Luận án : phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm pseudomonas spp bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ









NGÔ THANH PHONG





PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM PSEUDOMONAS SPP.
BÓN CHO CÂY LÚA CAO SẢN
VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG




LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC
Mã số 62 42 40 01

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS. TS. CAO NGỌC ĐIỆP







Cần Thơ - 2012






BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGÔ THANH PHONG





PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM PSEUDOMONAS SPP.
BÓN CHO CÂY LÚA CAO SẢN
VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG





LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC
Mã số 62 42 40 01

Cần Thơ - 2012






i
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc


LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố
định đạm Pseudomonas spp. bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu
Long” là của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa
từng được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án



Ngô Thanh Phong

ii
LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn Thầy - PGS.TS. Cao Ngọc Điệp, người đã tận tâm
hướng dẫn khoa học, tư vấn và giúp tôi tiếp cận các khía cạnh khoa học cho sự thành
công của đề tài nghiên cứu sinh.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban lãnh
đạo Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa
Học Tự Nhiên, Phòng Đào Tạo, Phòng Quản Lý Khoa Học, Khoa Sau Đại Học và các
Phòng Ban chức năng khác của Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi.
Chân thành cảm ơn quí Thầy Cô và anh chị đồng nghiệp ở Bộ môn Sinh học,
Khoa Khoa Học Tự Nhiên và Viện Nghiên Cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học đã
tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trợ và tư vấn cho tôi trong thời gian học tập cũng như thực
hiện luận án này.
Cảm ơn ThS. Trần Thị Xuân Mai đã tư vấn thiết kế cặp mồi chuyên biệt cho
Pseudomonas stutzeri A1501; cảm ơn ông Đào Văn Sơn (nông dân ở nông trường
Sông Hậu) đã hỗ trợ đất ruộng để triển khai thí nghiệm chủng vi khuẩn cho cây lúa cao
sản trồng ngoài đồng; cảm ơn các học viên cao học và các sinh viên đã có sự cộng tác
trong thời gian qua.
Chân thành cảm ơn Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp cơ sở đã có những ý
kiến nhận xét và góp ý giúp cho luận án được hoàn chỉnh hơn trước khi trình phản biện
kín và bảo vệ luận án cấp Trường; cảm ơn hai nhà khoa học đã tham gia phản biện kín
cho luận án tiến sĩ; xin cảm ơn Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường.

Cảm ơn gia đình và những người thân đã chia sẻ, động viên và tạo điều kiện
thuận lợi để tôi được an tâm học tập và hoàn thành luận án tiến sĩ.
Xin chân thành cảm ơn!
Ngô Thanh Phong


iii

TÓM LƯỢC
Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas spp. bón
cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện từ tháng 11 năm
2008 đến tháng 9 năm 2011. Những nội dung của đề tài đã được thực hiện nhằm đạt đến
mục tiêu tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. có khả năng cố định
đạm hữu hiệu với cây lúa cao sản. Kết quả nghiên cứu của đề tài đã đạt được như sau:
Phân lập được 150 dòng vi khuẩn cố định đạm từ 130 mẫu đất vùng rễ lúa của
13 tỉnh thành ở đồng bằng sông Cửu Long trên môi trường Pseudomonas Isolation
Agar (Difco). Tất cả 150 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH
4
+
trong đó có
86/150 dòng có khả năng tổng hợp NH
4
+
cao hơn 5 mg/l.
Các dòng tổng hợp NH
4
+
cao được phân tích PCR-16S rRNA với cặp mồi đặc
hiệu FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 để nhận diện Pseudomonas. Kết quả có 55/86
dòng vi khuẩn có băng ở vị trí 1500 bp so với thang chuẩn. Tiếp tục phân tích PCR-

nifH rRNA với cặp mồi đặc hiệu PolF-115 và PolR-476 để nhận diện Pseudomonas có
đoạn gen nifH , đã phát hiện 32/55 dòng vi khuẩn có băng tương ứng 361 bp so với
thang chuẩn.
Chọn 20 trong số 32 dòng vi khuẩn có đoạn gen nifH để kiểm chứng lại khả
năng cố định nitơ và cả 20 dòng vi khuẩn đều biểu hiện hoạt tính của nitrogenase
thông qua phương pháp khử acetylene (ARA). Đánh giá hiệu quả của 20 dòng vi
khuẩn này lên chiều cao và trọng lượng khô của cây lúa cao sản trồng trong dung dịch
khoáng (không sử dụng đạm) trong 20 ngày, đã chọn được 6 dòng vi khuẩn có độ hữu
hiệu cao để tiến hành thí nghiệm trên cây lúa cao sản trồng trong chậu ở nhà lưới. Kết
quả thí nghiệm đã xác định được 6 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp 25 – 75% nhu
cầu đạm sinh học cho sự phát triển của cây lúa trồng trong chậu.
Chọn 11 dòng vi khuẩn hữu hiệu nhất (bao gồm 6 dòng hiệu quả với cây lúa
trồng trong chậu và 5 dòng khác cũng có triển vọng cố định đạm cao) để tiến hành
định danh. Sử dụng cặp mồi PST3422-5 và PST3422-580 (được thiết kế nhận diện gen
nifH của Pseudomonas stutzeri A1501), đã phát hiện 4/11 dòng có băng tương ứng
575 bp và tương đồng với băng của dòng vi khuẩn đối chứng là Pseudomonas stutzeri
A1501 trong phổ điện di của các sản phẩm PCR. Kết quả giải trình tự DNA và so sánh
với ngân hàng dữ liệu NCBI cho thấy cả 4 dòng này đều tương đồng di truyền 98-99%


