phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid lactic có khả năng kháng nấm mốc từ nem chua
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.34 MB, 75 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID LACTIC
CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MỐC TỪ NEM CHUA
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG
TRẦN HỒNG VÂN
MSSV: 3082646
LỚP: CNSH TT K34
Cần Thơ, Tháng 05/2013
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. Ngô Thị Phương Dung
Trần Hồng Vân
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày
tháng 05 năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm tạ sự hướng dẫn và giúp đỡ của TS. Ngô Thị Phương Dung
cùng sự giúp đỡ, hỗ trợ và góp ý của ThS. Huỳnh Xuân Phong trong suốt quá trình
thực hiện đề tài luận văn.
Xin cám ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Phạm Hồng Quang – quản lý phòng
thí nghiệm CNSH thực phẩm và các quý thầy cô, anh chị quản lý các phòng thí
nghiệm tại Viện NC&PT CNSH đã hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi, đóng góp ý kiến
cho việc hoàn thành đề tài nghiêm cứu này.
Xin gửi lời tri ân đến các thầy cô giảng dạy trong suốt quá trình học tập và rèn
luyện. Xin cám ơn sự hướng dẫn của cố vấn học tập PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp.
Xin cám ơn các anh chị học viên cao học, các bạn sinh viên lớp CNSH TT K34
và CNSH K35 tại phòng CNSH thực phẩm đã trực tiếp giúp đỡ thực hiện đề tài.
Xin cám ơn sự động viên và hỗ trợ từ gia đình và bạn bè trong thời gian qua.
Xin trân trọng cám ơn!
Trần Hồng Vân
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
TÓM LƯỢC
Vi khuẩn acid lactic đóng vai trò quan trọng trong bảo quản thực phẩm nhờ khả
năng kháng nấm bên cạnh chức năng kháng khuẩn của bacteriocin. Sản phẩm thịt lên
men nói chung và nem chua nói riêng thường chịu nhiều ảnh hưởng từ nấm mốc vì quy
trình sản xuất thủ công, bảo quản ở điều kiện thường và được sử dụng trực tiếp. Đề tài
này được tiến hành nhằm khảo sát khả năng kháng nấm mốc của vi khuẩn acid lactic
được phân lập từ nem chua. Năm mẫu nem chua được thu thập để đánh giá cảm quan
với kết quả khá tốt, đạt tổng điểm trên 7/10. Chỉ số pH trung bình được xác định là 4,7
và lượng acid lactic trung bình là 1,6 g/100 g mẫu. Kết quả phân tích cho thấy 5 mẫu
nem chua có các chỉ tiêu về tổng vi sinh vật hiếu khí và nấm mốc nằm trong giới hạn
cho phép (lần lượt là 3,0.107 CFU/g và 3,3.103 CFU/g). Mật số vi khuẩn acid lactic
trong 5 mẫu tương đương nhau trung bình là 2,2.107 CFU/g. Từ 5 mẫu nem chua khác
nhau, 19 dòng vi khuẩn acid lactic và 9 dòng nấm mốc được phân lập. Kết quả khảo
sát tính kháng nấm mốc cho thấy hầu hết các dòng vi khuẩn acid lactic đều thể hiện
được tính kháng mốc, trong đó 9 dòng vi khuẩn (47%) cho kết quả kháng tốt đối với
7/9 dòng nấm mốc và có tính kháng mạnh (trên 10+) là P32B, P41A, V13A, P21B,
P31B, R11B, R14B, R22B và K34B. Trong số đó, 3 dòng vi khuẩn acid lactic P32B,
V13A và P41A cho kết quả tốt và được xác định là Lactobacillus plantarum (P32B và
V13A) và Pediococcus pentosaceus (P41A).
Từ khóa: kháng nấm mốc, nấm mốc, nem chua, vi khuẩn acid lactic.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
i
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
MỤC LỤC
TÓM LƯỢC................................................................................................................ i
MỤC LỤC ..................................................................................................................ii
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ iv
DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. v
TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................................... vi
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài .............................................................................................. 2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về vi khuẩn acid lactic ................................................................. 3
2.2. Ứng dụng vi khuẩn acid lactic trong các sản phẩm thịt lên men ............... 7
2.3. Khái quát về nem chua Việt Nam ................................................................ 9
2.3.1. Quy trình sản xuất ................................................................................. 9
2.3.2. Hệ vi sinh vật trong nem chua ............................................................. 10
2.4. Sự xâm nhiễm của nấm mốc và độc tố trên sản phẩm thịt lên men ......... 11
2.5. Vi khuẩn acid lactic với khả năng kháng nấm .......................................... 13
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 17
3.1. Phương tiện nghiên cứu.............................................................................. 17
3.1.1. Địa điểm và thời gian .......................................................................... 17
3.1.2. Vật liệu................................................................................................ 17
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................. 17
3.1.4. Hóa chất và môi trường ....................................................................... 17
3.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 18
3.2.1. Thu thập mẫu ...................................................................................... 18
3.2.2. Phân tích chỉ tiêu cảm quan, chỉ số pH, định lượng acid lactic ............. 18
3.2.3. Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn acid lactic và nấm mốc 19
3.2.4. Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn acid lactic từ nem chua ............. 21
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
ii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
3.2.5. Phân lập nấm mốc từ nem chua ........................................................... 22
3.2.6. Khảo sát khả năng kháng nấm của vi khuẩn acid lactic với các dòng
nấm được phân lập ........................................................................................ 23
3.2.7. Định danh cấp độ loài các dòng vi khuẩn được tuyển chọn .................. 24
3.2.8. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ............................................... 24
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 25
