG .............................................. triacylglycerol
CGTB ............................................ Cám gạo tách béo
BD ................................................. Biodiesel
NLSH ............................................ Nhiên liệu sinh học
NĐĐT ........................................... Nồng độ đƣờng tổng
DDA/CGTB .................................. Dung dịch acid/cám gạo tách béo
CHƢƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, cùng với sự cạn kiệt của nguồn nhiên liệu hóa thạch và nhu cầu sử
dụng nhiên liệu ngày càng tăng cao, nhiên liệu sinh học (NLSH) nói chung và
biodiesel (BD) nói riêng, đang đƣợc xem nhƣ là một nguồn nhiên liệu có khả thay thế
hiệu quả, không độc hại, dễ phân hủy sinh học, có thể tái tạo. Hiện nay sản phẩm BD
rất đƣợc quan tâm, tuy nhiên, giá thành còn rất cao. Giá thành sản phẩm BD cao bắt
nguồn từ giá thành của nguồn nguyên liệu dùng để tổng hợp. Hầu hết các biodiesel
thƣơng mại đƣợc sản xuất từ các loại dầu thực vật ăn đƣợc nhƣ dầu đậu nành ở Mỹ,
dầu hạt hƣớng dƣơng và dầu hạt cải ở Châu Âu, dầu cọ ở Đông Nam Á và dầu dừa ở
Philippines [1]. Giá của các loại nguyên liệu này đã chiếm 60 –70% [2] hoặc 75–88%
[3-5] giá thành của các sản phẩm BD thƣơng mại. Vì vậy, một trong những tiêu chí để
giảm giá thành DB là nghiên cứu tìm ra nguồn nguyên liệu rẻ tiền và ổn định để tổng
hợp BD và một trong những nguyên liệu hứa hẹn là chất béo (dầu) từ vi sinh vật hay
dầu đơn bào (single cell oil, SCO). Nguồn nguyên liệu này đƣợc xem nhƣ là tìm năng
để sản xuất biodiesel, bởi thời gian sản xuất ngắn, dễ dàng áp dụng ở quy mô công
nghiệp, thành phần tƣơng tự nhƣ acid béo của dầu thực vật [6].
Nấm men Yarrowia lipolytica có khả năng tích lũy hàm lƣợng chất béo cao trong
nội bào từ sự trao đổi chất với nền carbon. Y. lipolytica thƣờng đƣợc tìm thấy trong
môi trƣờng giàu chất nền kỵ nƣớc nhƣ alkane và chất béo. Với cơ chế phức tạp và sự
đa dạng của hệ gen Y. lipolytica có khả năng tích lũy chất béo trên 50% trọng lƣợng
khô của tế bào. Vì vậy, Y. lipolytica đƣợc xem nhƣ là một chủng nấm men có khả năng
tích lũy chất béo [7]. Chất béo từ nấm men đƣợc nuôi trên nền carbon giá rẻ, chẳng
hạn nhƣ phụ phẩm nông nghiệp.
Nguồn lignocellulose từ phụ phẩm nông nghiệp (rơm, rạ, vỏ rấu, bã mía, cám
gạo…) có thể tận dụng làm nguồn carbon nuôi cấy vi sinh vật sản xuất chất béo. Đây
cũng là một cách để xử lí hiệu quả phế phẩm nông nghiệp vì nguồn này nếu không có
cách xử lí hiệu quả sẽ gây ô nhiễm nghiêm trọng đến môi trƣờng. Trong đó cám gạo
đã tách béo có thể là phụ phẩm lignocellulose trong các nhà máy trích ly dầu. Sau trích
ly dầu, cám gạo tách béo (CGTB) có thể đƣợc xem là nguồn lignocellulose tiềm năng
dùng cho quá trình nuôi cấy nấm men sản xuất chất béo.
1
CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU
1.2 Mục tiêu và giới hạn của đề tài
Mục tiêu của đề tài tìm ra qui trình sử dụng cám gạo đã tách béo làm môi
trƣờng nuôi cấy nấm men. Trong đó xác định đƣợc các thông số tối ƣu của quá trình
thủy phân cám gạo và nuôi cấy nấm men Y.lipolytica. Qua đó đánh giá khả năng sử
dụng cám gạo tách béo làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy nấm men sản xuất chất béo.