iv

so với Pseudomonas stutzeri. Trong đó, hai dòng AG9 và BT2 tương đồng 99%, hai
dòng TG1 và BT1 tương đồng 98% với dòng CP000304.1 Pseudomonas stutzeri
A1501 và dòng CP002881.1 Pseudomonas stutzeri ATCC 17588. DNA của 7/11 dòng
vi khuẩn còn lại được tiếp tục giải trình tự (theo sản phẩm PCR dựa trên cặp mồi
FGPS4-281bis và FGPS1509’-153 tương ứng với đoạn 16S rRNA của Pseudomonas)
và so sánh với các dòng có trong ngân hàng dữ liệu NCBI. Kết quả cho thấy cả 7 dòng
này đều tương đồng di truyền 97-100% so với các loài thuộc giống Burkholderia.
Trong đó, dòng CT1 tương đồng 100% với dòng AB568313.1 Burkholderia

vietnamiensis 16S-rRNA, dòng VL2 tương đồng 99% với FJ436055.1 Burkholderia
vietnamiensis dòng SYe-6586, dòng KG14 tương đồng 99% với DQ979871.1
Burkholderia vietnamiensis dòng AU0829, dòng VL8 tương đồng 98% với
EF158393.1 Burkholderia vietnamiensis dòng TVV75, dòng KG1 tương đồng 98%
với DQ979872.1 Burkholderia vietnamiensis dòng AU0913, dòng CM1 và KG8 cùng
tương đồng 97% với AY098590.1 Burkholderia kururiensis dòng KP23 (dòng KG8
cũng tương đồng 97% với AY098588.1 Burkholderia brasilensis dòng M113) có trong
ngân hàng dữ liệu NCBI.
Thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện để đánh giá khả năng cố định đạm của 4
dòng vi khuẩn P. stutzeri PS1 (TG1), P. stutzeri PS4 (BT1), B. vietnamiensis BV3
(KG1) và B. vietnamiensis BV5 (CT1) (được chọn lọc từ 6 dòng vi khuẩn đã thí
nghiệm trong nhà lưới) trên cây lúa cao sản (OM2517) trồng trên đất phù sa tại nông
trường Sông Hậu – Cần Thơ vào vụ Hè Thu 2011. Kết quả cho thấy từng dòng vi
khuẩn P. stutzeri PS4 và B. vietnamiensis BV3 đều cung cấp đến 50% đạm sinh học
trong khi dòng P. stutzeri PS1 và B. vietnamiensis BV5 chỉ cung cấp được 25% nhu
cầu đạm sinh học cho sự phát triển của cây lúa cao sản.
Từ khóa: Burkholderia vietnamiensis, cố định đạm sinh học, đất phù sa, đất vùng rễ,
gen nif, lúa cao sản, Pseudomonas stutzeri






v

SUMMARY
Thesis "Isolation and selection of nitrogen-fixing bacteria Pseudomonas
spp., it’s application on high-yielding rice cultivated on the alluvial soil of the
Mekong Delta" was done from November 2008 to September 2011. The aim of this

study was isolation and selection Pseudomonas spp. strains with the high biological
nitrogen fixation (BNF) ability to apply to high-yielding rice cultivated on the soil of
the Mekong Delta. The results achieved as follows:
One hundred and fifty isolates were isolated from 130 soil samples (rice
rhizosphere soils of 13 provinces in Mekong Delta). All of them were able to
synthesize NH
4
+
, 86/150 isolates synthesized NH
4
+
higher than 5 mg/l.
The effective isolates (high NH
4
+
biosynthesis) were analysed by PCR-16S
rRNA technique with primers FGPS4-281bis and FGPS1509'-153 to identify
Pseudomonas spp. The results showed that 55/86 isolates having band at 1500 bp in
comparision to standard ladder; 32/55 isolates were determined nifH gene with PCR
technique with specific primer PolF-115 and PolR-476 which had band at 361 bp in
electrophoresis gel.
Twenty isolates in 32 isolates had high nitrogenase activity through ARA
method. Screening of 20 isolates by evaluation of 20 isolates’s effectiveness on rice
cultivated mineral solution free N in 20 days (in-vitro), the results showed that six
isolates having high BNF ability manifested on height and dry weight of high-yielding
rice. With in-pots experiment, these six isolates provided 25 to 75% nitrogen
requirement in the rice growth.
Using primer PST3422-5 and PST3422-580 in PCR technique identified 4/11
isolates having band 575 bp together with reference strain (P. stutzeri A1501) in
electrophoresis. Isolates were sequenced, DNA sequencing were compared with