4.1. Thu thập mẫu ............................................................................................. 25
4.2. Phân tích chỉ tiêu đánh giá cảm quan, chỉ số pH, định lượng acid lactic . 25
4.2.1. Đánh giá cảm quan .............................................................................. 25
4.2.2. Phân tích chỉ số pH .............................................................................. 26
4.2.3. Định lượng acid lactic ......................................................................... 28
4.3. Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn acid lactic và nấm mốc ... 29
4.4. Kết quả phân lập vi khuẩn acid lactic từ nem chua .................................. 32
4.5. Kết quả phân lập nấm mốc từ nem chua ................................................... 37
4.6. Khả năng kháng nấm mốc của các dòng vi khuẩn acid lactic .................. 40
4.7. Kết quả định danh cấp độ loài các dòng vi khuẩn được tuyển chọn ........ 44
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 45
5.1. Kết luận ....................................................................................................... 45
5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 46
PHỤ LỤC
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
iii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Phân biệt vi khuẩn acid lactic và sự phân loài hiện tại ...……………………….4
Bảng 2: Chỉ tiêu tổng vi sinh vật trên sản phẩm thịt …………………………………….8
Bảng 3: Nhiệt độ phát triển của một số vi khuẩn acid lactic phổ biến ..………………....9
Bảng 4: Chỉ tiêu cho phép các vi sinh vật trong thịt lên men, nem chua. .…………….. 11
Bảng 5: Kết quả đánh giá cảm quan nem chua………………………………………… 25
Bảng 6: Giá trị pH của năm mẫu nem chua ở ngày lên men thứ tư …………………… 27
Bảng 7: Độ chua Therner và lượng acid lactic của các mẫu nem chua ……………….. 28
Bảng 8: Mật số tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn acid lactic và nấm mốc ………….. 29
Bảng 9: Nguồn mẫu và ký hiệu của các dòng vi khuẩn acid lactic được phân lập
…. 32
Bảng 10: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn acid lactic phân lập …………… 33
Bảng 11: Đặc điểm sinh hóa và tế bào của các dòng vi khuẩn acid lactic ……………. 36
Bảng 12: Nguồn mẫu và ký hiệu các dòng nấm mốc phân lập ……………………… 37
Bảng 13: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng nấm mốc phân lập ……………. 38
Bảng 14: Đặc điểm vi học của các dòng nấm mốc quan sát dưới kính hiển vi ………. 40
Bảng 15: Khả năng kháng 9 dòng nấm mốc của 19 dòng vi khuẩn acid lactic được
phân lập ……………………………………………………………………………….41
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
iv
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Cây phát sinh loài vi khuẩn acid lactic
……………………………………….4
Hình 2: Một vài hình thái vi khuẩn acid lactic tiêu biểu ……………………………….5
Hình 3: Hình thái Penicillium sp. (trái) và Aspergillus sp. (phải) ….…………………13
Hình 4: Những chất kháng nấm được phân lập từ L. amylovorus và L. plantarum ….. .14
Hình 5: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm ……………………………………………………18
Hình 6: Màu sắc các mẫu nem chua …………………………………………………. 26
Hình 7: Sự tương quan giữa chỉ số pH và lượng acid lactic trong nem chua ………… 29
Hình 8: Sự tương quan giữa mật số vi khuẩn acid lactic và lượng acid lactic ……….. 31
Hình 9: Các dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn acid lactic phân lập ……………. 34
Hình 10: Hình dạng tế bào vi khuẩn acid lactic ở độ phóng đại 1000 lần ………….... 34
Hình 11: Kết quả nhuộm Gram của vi khuẩn acid lactic được phân lập ……………… 34
Hình 12: Thử nghiệm catalase trên mẫu vi khuẩn ……………………………………. 35
Hình 13: Thử nghiện oxydase trên mẫu vi khuẩn ……………………………………. 35
Hình 14: Khả năng phân giải CaCO3 của dòng vi khuẩn R13A …………………….. 36
Hình 15: Nấm mốc được quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần ………….. 39
Hình 16: Các mức độ kháng nấm mốc của vi khuẩn acid lactic phân lập ……………. 41
Hình 17: Kết quả định danh dòng vi khuẩn P32B …………………………………….45
Hình 18: Kết quả định danh dòng vi khuẩn V13A ……………………………………45
Hình 19: Kết quả định danh dòng vi khuẩn P41A …………………………………….45
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
v
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
TỪ VIẾT TẮT
ATP
Adenosine triphosphate
aw
Water activity
CFU
Colony forming unit
Kcal
Kilocalorie
LAB
Lactic acid bacteria
MEA
Malt extract agar
MRS
De Man, Rogosa and Sharpe
NAD+
Nicotinamide Adenine Dinucleotide
NADH
Nicotinamide Adenine Dinucleotide Hydrogen
PCA
Plate count agar
rRNA
Ribosomal ribonucleic acid
rDNA
Ribosomal deoxyribonucleic acid
SDA
Sabouraud dextrose agar
SPW
Saline peptone water
WQA
Woolworths Quality Assurance
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
vi
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Sản phẩm thịt lên men được biết đến từ lâu nhờ việc bổ sung muối và đường vào
thịt để thu được một loại thực phẩm thơm ngon và có giá trị dinh dưỡng cao. Trên thực
tế, việc bổ sung này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển một vài loài vi sinh vật có
sẵn trong sản phẩm để tạo ra sản phẩm có hương vị đặc biệt và có tác dụng bảo quản
sản phẩm lâu bị hỏng.
Nem chua là một trong những sản phẩm lên men thịt truyền thống nổi tiếng của
Việt Nam được làm từ thịt heo, bì và một số phụ liệu khác. Nem chua được sản xuất
tại nhiều vùng của đất nước với những thương hiệu nổi tiếng như: nem Bình Dương,
nem Thủ Đức, nem Lai Vung,… Phần lớn nem chua được sản xuất ở quy mô hộ gia
đình theo phương thức lên men tự nhiên, không sử dụng giống chủng nên chất lượng
sản phẩm thường không ổn định. Mặt khác, nem chua là sản phẩm thường được tiêu
thụ sau 3 đến 4 ngày lên men mà không qua chế biến, nên vấn đề vệ sinh thực phẩm
hiện là mối quan tâm của người tiêu dùng lẫn nhà sản xuất. Hiện trạng phổ biến nhất
là nem chua bị nhiễm nấm mốc, nguyên nhân làm hư hỏng, mất mùi vị, thậm chí gây
ngộ độc. Ngày nay, việc sử dụng chất hóa học kháng vi sinh vật trong thực phẩm
thường bị người tiêu dùng từ chối vì những tác động của hóa chất lên sức khỏe. Do đó,
việc tìm ra các chủng vi sinh vật vừa có khả năng định hướng quá trình lên men, đảm
bảo tính ổn định và cải thiện chất lượng sản phẩm vừa có khả năng sinh ra những chất
có khả năng kháng lại các vi sinh vật gây bệnh là rất cần thiết.
