tieu luan hoạt tính kháng oxy hóa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA: SAU ĐẠI HỌC


BÀI TIỂU LUẬN

KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHẾT
SINH HỌC TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

GVHD: TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo
TS. Nguyễn Thế Hân
Nhóm thực hiện: Nhóm 2
Lớp: CHTP2015

Nha Trang, tháng 10 năm 2015


2

DANH SÁCH HỌC VIÊN THỰC HIỆN TIỂU LUẬN
STT

Họ và tên

1

Nguyễn Trọng Hoành Phong

2

Nguyễn Lê Thùy Linh

3

Nguyễn Thị Thanh Nguyệt

4

Nguyễn Thế Nguyên

Mã học viên
57CH057

2


3

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU
Ngày nay, ngành bào chế dược phẩm đã góp phần sản xuất ra hơn hàng trăm loại kháng
sinh có mặt trên thị trường đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho người, động vật (Nguyễn Thị
Thanh và Hồ Huỳnh Quang Trí, 1995). Tuy kháng sinh tổng hợp có nhiều ưu điểm nhưng
3


4

nhược điểm của kháng sinh tổng hợp cũng không nhỏ như dễ lờn thuốc, phụ thuộc vào
thuốc, nhiều tác dụng phụ không mong muốn khác (Ngô Thế Hùng, 1985). Bên cạnh đó,

sự phát triển của khoa học ngày nay đã giúp các nhà khoa học phát hiện ra nhiều tác dụng
phụ có hại của kháng sinh tổng hợp hóa học. Từ đó, con người muốn trở lại với tự nhiên,
để phát hiện và sử dụng các cây cỏ có nguồn gốc tự nhiên. Hiện nay, xu hướng sử dụng
các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu tự nhiên đang được ưa chuộng vì tính an toàn, có
thể sử dụng lâu dài, hạn chế tác dụng phụ khi sử dụng thuốc tổng hợp hóa học: hạn chế
hiện tượng lờn thuốc, kháng kháng sinh (Hoàng Hiệp, 2011). Các dược liệu có công dụng
trị liệu như Actiso (Cynara scolymus), Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr), Vọng
cách (Premma integrifolia L.), Nhân trần (Adenosma glutinosum), Diệp hạ châu đắng
(Phyllanthus amarus Schum et Thonn.,). Trong đó, cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus
amarus) chứa nhiều chất chống oxy hóa thuộc nhóm xanthones có tác dụng ức chế mạnh
quá trình peroxyd hóa lipid ở tế bào gan, do đó hạn chế hiện tượng viêm và hoại tử gan,
bảo vệ và phục hồi tế bào gan (Hoàng Hiệp 2011). Ngoài ra, Diệp hạ châu đắng
(Phyllanthus amarus) có tác dụng kháng khuẩn trên nhiều loại vi khuẩn (Staphylococcus
aureus, Salmonella typhimurium, Shigella flexerneri, Shigella shiga, Bacillus subtilis,…)
(Akinjogunla và ctv, 2010; ETTA và ctv, 2011), chống nhiễm trùng máu.

PHẦN 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4


5

1. Giới thiệu về cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)
1.1 Vị trí phân loại
Theo Đỗ Huy Bích và ctv (2004), Phyllanthus thuộc họ thầu dầu. Tên khoa học:
Phyllanthus amarus. Tên thường gọi: cây chó đẻ, diệp hạ châu, rút đất, cam kiềm, trân
châu thảo, diệp hòe thái, lào nha châu.
Vị trí phân loại:

-

Ngành Thực vật hạt kín (Basal angiosperms)
- Lớp Hai lá mầm (Paleodicots)
- Bộ Sơ Ri (Malpighiales)
- Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae)
- Chi Phyllanthus
- Loài Phyllanthus amarus Schum et Thonn., (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.2. Hình thái và phân bố
Cây thảo, sống quanh năm, cao 20 – 30 cm, có thể lên đến 60 – 70 cm, thân nhẵn, có
màu xanh. Lá đơn, mọc so le, xếp thành 2 dãy, mỗi cành giống như một lá kép lông chim
gồm nhiều lá. Phiến lá hình bầu dục đầu tròn có mũi nhọn, màu xanh lục, đậm ở mặt trên,
nhạt ở mặt dưới. Hoa mọc ở kẽ lá, quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống ở dưới lá,
mùa hoa: tháng 4 – 6, mùa quả: tháng 7 – 9. Chi Phyllanthus L. có nhiều loài phân bố
chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, chi này có khoảng 40 loài, trong
đó đáng chú ý là hai loài P. urinaria và P. amarus có hình dáng gần giống nhau nhưng P.
amarus thân có màu xanh, quả nang nhẵn, có tên gọi là Diệp hạ châu đắng, còn P.
urinaria thân có màu đỏ, quả nang có gai, có tên gọi là diệp hạ châu ngọt hay cây chó đẻ
răng cưa.Cả hai loài này mọc rải rác ở khắp nơi, phân bố khắp các vùng nhiệt đới. Ở Việt
Nam, cây mọc hoang trên đất ẩm, ở khắp các địa phương trừ vùng núi cao, lạnh. Diệp hạ
châu đắng là cây ưa ẩm, ưa sáng và hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong các bầu cỏ,
ruộng cao, nương rẫy và vườn nhà,... Cây non mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng
nhanh vào mùa hè và tàn lụi vào giữa mùa thu nên cây thường được thu hái vào cuối mùa
hè vì trong thời gian này cây đã sinh trưởng, phát triển đầy đủ và chứa lượng hoạt chất
cao nhất (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004).

