Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin từ chất thải lông gia súc – gia cầm tại ba quận thuộc thành phố cần thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY KERATIN TỪ CHẤT
THẢI LÔNG GIA SÚC – GIA CẦM TẠI BA QUẬN
THUỘC THÀNH PHỐ CẦN THƠ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU

SINH VIÊN THỰC HIỆN
VƯƠNG THÀNH VŨ
MSSV:3092455
LỚP:CNSH K35

Cần Thơ, Tháng 8/2013


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013

Trường ĐHCT

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(ký tên)

TS. Bùi Thị Minh Diệu

SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)

Vương Thành Vũ

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013

Trường ĐHCT

LỜI CẢM TẠ
Xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học
Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận
văn.
Tập thể các thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, đã
tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường
Đại học Cần thơ.
Đặc biệt cảm ơn TS. Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và cho tôi
những lời khuyên hết sức quý báu trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Thầy Trần Vũ Phương, cố vấn học tập khóa 35, đã quan tâm và tạo điều kiện tốt
cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn.
Cán bộ, anh chị em phòng thí nghiệm Sinh Học Phân tử Thực vật đã tạo điều kiện
về các trang thiết bị trong quá trình thực hiện luận văn cũng như chia sẽ kinh nghiệm để
tôi thực hiện tốt luận văn này.
Gia đình và bạn bè luôn là nguồn lực và động viên tôi.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

TÓM TẮT
Keratin là một loại protein khó phân hủy và là thành phần chủ yếu của lông gia
súc, gia cầm. Từ 10 mẫu đất và nước thu tại các lò giết mổ gia súc, gia cầm và trại nuôi
gà tại ba quận Cái Răng, Ô Môn và Ninh Kiều thuộc Thành phố Cần Thơ, đã phân lập
được 11 dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường bột lông gia cầm. Tất cả
11 dòng đều tạo được vòng thủy phân trên môi trường sữa với đường kính từ 1,6 đến

7,2 mm và thể hiện hoạt tính enzyme keratinase từ 18,4 đến 79,3 U/ml. Tất cả các dòng
vi khuẩn đều có khả năng làm giảm khối lượng bột lông gia cầm trong môi trường lỏng
từ 41,9 đến 54,1%; và 7,9 đến 32% khối lượng bột lông gia súc trong môi trường lỏng
sau 7 ngày nuôi cấy. Sau 10 ngày nuôi lắc, 11 dòng vi khuẩn đều làm tách rời sợi lông
con khỏi sợi lông ống, trong đó dòng CT5 và CT8 cho kết quả hiệu quả nhất lần lượt là
80 và 75%.
Các từ khóa: keratin, keratinase, lông gia cầm, lông gia súc, vòng thủy phân,....

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

i

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT ..........................................................................................................i
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................. ii
TÓM TẮT.........................................................................................................................i
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................................iv
DANH SÁCH HÌNH .......................................................................................................v
TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................................vi
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU .............................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài ......................................................................................................1

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .........................................................................2
2.1. Sơ lược về keratin .................................................................................................2
2.2. Một số loại rác thải chứa keratin ..........................................................................2
2.3. Sơ lược về enzyme keratinase ..............................................................................2
2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật ..........3
2.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam ...............................................4
2.5.1. Trên thế giới ...................................................................................................4
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .................................................................6
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................7
3.1. Phương tiện nghiên cứu ........................................................................................7
3.1.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ...........................................................7
3.1.2. Vật liệu ...........................................................................................................7
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ.........................................................................................7
3.1.4. Hóa chất .........................................................................................................7
3.1.5. Môi trường phân lập .......................................................................................8
3.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................8
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

3.2.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin ...........................................8
3.2.2. Đánh giá hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn .....................................11
3.2.3. Đánh giá hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn (Areeb et al., 2012) ..12

3.2.3.1. Tổng hợp azo – keratin ..........................................................................12
3.2.3.2. Chuẩn bị enzyme keratinase thô từ môi trường bột lông ......................13
3.2.3.3. Đánh giá hoạt tính keratinase ................................................................13
3.2.4. Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn .......13
3.2.5. Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia súc (lông heo) của các dòng vi
khuẩn ......................................................................................................................14
3.2.6. Đánh giá khả năng phân hủy lông gà nguyên của các dòng vi khuẩn .........15
3.2.7. Phương pháp xử lý số liệu............................................................................15
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................16
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn phân hủy chất thải lông .............................................16
4.1.1. Kết quả phân lập ..........................................................................................16
4.1.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào của vi khuẩn ..................16
4.1.3. Kết quả nhuộm Gram các dòng vi khuẩn.....................................................17
4.2. Kết quả đánh giá hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn ...............................18
4.3. Kết quả đánh giá hoạt tính enzyme keratinase của các dòng vi khuẩn ..............19
4.4. Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn ..............20
4.5. Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia súc (lông heo) của các dòng vi khuẩn
....................................................................................................................................21
4.6. Đánh giá khả năng phân hủy lông gà nguyên của các dòng vi khuẩn ................22
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................24
5.1. Kết luận ...............................................................................................................24
5.2. Đề nghị ................................................................................................................24
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................25
PHỤ LỤC