Vi khuẩn acid lactic là nhóm vi khuẩn được quan tâm nhiều nhất trong chế biến
và bảo quản thực phẩm. Những vi khuẩn này được sử dụng phổ biến với mục đích lên
men, acid hóa nguyên liệu thông qua việc sản sinh các acid hữu cơ, đặc biệt là acid
lactic. Bên cạnh đặc tính tiêu biểu sinh ra bacteriocin kháng khuẩn, vi khuẩn acid
lactic còn có khả năng kháng nấm khá hiệu quả. Chúng có thể sinh ra các hợp chất
kháng nấm quan trọng trong bảo quản thực phẩm như: acid hữu cơ, hydrogen
peroxide, diacetyl, reuterin, reutericyclin, hợp chất phenolic, hydroxyl fatty acid,…
Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid lactic có khả năng kháng nấm
mốc từ nem chua” được thực hiện nhằm phân lập các dòng vi khuẩn acid lactic có thể
ứng dụng cải thiện chất lượng sản phẩm lên men cũng như đánh giá khả năng kháng
nấm mốc của các dòng phân lập.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
1
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được thực hiện với mục tiêu phân lập vi khuẩn acid lactic từ sản phẩm
nem chua, kiểm tra và tuyển chọn vi khuẩn acid lactic có khả năng kháng nấm mốc
cao.
Để thực hiện mục tiêu này, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
-
Đánh giá sơ bộ nem chua với chỉ tiêu cảm quan, pH, lượng acid lactic, mật số
vi khuẩn lactic, mật số nấm mốc, tổng vi sinh vật hiếu khí.
-
Phân lập vi khuẩn acid lactic từ nem chua.
-
Phân lập nấm mốc từ nem chua.
-
Kiểm tra tính kháng nấm mốc của vi khuẩn acid lactic được phân lập.
-
Chọn lọc định danh những dòng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc tốt.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
2
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về vi khuẩn acid lactic
Vi khuẩn acid lactic (LAB, hay còn được gọi là vi khuẩn lactic) là vi khuẩn Gram
dương, hầu hết không di động, không sinh bào tử, có dạng hình cầu hoặc hình que,
oxidase âm tính, catalase âm tính. Vi khuẩn này không tổng hợp cytochrome và
porphyrin cho quá trình hô hấp vì vậy chúng không thể tạo ra năng lượng. Thay vào
đó, vi khuẩn acid lactic có thể tạo ra năng lượng nhờ vào quá trình lên men đường
(glucose, lactose). Theo Knoll (2007) trích dẫn của Makarova và Koonin (2007) thì
thuật ngữ “vi khuẩn lactic” chủ yếu chỉ thị đặc tính chuyển hóa cơ bản của loại vi
khuẩn này, lên men đường hexose thành acid lactic. Đây là loại vi khuẩn kỵ khí tùy
nghi, sống được cả trong môi trường không có oxy.
Vi khuẩn acid lactic là một trong những nhóm vi sinh vật quan trọng trong lên
men thực phẩm. Chúng tạo nên mùi vị, kết cấu cho sản phẩm, cũng như bảo vệ thực
phẩm bằng sự ức chế của acid lactic và các chất kháng vi sinh vật. LAB được sử dụng
trong lên men sản xuất sữa chua, phô mai, bơ, kem, xúc xích, rau cải muối chua, rượu,
thịt lên men,…
Khuẩn lạc của vi khuẩn acid lactic tròn nhỏ, trong bóng, màu trắng đục hoặc màu
vàng kem; hoặc khuẩn lạc có đường kính to hơn, tròn nổi, trắng đục đặc biệt khuẩn lạc
tỏa ra mùi chua của acid (Kandler và Weiss, 1986).
Vi khuẩn acid lactic có khả năng tạo ra các hợp chất kháng khuẩn. Trong đó, việc
sản sinh acid lactic và acid acetic là quan trọng nhất. Tuy nhiên một số chủng vi khuẩn
acid lactic còn được biết đến bởi việc sản sinh các phân tử có hoạt tính sinh học như
ethanol, acid formic, các acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin,
reutericyclin,… Nhiều giống cũng sản sinh các bacteriocin và những phân tử thể hiện
hoạt tính kháng khuẩn tương tự bacteriocin (De Vuyst và Leroy, 2007).
Orla-Jensen
(1919)
đã
chia
LAB
thành
các
giống
Betabacterium,
Thermobacterium, Streptobacterium, Streptococcus, Betacoccus, Tetracoccus, và
Microbacterium dựa trên hình dạng và đặc tính kiểu hình (Bảng 1). Ngày nay, sự phân
loài có những thay đổi nhất định và dần được thống nhất với hệ thống các giống chính
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus và Streptococcus; và các giống
phụ Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, và
Weisella.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
3
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
Bảng 1: Phân biệt vi khuẩn acid lactic và sự phân loài hiện tại
Giống
Betabacterium
Hình dạng
Catalase
Khử NO2
Lên men
Que
-
-
Dị hình
Giống hiện tại
Lactobacillus
Weissella
Thermobacterium
Que
-
-
Đồng hình
Lactobacillus
Streptobacterium
Que
-
-
Dị-đồng
Lactobacillus
Carnobacterium
Streptococcus
Cầu
-
-
Đồng hình
Streptococcus
Enterococcus
Lactococcus
Vagococcus
Betacoccus
Cầu
-
-
Dị hình
Leuconostoc
Oenococcus
Weissella
Microbacterium
Que
+
+
Đồng hình
Brochothrix
Tetracoccus
Cầu
+
+
Đồng hình
Pediococcus
Tetragenococcus
Nguồn: Orla-Jensen, 1919 và Holzapfel et al., 2001.