Nội dung đề tài gồm hai phần: (i) khảo sát quá trình thủy phân cám gạo tách
béo bằng dung dịch H2SO4 loãng, tìm điều kiện phản ứng tối ƣu để thu đƣợc dung dịch
thủy phân có nồng độ đƣờng tổng cao nhất; (ii) khảo sát khả năng sử dụng CGTB thủy
phân của Y. lipolytica Po1g và các yếu tố chính ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy. Cụ
thể, trong quá trình thủy phân CGTB các yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến quá trình
thủy phân đều đƣợc khảo sát nhƣ:
-
Nồng độ acid (0 - 5%)
-
Thời gian (2 - 8 h)
-
Nhiệt độ (60 - 90 ºC)
-
Tỉ lệ giữa dung dịch acid/CGTB (5 - 15 mL/g)
-
Ảnh hƣởng của sự loại bỏ chất độc đến thành phần sản phẩm thủy phân.
Các yếu tố ảnh hƣởng quá trình nuôi cấy nấm men sẽ khảo sát nhƣ:
-
Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy
-
Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng trong môi trƣờng nuôi cấy
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
2
CHƢƠNG 2
TỔNG QUAN
2.1 Cám gạo
Hình 2.1 Cám gạo
Cám gạo là phụ phẩm chính thu đƣợc từ lúa sau khi xay xát và thƣờng chiếm
khoảng 10% trọng lƣợng lúa [8]. Cám gạo đƣợc hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm
phôi của hạt, cũng nhƣ một phần từ tấm (Hình 2.1). Cám gạo có màu sáng và mùi
thơm đặc trƣng. Tỷ lệ protein trong cám gạo mịn có thể đạt 12 – 14%. Lƣợng protein
thô ở cám gạo cao hơn so bắp hạt. Lƣợng chất béo trong cám gạo rất cao (15 – 22%),
thƣờng dùng chiết xuất dầu cám, chất đạm trên 12%, chất sắt trên 14% [9, 10].
Hình 2.2 Cấu tạo của hạt lúa
3
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN
Cám gạo tách béo (CGTB) giàu tinh bột và cellulose polysaccharide. Thành phần
chủ yếu: tinh bột (46,7%), cellulose và hemicellulose (11,3%), chất béo (1,4%) [8]. Tinh
bột, cellulose và hemicellulose dễ dàng đƣợc chuyển đổi thành glucose, disaccharides
(maltose, cellobiose) bằng phƣơng pháp thủy phân. Vì vậy, cám gạo tách béo (CGTB) có
thể đƣợc xem nhƣ là nguồn nguyên liệu phù hợp thủy phân thu đƣợc các loại đƣờng
nuôi cấy nấm men.
Cám gạo đã tách béo chứa các thành phần cellulose, hemicelllose và tinh bột có
thể chuyển hóa sang các loại đƣờng lên men. Cellulose từ CGTB là hợp chất hữu cơ có
công thức cấu tạo (C6H10O5)n gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O-(β-Dglucopyranosyl)-D-glucopyranolde (Hình 2.3). Các mạch cellulose đƣợc liên kết với
nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính
là tinh thể và vô định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ
với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng nhƣ hóa chất. Ngƣợc lại, trong
vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt nên dễ bị tác kích. Vùng vô định hình
dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết
của các liên kết cộng hóa trị (β - glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời
vị trí này không tạo đƣợc liên kết hydro.
Hình 2.3 Cấu trúc phân tử cellulose
Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh. Mạch nhánh cấu
tạo từ các nhóm đơn giản, thông thƣờng là disaccharide hoặc trisaccharide. Sự liên kết
của hemicellulose với các polysaccharide khác, lignin là nhờ các mạch nhánh này.
Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị
thủy phân (Hình 2.4)
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
4
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN
Hình 2.4 Cấu trúc phân tử hemicellulose
Ngoài ra trong CGTB còn có một số thành phần khác nhƣ lignin có cấu trúc
không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình. Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở.
Lignin là polymer, đƣợc cấu thành từ các đơn vị phenylpropene (Hình 2.5).
Hình 2.5 Các đơn vị phenylpropene
Tinh bột trong cám gạo là nguyên liệu đại diện cho một nguồn tài nguyên sinh
khối quan trọng đối với quá trình lên men vi sinh vật bởi nó rẻ tiền, phong phú, dễ
dàng lên men. Tinh bột không phải là một hợp chất đồng thể, mà gồm 2 polysaccaride
khác nhau: amilose và amilopectin. Amilose có cấu trúc mạch thẳng, gồm 2 phân tử
glucose liên kết bằng 1,4 glucoside. Amilopectin ở dang mạch thẳng, phân nhánh. Liên
kết giữa trên mạch thẳng là 1,4 glucoside; liên kết trên mạch nhánh là 1,6 glucoside.