GenBank database of NCBI by BLAST N software; the results showed that four
isolates were similarity of 98-99% with P. stutzeri, such as AG9 and BT2 strains were
similarity of 99%, TG1 and BT1 strains were similarity of 98% with both strains
CP000304.1 Pseudomonas stutzeri A1501 and CP002881.1 Pseudomonas stutzeri
ATCC 17588. Besides that, seven isolates were further sequenced with DNA from
PCR-16S rRNA products, the results showed that all of them were 97-100% similarity


vi

with species of the genus Burkholderia, such as CT1 strain was similarity of 100%
with AB568313.1 Burkholderia vietnamiensis 16S-rRNA, VL2 strain was similarity of
99% with FJ436055.1 Burkholderia vietnamiensis strain SYe-6586, KG14 strain was
similarity of 99% with DQ979871.1 Burkholderia vietnamiensis strain AU0829, VL8
strain was similarity of 98% with EF158393.1 Burkholderia vietnamiensis strain
TVV75, KG1 strain was similarity of 98% with DQ979872.1 Burkholderia
vietnamiensis strain AU0913, two strains CM1 and KG8 strain were similarity of 97%
with AY098590.1 Burkholderia kururiensis strain KP23 (in which one isolates the
identity 97% with AY098588.1 Burkholderia brasilensis strain M113) in the GenBank
database of NCBI.
A field experiment was conducted to evaluate biological nitrogen fixation
ability of four isolates (P. stutzeri PS1, P. stutzeri PS4, B. vietnamiensis BV3 and B.
vietnamiensis BV5 and they were selected from in-vitro and in-pots experiments) on
high-yielding rice (OM2517) cultivated on alluvial soil of Song Hau farm, Can Tho
city in Summer-Autumn cropping-season 2011. The results showed that PS4 strain
and/or BV3 strain had biological nitrogen fixation ability equivalent to 50% inorganic
fertilizer while two strains (PS1 and/or BV5) only provided 25% nitrogen requirement
for rice growth.

Keywords: alluvial soil, biological nitrogen fixation, Burkholderia vietnamiensis,

high-yielding rice, nif gene, Pseudomonas stutzeri, rhizosphere soil

vii
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
TÓM LƢỢC iii
SUMMARY v
MỤC LỤC vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi
DANH SÁCH BẢNG xii
DANH SÁCH HÌNH xiii
CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU – TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
.1. Tính cấp thiết của đề tài 1
.2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 3
.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4
.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 4
.5. Những đóng góp của luận án 5
.6. Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học 6
CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cố định đạm sinh học ……………… 7
2.1.1. Khái quát về cố định đạm sinh học 7
2.1.2. Chu trình nitơ ………… 8
2.1.3. Vi khuẩn cố định đạm sống tự do ………………… 10
2.2. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas 11
2.2.1. Đặc điểm của Pseudomonas 11
2.2.2. Phân loại Pseudomonas 13
2.2.3. Những loài Pseudomonas có khả năng cố định đạm 15
2.2.4. Phân lập và xác định Pseudomonas 16

2.3. Cơ chế cố định đạm của Pseudomonas 17

viii
2.3.1. Enzyme nitrogenase 17
2.3.2. Bộ gen của Pseudomonas và sự điều khiển tổng hợp nitrogenase 20
2.3.3. Cơ chế cố định đạm 24
2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm 25
2.4. Ứng dụng cố định đạm của Pseudomonas 28
2.4.1. Một số ứng dụng 28
2.4.2. Triển vọng ứng dụng Pseudomonas trong tương lai 30
2.5. Vai trò của đạm đối với cây lúa 31
CHƢƠNG III: NỘI DUNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
3.1. Nội dung nghiên cứu 33
3.2. Phương tiện nghiên cứu 33
3.2.1. Vật liệu 33
3.2.2. Dụng cụ 34
3.2.3. Thiết bị 34
3.2.4. Các loại hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn 35
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Thu mẫu đất vùng rễ lúa 38
3.3.2. Phân lập vi khuẩn cố định đạm từ đất vùng rễ lúa 38
3.3.3. Xác định khả năng cố định đạm (in-vitro) của vi khuẩn 40
3.3.3.1. Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Burk không đạm 40
3.3.3.2. Đo hàm lượng NH
4
+
bằng phương pháp Phenol – Nitroprusside 41
3.3.3.3. Thử hoạt tính nitrogenase bằng phương pháp khử acetylen (ARA) 42
3.3.4. Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 43

3.3.4.1. Tách chiết DNA (Neumann et al., 1992) 43
3.3.4.2. Khuếch đại DNA 45
3.3.4.3. Điện di các sản phẩm PCR 46
3.3.4.4. Chụp hình gel điện di chứa sản phẩm phản ứng PCR 46
3.3.4.5. Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI 47

ix
3.3.5. Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học của các dòng vi khuẩn
với cây lúa cao sản 47
3.3.5.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn lên cây lúa trồng trong ống nghiệm 47
3.3.5.2. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa trồng trong chậu 49
3.3.5.3. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa ngoài đồng 50
3.3.6. Khảo sát mật số vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường lỏng 51
3.3.7. Thống kê, xử lý và phân tích số liệu ……………………………… 52
CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thu mẫu đất vùng rễ lúa 53
4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm 53
4.2.1. Các dòng vi khuẩn đã được phân lập ………………………………… 53
4.2.2. Đặc điểm của khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn …………………………. 54
4.3. Kết quả đánh giá khả năng cố định đạm của vi khuẩn 56
4.3.1. Khả năng tổng hợp NH
4
+
…………………………………………… 56
4.3.2. Hoạt tính nitrogenase ………………………………………… 60
4.4. Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 63
4.4.1. Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR 63
4.4.2. Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI 65
4.5. Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản 72
4.5.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn với cây lúa trồng trong ống nghiệm …… 72