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Thành phần hóa chất môi trường Milk agar ......................................................8
Bảng 2. Thành phần hóa chất môi trường bột lông gia cầm ...........................................8
Bảng 3. Đặc điểm hình thái và kích thước khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập
được ...............................................................................................................................16
Bảng 4. Kết quả nhuộm Gram các dòng vi khuẩn phân lập được .................................17
Bảng 5. Đường kính thủy phân của các dòng vi khuẩn trên môi trường sữa sau 24 giờ ủ
ở 37˚C ............................................................................................................................18
Bảng 6. Kết quả đo hoạt tính enzyme keratinase ..........................................................19
Bảng 7. Khả năng phân hủy lông gia cầm của các dòng vi khuẩn ................................20
Bảng 8. Khả năng phân hủy lông gia súc của các dòng vi khuẩn .................................21
Bảng 9. Phụ lục khả năng phân hủy casein của các dòng vi khuẩn sau 24 giờ
Bảng 10. Phụ lục kết quả đo hoạt tính enzyme keratinase
Bảng 11. Phục lục thí nghiệm phân hủy bột lông gia cầm
Bảng 12. Phụ lục thí nghiệm phân hủy bột lông gia súc (lông heo)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iv

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Vòng thủy phân casein của dòng vi khuẩn CT4 sau 24 giờ ủ ở 37˚C ..............18
Hình 2. Khả năng phân hủy sợi lông gia cầm của dòng vi khuẩn CT5 .........................22

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

v

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

TỪ VIẾT TẮT
CFU

Colony-forming unit

FMA

Feather meal agar

H

Hour

SMA

Skim milk agar

STT

Số thứ tự

TCA

Trichloroacetic acid

Vi khuẩn/ml Vi khuẩn trên một ml
Vòng/phút

Vòng trên phút

UV

ultraviolet

U

Unit

U/ml

Đơn vị hoạt tính enzyme trên một ml

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vi

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Dân số thế giới đang gia tăng rất nhanh qua từng năm, theo thống kê của cục điều
tra dân số của Mỹ đến tháng 7 năm 2012 dân số thế giới là 7.01 tỷ người (nguồn:
viwikipedia.org 26/6/2013). Dân số gia tăng đặt ra một thách thức là phải đảm bảo vấn
đề lương thực cho tất cả mọi người. Sự phát triển mạnh của ngành chăn nuôi là một yếu
tố quan trọng góp phần giải quyết vấn đề lương thực toàn cầu. Tuy nhiên, khi ngành
chăn nuôi phát triển mạnh lại gây ra nhiều ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường, đòi hỏi
con người phải tìm ra biện pháp xử lý thích hợp.
Trong số các loại chất thải tạo ra trong quá trình chăn nuôi và giết mổ gia súc – gia
cầm thì phế phẩm lông là khó xử lý nhất; mỗi ngày một lượng lớn chất thải lông chưa
qua xử lý được thải trực tiếp ra môi trường, do thành phần chính của loại chất thải này
chủ yếu là keratin, một hợp chất cao phân tử rất khó bị phân hủy do cấu trúc phức tạp
và vì thế tích tụ dần dẫn đến ô nhiễm môi trường.
Để giải quyết vấn đề này, rất nhiều phương pháp hóa học và vật lý đã được áp
dụng, tuy nhiên, các phương pháp này vẫn chưa đạt được hiệu quả và tiêu tốn nhiều
năng lượng. Công nghệ sinh học phát triển đã giúp mở ra một hướng đi mới để giải
quyết vấn đề này, sử dụng các loài vi sinh vật có hoạt tính enzyme keratinase để phân
hủy các nguồn cơ chất keratin. Phương pháp này không những giúp giải quyết hiệu quả

vấn đề ô nhiễm môi trường mà sản phẩm sinh ra sau quá trình xử lý làm thức ăn chăn
nuôi, phân sinh học.
Với mục tiêu đa dạng các dòng vi sinh vật có khả năng phân hủy cơ chất keratin
nói chung cũng như lông gia súc, gia cầm nói riêng nên đề tài nghiên cứu “Phân lập và
tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin từ chất thải lông gia súc – gia cầm
tại ba quận thuộc thành phố Cần Thơ” được thực hiện.
1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin từ chất thải lông gia
súc, gia cầm ở thành phố Cần Thơ.
Đánh giá khả năng phân hủy cơ chất chứa keratin (lông gia súc, gia cầm) của các
dòng vi khuẩn phân lập được và chọn lọc các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy
keratin cao.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về keratin
Keratin là một dạng protein có nhiều trong các tế bào biểu mô của động vật có
xương sống và là thành phần chính của da và các phần phụ như móng tay, tóc, lông gia
cầm và lông gia súc. Các chuỗi protein được cuộn lại, ở dạng xoắn α (α-keratin) hoặc ở
dạng phiến β (β-keratin), gấp nếp tạo thành cấu trúc ba chiều. Keratin được phân thành
hai nhóm chính dựa theo hàm lượng lưu huỳnh là keratin cứng (lông, tóc, móng) và