Hình 1: Cây phát sinh loài vi khuẩn acid lactic
Nguồn: Schleifer et al., 1995.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
4
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
Mối quan hệ của các giống vi khuẩn acid lactic được thể hiện trong Hình 1 dựa
trên sự so sánh trình tự 16S rRNA. Carnobacterium, Enterococcus, Vagococcus,
Aerococcus, Tetragenococcus và giống mới Lactosphaera có quan hệ di truyền gần
gũi với nhau hơn hết so với các giống LAB khác. Lactobacillus là giống vi khuẩn acid
lactic đa dạng nhất (Schleifer et al., 1995).
Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn acid lactic thành dạng
hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài.
Giống Streptococcus có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế bào
0,5-1 µm. Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi
hoặc chuỗi ngắn.
Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,50,8 µm và chiều dài khoảng 1,6 µm. trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi
tròn, chiều dài khoảng 1-3 µm. Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi,
không tạo thành đám tập trung.
Giống Lactobacillus có dạng hình que. Tùy vào điều kiện của môi trường
sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài, sắp xếp thành chuỗi
hay đứng riêng lẻ.
Giống Pedicoccus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn, có hoạt tính
thủy phân protein rất yếu.
Giống Bifidobacterium là những trực khuẩn, khi mới phân lập có thể phân
nhánh dạng chữ Y, V và tập hợp thành khối. Sau nhiều lần cấy truyền chúng trở thành
dạng trực khuẩn dạng thẳng hoặc hơi uốn cong.
Hình 2: Một vài hình thái vi khuẩn acid lactic tiêu biểu
Nguồn: />me.home.html ngày 25/12/2012.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
5
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
Yêu cầu về dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn acid lactic
rất cao, nhưng khả năng tổng hợp acid amin và vitamin của chúng là rất hạn chế.
Không dòng nào của loài này có thể phát triển trong môi trường nghèo muối khoáng
với glucose và muối ammoni. Hầu hết chúng yêu cầu một số lượng lớn vitamin
(riboflavin, thiamine, acid folic, biotin và những vitamin khác), acid amin, purine và
pyridine.
Vi khuẩn acid lactic cần nhiều thành phần dinh dưỡng khác nhau cho sự sống,
nên chúng phát triển rộng rãi trong những môi trường dinh dưỡng như sữa, thực vật
nhưng chúng ít được tìm thấy trong đất và nước. Môi trường sống tự nhiên của chúng
là sữa, những nơi sản xuất sữa (Lactobacillus brevis, L. bulgaricus, L. casei, L.
fermentum) và trong màng nhầy ruột của người và động vật (Lactobacillus
acidophilus, Bifidobacterium, Enterococcus faecalis, Streptococcus salivarius, S.
bovis, S. pyogenes, S. pneumoniae).
Quá trình trao đổi chất là quá trình đường phân, chu trình pentose phosphate. Đối
với loại vi khuẩn này, NADH được oxy hóa thành NAD+. Từ đây, LAB chuyển đổi
pyruvate thành lactate bằng việc sử dụng lactate dehydrogenase. Có hai kiểu trao đổi
chất carbohydrate là lên men đồng hình (homofermentative) và lên men dị hình
(heterofermentative).
Lên men đồng hình: vi khuẩn acid lactic lên men đường theo chu trình EmbdenMeyerhorf, chúng có enzyme carboxylase làm cho pyruvate không bị phân giải sâu
hơn, thay vào đó nó nhận được hydro tách ra và chuyển tới pyruvate để hình thành các
sản phẩm acid lactic. Acid lactic là sản phẩm chính, chỉ một phần nhỏ pyruvate bị khử
carbon và chuyển thành các sản phẩm phụ khác. Nhóm này bao gồm Lactobacillus,
Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus và Pediococcus.
C6H12O6 =>
2CH3CHOHCOOH + 22,5 Kcal
Lên men dị hình: vi khuẩn acid lactic không có đủ các enzyme cơ bản để thực
hiện chu trình Embden-Meyerhorf với andolase và trizaphosphattizomarase. Thay vào
đó chúng đi theo con đường pentose phosphate và tiếp tục chuyển hóa theo các hướng
khác nhau tạo ra acid lactic và các sản phẩm, như CO2, ethanol, acid acetic. Nhóm này
bao gồm Leuconostoc, Oenococcus, Weissella và một vài loài Lactobacillus.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
6
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
2.2. Ứng dụng vi khuẩn acid lactic trong các sản phẩm thịt lên men
Rất nhiều loại thực phẩm của con người là thực vật và các sản phẩm từ động vật
được lên men bởi vi khuẩn acid lactic, vì loại vi khuẩn này sở hữu những những đặc
tính xúc tiến cho quy trình sản xuất và chuyển hóa trong thực phẩm. Những loại thực
phẩm như dưa cải muối chua, phô mai, xúc xích,… không chỉ có thời gian bảo quản
lâu hơn so với vật liệu ban đầu mà còn có mùi vị được tạo nên trực tiếp hoặc gián tiếp
bởi vi khuẩn acid lactic.
Thịt là một nguồn cung cấp các giá trị dinh dưỡng sinh học hiệu quả, như
protein, vitamin B12, niacin, vitamin B6, sắt, kẽm, phosphor. Thịt cũng là nguồn cung
cấp chất béo không bão hòa omega 3 dạng polymer chuỗi dài, riboflavin, selenium,
vitamin D.