5

6

Hình 1. Cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)
(a) Cây Diệp hạ châu đắng, (b) Quả, (c) Thân, (d) Rễ
1.3. Tính chất
Vị đắng, tính lạnh, lợi tiểu, tiêu độc, tán ứ, thông huyết và sát trùng (Đỗ Huy Bích và
ctv, 2004). Bộ phận dùng là toàn cây, rửa sạch dùng tươi hay phơi sấy khô.
1.4. Thành phần hóa học
Theo Đỗ Huy Bích và ctv (2004), Phyllanthus chứa nhiều chất thuộc các nhóm hóa học:
- Triterpen (Stigmasterol, stigmasterol – 3 – 0 – beta glucosid, beta – sitosterol, beta –

6


7

sitosterol glucosid, lup – 20 – en – 3 beta – ol), flavonoid (Kaempferol, quercetin, rutin),
tanin (Acid elagic, acid 3, 3’, 4 – tri – methyl elagic, acid galic), phenol, acid hữu cơ
(Acid succinic, acid ferulic, acid dotriacontanoic), lignan (Phyllanthin, Hypophyllanthin)
- Các thành phần khác: N - octadecan, acid dehydrochebulic methyl ester, triaontanol
phylanthurinol acton.
Lá diệp hạ châu đắng chứa chất đắng không có quinin hoặc alkaloid, lá khô chứa các
chất đắng Hypophyllanthin (0,05 %) và Phyllanthin (0,35 %), các chất này gây độc đối
với cá và ếch. Trong cây có niranthin, nirtetralin, phylteralin, quercetin, niruroidin,
isobubialin, epibubialin, isoquercitrin, astragalin, rutin và các acid hữu cơ (ascorbic,
geraniinic, amariinic, phenolic và repandusinic).
1.4.1 Phyllanthin
Công thức hóa học: C24H34O6
Trọng lượng phân tử: 418,52316 g/mol

Hình 2. Cấu trúc của Phyllanthin
(Vandana và ctv, 2008)
Phyllanthin cho tinh thể hình kim khi kết tinh trong dầu hỏa, tan nhiều trong hexan,
etylacetat, methanol, sắc ký lớp mỏng trên bản silicagel 60 F 254 Merck, dung môi động

7


8

hexan – etylacetat (2:1) hiện màu bằng H 2SO4 10 % trong methanol khi hơ nóng hiện rõ
một vết tròn có màu xanh dương nhạt, Rf = 0,35 (Nguyễn Thanh Hồng và ctv, 2002).
1.4.2 Hypophyllanthin
Công thức hóa học: C24H30O7
Trọng lượng phân tử: 430,4908 g/mol

Hình 3. Cấu trúc của Hypophyllanthin
(Vandana và ctv, 2008)
Hypophyllanthin kết tinh trong dầu hỏa hoặc hexan được tinh thể hình kim dài, tan
nhiều trong hexan, etylacetat. Sắc ký lớp mỏng trên bản silicagel 60 F254 Merck, dung môi
động hexan – etylacetat (2:1) hiện màu bằng H2SO4 10 % trong methanol, khi hơ nóng
hiện rõ một vết tròn, có màu xanh dương đậm. R f = 0,4 (Nguyễn Thanh Hồng và ctv,
2002).
1.5. Tác dụng dược lý
Diệp hạ châu đắng đã được chứng minh có rất nhiều tác dụng dược lý. Theo Đỗ Huy
Bích và ctv (2004), Diệp hạ châu đắng có tác dụng trong điều trị tiêu chảy và rối loạn tiêu
hóa do làm giảm nhu động ruột, có tác dụng lợi tiểu và điều trị bệnh tiết niệu, giúp hạ
đường huyết (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004). Bên cạnh đó, Diệp hạ châu đắng còn được sử

8

9

dụng trong điều trị tiêu chảy và rối loạn tiêu hóa do làm giảm nhu động ruột, có tác dụng
lợi tiểu và điều trị bệnh tiết niệu, giúp hạ đường huyết
Nước sắc của Diệp hạ châu đắng có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn Gram âm và
Gram dương như Escherichia coli (Akinjogunla và ctv, 2010), Staphylococcus aureus
(ETTA và ctv, 2011) , Salmonella typhi (Flora và Folasade, 2008), Shigella flexerneri,
Shigella shiga, Baccillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp. (Adegoke và
ctv, 2010).... Chất kháng khuẩn tan nhiều trong ether dầu hỏa, ether ethylic, methanol
(Nguyễn Thị Hồng và ctv, 2002). Phân đoạn chiết với butanol có hoạt tính bảo vệ gan cao
nhất, liều uống 50 mg/kg P có tác dụng bảo vệ 35 – 85 %, phân đoạn chiết với nước có tác
dụng bảo vệ gan nhẹ 20 – 40 %.
Từ Tích Tổ (2008) cho rằng trong Diệp hạ châu đắng có các thành phần: flavonoid,
alkaloid và các hợp chất phyllanthin, hypophyllathin, niranthin, phylteralin có tác dụng ức
chế mạnh virus gây viêm gan (HBV). Diệp hạ châu đắng ức chế virus viên gan thông qua
việc ức chế enzyme DNA polymerase của HBV từ đó ức chế sự sao chép tế bào của virus
viêm gan, làm cho virus không nhân lên được và bị đào thải do không bám vào được
DNA, làm giảm hoạt độ của HBsAg và anti-HBs, giúp phục hồi enzyme transminase từ
50 – 97 %, Bilirubin trở về bình thường (trích dẫn bởi Trần Thị Nhã Thi, 2011). Bên cạnh
đó, Phyllanthin và Hypophyllanthin còn có tác dụng bảo vệ tế bào gan chuột cống chống
tính độc hại tế bào gây bởi carbon tetrachlorid và galactosamin. Triterpentriacontanol
trong Diệp hạ châu đắng có tác dụng bảo vệ gan chống lại tính độc hại tế bào gây bởi
galactosamin. Acid galic chứa trong cây có tác dụng kháng khuẩn yếu nhưng phenolic và
flavonoid có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm mạnh hơn (Đỗ Huy Bích và ctv 2004).
Vậy, diệp hạ châu đắng có tác dụng dược lý trên hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu, hệ sinh dục…
nhưng tác động rõ rệt nhất là trên gan. Trong đề tài này, nghiên cứu được tiến hành chủ
yếu dựa trên hoạt tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng để từ đó xác định được
giá trị nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của cao thô đã điều chế

được.