Nhƣ đã đề cập, tinh bột chiếm 47.6% thành phần CGTB.
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
5
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN
Hình 2.6 Cấu trúc amylose và amilopectin
2.2 Tổng quan về lipid [11]
Các chất béo động vật (mỡ) và chất béo thực vật tự nhiên (dầu) là các glyceride
tức là ester của glycerol và các acid béo. Cơ thể sinh vật gồm có ba thành phần cơ
bản là protein, glucide và lipid. Lipid là nguồn cung cấp năng lƣợng cho các cơ
thể sống nhiều hơn cả protein và glucide. Lipid đƣợc chia thành các nhóm nhƣ
glyceride, phosphatide, steride và sterol, sáp.
2.2.1 Glyceride
Glyceride hay acylglycerol là ester của glycerol và các acid béo (no, không no,
vòng). Công thức chung của glyceride là:
R1, R2, R3 là gốc hydrocarbon của acid béo. Chúng có thể giống nhau hoặc
khác nhau. Vì vậy, có thể có các glyceride thuần khiết (nhƣ triolein, tristearin...)
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
6
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN
hoặc glyceride hỗn tạp (oleodistearin, oleopalmitostearin).
Triolein (có trong mỡ cừu)
Tristearin
Oleopalmitostearin (có trong mỡ bò)
Qua phân tích các thành phần của glyceride, hơn 50 acid béo khác nhau đƣợc
tìm thấy. Các acid này thƣờng có cấu tạo mạch hở và có số carbon chẵn, khoảng từ
6 ÷ 24, nhƣng các acid béo trong tế bào có số nguyên tử carbon phổ biến từ 16 ÷ 20.
Một số acid béo có chứa 6 ÷ 14 nguyên tử carbon:
-
Caproic acid có dầu hạt cọ, dầu dừa.
-
Caprylic acid có trong dầu hạt cọ, dầu dừa.
-
Capric acid có trong dầu hạt cọ, dầu dừa.
-
Lauric acid có trong dầu hạt cọ, dầu dừa.
-
Myristic acid có trong dầu hạt cọ, dầu dừa.
Các acid béo có chứa 16 nguyên tử carbon:
-
Palmitic acid có trong mỡ động vật, dầu hạt cọ, dầu dừa.
-
Palmitoleic acid có trong mỡ động vật, dầu thực vật.
Một số acid béo chứa 18 nguyên tử carbon:
vật khác.
Oleic acid có trong mỡ lợn, dầu olive, dầu dừa và nhiều loại dầu thực
-
Stearic acid có trong mỡ động vật, ca cao.
-
Linoleic acid có trong đậu nành, dầu lanh, dầu bắp.
-
Linolenic acid có trong dầu hạt gai, dầu lanh.
-
Eleostearic acid có trong dầu hạt khổ qua.
Một số acid béo chứa 20 nguyên tử carbon:
-
Arachidic acid có trong dầu đậu phộng và dầu bắp.
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
7
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN
-
Arachidonic acid có trong dầu đậu phộng.
2.2.2 Phospholipid
Phospholipid là ester của glycerol với các acid béo phân tử lƣợng cao và
ester của phosphoric acid.
Lecithin
Cephalin
Lecithin có trong đậu tƣơng, đậu nành, gấc, trứng, gan...
Cephalin có trong trứng, gan, não...
R1, R2 là gốc của acid béo no và chƣa no.
Lecithin hay choline phospholipid cũng là triglyceride nhƣng chỉ có hai nhóm
hydroxyl của glycerol tạo ester với hai acid béo phân tử lƣợng cao (R 1COOH và
R2COOH), còn nhóm hydroxyl thứ ba của glycerol tạo ester với phosphoric acid và
nhóm hydroxyl thứ hai của phosphoric acid lại tạo ester với choline (trong lecithin) hay
cholamine (trong cephalin) hoặc với serine (trong phosphatidylserine)
2.2.3 Steride và sterol
Sterol là alcol mạch vòng, còn steride là ester của acid béo và sterol. Cholesteride
là ester của acid béo phân tử lƣợng cao và cholesterol (một sterol).
Hình 2.7 Cấu trúc cholesterol
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
8
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN
Cholesterol có công thức phân tử C27H47O, là alcol mạch vòng bậc hai và ester
của nó là cholesteride.