4.5.2. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa trong chậu … 73
4.5.3. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa ngoài đồng 77
CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận 87
5.2. Đề nghị 88
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 89
TÀI LIỆU THAM KHẢO 90

x
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Một số loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn a
Phụ lục 2: Môi trường trích DNA và phản ứng PCR b
Phụ lục 3: Chuẩn bị gel agarose và điện di d
Phụ lục 4: Qui trình giải trình tự DNA e
Phụ lục 5: Phân bón cho cây lúa thí nghiệm trong chậu và ngoài đồng h
Phụ lục 6: Phân tích đạm tổng số bằng phương pháp micro-Kjeldahl j
Phụ lục 7: Đường chuẩn đo NH
4
+
k
Phụ lục 8: Bảng kết quả thu mẫu đất vùng rễ lúa và phân lập vi khuẩn k
Phụ lục 9: Bảng đặc điểm khuẩn lạc và hình dạng tế bào của 150 dòng vi khuẩn…. m
Phụ lục 10: Khả năng phát triển và tổng hợp NH
4
+
của 150 dòng vi khuẩn p
Phụ lục 11: Xử lý số liệu của thí nghiệm trồng lúa in-vitro u
Phụ lục 12: Xử lý số liệu của các thí nghiệm trong chậu (in-pots) w
Phụ lục 13: Xử lý số liệu của các thí nghiệm ngoài đồng aa
Phục lụ 14: Trình tự DNA của các dòng vi khuẩn BV và BK ………………… hh

Phụ lục 15: Bảng kết quả khử acetylen của 20 dòng vi khuẩn ……………………. oo


xi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT


16S-rRNA/DNA gene 16S-ribosomal RNA/DNA coding gene
ARA Acetylene reduction assay
BNF Biological nitrogen fixation
Blast Basic local alignmeht search tool
BV, BK Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia kururiensis
DNA, rRNA Deoxyribonucleic acid, ribosomal ribonucleic acid
dNTP Deoxy nucleoside triphotphate
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EtBr Ethidium Bromide
Gen nif Nitrogen fixing gene
HG, ST, BL, CM Hậu Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau
KG, AG, ĐT, TV Kiên Giang, An Giang, Đồng Tháp, Trà Vinh
LA, TG, VL, BT, CT Long An, Tiền Giang. Vĩnh Long, Bến Tre, Cần Thơ
NCBI National centre for biotechnology information
NT Nghiệm thức
PCR Polymerase chain reaction
PS Pseudomonas stutzeri




xii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang



3.1
Bảng số liệu xây dựng đường chuẩn NH
4
+
41
3.2
Các nghiệm thức trồng lúa trong ống nghiệm
48
3.3
Các nghiệm thức trồng lúa trong chậu
49
3.4
Các nghiệm thức trồng lúa ngoài đồng
50
4.1
Các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông
Cửu Long
53
4.2
Tỉ lệ phần trăm về các đặc điểm khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn
55

4.3
Bảng tổng hợp sự phát triển và khả năng tổng hợp NH
4
+
của các dòng
vi khuẩn trong môi trường Burk lỏng không đạm
58
4.4
Mật số vi khuẩn (sau 2 ngày nuôi cấy) và hàm lượng NH
4
+
được tổng
hợp ở 20 dòng vi khuẩn
60
4.5
Hàm lượng NH
4
+
(mg/l) và hàm lượng nitrogenase (mM) được tổng
hợp ở 10 dòng vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy (đợt 1)
61
4.6
Hàm lượng NH
4
+
(mg/l) và hàm lượng nitrogenase (mM) được tổng
hợp ở 10 dòng vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy (đợt 2)
62
4.7
Hiệu quả của 20 dòng vi khuẩn lên chiều cao và trọng lượng khô cây

lúa ở giai đoạn 20 ngày tuổi
73
4.8
Hiệu quả của 6 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học trên thành phần
năng suất và năng suất lúa cao sản (thí nghiệm trong chậu)
75
4.9
Khả năng cố định đạm sinh học của 6 dòng vi khuẩn cho nhu cầu sinh
trưởng và phát triển của cây lúa cao sản (OM2517) (thí nghiệm trồng
lúa trong chậu)
77
4.10
Hiệu quả của 4 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học trên thành phần
năng suất lúa cao sản (OM2517) trồng trên đất phù sa nông trường Sông
Hậu, huyện Cờ Đỏ, Cần Thơ (vụ Hè Thu 2011)

78




xiii

DANH SÁCH HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
2.1
Chu trình nitơ

9
2.2
Quan hệ tương tác giữa vi sinh vật và thực vật ảnh hưởng đến sự tăng
trưởng của thực vật
10
2.3
Một số nguồn nitơ cung cấp cho cây
11
2.4
Pseudomonas dưới kính hiển vi điện tử
12
2.5
Khuẩn lạc của Pseudomonas stuzeri và Pseudomonas fluorescens
15
2.6
Cây di truyền (phylogenetic tree) biểu diễn mức độ tương quan di
truyền giữa các loài Pseudomonas dựa vào kết quả phân tích di truyền
phân tử
16
2.7
Cây di truyền (phylogenetic tree) của các loài Burkholderia
17
2.8
Nitrogenase có khả năng xúc tác chuyển hóa, khử N
2
thành NH
3