Các sản phẩm thịt lên men được định nghĩa là thịt được chủng với vi sinh vật
trong quá trình sản xuất dưới những điều kiện được kiểm soát nhằm tạo điều kiện
thuận lợi cho quá trình lên men (Acton, 1977). Tuy nhiên, hầu hết các nhà sản xuất địa
phương hoặc ở hộ gia đình thường dựa vào sự lên men tự nhiên, không sử dụng chủng
khởi động hoặc không kiểm soát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến quá trình lên
men. Trong những trường hợp trên, các vi sinh vật thường có nguồn gốc từ thịt hoặc
môi trường xung quanh.
Nguồn dinh dưỡng phong phú từ thịt lên men cung cấp cả cho vi sinh vật gây
bệnh và không gây bệnh môi trường thích hợp cho những giai đoạn phát triển ban đầu
và dự trữ. Quá trình lên men thịt được xúc tiến bởi vi khuẩn acid lactic oxy hóa
carbonhydrate trong điều kiện thiếu oxy và tạo ATP, chúng sử dụng pyruvate như chất
nhận electron cuối cùng thay vì là oxy (Zakpaa et al., 2009). Những giống vi khuẩn
acid lactic góp mặt trong quá trình lên men thịt thường là Lactobacillus, Pediococcus,
Leuconostoc, Streptococcus và Enterococcus (Doyle et al., 2001). Lactobacilli sử dụng
phần carbohydrate của thịt để tạo ra acid, nên pH của sản phẩm sẽ giảm, cải thiện cấu
trúc sản phẩm, tạo khả năng kháng các vi sinh vật gây hại, cũng như tạo mùi đặc trưng
cho sản phẩm. Sau khi sử dụng hết carbonhydrate, chúng sẽ tiếp tục sử dụng protein và
chất béo. Giá trị pH của thịt lên men phụ thuộc vào lượng dextrose, nhiệt độ, độ ẩm,
và thời gian lên men (Zakpaa et al., 2009).
Các vi khuẩn gây độc và các vi sinh vật khác là những mối lo ngại cho sự an toàn
trong các quá tình lên men thịt. Hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm thường xảy ra trên
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
7
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
sản phẩm thịt. Chỉ tiêu tổng vi sinh cho loại sản phẩm này được đề cập bởi Wilson et
al. (1981) trong Bảng 2.
Bảng 2: Chỉ tiêu tổng vi sinh vật trên sản phẩm thịt
Mức độ
Tổng vi sinh vật sống/g ở 30oC (CFU/g)
Miêu tả
I
< 5.105
Đạt yêu cầu
II
5. 105 – 107
Chấp nhận được
III
> 107
Không đạt
Nguồn: Wilson et al, 1981.
Yêu cầu về chủng giống vi khuẩn acid lactic từng được đề cập bởi Okerman và
Basu (2008), chủng giống phải không gây bệnh, kháng chịu được thực bào, không bị
nhiễm bởi các vi sinh vật và hóa chất không mong muốn để tránh trường hợp gây hại
sức khỏe và cản trở quá trình sản xuất, chịu được muối, phát triển nhanh trong môi
trường 6% nước muối, sống được trong điều kiện 80 - 100 ppm nitrite, phát triển trong
khoảng nhiệt độ 26 - 43oC và tạo được acid lactic từ dextrose. Ngoài ra, chủng giống
tốt cũng không sinh khí trong quá trình lên men, không phân hủy amino acid thành
amine linh động hoặc hydro lưu huỳnh, tạo ra ít hoặc không tạo acetic acid, tạo được
mùi hương và màu sắc cho sản phẩm.
Một thuận lợi khác của việc sử dụng giống chủng so với lên men tự nhiên là
được cung cấp lượng lớn vi sinh vật (106 - 107 CFU/g thịt), lấn át những loài không
mong muốn, và đạt được pH thấp 5,0 trong vài ngày đầu lên men. Nhìn chung, giống
chủng sẽ làm giảm thời gian lên men so với lên men tự nhiên 15 - 20% và tăng năng
suất lên đến 5 - 7% (Okerman và Basu, 2008). Giá trị pH 5,0 của sản phẩm gần với
điểm đẳng điện của thịt, vị trí làm kết tụ các protein tan trong thịt và hạn chế việc giữ
nước, điều đó sẽ thuận lợi cho việc làm khô, săn chắc, tạo độ cứng cho sản phẩm.
Mỗi loài vi sinh vật trong giống chủng đều có những đặc tính riêng và những
điều kiện sống tối ưu khác nhau, đặc biệt là nhiệt độ. Một vài thông số nhiệt độ thích
hợp cho các LAB trong men chủng phát triển tốt được thể hiện trong Bảng 3. Hầu hết
các dòng đều phát triển tốt ở nhiệt độ 30 - 35oC. Riêng chỉ có Penicillium miczynskii,
Staphylococcus và Lactobacillus casei phát triển trong điều kiện nhiệt độ thấp hơn so
với các loài còn lại ở 20oC.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
8
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
Bảng 3: Nhiệt độ phát triển của một số vi khuẩn acid lactic phổ biến
Nhiệt độ phát triển tối ưu (oC)
Dòng vi khuẩn
Lactobacillus plantarum, pH 4,3 - 4,9
30 - 37
L. saka
< 25
L curvatus
< 25
Lactococcus, pH 4,3 - 4,9
35 - 43
L. sakei
< 30
L. curvatus
< 30
Pediococcus acidilactici
38 - 40
P. pentosaceus
30 - 35
Penicillium miczynskii
20
Staphylococci
30
Staphylococcus +
20
Lactobacillus casei, pH < 5,2
Nguồn: Campbell-Platt và Cook, 1995; Luo-Xin et al., 2003.
2.3. Khái quát về nem chua Việt Nam
2.3.1. Quy trình sản xuất
Nem chua là sản phẩm của quá trình lên men từ thịt nhờ vi khuẩn acid lactic.
Hiện nay nem chua được sản xuất rộng rãi ở nước ta, mỗi vùng có một đặc điểm riêng
về hương vị dựa vào kinh nghiệm sản xuất và chủ yếu được thực hiện theo phương
pháp thủ công. Nem chua có hương vị đặc trưng của sản phẩm lên men, sẽ tạo được
cảm giác ngon miệng khi ăn và tốt cho quá trình tiêu hóa.