9


10

2. Sơ lược về chiết suất các hợp chất thiên nhiên
Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), chiết suất là phương pháp dùng một dung môi
(đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên
cứu. Phương pháp cổ điển li trích một hợp chất thiên nhiên là dùng một dãy dung môi bắt
đầu từ không phân cực đến phân cực mạnh để li trích, phân đoạn các hợp chất ra khỏi hợp
chất thiên nhiên. Cách li trích thông dụng là li trích nóng bằng máy li trích liên tục hoặc li
trích hồi lưu. Sau mỗi lần li trích với một loại dung môi cần làm khô hợp chất thiên nhiên
rồi mới tiếp tục li trích với loại dung môi tiếp theo. Mỗi phân đoạn li trích, cất thu hồi
dung môi và tiến hành phân tích riêng.
Nguyên tắc chiết suất: phương pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi,
dụng cụ chiết và cách chiết. Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại
dung môi. Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự
đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn li trích.
Dung môi để chiết suất các hợp chất: tính trung tính, không độc, không quá dễ gây
cháy, hòa tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi tách chiết dung môi đó có thể được loại
bỏ dễ dàng, cần tránh các dung môi độc như benzen hoặc dễ cháy như dietyl eter do có
nhiệt độ sôi thấp. Người ta thường sử dụng các dung môi không hòa tan trong nước như
hydrocacbon (hexan, toluen), alcol (butanol), ceton (metyl etyl ceton), acetat (etyl, butyl).
Các dung môi này tương đối rẻ tiền, có bán sẵn, độ nhớt thấp, tỉ trọng tương đối cao so
với nước.
Các phương pháp chiết suất hợp chất thiên nhiên: có hai phương pháp thường sử dụng
để chiết suất là chiết ở nhiệt độ thường (chiết lạnh) và chiết nóng, mỗi phương pháp chiết
có dung môi và thiết bị chiết khác nhau. Phương pháp chiết lạnh là phương pháp chiết ở

nhiệt độ phòng (27 – 30 oC) trong thời gian 10 – 15 ngày và được áp dụng với đa số dược
liệu. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, không cần máy móc phức tạp và thường
được dùng trong điều chế cao thô do hạn chế được tác dụng của nhiệt độ tới hoạt chất
trong dược liệu. Khác với phương pháp chiết lạnh, phương pháp chiết nóng là phương
pháp chiết ở nhiệt độ 60 – 100 oC trong thời gian 7 – 10 ngày và thường áp dụng cho các
10


11

dược liệu có cấu tạo rắn chắc, khó chiết xuất và có khả năng chịu nhiệt (Phạm Ngọc Bùng
và Nguyễn Thị Nga, 2004).
Chiết suất hợp chất trong Diệp hạ châu đắng: khi cần chiết lấy toàn bộ hoạt chất trong
Diệp hạ châu đắng thì dạng thuốc điều chế thích hợp là cao thô. Cao thô có đặc điểm là đã
loại bỏ được một phần hoặc hoàn toàn các tạp chất (chất béo, nhựa, protein…) và tỷ lệ
hoạt chất trong cao thô có thể bằng (cao lỏng) hoặc thường cao hơn (cao đặc, cao khô) tỷ
lệ hoạt chất trong Diệp hạ châu đắng (Phạm Ngọc Bùng và ctv, 2004).
3. Sơ lược về các nhóm vi khuẩn liên quan đến nghiên cứu
3.1. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hình cầu, Gram dương, kị khí tuỳ tiện, không di
động, không sinh bào tử và có vỏ nhầy. Theo hội nghị quốc tế về xếp loại Micrococcus thì
giống Staphylococcus bao gồm 3 loài Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis
và Staphylococcus saphilophyticus. Staphylococcus aureus nuôi cấy trên môi trường
thạch trong điều kiện kỵ khí, nhiệt độ thích hợp 37 oC, chịu được nhiệt độ từ 4 – 40 oC, ở
môi trường lỏng, sau khi nuôi cấy 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ,
tạo mùi thối và có nhiều hạt lắng xuống đáy. Trong môi trường đặc, S. aureus tạo khuẩn
lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh có màu vàng, có thể phát triển tốt ở môi trường tổng
hợp đặc biệt đặc biệt ở môi trường thạch máu hoặc huyết thanh. Staphylococcus
aureus sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu, indol (+), NH 3 (+), thủy phân
gelatine (+), đông huyết tương (Wladimir và ctv, 2000; Nguyễn Thị Chính và Trương Thị

Hòa, 2005). Staphylococcus aureus kháng với penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được
men penicillinase, kháng MRSA (Methicillin resistant Staphylococcus aureus) do tạo ra
một loại protein gắn vào thụ thể hoạt động của methicillin, tỉ lệ S. aureus kháng
methicillin lên trên 50 %. S. aureus kháng thuốc cao với penicillin (89,4 %) (Frank và
Henry, 2009), tertracycline (82,4 %), trimethoprin + sulfamethazin (80,6 %), chloramphe
– nicol (64,8 %), erythomycin (38,4 %) và methicillin (25,9 %). Các chủng
Staphyloccoccus aureus có tỷ lệ đề kháng cao với ampicillin, co-trimoxazol,
erythromycin, lincomycin (từ 50 – 80 %) và những kháng sinh có hoạt lực mạnh như
ceftriazon, ciprofloxacin thì bắt đầu bị vi khuẩn này kháng lại (Nguyễn Bữu Châu, 2007).
11


12

Staphylococcus aureus gây bệnh đi kèm với các triệu chứng sốt, nổi ban, nôn ói, tiêu
chảy, hạ huyết áp, tiến triển nhanh suy đa cơ quan, luôn có biểu hiện ở gan với các triệu
chứng vàng da, tăng men gan (Phạm Thị Thu Thủy, 2005).
3.2. Bacillus subtilis
Chủng Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872. Bacillus
subtilis là trực khuẩn, Gram dương, kích thước 3 – 5 × 0,6 µm, có khả năng sinh bào tử và
là loài sinh vật tự dưỡng, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi. Hệ enzyme của Bacillus subtilis
rất phong phú và đa dạng. Bacillus subtilis được hoạt hóa trên môi trường với thành phần:
NaCl 0,5 %, pepton 1 %, cao nấm 1 %, cao thịt 0,3 %, agar 0,7 %, pH = 7, nhiệt độ 30 –
39 oC, nhưng phát triển tốt ở 37 oC (Trần Thị Ánh Nguyệt, 2010). Các đặc tính sinh hóa
của Bacillus subtilis: hoạt tính catalase, phản ứng Methyl Red (+), phản ứng Voges
Proskauer (+), khử Nitrate (+), phân giải tinh bột (+), có khả năng tiết cellulase, amylase,
và caseinase. Bacillus subtilis được ứng dụng trong việc sử dụng để sản xuất probiotic vì
chúng có thể tiết ra các enzyme ngoại bào giúp cải thiện tiêu hóa, ứng dụng trong xử lý
nước thải, sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống, công nghệ lên men, sinh học phân
tử, y – dược học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, thu hồi bạc từ các phế liệu (Ngô

Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà, 2009). Bacillus subtilis có khả năng kháng kanamycin,
phleomycin

(Zofia,

2004),

streptomycin,

ampicillin,

penicillin,

erythromycin,

amoxycillin, bacitracin (Hemalatha và Shanthi, 2010).
3.3. Streptococcus pyogenes
Streptococcus pyogenes (vi khuẩn liên cầu nhóm A) thuộc giống Streptococcus, dựa
vào giải mã trình tự protein M, Streptococcus pyogenes phân loại hơn 100 loài.
Streptococcus pyogenes là vi khuẩn Gram dương, không di động, kích thước 0,6 – 1 µm,
vi khuẩn yếm khí tùy nghi, phát triển trong môi trường chứa máu, có khả năng làm tan
huyết, phát triển tốt trong điều kiện môi trường 37 – 39 oC. Streptococcus pyogenes được
nuôi cấy trong môi trường thạch có chứa máu, ủ qua đêm ở 37 oC vi khuẩn phát triển sẽ
làm tan huyết tạo vòng trong suốt xung quanh (Tara, 2010). Streptococcus pyogenes
kháng macrolid, sulfornamid, streptogramin B với tỷ lệ 70 %; clindamycin (58 %) và
erythromycin (56 %) (Nevial, 2009). Streptococcus pyogenes là một trong số các chủng vi
12


13

khuẩn gây bệnh trên người: ban đỏ, viêm Amidan, bệnh chốc lở, viêm quầng, sốt thấp
khớp, gây bệnh ở phụ nữ thời kỳ sinh (Tara, 2010).

3.4. Salmonella typhimurium
Salmonella typhimurium là một trong số các serotype thuộc giống Salmonella.
Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, được Salmon và Smith tìm ra năm 1885, lấy tên
Salmon đặt tên cho vi khuẩn. Salmonella typhimurium là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí
tuỳ nghi, có tiêm mao di động, không tạo bào tử, có kích thước khoảng 2 – 3 × 0,4 – 0,6
μm (Võ Thị Hoàng Mi, 2005). Salmonella typhimurium phát triển tốt ở nhiệt độ 6 – 42 oC,
nhiệt độ thích hợp 35 – 37 oC, pH = 6 – 9, thích hợp nhất ở pH = 7,2 và được nuôi cấy dễ
dàng trong môi trường dinh dưỡng đơn giản, đầy đủ chất dinh dưỡng. Salmonella
typhimurium kháng các loại kháng sinh với tỉ lệ cao trên 50 % đối với: tetracycline (84,7
%), sulfonamide (88,1 %), chloramfenicol (83 %), ampicilline (86,4 %), streptomycine
(91,5 %) (Phùng Quốc Chương, 2002; Sisak và ctv, 2006). Salmonella typhimurium gây
các bệnh liên quan đến gan viêm gan cấp tính, gan to nhẹ, Bilirubin tăng nhẹ đến trung
bình (16 % các trường hợp), men gan tăng trong 60 % các trường hợp (Nguyễn Thị
Nguyệt và ctv, 2010).
3.5. Shigella flexerneri
Shigella flexerneri thuộc giống Shigella, họ Enterobacteriaceae, dựa vào đặc điểm
kháng nguyên thân O và các đặc tính sinh hóa người ta chia Shigella flexerneri ra làm 4
nhóm chính: A, B, C, D; ngoài ra còn có kháng nguyên K; mỗi nhóm có nhiều kiểu huyết
thanh. Shigella flexerneri có dạng hình que thẳng dài, kích thước từ 1 – 3 µm, không có
lông, không di động, không sinh bào tử, Gram âm, vi khuẩn hiếu kị khí tùy tiện nhưng
phát triển rất tốt trong điều kiện kị khí. Shigella flexerneri được nuôi cấy trong điều kiện
hiếu khí hoặc kị khí, có thể phát triển trong điều kiện nhiệt độ từ 8 – 40 oC, pH = 6 – 8,8
và phát triển tốt nhất trong điều kiện 37 oC, pH = 7 – 8. Shigella flexerneri gây nhiễm
trùng đường ruột dẫn đến viêm gan ứ mật, các biến đổi mô học ở gan bao gồm: thấm
nhiễm tế bào đa nhân ở cửa gan và xung quanh bị hoại tử và ứ mật (Phạm Thị Thu Thủy,

13


14

2005). Shigella flexerneri có khả năng kháng nalidixic acid (59,6 %), tetracycline (78%),
ampicillin (74%), cotrimoxazole (71 %), và chloramphenicol (69 %) (Oelia và ctv, 2005).
4. Sơ lược về sắc ký
4.1. Đại cương về sắc ký
Sắc ký là phương pháp vật lý dùng để tách hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng
thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối
với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: pha tĩnh và pha động). Việc tách hai pha nào đó
ra riêng có đạt kết quả tốt hay không là tùy thuộc vào hệ số phân chia. Bất kỳ một hợp
chất nào khi đặt vào một hệ thống gồm có hai pha, lúc đạt đến trạng thái cân bằng hợp
chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ nồng độ nhất định, tỉ lệ này thay đổi tùy
thuộc vào các tính chất động học của hợp chất và cả hai pha. Cũng tương tự một hỗn hợp
gồm nhiều loại hợp chất khác nhau khi được đặt vào hệ thống có hai pha, mỗi loại hợp
chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với mỗi pha, vì thế sẽ có tương tác mạnh/ yếu khác nhau
đối với pha tĩnh. Kết quả là mỗi loại hợp chất sẽ di chuyển ngang pha tĩnh với vận tốc
khác nhau, nhờ vậy kỹ thuật sắc ký có thể tách riêng các loại hợp chất (Nguyễn Kim Phi
Phụng, 2007).
4.2. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC- Hight-Performance Liquid Chromatography)
Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007): sắc lý lỏng cao áp, hay sắc ký lỏng hiệu quả cao
(HPLC- Hight-Performance Liquid Chromatography). HPLC là chữ viết tắt của bốn chữ
cái đầu bằng tiếng anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight – Performance
Liquid Chromatography) mà trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High
Pressure Liquid Chromatography). HPLC phát triển rất nhanh từ năm 1969. HPLC có khả
năng phân tách các hợp chất đặc thù như: các hợp chất cao phân tử và ion, các hợp chất tự
nhiên không bền, các hợp chất kém bền nhiệt, các hợp chất dễ nổ.
Khái niệm: HPLC là một phương pháp phân tách trong đó pha động là chất lỏng, pha