keratin mềm (da, mô). Những protein này thuộc nhóm scleroprotein là những chất bền
vững dưới tác động của các tác nhân vật lý, hóa học và sinh học. Một trong những đặc
điểm chính của keratin là tính ổn định cơ học, khả năng chống phân hủy bởi các tác nhân
phân hủy protein cao, phụ thuộc vào các liên kết disulfide, hydro và các liên kết khác
(Onifade et al., 1998). Do đó, các chất cấu tạo bởi keratin không tan trong nước, không
bị phân hủy bởi các enzyme phổ biến như papain, trypsin và pepsin (Veslava et al.,
2009).
2.2. Một số loại rác thải chứa keratin
Lông chứa khoảng 90% protein, trong đó thành phần chính là keratin. Keratin là
thành phần cấu tạo chủ yếu trong lông, tóc, móng tay, móng vuốt, da,… (Onifade et al.,
1998). Đối với gia súc như lợn thì lông chiếm từ 0,5 – 0,8% trọng lượng cơ thể. Đối với
gà trưởng thành thì lông chiếm từ 5 – 7% trọng lượng cơ thể.
Các phế phẩm chứa keratin của gia súc và gia cầm sau quá trình giết mổ thường
được xử lý bằng cách đốt cháy hoặc chôn lấp và thậm chí được thải trực tiếp ra môi
trường gây ô nhiễm nghiêm trọng cho môi trường đất, nước, không khí. Cho nên, việc
tìm biện pháp xử lý tốt hơn cho các loại chất thải này là vô cùng rất cần thiết. Do thành
phần chính của chúng là protein, nên các loài vi sinh vật có hoạt tính enzyme keratinase
hoàn toàn có khả năng phân hủy các nguồn cơ chất này. Đây được xem là một hướng đi
mới có hiệu quả để giải quyết được vấn đề đặt ra.
2.3. Sơ lược về enzyme keratinase
Keratinase là loại enzyme có khả năng phân hủy protein trong tự nhiên. Nó được
phân loại là protease với mã số là EC 3.4.99.11 (Fuchs, 1995; Parry và North, 1998).
Gần đây, keratinase được định nghĩa là serine protease do nó tương đồng trình tự 97%

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

với protease kiềm và nó cũng bị ức chế bởi các chất ức chế tương tự chất ức chế serine
protease (Bressollier et al., 1999; Wang et al., 2003).
Keratinase được sản xuất từ vi sinh vật khi môi trường nuôi cấy có chứa keratin
làm nguồn carbon duy nhất. Enzyme này chủ yếu phá hủy các liên kết disulfide (-SS-)
bên trong keratin (Bockel et al., 1995). Keratinase có thể được sản xuất từ nhiều nguồn
vi sinh vật khác nhau như nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn. Các enzyme này còn có thể phân
hủy các protein dạng sợi như fibrin, elastin, collagen và các protein khác không có dạng
sợi như casein, albumin huyết thanh bò, gelatin,... (Noval and Nickerson, 1959;
Mukhapadhayay and Chandra, 1990; Dozie et al., 1994; Lin et al., 1995; Letourneau et
al., 1998; Bressollier et al., 1999).
Keratinase có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn như :
Từ vi khuẩn : nhóm vi khuẩn Gram dương có khả năng tổng hợp keratinase bao
gồm Bacillus, Lysobacter, Nesternokia, Kocurica và Microbacterium. Tuy nhiên, một
vài dòng Gram âm như Vibrio, Xanthomonas, Stenotrophomonas và Chryseobacterium
(Sangali and Brandelli, 2000; De Toni et al., 2002) cũng đã được báo cáo.
Từ xạ khuẩn: chủ yếu là nhóm Streptomyces bao gồm S. fradiae (Novel and
Nickerson, 1959), Streptomyces. sp. A11 (Mukhopadhyay and Chandra, 1990), S.
pactum (Bockle et al., 1995), S. albidoflavus (Letourneau et al., 1998), S.
thermoviolaceus SD8 (Chitte et al., 1999).
Từ nấm: Chrysosporium, Aspergillus, Alternaria, Trichurus, Curvularia,
Cladosporium,

Fusarium,

Geomyces,

Gleomastis,

Monodictys,

Myrothecium,

Paecilomyces, Stachybotrys, Urocladium, Scopulariopsis, Sepedonium, Penicillium,
Doratomyces (Gradisar et al., 2000).
2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật
Sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật liên quan chặt chẽ với các điều kiện môi
trường bên ngoài. Các yếu tố môi trường tác dụng lên vi sinh vật được chia làm ba loại
chính yếu tố vật lý, yếu tố hóa học, yếu tố sinh học. Sự ảnh hưởng của các yếu tố này
có thể là thuận lợi hoặc có thể là bất lợi. Các yếu tố thuận lợi sẽ giúp cho vi sinh vật sinh
trưởng, phát triển tốt, tăng khả năng phân hủy cơ chất và sinh ra nhiều enzyme nhất. Các
yếu tố gây bất lợi có thể làm phá hủy thành tế bào, biến đổi tính thấm của màng tế bào
chất, kiềm hãm hoạt tính enzyme,... (Nguyễn Lân Dũng et al., 2012). Trong các yếu tố
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật thì chất dinh dưỡng, nhiệt độ
và pH là những yếu tố quan trọng, ảnh hường lón đến vi sinh vật. Các yếu tố khác như