Nguyên liệu được dùng trong sản xuất nem chua bao gồm: thịt heo nạc, da heo,
muối, nước mắm, tỏi, tiêu, bột ngọt, ớt, đường, thính gạo, lá ổi, lá vông, lá chuối,…
Khâu chọn nguyên liệu là khâu quan trọng cho sản xuất nem chua vì nó đóng vai
trò chủ đạo quyết định giá trị của sản phẩm. Yêu cầu cho nguyên liệu là thịt còn mới,
còn nóng, thịt nạc đùi hoặc mông, tránh rửa thịt. Thêm vào đó da heo là yếu tố quan
trọng thứ hai, vì ngoài công dụng làm chất độn, da heo còn có vai trò làm chất kết dính
trong các phân tử mô cơ, giúp định hình sản phẩm, làm tăng độ giòn, dai.
Quá trình chín của nem chua không tiến hành xử lý nhiệt vì vậy các chất dinh
dưỡng của thịt như các acid amin hòa tan sẽ không bị mất đi, điều đó càng làm tăng
giá trị dinh dưỡng của loại sản phẩm này.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
9
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
Sau khi thịt được sơ chế và ướp gia vị, công đoạn quết được tiến hành. Mục đích
của việc quết là thực hiện gia công cơ học nhằm phá vỡ cấu trúc của mô cơ, làm tách
rời các sợi protein trong bó cơ, khuếch tán gia vị, tạo cấu trúc gel cho khối thịt. Sau đó,
tiến hành phối trộn thịt và da heo đã cắt sợi. Trong quá trình này, tỏi xay nhuyễn được
bổ sung nhằm hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn. Cuối cùng
là khâu vo viên, định hình và gói sản phẩm cho lên men từ 3 đến 5 ngày.
Sản phẩm có thể được đánh giá cảm quan dựa vào các yếu tố sau: nem chua có
thịt dai, chắc, có vị chua vừa phải của acid lactic, vị cay của tiêu, ớt, tỏi, hơi có mùi
thơm rượu, không nhầy nhớt, màu đỏ đẹp như màu của thịt tươi, không có nấm mốc
phát triển, lá chuối gói bên ngoài có thể vừa chuyển sang màu vàng xanh nhưng không
bị khô, không bị ẩm mốc.
Quá trình lên men nem chua bị ảnh hưởng và có thể dẫn đến hư hỏng bởi nhiều
yếu tố. Trong đó, thành phần nguyên liệu được xem như yếu tố đầu tiên vì nó quyết
định tính đặc trưng cho sản phẩm. Kế đến phải đề cập tới yếu tố hệ vi sinh vật, nếu sử
dụng giống chủng sẽ hạn chế được vi sinh vật không mong muốn, trong khi đó,
phương pháp sản xuất truyền thống lên men tự nhiên không thể lựa chọn được chủng
vi sinh vật thích hợp, mà hoàn toàn phụ thuộc vào vi sinh tự nhiễm. Bên cạnh đó, theo
kinh nghiệm sản xuất, nhiệt độ 27 - 30oC sẽ tạo điều kiện thích hợp nhất cho giá trị
dinh dưỡng cao và cảm quan tốt. Ngoài ra, các yếu tố pH và độ yếm khí của môi
trường cũng có ảnh hưởng nhất định đến chất lượng sản phẩm.
2.3.2. Hệ vi sinh vật trong nem chua
Các vi khuẩn acid lactic thường gặp trong lên men nem chua là Lactobacillus,
Pediococcus, Micrococuss, trong đó chủ yếu là Lactobacillus.
Hiện nay, các vi khuẩn acid lactic được nghiên cứu và đưa vào ứng dụng như:
- Pediococcus lên men đồng hình, yếm khí tùy nghi, có khả năng sinh tổng hợp
các chất cần thiết cho cơ thể. Các loài Pediococcus khác nhau về tính chịu nhiệt, chịu
acid và muối.
- Lactobacillus bao gồm các loài chiếm ưu thế trong hệ vi sinh tự nhiên của quá
trình lên men thịt. Chúng phát triển mạnh ở nhiệt độ 30 - 35oC, các vi khuẩn acid lactic
thuộc giống này thường được sử dụng là L. acidophilus, L. pasterian, L. brevis, L.
casei, L. bulgaricus, L. plantarum.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
10
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
Theo nghiên cứu của Hồ Thị Nguyệt Thu et al. (2007), Đại học Nông Lâm
TPHCM, trong số 131 giống được định danh từ nem chua, có các giống như L. brevis
(25,19%), L. plantarum (21,37%), Leuconostoc mesenteroides dextranicum (14,50%),
Pediococcus pentosaceus (12,21%) và Lactococcus lactis (11,45%) được ghi nhận.
Đồng thời, những vi khuẩn acid lactic khác như L. paracasei, L. fermentum, L.
cellobiosus, L. collinoides, Leuconostoc lactis cũng có xuất hiện với tỉ lệ thấp (từ
1,53% đến 3,82%).
Ngoài vi khuẩn acid lactic, trong các sản phẩm thịt nói chung và nem chua nói
riêng, việc nhiễm các vi khuẩn gây bệnh và các loại nấm mốc, nấm men là khá phổ
biến. Một số loại vi khuẩn gây bệnh cho người được tìm thấy trên thịt là Salmonella,
Streptococcus, Clostridium botulinum, Clostridium putrificus, E. coli, S. aureus…
Bảng 4 thể hiện cụ thể hơn các chỉ tiêu vi sinh cho sản phẩm thịt lên men nói chung.
Sự hiện diện của các loại nấm không mong muốn có thể kể đến là Penicillium,
Aspergillus, Scopulariopsis (Mizacova et al., 2002).