tĩnh là chất rắn được chứa trong một cột, chất rắn này đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi

14


15

bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế
hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử).
Các bộ phận của máy HPLC:
Bình chứa dung môi giải ly cột: hệ dung môi giải ly cột được hút ra từ hai bình chứa
dung môi. Bình được làm bằng chất liệu trơ, thường là bằng thủy tinh. Bình luôn luôn có
một cái nắp bảo vệ để chống không cho bụi rơi vào trong bình, nắp có lỗ hở để bình luôn
thông với khí trời. Trong bình, có một ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc ký, ở đầu
này có gắn một nút lọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi và cũng để giữ ống luôn
ở dưới mặt thoáng của chất lỏng. Các nhà sản xuất có những bình chuyên dùng để cho nút
lọc bằng kim loại nói trên lọt vào một lỗ giếng, bảo đảm đầu ống luôn chạm sát đáy bình,
có thể sử dụng đến giọt dung môi cuối cùng trong bình. Trước khi lắp một bình dung môi
vào vị trí hoạt động, cần phải loại bỏ phần không khí đã hoà tan vào dung môi trước đó,
gọi là khử bọt khí (degassing), bởi vì nếu còn lẫn những bọt không khí vào trong luồng
dung môi đi vào máy sẽ làm cho máy bơm và đầu dò hoạt động kém hiệu quả.
Dung môi dùng cho HPLC: máy HPLC thường sử dụng hồn hợp hai loại dung môi, tuy
vậy cũng có những nghiên cứu sử dụng bốn loại dung môi, trong trường hợp này, cần có
thêm thiết bị phụ trợ thích hợp có bán sẵn. Tỉ lệ của mỗi dung môi trong hỗn hợp được
điều khiển bằng hệ thống điều khiển. Máy bơm hút hai dung môi trong hai bình đưa vào
hộp phối trộn. Tất cả các dung môi phải có độ tinh khiết cao đạt tiêu chuẩn HPLC không
có lẫn bụi bẩn, trước khi gắn vào máy HPLC dung môi phải được khử không khí.
Máy bơm: loại máy bơm của HPLC là loại bơm đặt biệt với áp suất rất cao lên đến
7000 psi (48,3 MPa). Bơm được cấu tạo bằng chất liệu để chịu đựng được dung môi hữu

cơ.
Cột sắc kí: cột HPLC được làm bằng thép không gỉ, thường dài 10 – 25 cm và có
đường kính bên trong 2,1 – 4,6 mm cột được nhồi thật chặt bởi những hạt nhỏ.
Bộ phận trích mẫu vào máy: máy HPLC có hệ thống trích mẫu đặc biệt: ống chứa mẫu
giúp định hướng dòng chảy của pha động chỉ có thể đi trên một trong hai con đường khác
nhau. Mẫu khảo sát được tiêm vào máy nhờ một kim tiêm.
Các phương pháp nâng cao độ phân giải trong HPLC: tăng chiều dài của cột, giảm
đường kính của cột, giảm lưu lượng pha động, pha tĩnh (vật liệu nhồi cột) đồng nhất.
15


16

giảm thể tích bơm mẫu, lựa chọn pha tĩnh sạch hơn, lựa chọn pha động tinh khiết hơn, sử
dụng áp suất ổn định hơn

Van nhiều
cổng
Bình chứa dung
môi
5. Sơ lược về các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn
Cột bảo vệ
Hộp trộn
Một số phương pháp thường được sử
dụng
để xác định hoạt tính kháng khuẩn của một
dung
môi
Van 2 cổng
số hợp chất như: phương pháp khuếch tán trên thạch (Antibiotic Disc Diffusion Method)

Cột sắc ký
và phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng. Trong đó phương pháp khuếch tán trên
thạch thông dụng hơn (Attur và ctv, 2005)
Máy bơm
5.1. Phương pháp khuếch tán trên thạch
Đầu dò
Máy in
Hệ thống
Nguyên tắc: hợp
điềuchất
khiểncó tính kháng khuẩn được tẩm vào các đĩa giấy (ϕ = 2 mm) tiệt
trùng với hàm lượng nhất định. Khi đĩa giấy được đặt lên bề mặt môi trường thạch đĩa đặc
biệt, hợp chất có tính kháng khuẩn sẽ khuếch tán ra xung quanh và ngăn cản không cho vi
Hình 4. Sơ đồ mô tả tổng quát các bộ phận của máy HPLC
sinh vật mọc lên, tạo nên vòng vô khuẩn (trong trường hợp vi sinh vật bị tác động bởi hợp
chất có tính kháng khuẩn được thử) (Attur và ctv, 2005). Phương pháp sử dụng môi
trường mà hầu hết các vi sinh vật phát triển được và hợp chất có tính kháng khuẩn có thể
dễ dàng khuếch tán ra môi trường: Mueller Hinton Agar (John và ctv, 2011), Tryticase –
Soy – Agar (Nguyễn Ngọc Hải và Nguyễn Thị Kim Loan, 2009), Nutrient Agar (Flora và
Folasade, 2008). Đánh giá kết quả dựa trên việc đo đường kính vòng vô khuẩn (phạm vi
vi khuẩn không mọc được xung quanh đĩa tẩm giấy có chứa hợp chất kháng khuẩn) xuất
hiện trên đĩa.
5.2. Phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng

16


17

Theo Adegoke và ctv (2010): phương pháp này được sử dụng để xác định sự nhạy cảm

của vi sinh vật đối với các loại hợp chất có tính kháng khuẩn, bên cạnh đó giúp xác định
được giá trị MIC, MBC của một hợp chất có tính kháng khuẩn đối với từng loại vi khuẩn.
Môi trường sử dụng: môi trường canh dinh dưỡng Nutrient Broth (Adegoke và ctv, 2010)
hoặc môi trường Brain Heat Infusion (Rashmi, 2012). Kết quả được đánh giá dựa trên sự
phát triển của vi khuẩn trong môi trường. Ghi nhân độ pha loãng hợp chất kháng khuẩn
cao nhất mà ở đó vi khuẩn không mọc để xác định giá trị MIC.
5.3. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)
MIC – nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ tối thiểu có thể ức chế 99 % sự phát triển
của một loại vi khuẩn nhất định trong điều kiện nuôi cấy ở 37 oC trong 24 giờ (Ansari và
ctv, 2011; Chen, 2011). MBC – nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là nồng độ tối thiểu có thể
diệt 99,9 % vi khuẩn (Ansari và ctv, 2011; Chen, 2011).
Trong đề tài này, phương pháp pha loãng trong môi trường MHA, BHI trên microplate
96 giếng (Chen, 2011) được sử dụng để xác định MIC và MBC của cao thô Diệp hạ châu
đắng trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm.

PHẦN 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Vi khuẩn dùng trong thí nghiệm
Các chủng vi khuẩn thuộc bộ sưu tập vi khuẩn của Mỹ ATCC (American Type Culture
Collection) được mua và bảo quản tại Bệnh xá Thú Y – trường Đại học Nông Lâm –
Thành phố Hồ Chí Minh
(1) Staphylococcus aureus ATCC
(2) Bacillus subtilis ATCC
(3) Streptococcus pyogenes ATCC
17


18
(4) Salmonella typhimurium ATCC

(5) Shigella flexerneri ATCC

2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng
Điều chế dịch chiết: dung môi có thể là cồn methanol hoặc ethanol 80 – 100 %. Tuy
nhiên, cồn methanol được sử dụng thường xuyên hơn vì nó được xem là dung môi vạn
năng, nó hòa tan được các chất không phân cực và có khả năng tạo liên kết hydro với các
nhóm phân cực (Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985). Ngoài ra, cồn methanol rẻ
hơn cồn ethanol, nhiệt độ sôi của cồn methanol (65 oC) thấp hơn cồn ethanol (78 oC) nên
dịch chiết cồn methanol khi cô quay sẽ bay hơi nhanh hơn cồn ethanol và thu được cao
thô toàn phần chứa hầu hết hợp chất của Diệp hạ châu đắng. Chính vì những lý do trên,
chúng tôi sử dụng cồn methanol để chiết xuất Diệp hạ châu đắng. Bên cạnh những ưu
điểm trên, methanol lại có nhược điểm là gây ngộ độc khi ăn phải với hàm lượng nhất
định hoặc hàm lượng rất ít trong thời gian dài nên để tránh tình trạng này tiến hành cô
quay cao đến khi đặc cứng và để cao ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 ngày để loại hết hoàn
toàn dung môi methanol (Trần Thị Nhã Thi, 2011).
Đối tượng khảo sát: Diệp hạ châu đắng được thu vào buổi sáng từ 7 – 9 giờ, không
thu cây còn non hay quá già vì cây non hay quá già lượng hoạt chất chứa trong cây ít
làm ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất và hiệu quả điều trị. Sau khi thu mẫu, loại
sạch đất, những dược liệu bị sâu, nấm ký sinh và những tạp chất khác, cuối cùng đem
điều chế thành cao đặc diệp hạ châu đắng. Bộ phận dùng: rễ, thân và lá để thực hiện
tách chiết được sấy khô.
Phương pháp điều chế: mẫu tươi toàn cây Diệp hạ châu đắng (rễ, thân và lá) sau khi
thu hái, làm sạch, chọn lọc, rồi cắt nhỏ và đem sấy ở 55 oC đến khi trọng lượng không
thay đổi. Sau đó đem nghiền nhỏ rồi ngâm trong cồn methanol 99,5 % trong thời gian 72
giờ, lọc lấy dịch chiết và tiếp tục ngâm chiết với methanol trong 48 giờ tiếp theo và lọc
lấy dịch chiết 24 giờ/ lần/ lọc. Các dịch chiết sau khi lọc được trữ lạnh ở 0 – 4 oC .Loại
dung môi trong dịch chiết bằng máy cô quay cho đến khi đạt độ cắn, cuối cùng thu được

18

19

cao thô Diệp hạ châu đắng (Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985; Huỳnh Kim
Diệu, 2008).
Hiệu suất chiết xuất được tính theo công thức:
HS (%) = (P2/P1) *100
trong đó:
P1: trọng lượng mẫu sau sấy (g)
P2: trọng lượng cao thu được (g)
HS: hiệu suất (%)

Ẩm độ cao thô Diệp hạ châu đắng (H – humidity) được xác định và tính theo công
thức:
H (%) = 100 – DM
trong đó:
H: ẩm độ cao đặc (%)
DM: hàm lượng vật chất khô (%)
DM là hàm lượng vật chất khô cao đặc và được tính theo công thức:
DM (%) = [(m2 – m1)/m]*100
m: trọng lượng cao đặc (g)
m2: trọng lượng bình và cao đặc sau sấy (g)
m1: trọng lượng bình sau sấy (g)

Chỉ tiêu khảo sát: Hiệu suất chiết xuất (%), độ ẩm (%) cao thô Diệp hạ châu đắng
Methanol
24 giờ/ lần