độ ẩm, ánh sáng, oxi,… cũng có ảnh hưởng nhưng không lớn.
Yếu tố chất dinh dưỡng: cacbon và nitơ là hai chất dinh dưỡng chính. Cacbon là
thành phần chính trong tế bào, các cấu trúc tế bào đều có sự có mặt của cacbon. Nitơ là
thành phần cấu tạo của acid amin, protein, acid nhân, các coenzyme cần thiết cho tế bào.
Bên cạnh đó, sulfur, phospho, potassium, calcium, magnesium, sắt là những nguyên tố
cần thiết cho tế bào; ngoài ra, các nguyên tố vi lượng Co, Mn, Mo, Zn tham gia vào cấu
trúc, chức năng và điều hòa hoạt tính enzyme, protein (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu
Hiệp, 2011).
Yếu tố nhiệt độ là yếu tố quang trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển
của vi sinh vật. Khi nhiệt độ tăng, vận tốc phản ứng hóa học hay các phản ứng của các
enzyme trong tế bào gia tăng do đó sự sinh trưởng của vi sinh vật cũng tăng lên. Tuy
nhiên, nếu nhiệt độ tăng quá ngưỡng chịu đựng của vi sinh vật, một số bào quan nhạy
cảm với nhiệt độ có thể bị hư hại và mất chức năng hoạt động.
Yếu tố pH cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và phát
triển của vi sinh vật. Các loài vi sinh vật khác nhau thích nghi với từng vùng pH khác
nhau. Đa số các loài vi sinh vật sống và phát triển trong môi trường có pH 6 – 8. Tuy
nhiên vẫn có những loài có khả năng tồn tại ở nơi có pH thấp gần bằng 1 như Euglena
mutabilis. Cũng có những loài vi sinh vật ưa kiềm sống ở pH cao như các vi khuẩn suối
nước nóng có pH trên 10.
2.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
2.5.1. Trên thế giới
Sangali và Brandelli (2000) đã phân lập được dòng vi khuẩn thuộc họ
Vibrionaceae từ vùng nuôi gia cầm công nghiệp ở Brazil. Vi khuẩn được phân lập trên
môi trường chứa 10g lông gia cầm được sử dụng như là nguồn năng lượng, carbon và
nitơ duy nhất. Môi trường nuôi cấy bao gồm 0,5g/l NaCl; 0,3g/l Na2HPO4; 0,4g/l
NaH2PO4 bổ sung 10g lông gia cầm và 15g agar. Trong nghiên cứu này vi khuẩn phát
triển thuận lợi nhất ở 30˚C. Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme hoạt động lần lượt là
55˚C và pH = 8,0.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

Kết quả nghiên cứu của Riffel et al. (2003) cho thấy vi khuẩn Chryseobacterium
sp. dòng kr6 có khả năng phân hủy hoàn toàn lông vũ trong quá trình nuôi cấy. Dòng vi
khuẩn này có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 30˚C và pH tối ưu 8,0. Dưới điều kiện
này, hoạt động phân giải lông vũ cũng biểu hiện tối đa. Nghiên cứu cũng cho thấy hoạt
tính của keratinase bị ức chế bởi EDTA, Hg2+, Cu2+ và được kích hoạt bởi Ca2+.
Gupta và Ramnani (2006) đã thực hiện nghiên cứu về enzyme keratinase từ vi
khuẩn và ứng dụng của enzyme này. Trong đó, enzyme keratinase chỉ được sinh ra trong
điều kiện môi trường có sự hiện diện của cơ chất chứa keratin như lông, tóc, móng,…
cơ chế phản ứng phân hủy keratin bao gồm phản ứng cắt đứt cầu nối disulfide và thủy
phân protein. Keratinase thuộc loại serine proteinase. Keratinase được ứng dụng trong
chế biến thức ăn cho gia súc, phân bón, làm sạch và làm giảm ô nhiễm ở các khu công
nghiệp.
Riffel và Brandelli (2006) đã tiến hành phân lập vi khuẩn phân giải keratin từ chất
thải lông gia cầm. Bốn dòng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường bột lông vũ được
kiểm tra khả năng phân hủy protein trên môi trường sữa, trong đó có ba dòng Gram âm
(thuộc chi Burkholderia, Chryseobacterium và Pseudomonas) và một dòng Gram dương
(Microbacterium sp.). Những vi khuẩn này có thể phát triển trên đa dạng các chất thải
chứa keratin như bột lông vũ, lông vũ thô, móng gà, tóc và len.
Daroit et al. (2009) đã phân lập dòng vi khuẩn Bacillus từ ruột của loài cá Piaractus
mesopotamicus. Dòng vi khuẩn thể hiện hoạt tính trên cả môi trường milk agar và môi

trường có bổ sung bột lông, phân hủy 90% lông sau 72 giờ nuôi cấy trong môi trường
lỏng chỉ toàn bột lông. Sự tạo thành của các nhóm thiol cũng đã được ghi nhận trong
suốt quá trình nuôi cấy, điều này chỉ ra đóng góp của các liên kết disulfide đến sự hiệu
quả của liên kết hydro trong phân tử keratin. Tuy nhiên, dòng Bacillus không có khả
năng phân hủy keratin tóc. Dòng Bacillus này có thể ứng dụng cho các quá trình thân
thiện với môi trường như quá trình chuyển hóa sinh học (bioconversion) của các sản
phẩm phân hủy lông, và hướng tới một cách giải quyết mang nhiều giá trị hơn như sinh
khối vi sinh vật, các quá trình thủy phân protein, các enzyme phân giải protein.
Bo Xu et al. (2009) đã phân lập được một dòng vi khuẩn mới được định danh là
Bacillus licheniformis K-19 chịu được nhiệt độ cao (30 – 90˚C) và pH rộng (6 – 10).
Nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 60˚C và pH 7,5 – 8. Hàm lượng enzyme tối đa thu được

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

khoảng 224 U/l sau 72 giờ nuôi cấy. Môi trường phân lập được bổ sung (NH4Cl 0,5 g/l,
NaCl 0,5 g/l, K2HPO4 0,3 g/l, KH2PO4 0,4 g/l, MgCl2.7H2O 0,1 g/l, bột lông 10 g/l, pH
7,5) và ủ ở 37˚C trong điều kiện lắc 180 vòng trên phút từ hai đến năm ngày. Enzyme
được dùng để bổ sung trong các loại thức ăn cho gia súc.
Park và Son (2009) đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện môi trường
đến sự phân giải lông gà và hoạt tính keratinase của vi khuẩn Bacillus megaterium F71. Vi khuẩn này phân hủy hoàn toàn lông gà trong bảy ngày. Điều kiện nhiệt độ ở 25 –
40˚C và pH từ 7,0-11,0 là điều kiện tối ưu cho sự phát triển của dòng vi khuẩn này. Hoạt