Bảng 4: Chỉ tiêu cho phép các vi sinh vật trong thịt lên men, nem chua
Vi sinh vật
Giới hạn cho phép trên 1 g (CFU/g)
3.107
Tổng vi khuẩn hiếu khí
Coliforms
50
E. coli
3
Clostridium perfringens
10
Salmonella
0
B. cereus
10
S. aureus
10
Nguồn: ngày 25/12/2012.
2.4. Sự xâm nhiễm của nấm mốc và độc tố trên sản phẩm thịt lên men
Nấm thường có khả năng chống chịu với nhiệt độ thấp, pH thấp, aw thấp và chất
bảo quản hơn hẳn vi khuẩn. Vì vậy tình trạng nhiễm nấm trong thực phẩm xảy ra khá
phổ biến đối với một số sản phẩm như thịt tươi, thịt lên men, phô mai, nước trái cây,…
Trường hợp nhiễm nấm có thể được xác định như sau:
Có thể nhìn thấy được, sự phát triển thường tạo màu.
Bị nhớt.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
11
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
Lên men đường tạo acid, khí hoặc alcohol.
Làm sản phẩm mất màu, mất mùi.
Theo Magnusson (2003), Claviceps purpurea và Aspergillus flavus là hai trong
những loại nấm được phát hiện sớm nhất bởi những trường hợp ngộ độc thực phẩm
trong phạm vi lớn. Claviceps purpurea đã gây ra thiệt hại về người lên đến con số
hàng nghìn ở châu Âu trong thế kỷ 11. Đến thể kỷ 20, Aspergillus flavus được
Filtenborg et al. (1996) công bố cùng với độc tố nấm, aflatoxin. Ngày nay, có hơn 400
loại mycotoxin được phát hiện từ những giống nấm khác nhau và con số này ngày
càng tăng một cách nhanh chóng.
Ngày càng nhiều nghiên cứu về nấm trên thực phẩm được tiến hành, một trong
những lý do được quan tâm đó là mycotoxin, chất gây ra những ảnh hưởng tiêu cực
cho thực phẩm như gây độc, gây biến tính và chất này chó khả năng chịu nhiệt cao.
Một khi nấm mốc xâm nhiễm vào thực phẩm, khả năng tạo ra mycotoxin là rất lớn khi
chúng gặp điều kiện thuận lợi của môi trường. Theo nghiên cứu của Hanssen (1995),
khi aw (water activity) thấp (aw < 0,9) và chỉ số pH thấp hơn 6,0 là điều kiện khá tốt
cho sự phát triển của nấm mốc.
Các điều kiện môi trường trong các khu sản xuất, kho lưu trữ, tủ lạnh, cửa hàng
rất phù hợp cho sự phát triển của nấm mốc trong sản phẩm, nhưng phổ biến nhất vẫn
là sự xuất hiện trên bề mặt của các sản phẩm từ thịt. Pitt và Hocking (1997) ước tính
có từ 5 - 10% thực phẩm trên thế giới hao hụt bởi sự gây hại của nấm.
Penicillium và Aspergillus là những loài được phát hiện phổ biến nhất trên hầu
hết các dạng thực phẩm (Filtenborg, 1996), cùng với Cladosporium, chúng được xác
định là những sinh vật gây bệnh trên các sản phẩm có thời gian chín dài, như thịt lên
men, xúc xích,… (Mizacova et al., 2002). Bên cạnh đó, Fusarium cũng được chú ý với
những loại mycotoxin mà loài này sinh ra như zearalenone và trichothecene, như
deoxynivelenol. Những loại mycotoxin này đều là những hợp chất chuyển hóa thứ cấp
và được cho ra là nguyên nhân gây ra hiện tượng kháng miễn dịch và gây ngộ độc trên
động vật.
Theo kết quả phân tích của Mizacova et al. (2002) trên sản phẩm thịt lên men,
những giống nấm mốc được phát hiện chủ yếu là Penicillium sp., Acremonium sp.,
Mucor sp., Cladosporium sp., và Aspergillus sp. Nhưng không phải tất cả các loại nấm
mốc đều sinh mycotoxin nên sự xuất hiện của nấm mốc trên sản phẩm thịt lên men
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
12
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
không khẳng định hoàn toàn sự có mặt của mycotoxin. Trong các loài được phân lập
thì Penicillium và Aspergillus (Hình 3) là hai giống được cho là có khả năng gây độc
cao. Các loài Penicillium tạo ra nhiều loại mycotoxin nhất, trong đó đáng chú ý nhất là
các chất ochratoxin A, patulin, citrinin, citreoviridin, griseofulvin, rubratoxin,
roquefortin C, acid penicillic, acid cyclopiazonic, acid secalonic hoặc acid
mycophenolic. Aspergillus flavus sản sinh ra aflatoxin và acid cyclopiazonic. Sự phát
triển của Aspergillus niger có thể góp phần hình thành ochratoxin A. Trong khi đó, các
giống còn lại (Acremonium sp., Mucor sp., Cladosporium sp.) không có tiền sử về
mycotoxin trên sản phẩm thịt lên men.
Hình 3: Hình thái Penicillium sp. (trái) và Aspergillus sp. (phải)
Nguồn: ,
ngày 29/12/2012.
Sự hình thành mycotoxin trên thịt và các sản phẩm từ thịt được xúc tiến bởi các
điều kiện sau (Ostry, 2001):
Sự hiện diện của oxy
Nhiệt độ từ 4 - 40oC
pH tối ưu trong khoảng 5,0 - 8,0
aw thấp nhất là 0,8
Nồng độ muối cao nhất là 14%
2.5. Vi khuẩn acid lactic với khả năng kháng nấm
Vi khuẩn acid lactic có khả năng cạnh tranh với các vi sinh vật khác bằng cách
tiết ra các chất ức chế hoặc kiểm soát môi trường sống bằng quá trình trao đổi chất của
chúng. Đã có nhiều nghiên cứu phân tích các hợp chất đó cũng như nguyên lý hoạt
động của chúng. Các chất chuyển hóa kháng vi sinh vật được chia thành hai nhóm
chính: những hợp chất có phân tử lượng thấp (<1000 g/mol) và bacteriocin (phân tử
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
13
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
lượng >1000 g/mol) (Niku-Paavola et al., 1999) và những chất có tác dụng kháng nấm
thường thuộc nhóm có phân tử lượng thấp (Hình 4). Dòng L. plantarum VTTE-78076
được công bố tính ức chế phát triển đối với nấm mốc Fusarium VTTD-80147. Những
hợp chất mà dòng vi khuẩn acid lactic này sản sinh ra được xác định là acid benzoic,
dẫn xuất của imidazolidinedione và dẫn xuất của piperazinedione.