Mẫu tươi

Sấy 50 oC

Lọc

nhỏ3)
Mẫu đã loại dịchNghiền
chiết (Lần
Hình 5. Sơ đồ qui trình chiết xuất
caovới
thôMethanol
Diệp hạ châu đắng sử dụng trong nghiên cứu
Chiết
(Huỳnh Kim Diệu, 2008)
100% (Lần 1)
Mẫu đã loại dịch chiết (Lần 1)
Methanol

72 giờ/ lần
19

Lọc

Dịch
chiết (Lần 1, trữ)Dịch chiết (Lần 2, trữ)
Cao đặc
Cô quay


20

24 giờ/ lần
Lọc
Mẫu đã loại dịch chiết (Lần 2)
Dịch chiết (Lần 3, trữ)

2.2. Định lượng Phyllanthin và Hypophyllanthin trong cao thô Diệp hạ châu
đắng bằng HPLC
Phương pháp tiến hành: sử dụng cao thô Diệp hạ châu đắng được điều chế từ thí
nghiệm 1 sử dụng làm mẫu thực hiện phản ứng HPLC
Nồng độ (%) của Phyllanthin và Hypophyllanthin dựa theo chuẩn tại Phòng hợp chất
thiên nhiên – Viện Công nghệ hóa học, Thành phố Hồ Chí Minh; Arvind và ctv, 2006 và
Vandana và ctv, 2008.
Xử lý bọt khí
Bình chứa dung môi

Cột
Cột bảo vệ
Bơm
Màng lọc dung môi

Hình 6. Đường đi của dung môi trong hệ thống sắc ký
Đầu
dòthiên nhiên – Viện Công nghệ hóa học, Thành phố Hồ Chí Minh)
(Phòng hợp
chất
2.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng
2.3.1 Chuẩn độ vi khuẩn
Môi trường BHI được pha, hút 2 ml vào ống nghiệm, sau đó hấp vô trùng ở 121 oC
trong 15 phút. Các chủng vi khuẩn từ các ống giống gốc dùng que cấy vòng vô trùng, lấy
20

21

vòng vi khuẩn và cấy chuyền sang BHI, ủ 37 oC trong 24 giờ. Môi trường NA được pha,
hấp vô trùng ướt và đỗ 20 ml vào các đĩa petri, đã được vô trùng 121 oC trong 15 phút.
Với 5 chủng vi khuẩn sử dụng, được cấy chuyển từ BHI sang NA, ủ 37 oC trong 24 giờ
(Andrews, 2006). Sau đó dùng que cấy vô trùng lấy một lượng rất nhỏ vi khuẩn từ khuẩn
lạc cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch NaCl 0,85 % (đã được pha và hấp vô trùng
trước), chuẩn độ đục cho bằng với Mac Farland 0,5 (tương đương 1,5 x 10 8 CFU/ml)
(Trường đại học Dược Hà Nội, 1993). Rút 10µl từ ống nghiệm đã chuẩn độ cho vào 8.99
ml dung dịch NaCl 0,85 % được vô trùng đạt mật độ vi khuẩn 1,5 x 10 5 CFU/ml (Neeraj
và ctv, 2010; Mohana và ctv, 2008) sử dụng trong vòng 15 phút, được lắc lên trước khi sử
dụng (Thongson và ctv, 2004).
Vi khuẩn
Cấy chuyển
BHI
Ủ 37 oC/24 giờ
NA
Ủ 37 oC/ 24 giờ
Chuẩn độ Mac Farland 0,5

Rút 10 µl + 8,99 ml NaCl 0,85 %,
được nồng độ 1,5 x 105 CFU/ml

Hình 7. Sơ đồ qui trình chuẩn độ vi khuẩn sử
dụng trong nghiên cứu (Thongson và ctv, 2004)

2.3.2 Thử tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng
Xác định tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng bằng phương pháp pha

loãng liên tục trong môi trường MHA (Chitravadivu và ctv, 2009; Britto và ctv, 2011)
21


22

thực hiện trên microplate 96 giếng (Chen, 2011). Pha 2 g cao thô Diệp hạ châu đắng vào
20 ml dung dịch DMSO 5% (Abdul, 2010). Từ dung dịch gốc pha loãng liên tục trong
môi trường theo dãy nồng độ giảm dần từ 50 mg/ml; 25 mg/ml đến 1,561 mg/ml (Abdoul
và ctv, 2010). Cuối cùng, chuẩn bị giếng có chứa 150 µl môi trường và 150 µl dung dịch
gốc được sử dụng làm đối chứng dương và giếng có chứa 300 µl môi trường có nhỏ 1 µl
vi khuẩn được sử dụng làm đối chứng âm. Môi trường MHA được pha với nước cất, vô
trùng ở 121 oC trong vòng 15 phút, sau đó môi trường được lấy ra để nguội khoảng 40 –
50 oC mới cho vào dãy pha loãng nồng độ dung dịch gốc. Tiếp theo, hút 1 µl huyễn dịch
vi khuẩn 1,5 x 105 CFU/ml (Neeraj và ctv, 2010; Mohana và ctv, 2008) nhỏ vào giữa
giếng. Ủ đĩa 37 oC trong 24 giờ. Tổng thể tích trong các tất cả các giếng là 300 µl. Đánh
giá kết quả dựa vào sự phát triển của vi khuẩn ở các giếng.
Xác định phần trăm ức chế vi khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng: Theo Neeraj và
ctv (2010): khả năng ức chế vi khuẩn của hợp chất kháng khuẩn sau khi nuôi cấy 37 oC
trong vòng 24 giờ được thể hiện qua phần trăm ức chế vi khuẩn. Phần trăm ức chế vi
khuẩn được xác định bởi công thức (Sultanbawa và ctv, 2009):
Phần trăm ức chế (%) = {1 – (A24 – A0)/(C24 – C0)}*100
trong đó:
A0 : Giá trị OD tại thời điểm nhỏ vi khuẩn
A24: Giá trị OD tại thời điểm sau khi ủ vi khuẩn
C0: Giá trị OD của đối chứng âm tại thời điểm nhỏ vi khuẩn
C24 : Giá trị OD của giếng đối chứng âm sau khi ủ vi khuẩn

Chỉ tiêu theo dõi:
- Giá trị OD tại thời điểm sau khi nhỏ và sau khi ủ vi khuẩn

- Phần trăm ức chế vi khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng.