tính keratinase tạo ra trong môi trường chứa 0,6% sữa không béo là 468 U/ml, cao gấp
9,4 lần trong môi trường không bổ sung sữa. Lượng keratinase tạo ra phụ thuộc vào hàm
lượng lông vũ.
Veslava et al. (2009) đã chọn ra các dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis 511, B.
subtilis 11, B. subtilis 717, B. subtilis 103 phân lập từ nước thải tại khu công nghiệp chế
biến gia cầm để khảo sát khả năng phân hủy lông gia cầm. Các dòng vi khuẩn được phân
lập trên môi trường có bổ sung bột lông vũ : (NaCl 0,5 g/l, KH2PO4 0,4 g/l, K2HPO4 0,3
g/l, bột lông vũ 10 g/l và agar 15 g/l). Đối với dòng B. subtilis 103 thì hàm lượng enzyme
keratinase tối đa là 153 U/ml sau 24 giờ nuôi cấy, trong khi các dòng khác từ 148 – 292
U/ml sau 48 giờ nuôi cấy.
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Các nghiên cứu về phân lập vi khuẩn ở Việt Nam còn khá ít, chỉ có vài tài liệu về
phân lập vi sinh vật phân hủy lông vũ ở miền Bắc Việt Nam.
Nguyễn Huy Hoàng et al. (2010) đã phân lập một số dòng vi khuẩn (Bacillus sp.
Đ.NĐ 1.2, Bacillus sp. Đ.HY 1.1, chủng L.HY 2.6 và L.TO 2.1) có khả năng phân hủy
lông vũ tạo nguồn thức ăn cho nuôi trồng thủy sản.
Nguyễn Thu Hiền et al. (2010), viện khoa học và công nghệ Việt Nam, đã phân
lập được dòng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng phân hủy lông vũ.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
 Thời gian: Từ tháng 6/2012 đến tháng 12/2012
 Địa điểm: Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực
vật, thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học
Cần Thơ.
3.1.2. Vật liệu
 Mẫu đất, nước được thu tại các lò mổ gia súc, trại nuôi gà tại ba quận: Ninh Kiều,
Cái Răng, Ô Môn thuộc thành phố Cần Thơ.
 Lông gia cầm, lông gia súc được thu tại các cơ sở giết mổ gia cầm, gia súc tại thành
phố Cần Thơ.
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Bộ micropipette Gibson P10, P20, P200, P1000 - Đức
Cân điện tử Sartorius - Đức
Kính hiển vi Olympus CHT - Nhật
Máy lắc mẫu GFL 3005 - Đức
Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international - Đức
Tủ cấy vi sinh vật – Đức
Tủ lạnh trữ mẫu Akira - Việt Nam
Tủ sấy EHRET - Đức
Tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 - Đức
Một số dụng cụ khác như đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, đèn
cồn, que cấy, đầu cone (trắng, xanh, vàng), găng tay…
3.1.4. Hóa chất
Hoá chất dùng để phân lập các dòng vi khuẩn: K2PO4, KH2PO4, NaCl, Yeast
extract, pepton, MgSO4.7H2O,…
Hoá chất dùng để nhuộm Gram: Crystal Violet, Iod, Ethanol 70%, Fushin.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

3.1.5. Môi trường phân lập
Bảng 1. Thành phần hóa chất môi trường Milk agar
Hóa chất

Nồng độ (g/l)

Peptone

5

Yeast extract

3

Sữa không béo

100 ml

Agar

12
(Riffel và Brandelli, 2006)

Bảng 2. Thành phần hóa chất môi trường bột lông gia cầm
Hóa chất

Nồng độ (g/l)

MgSO4.7H2O

0,1

KH2PO4

0,4

K2HPO4

0,3

NaCl

0,5

Bột lông gia cầm

10

Agar

20
(Bo Xu et al., 2009)

3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin
a. Phân lập
Thu mẫu
Mẫu đất và nước thải được thu tại các lò mổ gia súc, lò mổ gia cầm và trại nuôi gia
cầm tại ba quận Ninh Kiều, Cái Răng, Ô Môn thuộc thành phố Cần Thơ.
Mẫu đất được thu ở nơi có lông mục, lấy cả đất và lông khoảng 100g cho vào bịch
nilon. Mẫu nước: thu khoảng 100ml từ hố nước thải của các cơ sở cho vào chai nhựa
sạch. Các mẫu được mang về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nơi mát cho đến khi sử
dụng.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

Xử lý mẫu
Mẫu nước: mẫu được khuấy đều sau đó hút 10ml cho vào bình tam giác 250ml
chứa 90ml môi trường bột lông vũ lỏng đã khử trùng có bổ sung thêm 3 g/l yeast extract,
lắc ở 37˚C trong 2 ngày ở 120 vòng/phút. Sau 2 ngày, mẫu được pha loãng về nồng độ
thấp hơn 10-5 hoặc 10-6 (thực hiện trong tủ cấy).
Mẫu đất: cân 1g mẫu cho vào bình tam giác 250ml chứa 99ml môi trường bột lông