18
2.9

Các thành phần protein cấu thành nitrogenase
19
2.10
“Vùng cố định đạm” (nitrogen fixation region) của Pseudomonas
stutzeri A1501
22
2.11
Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định đạm sinh học
25
2.12
Các phản ứng cố định đạm trong nitrogenase
26
3.1
Sơ đồ phân lập vi khuẩn từ mẫu đất vùng rễ lúa cho đến khi trữ ròng
40
3.2
Các ống nghiệm xây dựng đường chuẩn đo ammonium
42
3.3
Trồng lúa trong dung dịch khoáng có bổ sung 0,8% agar
48
3.4
Sơ đồ pha loãng mật số vi khuẩn
51
4.1
Hình ảnh một số khuẩn lạc (Theo thứ tự từ trái qua phải là các dòng
vi khuẩn TG7, BL4, LA7)
55
4.2
Dòng KG7 được chụp dưới kính hiển vi điện tử quét JSM 5500 ở độ

phóng đại 8500 lần
56
4.3
Dòng VL2 được chụp dưới kính hiển vi điện tử quét JSM 5500 ở độ
phóng đại 10000 lần
56
4.4
Mức độ tổng hợp NH
4
+
của các dòng vi khuẩn
57
4.5
Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi
khuẩn Pseudomonas với cặp mồi tổng (M: thang chuẩn 100bp plus)
63

xiv

Hình
Tên hình
Trang
4.6
Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi
khuẩn với cặp mồi xác định gen nifH (Thang chuẩn 100bp)
64
4.7
Phổ điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của 5 dòng P.
stutzeri A1501 (PS5), TG1, AG9, BT2 và BT1
65

4.8
So sánh trình tự DNA của dòng PS1 với GenBank
66
4.9
So sánh trình tự DNA của dòng PS2 với GenBank
66
4.10
So sánh trình tự DNA của dòng PS3 với GenBank
67
4.11
So sánh trình tự DNA của dòng PS4 với GenBank
67
4.12
So sánh trình tự DNA của dòng PS5 – Pseudomonas stutzeri A1501
(dòng vi khuẩn đối chứng) với GenBank
68
4.13
So sánh trình tự của 5 dòng P. stutzeri (PS1, PS2, PS3, PS4 và PS5)
với nhau cho thấy dòng PS1 và PS3 chỉ khác nhau 3 vị trí; dòng PS4
khác PS2 và PS5 (A1501) ở 8 vị trí.
69
4.14
Cây phả hệ (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ về mặt di truyền
giữa 4 dòng vi khuẩn với dòng chuẩn P. stutzeri A1501
70
4.15
Hiệu quả của vi khuẩn PS1 và phân đạm hóa học trên sự phát triển
của cây lúa và PS4 lên chiều cao cây lúa cao sản OM2517
77
4.16

Ruộng lúa thí nghiệm tại Nông trường Sông Hậu (trái) và các bụi lúa
ở các nghiệm thức chủng P. stutzeri PS4 (phải) được 89 ngày sau khi
gieo sạ (trước khi thu hoạch 1 ngày).
79
4.17
Hiệu quả của 4 chủng vi khuẩn và phân đạm hóa học trên năng suất
lúa cao sản (tấn/ha) trồng trên đất phù sa Nông trường Sông Hậu, Cần
Thơ (vụ Hè Thu 2011).
80
4.18
Tương quan tuyến tính giữa chiều cao cây và số bông/m
2
với năng
suất lúa ở mức ý nghĩa 5%
81
4.19
Hiệu quả của 4 chủng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên hàm lượng
protein trong gạo (%)
82
4.20
Tương quan tuyến tính giữa hàm lượng protein trong gạo (%) với
năng suất lúa (tấn/ha) ở mức ý nghĩa 5%
83
4.21
Hiệu quả của 4 chủng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên nitơ tổng số
(%) của đất trồng lúa ở Nông trường Sông Hậu, Cần Thơ
84

xv

1

CHƢƠNG I
MỞ ĐẦU - TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI
.1. Tính cấp thiết của đề tài
Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích gần 4 triệu ha, trong đó có 1,7 triệu ha đất
nông nghiệp được sử dụng để trồng lúa với diện tích canh tác lúa hàng năm lên đến 3,9
triệu ha (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2008). Phân bón nói chung và phân đạm
hoá học nói riêng đã góp phần quan trọng trong việc gia tăng năng suất cây trồng. Để
đảm bảo năng suất, nông dân đã sử dụng rất nhiều phân bón nhưng hiện nay giá cả
phân bón hóa học ngày càng tăng cao làm tăng giá thành sản xuất và giảm hiệu quả
kinh tế trong nông nghiệp. Sự lạm dụng phân đạm hóa học sẽ dẫn đến chi phí cao,
đồng thời cũng sẽ dẫn đến những hậu quả như thay đổi lý, hóa tính của đất, giảm độ
phì, mất cân bằng sinh thái gây ảnh hưởng tiêu cực lên hệ sinh thái nên không đảm bảo
thân thiện với môi trường canh tác trong nông nghiệp (Kannaiyan, 1999). Theo Võ Minh
Kha (2003), cây lúa hấp thu chỉ khoảng 50-60% lượng đạm được bón vào trong đất. Số
còn lại sẽ được lưu tồn trong đất hoặc bị rửa trôi gây hưởng đến môi trường nước. Bón
quá nhiều phân đạm hóa học cho cây trồng đã góp phần dẫn đến chi phí sản xuất cao, hiệu
quả kinh tế thấp, đồng thời không đảm bảo cho một hệ sinh thái phát triển bền vững.
Để khắc phục những tác hại do sử dụng quá nhiều phân đạm hóa học thì việc sử
dụng phân đạm sinh học có chứa các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm (BNF:
biological nitrogen fixation) là một trong những biện pháp có hiệu quả mà không gây
ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí sản xuất nhưng vẫn đảm bảo chất lượng đồng
thời vẫn tăng năng suất nông sản. Việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn cố định đạm
sinh học đã và đang là những đề tài được nghiên cứu rộng rãi khắp thế giới. Những vi
khuẩn cố định đạm đã được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng như vi khuẩn
Rhizobium (
Keyser và ctv., 1982; Scholla và Elkan, 1984)