Cholesteride có cấu tạo nhƣ sau:
Hình 2.8 Cấu trúc cholesteride
R là gốc acid béo phân tử lƣợng cao nhƣ stearic acid, palmitic acid và oleic acid.
Cholesteride còn đƣợc tìm thấy nhiều trong mỡ cừu.
2.2.4 Sáp
Sáp là những chất giống nhƣ mỡ và đƣợc tìm thấy cả ở trong động vật và thực
vật nhƣ sáp ong, sáp lông cừu, sáp cá nhà táng...Tƣơng tự nhƣ dầu mỡ động thực vật,
sáp cũng là ester nhƣng không phải là ester của glycerol mà là ester của alcol đơn chức
bậc cao có mạch hở hoặc vòng với acid béo phân tử lƣợng cao và có số nguyên tử
carbon chẵn.
Trong sáp, ngoài ester nhƣ trên còn chứa một lƣợng carboxylic acid tự do, alcol,
một ít hydrocarbon, kèm theo các sterol và chất màu thuộc loại carotenoid. Một số
acid béo phân tử lƣợng cao thƣờng có trong các loại sáp nhƣ:
Cerotic acid: CH3(CH2)24COOH
Montanic acid: CH3(CH2)26COOH
Sáp cá voi (spermaceti) C15H31COOC16H33 là sáp đƣợc tách khi làm lạnh dầu cá
voi, có nhiệt độ nóng chảy ở 42 – 47 °C.
Sáp ong là sáp đƣợc thu từ tổ ong mật, là một hỗn hợp ester có nhiệt độ nóng
chảy ở 60-82 °C. Khi thủy phân sáp ong, carboxylic acid có mạch carbon C26 và C28,
alcol bậc nhất với mạch carbon C30 và C32 đƣợc tạo thành.
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
9
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN
Sáp carnauba đƣợc thu từ cây cọ Brazil, có nhiệt độ nóng chảy ở 80–87 °C,
không thấm nƣớc, thƣờng đƣợc dùng làm phụ gia trong sơn bóng ôtô và nƣớc bóng
nền nhà. Sáp carnauba là một hỗn hợp ester của acid có mạch carbon C24 và C28 với
alcol bậc nhất có mạch carbon C32 và C34.
2.3 Vi sinh vật cho dầu
Khả năng tích lũy chất béo của một số loài vi sinh vật đã đƣợc biết đến trong
nhiều năm qua [7]. Trong đó, một số loài vi sinh vật có thể tích lũy chất béo tƣơng
đƣơng 86% trọng lƣợng khô tế bào [12] (Bảng 2.1). Những loài vi sinh vật này chủ yếu
là vi tảo, nấm men, nấm, vi khuẩn.
Bảng 2.1: Một số loài vi sinh vật cho dầu [12]
Vi sinh vật
Hàm lƣợng dầu
(% trọng lƣợng khô)
Botryococcus braunii
Cylindrotheca sp
Vi tảo
Nitzschia sp
Schizochytrium sp
Arthrobacter sp
Acinetobactercalcoaceticus
Vi khuẩn
Rhodococcus opacus
Bacillus alcalophilus
Candida curvata
Cryptococcus albidus
Nấm men
Lipomyces starkeyi
Rhodotorula glutinis
Aspergillus oryzae
Mortierella isabellina
Nấm
Humicola lanuginosa
Mortierella vinacea
25-75
16-37
45-47
50-77
>40
27-38
24-25
18-24
58
65
64
72
57
86
75
66
2.3.1 Vi Tảo
Vi tảo có khả năng sử dụng năng lƣợng mặt trời để chuyển đổi CO2 thành tiền
nhiên liệu sinh học [12]. Vi tảo phát triển rất nhanh chóng, trong vòng 24 h sinh khối
có thể tăng gấp 2 lần. Sinh khối của vi tảo là các acid amine (leucine, isoleucine,
valine, v.v). Thành phần lipid tích lũy trong tế bào vi tảo là các acid béo trung tính
(> 80%) chủ yếu là C16 và C18 [13]. Hàm lƣợng lipid trung bình có thể đạt từ 1% đến
70%, trong điều kiện thuận lợi có thể chiếm hơn 75% trong lƣợng khô của tế bào [14].
Tuy nhiên, vi tảo lại cần sinh trƣởng trong một diện tích lớn và thời gian nuôi cấy dài.
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
10
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN
Thêm vào đó chất béo thu đƣợc từ vi tảo bị hạn chế trong việc dùng để tổng hợp BD
do có nhiều thành phần acid béo không bảo hòa làm chúng dễ bị oxy hóa.