vũ lỏng đã khử trùng có bổ sung thêm 3 g/l yeast extract, lắc ở 37˚C trong 2 ngày tốc độ
120 vòng/phút. Sau 2 ngày, mẫu cũng được pha loãng đến các nồng độ 10-5 hoặc 10-6
(thực hiện trong tủ cấy).
Phân lập
- Mẫu đã được pha loãng được trãi trên môi trường Milk agar ở 37˚C trong 24 giờ,
những khuẩn lạc tạo vòng trong xung quanh được chọn và cấy chuyển sang môi trường
bột lông vũ.
- Chọn các khuẩn lạc khác nhau ít nhất về một đặc điểm hình thái.
- Tiếp tục phân lập riêng các khuẩn lạc trên môi trường bột lông vũ cho đến khi
mẫu ròng.
- Mẫu ròng được cấy trữ vào ống nghiệm chứa môi trường bột lông vũ đặc có bổ
sung 1% yeast extract và trữ ở 4˚C.
b. Quan sát hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào của vi khuẩn (Cao Ngọc
Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
- Quan sát hình dạng, kiểu bìa, màu sắc, độ nổi và kích thước khuẩn lạc
Các dòng vi khuẩn được cấy trên đĩa môi trường có bổ sung bột lông gia vũ ủ ở
37˚C. Sau 24 giờ tiến hành quan sát các đặc điểm của khuẩn lạc: hình dạng, màu sắc, độ
nổi và chọn những khuẩn lạc rời để tiến hành đo kích thước.
- Quan sát hình dạng tế bào
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi
khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng. Các mẫu vi khuẩn sống được làm bằng
phương pháp giọt ép, rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học.
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:
+ Nhỏ 5µl nước cất vô trùng lên kính mang vật
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

+ Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội
+ Dùng kim cấy, lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật.
+ Dùng kính đậy vật, đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật
tiếp xúc với kính mang vật một góc 45˚, rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng
sau cho trong mẫu vật không có bọt khí.
+ Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học để thấy được các hình dạng tế bào
của vi khuẩn.
c. Nhuộm Gram các dòng vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp,
2002).
Sau khi quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn, tiến hành nhuộm Gram các vi
khuẩn. Trình tự nhuộm Gram như sau:
- Lấy 20µl nước cất vô trùng nhỏ lên kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng
vi sinh vật lên kính mang vật.
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính
mang vật.
- Nhỏ từ một đến hai giọt Crystal Violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh
vật đã cố định, trải đều Crystal Violet bằng que cấy và để một phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
- Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong một
phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70% thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau
cho đến giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.

- Nhỏ từ một đến hai giọt Fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để một phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến khi giọt nước cuối cùng không còn màu
của Fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

- Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học:
+ Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal Violet là Gram dương
+ Nếu có màu hồng đỏ của Fushin thì Gram âm.
3.2.2. Đánh giá hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn
Tăng sinh khối vi khuẩn
Các dòng vi khuẩn ròng trữ trong ống sẽ được cấy chuyển sang đĩa petri, ủ ở 37˚C
trong vòng 2 ngày. Sau đó, lấy 1 – 2 khuẩn lạc từ đĩa petri, cấy vào 30 ml môi trường
bột lông vũ lỏng trong ống nghiệm, ủ ở 37˚C trên máy lắc (120 vòng/phút) trong vòng
2 ngày.
Đếm mật số tế bào vi khuẩn
Hút 100 μl dịch nuôi vi khuẩn cho vào eppendorf chứa 900 μl nước cất vô trùng,
lắc đều bằng máy vortex sẽ được mẫu có độ pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng mẫu đến
độ pha loãng 10-12. Sau khi lắc đều bằng máy vortex, hút 5μl huyền phù tế bào vi khuẩn
ở các độ pha loãng 10-9, 10-10, 10-11, 10-12 nhỏ giọt vào đĩa môi trường bột lông vũ đã

được chuẩn bị trước đó. Mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 lần. Đem ủ ở 37˚C trong vòng
24 giờ, sau đó đếm số khuẩn lạc xuất hiện trong mỗi giọt.
Số tế bào vi khuẩn trong 1 ml (CFU/ml) trong dịch nuôi ban đầu tính từ số liệu
của độ pha loãng D1 được tính theo công thức là :
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V
Trong đó:

Ai là số khuẩn lạc trung bình/ giọt
Di là độ pha loãng
V là dung tích huyền phù tế bào trong mỗi giọt (ml)

Mật số tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các
độ pha loãng khác nhau.
Đồng nhất số lượng giữa các dòng vi khuẩn
Từ kết quả đếm mật số tính mật độ vi khuẩn trong 1ml, sau đó pha loãng các dòng
có mật số cao về dòng có mật số thấp nhất (khoảng 1011 vi khuẩn/ml).
Đánh giá hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

Hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn được đánh giá nhờ vào khả năng tạo