; Bradyrhizobium cố định
đạm với cây họ đậu
(Elkan, 1992; Dowdlé và Bohlool, 1987; Buendia-Clavaria và ctv.,
1994)
; vi khuẩn Azospirillum
có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và

2

các chất dinh dưỡng khác (Bilal và ctv., 1990; Seshadri và ctv., 2000; Somers và ctv.,
2005; Lăng Ngọc Dậu và ctv., 2007), loài Azospirillum lipoferum cũng đã được phân
lập từ cây lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2007); vi khuẩn
Azotobacter có khả năng cố định đạm (Döbereiner, 1974), như loài Azotobacter
paspali là loài vi khuẩn nội sinh đặc hiệu cho cây cỏ Paspalum notatum và khoai lang
(Döbereiner, 1976); vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có một số đặc tính
như cố định đạm, tổng hợp kích thích tố tăng trưởng ở thực vật (phytohormone) như
auxin và gibberellin, làm giảm độ pH môi trường để hòa tan lân khó tan (Bastian và
ctv., 1998; Muthukumarasamy và ctv., 2002a; Tejera và ctv., 2003; Madhaiyan và ctv.,
2004), chúng thường hiện diện ở đất quanh rễ cây cà phê, khóm, lúa, khoai lang
(Jimenaz-Salgalo và ctv., 1997; Hernandez và ctv., 2000; Muthukumarasamy và ctv.,
2002b) đồng thời cũng xác định được nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định đạm
mạnh mẽ làm tăng sản lượng mía đường, khóm, khoai lang (Prabudoss và Stella,
2009); vi khuẩn Burkholderia có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần với những cây
họ đậu vùng nhiệt đới (Mounlin và ctv., 2001), cộng sinh với nhiều loại cây trồng giúp
cố định đạm và kích thích sự tăng trưởng khi chúng hiện diện ở đất quanh vùng rễ và
trong rễ của một số loại cây trồng như bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpella và ctv., 2003;
Chen và ctv., 2006), khóm, chuối (Weber và ctv., 1999) và loài Burkholderia
vietnamiensis đã được tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Việt Nam (Gillis và
ctv., 1995); Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng
và phát triển thực vật như tổng hợp kích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin,

kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng
trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas syringae (Glickmann et al, 1998; Patten và Glick, 1987; Suzuki và ctv.,
2003; Xie và ctv., 1996), hòa tan lân ở dạng khó tan thành dạng dễ tan giúp cây trồng
hấp thụ như: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas
chlororaphis (Cattenlla và ctv., 1999), cố định đạm như Pseudomonas stutzeri
(Krotzky và Werner, 1987).

3

Các loài thuộc giống Pseudomonas có khả năng cố định đạm đã được khẳng định
từ lâu (Chan và ctv., 1994), trong đó có Pseudomonas stutzeri (Krotzky và Werner,
1987; Vermeiren, 1999). Ngoài ra, các nhà khoa học cũng đã xác định một số loài vi
khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm và giúp tăng năng
suất lúa (Gillis và ctv., 1995; Tran Van và ctv., 2000; Nguyễn Ngọc Dũng và ctv.,
2000).
Hiện nay, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu và sử dụng các chủng vi khuẩn
cố định đạm sinh học. Việc nghiên cứu ứng dụng các chủng vi khuẩn có khả năng cố
định đạm hữu hiệu bón cho cây lúa ở đồng bằng sông Cửu Long mang tính cấp thiết
nhằm góp phần giảm sử dụng phân đạm hóa học cho cây lúa nhưng vẫn giữ vững năng
suất, bảo vệ môi trường và góp phần đảm bảo cho sự phát triển nông nghiệp bền vững
trong khu vực. Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm
Pseudomonas spp. bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu Long” được
thực hiện nhằm nhận diện và xác định được những dòng Pseudomonas spp. có khả năng
cố định đạm hữu hiệu trên cây lúa cao sản.
.2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu
- Mục tiêu chính: Chọn lọc được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas spp.
mang gen nif có khả năng cố định đạm hữu hiệu, cung cấp 25-50% nhu cầu
đạm cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa cao sản.

- Mục tiêu cụ thể: (1) Phân lập và tách ròng các dòng Pseudomonas bản địa
có trong đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông Cửu Long làm nguồn vi khuẩn cố
định đạm với cây lúa cao sản; (2) Khảo sát đặc điểm, khả năng cố định đạm
sinh học và nhận diện vi khuẩn Pseudomonas trên các mức độ hình thái, hóa
sinh và sinh học phân tử (DNA); (3) Đánh giá hiệu quả cố định đạm của các
dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản ở mức độ in-vitro cho đến nhà lưới và
ngoài đồng ruộng.