2.3.2 Nấm men
Một số nấm men cho dầu đƣợc mô tả là có thể tích lũy chất béo lớn hơn 20%
trọng lƣợng khô của tế bào [15]. Trong đó các chủng nấm men cho dầu điển hình bao
gồm Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon,
và Lipomyces [16] (Bảng 2.2). Tuy nhiên, trong số 600 loài nấm men, chỉ có 30 loài đã
đƣợc mô tả là có thể tích lũy hơn 25% trọng lƣợng khô tế bào [7].
Bảng 2.2: Một số chủng nấm men có khả năng tích lũy dầu [16]
Tên loài
Cryptococcus curvatus
Cryptococcus terricola
Rhodosporidium toruloides
Starmerella bombicola
Lipomyces tetrasporus
Yarrowia lipolytica
Tên gọi khác
Apiotrichum curvatum
Candida curvata
Cryptococcus terricolus
Rhodotorula gracilis
Zygolipomyces lactosus
Endomycopsis lipolytica
Saccharomycopsis lipolytica
Giống biến đổi
Rhodotorula rubescens
Candida bombicola
Torulopsis bombicola
Candida lipolytica
Cơ chế tích lũy lipid trong tế bào nấm men thay đổi khi nguồn carbon sử dụng là
glucose hoặc chất béo. Bên cạnh đó, sự dự trữ chất béo trong tế bào vi sinh vật thƣờng
ở dạng các triacylglycerol[7]. Chúng không chỉ bị ảnh hƣởng bởi tỉ lệ carbon/nitrogen
(C/N), mà còn bởi lƣợng oxy hòa tan trong môi trƣờng nuôi cấy [6]. Các sản phẩm
chất béo này đƣợc xem nhƣ là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất nhiên liệu sinh
học.
2.3.3 Nấm men Yarrowia lipolytica
Nấm men Yarrowia lipolytica thƣờng đƣợc tìm thấy trong các môi trƣờng giàu
chất nền kị nƣớc nhƣ alkane và chất béo (Hình 2.9). Với cơ chế phức tạp và sự đa dạng
của hệ gen, Y. lipolytica có khả năng tích lũy chất béo trên 50% trong lƣợng khô của tế
bào. Vì vậy, Y. lipolytica đƣợc xem nhƣ là một chủng nấm men có khả năng tích lũy
dầu [7]. Sự tích lũy lipid của tế bào nấm có thể đƣợc tăng cƣờng bởi những chỗ lồi
lõm trên bề mặt tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho các cơ chất kị nƣớc hấp thu từ môi
trƣờng [15]. Những chất béo này tạo thành phần lipid lƣu trữ, chủ yếu là các
triacylglycerol (triglycerides) và este steryl.
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
11
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN
Hình 2.9 Hình ảnh nấm men Yarrowia lipolytica dƣới kính hiển vi [17]
Este steryl hình thành và vận động cung cấp các sterol cần thiết cho sự tăng sinh
màng. Sự lƣu trữ các phân tử lipid trong một khoang của các tế bào đƣợc gọi là cơ
quan lipid. Khi nguồn nitrogen bị hạn chế, vi sinh vật tiếp tục đồng hóa nguồn carbon,
tế bào không tiếp tục phát triển vì nguồn nitrogen không đáp ứng đủ cho sự tổng hợp
protein và nucleic. Vào lúc này, nguồn carbon thừa đƣợc chuyển sang tổng hợp lipid,
kết quả là tạo thành các hợp chất triacylglycerols trong tế bào [7].
Bảng 2.3: Hàm lƣợng và thành phần chất béo trong sinh khối của một số loại
nấm men [7]
% chất
béo
tích lũy
C16:0
C16:1
58
25
0
10
65
42
63
72
12
44
34
37
1
5
6
1
Rhodotorula graminis
36
30
Rhizopus arrhizus
Trichosporon
pullulans
Yarrowia lipolytica
57
Loại nấm men
Cryptococcus
curvatus
Cryptococcus albidus
Candida sp. 107
Lipomyces starkeyi
Rhodotorula glutinis
SVTH: Ngô Tƣờng Vi
Thành phần acid béo tích lũy
C18:0 C18:1
C18:2
C18:3
57
7
0
3
8
5
3
73
31
51
47
12
9
3
8
0
1
0
0
2
12
36
15
4
18
0
6
22
10
12
65
15
0
2
57
24
1
36
11
6
1
28
51
1
12