vòng phân giải trên môi trường sữa (Prasad et al., 2010). Đây là phương pháp đơn giản
để bước đầu đánh giá hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn. Với mỗi dòng vi khuẩn,
hút 5 μl dịch nuôi đã pha loãng nhỏ giọt vào môi trường sữa và ủ ở 37˚C trong vòng 24
giờ. Các dòng vi khuẩn có hoạt tính protease sẽ tạo vòng halo trên môi trường sữa.
Đường kính thủy phân sẽ đánh giá hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn. Trong đó,
đường kính thủy phân được tính theo công thức:
Đường kính thủy phân = Đường kính vòng halo – Đường kính giọt dịch nuôi vi
khuẩn
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên và được lập lại 3 lần.
3.2.3. Đánh giá hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn (Areeb et al., 2012)
3.2.3.1. Tổng hợp azo – keratin
- Chuẩn bị mẫu bột lông gà được nghiền thật mịn
- Lấy 5 g bột lông gà cho vào bình tam giác 250 ml, cẩn thận cho phần bột lông
nằm ở đáy bình.
- Cho vào tiếp 100 ml nước đã khử ion, dùng khuấy từ trộn đều hỗn hợp.
- Cho tiếp vào hỗn hợp 10 ml NaHCO3 10% (w/v), khuấy đều.
- Dùng bình tam giác 100 ml, cho vào 870 mg acid sulfanilic hòa tan trong 25 ml
NaOH 0,2 N.
- Tiếp tục cho 345 mg NaNO2 hòa tan vào dung dịch
- Dung dịch được chuyển đổi thành môi trường acid bằng 2 ml HCl 5 N
- Lắc đều trong 2 phút, sau đó trung hòa bởi 2 ml NaOH 5 N
- Cho tất cả phần dung dịch trong bình tam giác 100 ml vào bình tam giác 250
ml có bột lông gà đã chuẩn bị ở trên, hỗn hợp dung dịch được trộn đều trong 10 phút.
- Hỗn hợp phản ứng được lọc bằng giấy lọc whatman number 1, phần azokeratin
không tan sẽ được rửa hoàn toàn với nước khử ion.
- Azokeratin sẽ được hòa lơ lửng trong nước, được lắc đều ở 50˚C trong 2 giờ và
được lọc lại lần nữa.
- Chu kỳ rửa được lập lại cho đến khi pH của dịch rửa 6,0 – 7,0 và sự hấp thụ
quang phổ của dung dịch ở bước sóng 450 nm nhỏ hơn 0,01.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

- Cuối cùng, chu trình rửa được lập lại ít nhất hai lần sử dụng dung dịch đệm
potassium phosphate 50 mM pH 7,5. Azokeratin được rửa một lần nửa với nước và làm
khô qua đêm trong chân không ở 50˚C.
- Trử lạnh azokeratin để sử dụng trong thời gian dài.
3.2.3.2. Chuẩn bị enzyme keratinase thô từ môi trường bột lông
- Vi khuẩn được nuôi trong môi trường bột lông vũ ở 37˚C sau 2 ngày.
- Lọc dung dịch nuôi vi khuẩn bằng giấy lọc, dung dịch lọc được dùng để xác định
hoạt tính enzyme.
- Cho 1ml dung dịch lọc vào eppendopf 1,5ml, ly tâm ở 12 000 vòng/phút trong 5
phút loại bỏ vi khuẩn và bột lông vũ còn lại.
- Phần dung dịch lỏng phía trên eppendopf được sử dụng như enzyme thô để đo
hoạt tính của enzyme.
3.2.3.3. Đánh giá hoạt tính keratinase
- Năm mg azokeratin được thêm vào tuýp 1,5 ml có chứa 0,8 ml dung dịch đệm
potassium phosphate 50 mM pH 7,5 và lắc đều bằng máy vortex cho đến khi azokeratin
được hòa tan hoàn toàn.
- Thêm 0,2 ml dịch enzyme thô vào, trộn đều và ủ lắc ở 50˚C trong 15 phút.
- Sau 15 phút, thêm 0,2 ml TCA (trichloroacetic acid) vào để kết thúc phản ứng.
- Kết quả được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 450 nm. Một đơn vị hoạt tính
enzyme được xác định bằng sự gia tăng 0,01 đơn vị hấp thụ quang phổ ở 450nm so với

mẫu đối chứng sau 15 phút phản ứng.
Đơn vị hoạt tính enzyme = (OD mẫu – OD dc)/0,01.
3.2.4. Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn
Bột lông gia cầm được xay từ hỗn hợp lông gà và lông vịt theo tỉ lệ 1:1. Hỗn hợp
lông sau khi rửa sạch, đem sấy khô, sau đó xay nhuyễn và bảo quản ở nơi khô ráo.
Tăng sinh khối các dòng vi khuẩn trong môi trường bột lông vũ lỏng, sau 2 ngày
đếm mật số tế bào trong dịch nuôi đối với mỗi dòng vi khuẩn, sau đó đồng nhất mật số
giữa các dòng.
Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia cầm

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường bột lông gia cầm với thành
phần như sau: MgSO4.7H2O 0,1 g/l; KH2PO4 0,4 g/l; K2HPO4 0,3 g/l; NaCl 0,5g/l; bột
lông gia cầm 10 g/l. Khử trùng ở 121˚C trong 10 phút.
Lần lượt chủng vào mỗi bình tam giác 5 ml dịch nuôi vi khuẩn đã đồng nhất mật
số (khoảng 1011 vi khuẩn/ml), ủ ở 37˚C trên máy lắc (120 vòng/phút).
Một bình tam giác không chủng vi khuẩn được sử dụng làm mẫu đối chứng.
Sau một tuần nuôi lắc, tiến hành lọc môi trường qua giấy lọc đã được cân khối
lượng trước đó.
Rửa với nước cất đến khi dịch trong. Sấy khô, cân và ghi nhận kết quả.