4

1.2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Phân lập vi khuẩn Pseudomonas spp. từ đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông
Cửu Long dựa trên môi trường chuyên biệt, đồng thời kiểm tra và nhận diện
các dòng vi khuẩn bằng các phương pháp hóa sinh và phương pháp sinh học
phân tử.
- Xác định sự hiện diện gen nif và đánh giá khả năng cố định đạm của các
dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. đã phân lập được.
- Chọn lọc các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. dựa trên cơ sở các thí
nghiệm in-vitro và trong nhà lưới để tiến hành xác định hiệu quả cố định
đạm của các dòng vi khuẩn trên cây lúa cao sản trồng ở ngoài đồng.
.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài: các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. có khả
năng cố định đạm với cây lúa cao sản.
Phạm vi nghiên cứu: các dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. bản địa được phân
lập từ đất vùng rễ lúa trồng ở 13 tỉnh thành đồng bằng sông Cửu Long, có mang gen
nif và có khả năng cố định đạm hữu hiệu với cây lúa cao sản trồng ở trên đất phù sa
Nông trường Sông Hậu, huyện Cờ Đỏ, Cần Thơ.
.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
1.4.1. Thời gian nghiên cứu
- Quyết định công nhận Nghiên cứu sinh số 6919/QĐ-BGDĐT ngày 15/10/2008

của Bộ trưởng Bộ Giáo dục và Đào tạo.
- Thời gian đào tạo theo hệ không tập trung là 4 năm (11/2008 – 11/2012), theo
Quyết định giao đề tài và người hướng dẫn Nghiên cứu sinh số 468/QĐ-ĐHCT
ngày 13/11/2008 và Quyết định cử cán bộ, viên chức đi đào tạo Nghiên cứu

5

sinh số 1878/QĐ-ĐHCT ngày 25/12/2008 của Hiệu Trưởng trường Đại Học
Cần Thơ.
- Thời gian nghiên cứu thực tế của nghiên cứu sinh cho đến khi hoàn thành các
nội dung nghiên cứu theo đề cương của đề tài: 11/2008 – 9/2011.
1.4.2. Địa điểm nghiên cứu
- Các ruộng lúa được thu mẫu đất vùng rễ ở 13 tỉnh thành đồng bằng sông Cửu
Long.
- Phòng thí nghiệm Sinh học tế bào và Nhà lưới thuộc Khoa Khoa Học Tự
Nhiên; Phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất và Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử
thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học; Phòng thí nghiệm
Chuyên sâu thuộc Phòng Quản Lý Khoa Học, trường Đại Học Cần Thơ.
- Ruộng lúa của ông Đào Văn Sơn, nông dân ở ấp 3, xã Thới Hưng (Nông trường
Sông Hậu), huyện Cờ Đỏ, TP. Cần Thơ.
.5. Những đóng góp của luận án
- Phân lập được 150 dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông Cửu
Long bằng môi trường Pseudomonas Isolation Agar (Difco). Dùng phương
pháp Phenol – Nitroprusside đã xác định được 150 dòng vi khuẩn này đều có
khả năng tổng hợp NH
4
+
, trong đó có 18 dòng tổng hợp được lượng NH
4
+

trên
10 mg/l, góp phần tìm ra nguồn vi sinh vật cố định đạm sinh học cung cấp cho
cây lúa cao sản.
- Xác định được sự hiện diện của gen nifH ở 32 dòng vi khuẩn, trong đó có 11
dòng vi khuẩn triển vọng được giải trình tự DNA, gồm có 4 dòng vi khuẩn
được xác định tương đồng 98-99% với Pseudomonas stutzeri, 5 dòng vi khuẩn
được xác định tương đồng 98-100% với Burkholderia vietnamiensis và 2 dòng
được xác định tương đồng 97% với Burkholderia kururiensis, trong đó có 1
dòng còn tương đồng 97% với Burkholderia brasilense [theo Yabuuchi và ctv.

6

(1992), Burkholderia được phân loại từ việc xác định và tách ra từ một số dòng
vi khuẩn Pseudomonas ban đầu].
- Sử dụng 6 dòng vi khuẩn có triển vọng ứng dụng cố định đạm để chủng cho cây
lúa trồng trong chậu, đã xác định được 6 dòng này đều có khả năng cung cấp
25-75% nhu cầu đạm sinh học cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa cao
sản OM2517 trồng trong chậu. Có 4/6 dòng vi khuẩn triển vọng trong chậu
được thí nghiệm chủng cho cây lúa cao sản trồng ở Nông trường Sông Hậu –
Cần Thơ. Kết quả cho thấy từng dòng vi khuẩn P. stutzeri PS4 (TG1) và B.
vietnamiensis BV3 (KG1) đều có khả năng cung cấp đến 50%N trong khi dòng
P. stutzeri PS1 (BT1) và B. vietnamiensis BV5 (CT1) đảm bảo được 25% nhu
cầu đạm cho sự phát triển của cây lúa cao sản.
.6. Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học
- Đồng bằng sông Cửu Long hiện đang trồng nhiều giống lúa cao sản và những
nghiên cứu gần đây cũng cho thấy có sự hiện diện của Pseudomonas spp. ở
vùng rễ của nhiều loại cây trồng trong đó có cây lúa cao sản. Tuy nhiên, việc
xác định khả năng cố định đạm hữu hiệu của vi khuẩn Pseudomonas spp. trên
cây lúa cao sản vẫn còn hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas
spp. đang được quan tâm, đặc biệt là tìm hiểu về khả năng cố định đạm với sự

hiện diện của gen nifH ở các dòng vi khuẩn này.
- Giá thành phân hóa học trên thị trường hiện đang tăng cao là gánh nặng cho
nông dân, đồng thời việc sử dụng nhiều phân hóa học sẽ dẫn đến ô nhiễm môi
trường, không đảm bảo sự phát triển bền vững, ảnh hưởng đến sự phát triển
kinh tế xã hội. Vì vậy, hiện nay có các cơ sở sản xuất đang chú ý đến phương
án sản xuất phân sinh học. Do đó, nghiên cứu và tuyển chọn các dòng vi khuẩn
Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm hữu hiệu, dễ nhân nuôi với giá
thành rẻ bón cho cây lúa cao sản là hướng nghiên cứu cần thiết.