Hình 4: Những chất kháng nấm được phân lập từ
L. amylovorus và L. plantarum
Nguồn: Ryant et al., 2011; Strom et al., 2002.
Có rất nhiều nghiên cứu chuyên sâu về khả năng kháng vi khuẩn và bacteriocin
của LAB, nhưng mảng đề tài kháng nấm vẫn chưa bắt kịp về số lượng (Magnusson và
Schnurer, 2001). Theo Magnusson et al. (2003), có thể giải thích khả năng kháng vi
sinh vật của LAB theo ba cơ chế: sự sản sinh acid hữu cơ, cạnh tranh về chất dinh
dưỡng và sự hình thành các chất đối kháng. Dòng vi khuẩn Lactobacillus coryniformis
Si3 được phát hiện có khả năng tạo ra các hợp chất giống protein có thể kháng lại
nhiều loại nấm mốc như Aspergillus fumigatus, A. nidulans, Penicillium roqueforti,
Mucor hiemalis, Talaromyces flavus, Fusarium poae, F. graminearum, F. culmorum,
và F. sporotrichoides. Các chất kháng nấm của vi khuẩn acid lactic có thể được phân
nhóm thành các sản phẩm lên men, hợp chất giống protein, và các chất ức chế có phân
tử lượng thấp. Ngoài ra, trong nghiên cứu này cũng đề cập đến khả năng kháng nấm
rất tốt của dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum MiLAB 14 tạo ra acid
hydroxylated fatty (acid 3-Hydroxydecanoic, acid 3-hydroxydodecanoic, acid 3-
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
14
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
hydroxytetradecanoic, 3-hydroxy-5-cis-dodecenoic). Những loại acid hydroxyl fatty
này có tác dụng với nồng độ trong khoảng 10 - 100 µg/mL để kháng nấm mốc.
Những loài vi khuẩn như Lactococcus lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp.
cremoris, Lc. lactis subsp. diacetylactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
plantarum và Lactobacillus curvatus có thể tổng hợp peptide hoặc bacteriocin để
chống lại những loài vi khuẩn Gram dương, kể cả nấm mốc và nấm men. Hơn nữa, sự
hoạt động của vi khuẩn acid lactic kháng nấm được nghiên cứu và công bố bởi nhiều
tác giả (Phụ lục 1). Theo đó, những dòng LAB chính với khả năng hạn chế sự phát
triển của nấm tạo mycotoxin thuộc về các giống Lactococcus và Lactobacillus, một số
khác thuộc về giống Pediococcus và Leuconostoc (Dalie et al., 2010).
Dòng vi khuẩn L. plantarum IMAU10014 được xác định tính kháng nấm với ba
hợp chất acid 3-phenyllactic, acid benzeneacetic và 2- propenyl ester (Wang et al.,
2012). Những loài nấm được thử nghiệm dương tính với dòng vi khuẩn này là
F. oxysporum, P. citrinum và P. drechsleri Tucker.
Một vài dòng vi khuẩn Lactobacillus đã được khẳng định có khả năng kháng
nấm bằng phương pháp overlay assay với nhiều loài nấm gây ngộ độc trong nghiên
cứu của Magnusson và Schnurer (2001). Tính kháng nấm của L. coryniformis subsp
cornyformis ổn định ở nhiệt độ cao và pH 3,0 - 4,5.
Acid phenyllactic và 4-hydroxyphenyllactic được phát hiện có khả năng kháng
nấm cao trong nghiên cứu của Lavermicocca et al. (2000) tại Ý. Hai chất này được tạo
ra bởi hai dòng vi khuẩn acid lactic L. plantarum 21B và L. plantarum 20B. Trong đó,
dòng 21B có vùng hoạt động tốt nhất, kháng được nhiều loài nấm mốc và nấm men
(Eurotium repens IBT18000, Eurotium rubrum FTDC3228, Penicillium corylophilum
IBT6978, Penicillium roqueforti IBT18687, Penicillium expansum IDM/FS2,
Endomyces fibuliger IBT605 và IDM3812, Aspergillus niger FTDC3227 và IDM1,
Aspergillus flavus FTDC3226, Monilia sitophila IDM/FS5 và Fusarium graminearum
IDM623). Trong khi dòng 20B chỉ có hiệu quả cao với nấm mốc.
Rouse et al. (2008) cũng từng khẳng định lại đặc điểm kháng nấm của vi khuẩn
acid lactic với nấm mốc, và đưa ra kết quả dương tính cao trên nhiều loài Penicillium
và Aspergillus nidulans.
Vách tế bào của một số loài vi khuẩn như Leuconostoc và Streptococcus được
nghiên cứu và kết luận với khả năng bám dính các chất gây độc như acid amin
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
15
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 -2013
Trường Đại học Cần Thơ
pyrolysates và acid amin heterocyclic trong quá trình chế biến thực phẩm. Vẫn còn
nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá khả năng loại bỏ các chất nhiễm trong
thức ăn của vi khuẩn acid lactic, kể cả mycotoxin, chất gây ngộ độc thực phẩm (Dalie
et al., 2010). Cơ chế mycotoxin (aflatoxin, zearalenone và fumonisin) bị vi khuẩn acid
lactic hấp thu và loại bỏ bằng màng tế bào ngày càng được khẳng định nhiều hơn.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
16
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