Tỉ lệ phần trăm về sự thủy phân bột lông gia cầm của vi khuẩn được tính theo công
thức sau (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010):
A (%) = (mBĐ - mC) x 100 / mBĐ
Trong đó: A (%) là tỉ lệ bột lông bị thủy phân bởi vi khuẩn
mBĐ là khối lượng bột lông ban đầu
mC là khối lượng bột lông còn lại sau khi bị thủy phân
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên và được lập lại 3 lần.
3.2.5. Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia súc (lông heo) của các dòng vi
khuẩn
Chuẩn bị bột lông gia súc: lông heo được thu về từ các lò giết mổ gia súc, rửa sạch
với xà bông, phơi khô ráo nước, sấy 80˚C trong 2 ngày, cắt bỏ các phần da và thịt, sau
đó cắt nhỏ (khoảng 1mm), bảo quản nơi khô ráo.
Tăng sinh khối các dòng vi khuẩn trong môi trường bột lông vũ lỏng, sau 2 ngày
đếm mật số tế bào trong dịch nuôi đối với mỗi dòng vi khuẩn, sau đó đồng nhất mật số
giữa các dòng.
Đánh giá khả năng phân hủy lông gia súc
Chuẩn bị bình tam giác 250ml chứa 100ml môi trường bột lông gia súc với thành
phần như sau: MgSO4.7H2O 0,1 g/l; KH2PO4 0,4 g/l; K2HPO4 0,3 g/l; NaCl 0,5g/l; bột
lông gia súc 10 g/l. Khử trùng ở 121˚C trong 10 phút.
Lần lượt chủng vào mỗi bình tam giác 5ml dịch nuôi vi khuẩn đã đồng nhất mật
số (khoảng 1011 vi khuẩn/ml), ủ ở 37˚C trên máy lắc (120 vòng/phút).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

Một bình tam giác không chủng vi khuẩn được sử dụng làm mẫu đối chứng.
Sau một tuần nuôi lắc, tiến hành lọc môi trường qua giấy lọc đã được cân khối
lượng trước đó.
Rửa với nước cất đến khi dịch trong. Sấy khô, cân và ghi nhận kết quả.
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên và được lập lại 3 lần.
3.2.6. Đánh giá khả năng phân hủy lông gà nguyên của các dòng vi khuẩn
Tăng sinh khối các dòng vi khuẩn trong môi trường bột lông vũ lỏng, sau 2 ngày
đếm mật số tế bào trong dịch nuôi đối với mỗi dòng vi khuẩn, sau đó đồng nhất mật số
giữa các dòng.
Đánh giá khả năng phân hủy lông gà nguyên
Chuẩn bị ống nghiệm lớn chứa 40 ml dung dịch muối khoáng với thành phần như
sau: MgSO4.7H2O 0,1 g/l; KH2PO4 0,4 g/l; K2HPO4 0,3 g/l; NaCl 0,5g/l; Mỗi ống cho
vào 1 sợi lông gà, lông gà được chọn có độ đồng đều nhau về kích thước và tỉ lệ lông
con, lông nguyên; mỗi sợi có khối lượng khoảng 0,3 g. Khử trùng ở 121˚C trong 10
phút.
Lần lượt chủng vào mỗi ống nghiệm 2 ml dịch nuôi vi khuẩn đã đồng nhất mật số
(khoảng 1011 vi khuẩn/ml), ủ ở 37oC trên máy lắc (120 vòng/phút).
Một ống nghiệm không chủng vi khuẩn được sử dụng làm mẫu đối chứng.
Sau 10 ngày nuôi lắc, đánh giá độ rụng lông bằng cảm quan. Mẫu đối chứng không
chủng vi khuẩn là 100%, tùy theo độ rụng sẽ đánh giá các ống nghiệm có chủng vi
khuẩn.
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên và được lập lại 3 lần.
3.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thí nghiệm được phân tích thống kê và vẽ đồ thị bằng phần mềm
Statgraphics Plus 3.1 và MS Excel 2010.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

15

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2012

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn phân hủy chất thải lông
4.1.1. Kết quả phân lập
Từ 10 mẫu (6 mẫu đất và 4 mẫu nước) thu tại các lò giết mổ gia súc, gia cầm và
trại nuôi gà ở ba quận Cái Răng, Ô Môn và Ninh Kiều, sau khi trãi mẫu trên môi trường
sữa, chọn ra được 23 dòng có xuất hiện vòng trong, đánh số thứ tự lần lượt từ CT1 đến
CT23. Cấy qua môi trường bột lông vũ thì tất cả 23 dòng đều có khả năng phát triển trên
môi trường bột lông vũ. Chọn các dòng khác nhau ít nhất về một đặc điểm hình thái
khuẩn lạc để tiếp tục cấy phân lập cho đến khi mẫu ròng. Kết quả chọn được 11 dòng,
đánh số thứ tự từ CT1 đến CT11.
4.1.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào của vi khuẩn
Các dòng vi khuẩn sau khi phân lập, được cấy trên môi trường bột lông vũ ủ ở
37˚C trong 24 giờ để tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc. Đa số các khuẩn lạc có hình
tròn hoặc không đều, kiểu bìa nguyên, màu trắng trong, độ nổi lài, đường kính khuẩn
lạc thay đổi từ 1 – 3,5mm. Các đặc điểm của khuẩn lạc được tóm tắt lại trong bảng 3.
Bảng 3. Đặc điểm hình thái và kích thước khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn
phân lập được
Đường kính

STT

Dòng

Hình dạng

Kiểu bìa

Màu sắc

Độ nổi

1

CT1

Tròn

Nguyên

Trắng đục

Mô

1,5

2

CT2

Không đều

Răng cưa

Trắng trong

Lài

2

3

CT3

Tròn

Nguyên

Trắng trong

Lài

3

4

CT4

Không đều

Chia thùy

Trắng trong

Mô

2,5

5

CT5

Tròn

Nguyên

Trắng đục

Mô

2,5

6

CT6

Không đều

Nguyên

Trắng trong

Lài

3

7

CT7

Tròn

Nguyên

Trắng trong

Lài

3

8

CT8

Không đều

Nguyên

Trắng trong

Lài

3,5

9

CT9

Tròn

Nguyên

Trắng trong

Lài

1,5

10

CT10

Không đều

Chia thùy

Trắng đục

Mô

1

11

CT11

Tròn

Nguyên

Trắng trong

Lài

1

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

16

(mm)

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học