22


23

PHẦN 3
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

1. Điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng
1.1. Hiệu suất chiết xuất cao thô Diệp hạ châu đắng
Diệp hạ châu đắng sau khi chiết với cồn methanol và xử lý trong máy cô quay cuối
cùng thu được cao thô Diệp hạ châu đắng. Hiệu suất chiết suất cao thô Diệp hạ châu đắng
qua các lần chiết được tính toán và trình bày qua Bảng 1.
Bảng 1. Hiệu suất chiết xuất cao thô Diệp hạ châu đắng qua hai lần chiết
Lần chiết

Trọng lượng
mẫu tươi
(g)

Trọng lượng
mẫu sau
sấy(g)

Trọng lượng cao
sau cô quay (g)

Hiệu suất

chiết xuất
(%)

1

3000

700

25,87

3,70

2

1000

250

15,52

6,21

Qua Bảng 1 ghi nhận hiệu suất chiết xuất của cao thô Diệp hạ châu đắng trong dung
môi methanol cao nhất ở lần chiết thứ hai (6,21 %). Điều này do sai sót về thao tác kỹ
thuật thực hiện trong quá trình cô quay làm thất thoát lượng dịch chiết, ở lần chiết 1, chưa
chiết kiệt được lượng dịch chiết ở lần lọc thứ 3 (lọc lại cặn với methanol sau khi lọc dịch
chiết lần thứ 3). Bên cạnh đó, Diệp hạ châu đắng được thu hái, sử dụng để điều chế cao
thô ở lần chiết 1có độ tuổi cây già nên hàm lượng hoạt chất trong cây ít, làm giảm hiệu
suất chiết xuất (Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985; Huỳnh Kim Diệu, 2008).

Điều này đươc giải thích theo kết quả nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu (2008); Salim và
ctv, (2010): các yếu tố tự nhiên: nhiệt độ, thời tiết, lượng mưa…; đặc điểm cây trồng:
chiều cao, độ tuổi… đều có ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất trong cây Diệp hạ châu
đắng. Theo Arvind và ctv, (2008), với mỗi dung môi chiết, phương pháp chiết xuất sẽ cho
hàm lượng các hoạt chất khác nhau. Như vậy, dung môi sử dụng chiết, độ tinh khiết của
23


24

dung môi, phương pháp chiết xuất, nguồn gốc, độ tuổi cây Diệp hạ châu đắng được thu
hái cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất cao thô Diệp hạ châu đắng.
1.2. Ẩm độ cao thô Diệp hạ châu đắng
Ẩm độ cao thô cũng ảnh hưởng đến độ ổn định của cao. Ẩm độ cao thô càng lớn thì độ
ổn định và hiệu quả điều trị của cao càng thấp. Ngoài ra ẩm độ cao thô cũng ảnh hưởng
đến MIC. Ẩm độ cao thô càng cao ảnh hưởng đến giá trị MIC cao. Ẩm độ cao thô Diệp
hạ châu đắng qua các lần chiết 1, 2 được tính toán và trình bày qua Bảng 2.
Bảng 2. Hàm lượng vật chất khô và ẩm độ cao thô Diệp hạ
châu đắng qua hai lần chiết
Lần chiết

Hàm lượng vật chất khô (%)

Ẩm độ (%)

1

86,99

13,01

2

82,64

17,36

Ở lần chiết thứ nhất đạt ẩm độ thấp hơn lần thứ hai. Điều này do ở lần chiết thứ nhất
thời gian cô quay dài hơn so với lần thứ hai. Ngoài ra thời điểm thu hái cây Diệp hạ châu
đắng ở 2 lần không giống nhau (lần mẫu đầu tiên được thu hái đầu tháng 2, lần thứ hai
giữa tháng 4) nên có thể dẫn đến sự khác biệt thời tiết, ảnh hưởng đến điều kiện phát triển
của cây Diệp hạ châu, do đó có thể dẫn đến sự khác biệt về độ ẩm cao thô giữa hai lần
chiết. Kết quả cho thấy khi hàm lượng vật chất khô tăng dần thì ẩm độ cao thô Diệp hạ
châu đắng giảm dần. Kết quả ẩm độ ở các lần chiết trên phù hợp với tiêu chuẩn của Dược
Điển Việt Nam III và ghi nhận của Phạm Ngọc Bùng và Nguyễn Thị Nga (2004) là ẩm độ
cao đặc không quá 20 %.
Khảo sát hiệu suất và ẩm độ cao thô Diệp hạ châu đắng cho thấy khi chiết xuất Diệp
hạ châu đắng với cồn methanol bằng phương pháp ngâm lạnh cho ta một sản phẩm với
hiệu suất chiết và ẩm độ cao thô theo tiêu chuẩn nên có thể sử dụng cho các thí nghiệm.

24


25

2. Định lượng Phyllanthin và Hypophyllanthin trong cao thô Diệp hạ châu đắng
bằng HPLC
Phyllanthin và Hypophyllanthin có tác dụng ức chế mạnh virus gây viêm gan (Từ Tích
Tổ, 2008). Hàm lượng Phyllanthin và Hypophyllanthin trong cao thô Diệp hạ châu đắng
có ảnh hưởng đến tác dụng dược lý của cao thô, hàm lượng các hợp chất này trong cao

thô càng cao thì tác dụng dược lý của cao thô Diệp hạ châu đắng trên virus gây viêm gan
càng lớn càng lớn. Phản ứng HPLC giúp định được hàm lượng Phyllanthin và
Hypophyllanthin trong cao thô từ đó xác định chính xác được tác dụng dược lý của cao
thô, qua đó có thể xác định khả năng điều trị viêm gan của cao thô Diệp hạ châu đắng.
Sau khi đã điều chế được cao thô Diệp hạ châu đắng, phản ứng định hàm lượng hợp
chất Phyllanthin và Hypophyllanthin trong cao thô Diệp hạ châu đắng bằng HPLC được
tiến hành

min
10
12
14
16
18
mAU
0
2
4
6
8
10

13.450

25