7
CHƢƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cố định đạm sinh học
2.1.1. Khái quát về cố định đạm sinh học
Cố định đạm sinh học là quá trình khử N
2
thành NH
3
dưới sự xúc tác của
enzyme nitrogenase. Sau đó, NH
3
có thể kết hợp với các acid hữu cơ để tạo thành các
acid amin và protein. Trong thực tế chỉ có một số ít loài vi sinh vật có khả năng cố
định N
2
không khí, đó là vi khuẩn lam (cyanobacteria) và một số vi khuẩn có khả năng
cố định đạm. Vi khuẩn cố định đạm có thể cộng sinh với những cây họ đậu như giống
vi khuẩn Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium
và Allorhizobium, Methylobacterium (Tan và ctv., 2001; Sy và ctv., 2001); vi khuẩn
cố định đạm cũng có thể sống tự do như Azotobacter, Beijerinckia, Klebsiella,

Pseudomonas… hoặc có thể sống tự do nhưng cũng có thể nội sinh như Burkholderia
(Mattos và ctv., 2008).
Quá trình cố định đạm xảy ra trong tế bào của các vi sinh vật đều giống nhau là
nhờ chúng có hệ thống gen nif (ni là chữ viết tắt của nitrogen – nitơ và f là fixing – cố
định) điều khiển quá trình tổng hợp enzyme nitrogenase. Nitrogenase là hệ enzyme
xúc tác cho phản ứng khử N
2
thành NH
3
. Như vậy, hệ thống gen nif được xem là hệ
thống gen điều khiển cho quá trình cố định đạm sinh học. Tuy nhiên, ở vi khuẩn lam,
quá trình cố định đạm không phải xảy ra ở bất kỳ tế bào nào mà chỉ có thể xảy ra ở dị
bào (heterocyst) (Heldt, 1999).
Trong tự nhiên có những nhóm vi sinh vật có khả năng cố định N
2
từ không khí
để cố định thành đạm sinh học cung cấp cho cây. Những vi sinh vật này có một hệ
thống sinh hóa chuyên biệt. Vấn đề này có ý nghĩa to lớn và vô cùng quan trọng trong
nông nghiệp, vì vi sinh vật có thể cố định nitơ từ không khí (chiếm 78,16% theo thể
tích và 75,5% theo khối lượng bầu khí quyển) mà cây trồng không trực tiếp hấp thu

8
được (Nester và ctv., 2004). Theo Hardy và ctv., (1973), lượng đạm mà các vi sinh vật
trên trái đất có thể cố định hàng năm lên đến 175x10
6
tỉ tấn.
Phản ứng cố định đạm sinh học xảy ra được ở một số vi sinh vật là nhờ sự xúc
tác của một hệ enzyme chuyên biệt là nitrogenase. Enzyme này xúc tác phản ứng biến
đổi đạm ở thể khí (N
2

) thành ammonia (NH
3
). Nitrogenase được tìm thấy trong quá
trình cố định đạm của vi khuẩn háo và yếm khí là một phức hệ bao gồm hai protein,
trong đó protein nhỏ chứa Fe và protein lớn hơn chứa Fe và Mo (Bothe và Neuer,
1988).
Theo Evans và Barber (1977) thì quá trình cố định đạm xảy ra như sau:
Nitrogenase
N
2
+6H
+
+6e 2NH
3
NH
3
sẽ kết hợp acid hữu cơ tạo thành amino acid rồi thành protein:
NH
3
+ Acid hữu cơ Amino acid Protein
Cố định đạm sinh học có thể được trình bày theo phương trình sau đây, trong đó
2 phân tử ammonium được sản xuất từ 1 phân tử N
2
cùng với 16ATP, 8 điện tử và 8
ion H
+
: N
2
+ 8H
+

+ 8e
−
+ 16ATP → 2NH
3
+ H
2
+ 16ADP + 16Pi
2.1.2. Chu trình nitơ
Chu trình nitơ là quá trình biến đổi của nitơ trong sinh quyển, trong đó nitơ xuất
hiện dưới nhiều dạng tự do hay kết hợp (nitơ phân tử trong khí quyển, các nitrit, nitrat,
amoni, protein, acid amin ). Không khí chứa 78% nitơ phân tử (N
2
). Khí nitơ này có
thể được các vi sinh vật cố định như những vi sinh vật cộng sinh với thực vật bậc cao
hoặc sống tự do trong đất, đặc biệt là đất vùng rễ của thực vật (Nester và ctv., 2004).
Nitơ là nguyên tố thiết yếu cho các tiến trình sinh học, nó có trong thành phần
của các acid amin (hợp phần bắt buộc của protein trong tế bào chất đặc trưng cho sự
sống); hiện diện trong DNA, RNA (vật chất di truyền của tế bào ở cấp độ phân tử);
trong các enzyme; trong màng tế bào; mang chức năng cấu trúc hoặc giữ chức năng cử