Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) và nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) ở vùng Bắc Trung Bộ (FULL)

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ NGẦN

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TỪ QUẢ THỂ NẤM ĐA NIÊN LỖ ĐEN
(NIGROFOMES MELANOPORUS (MONT.) MURRILL) VÀ NẤM
VÂN CHI (TRAMETES CUBENSIS (MONT.) SACC.)
Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

Vinh - 2015


2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ NGẦN

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TỪ QUẢ THỂ NẤM ĐA NIÊN LỖ ĐEN
(NIGROFOMES MELANOPORUS (MONT.) MURRILL) VÀ NẤM
VÂN CHI (TRAMETES CUBENSIS (MONT.) SACC.)
Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ

Chuyên ngành : HOÁ HỮU CƠ
Mã số: 62.44.2701
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS. TS TRÀN ĐÌNH THẮNG
GS. TS TIAN-SHUNG WU

Vinh – 2015


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Vinh, ngày 20 tháng 10 năm 2015
Ký tên

Nguyễn Thị Ngần


ii

LỜI CẢM ƠN
Luận án được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá hữu cơ - khoa
Hoá, Trung tâm Phân tích và Chuyển giao công nghệ Thực phẩm và Môi trường, Trường
Đại học Vinh, khoa Hóa-Đại học Quốc gia Cheng Kung - Đài Nam, Đài Loan, Viện Hoá

học-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS. TS. Trần Đình
Thắng - Trường Đại học Vinh và GS. TS. Tian-Shung Wu - Đại học Quốc gia ChengKung, Đài Nam, Đài Loan là người những thầy đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo điều
kiện tốt nhất, giúp tôi từng bước trong quá trình thực hiện luận án. PGS. TS Ping-Chung
Kuo - Đại học Quốc gia Formosa, Đài Loan đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Hoàng Văn Lựu đã tạo điều kiện thuận lợi,
động viên tôi trong quá trình làm luận án. Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn PGS. TS PingChung Kuo - Đại học Quốc gia Formosa, Đài Loan đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện
luận án.
PGS. TS. Ngô Anh - Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Huế đã giúp định danh
các mẫu nấm.
Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, khoa Hoá học, cán
bộ phòng Đào tạo Sau đại học, các phòng ban chức năng của Trường Đại học Vinh, các
thầy cô, các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã
động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này.
Vinh, ngày 20 tháng 10 năm 2015

Nguyễn Thị Ngần


iii

MỤC LỤC
Trang
Mở đầu

1

1. Lý do chọn đề tài

1

2. Đối tượng nghiên cứu

2

3. Nhiệm vụ nghiên cứu

2

4. Phương pháp nghiên cứu

3

5. Những đóng góp mới của luận án

3

6. Cấu trúc của luận án

4

Chương 1: Tổng quan

5

1.1. Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn

5

1.1.1. Giới thiệu về nấm lớn

5

1.1.2. Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn

6

1.1.2.1. Kháng khuẩn và kháng nấm

6

1.1.2.2. Khả năng kháng virut

13

1.1.2.3. Gây độc tế bào, chống ung thư và tăng cường hệ thống miễn dịch

16

1.1.2.4. Những hoạt tính khác

22

1.2. Nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus)

25

1.2.1. Đặc điểm và sự phân bố

25

1.2.2. Thành phần hoá học và hoạt tính của các chất đã được phân lập

26

1.3. Nấm vân chi (Trametes cubensis)

26

1.3.1. Đặc điểm và sự phân bố

26

1.3.2. Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học

27

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm

30

2.1. Phương pháp nghiên cứu

30

2.1.1. Phương pháp lấy mẫu

30

2.1.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các chất phân lập

30


iv
được
2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

30

2.1.4. Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học

31

2.2. Hóa chất và thiết bị

31

2.2.1. Hoá chất

31

2.2.2. Thiết bị

31

2.2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

31

2.2.2.2. Sắc ký cột (CC)

31

2.2.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

32

2.2.2.4. Phổ tử ngoại (UV)

32

2.2.2.5. Phổ hồng ngoại (FT-IR)

32

2.2.2.6. Phổ khối lượng (MS)

32

2.2.2.7. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

32

2.2.2.8. Phổ X-ray

32

2.2.2.9. Điểm nóng chảy

33

2.2.2.10. Độ quay cực riêng

33

2.3. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes

33

melanoporus)
2.3.1. Mẫu nấm

33

2.3.2. Phân lập các hợp chất

33

2.3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào của 2 hợp chất NDM1, NDM2

36

2.3.4. Hằng số vật lý các hợp chất

37

2.3.4.1. Hợp chất NDM-1 (chất mới)

37

2.3.4.2. Hợp chất NDM-2 (chất mới)

38

2.3.4.3. Hợp chất NDM-3

39

2.3.4.4. Hợp chất NDM-4

39

2.3.4.5.Hợp chất NDM-5

40

2.3.4.6.Hợp chất NDM-6

40


v
2.3.4.7. Hợp chất NDM-7

41

2.3.4.8. Hợp chất NDM-8

42

2.3.4.9. Hợp chất NDM-9

42

2.3.4.10. Hợp chất NDM-10

43

2.3.4.11. Hợp chất NDM-11

43

2.4. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis)

44

2.4.1. Mẫu nấm

44

2.4.2. Phân lập các chất

44

2.4.3. Thử hoạt tính các hợp chất phân lập từ quả thể nâm vân chi

47

2.4.3.1. Thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất DQE-1

47

2.4.3.2. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật của hợp chất DQE-1

48

2.4.4. Hằng số vật lý của các hợp chất

49

2.4.4.1. Hợp chất DQE-1 (chất mới)

49

2.4.4.2. Hợp chất DQE-2(chất mới)

50

2.4.4.3. Hợp chất DQE-3

51

2.4.4.4. Hợp chất DQE-4

51

2.4.4.5. Hợp chất DQE-5

52

2.4.4.6. Hợp chất DQE-6

53

2.4.4.7. Hợp chất DQE-7

53

2.4.4.8. Hợp chất DQE-8

54

Chương 3: Kết qủa và thảo luận

55

3.1. Nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus)

55

3.1.1. Mẫu nấm

55

3.1.2. Phân lập các hợp chất

55

3.1.3 Xác định cấu trúc các hợp chất

56

3.1.3.1. Hợp chất NDM-1 (chất mới)

56

3.1.3.2. Hợp chất NDM-2 (chất mới)

64

3.1.3.3. Hợp chất NDM-3

70


vi
3.1.3.4. Hợp chất NDM-4

71

3.1.3.5. Hợp chất NDM-5

72

3.1.3.6. Hợp chất NDM-6

74

3.1.3.7. Hợp chất NDM-7

76

3.1.3.8. Hợp chất NDM-8

78

3.1.3.9. Hợp chất NDM-9

80

3.1.3.10. Hợp chất NDM-10

83

3.1.3.11. Hợp chất NDM-11

83

3.1.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất nigrofomin A và nigrofomin B

85

3.2. Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis)

86

3.2.1. Mẫu nấm

86

3.2.2. Phân lập các hợp chất

86

3.2.3 Xác định cấu trúc các hợp chất

87

3.2.3.1. Hợp chất DQE-1 (chất mới)

89

3.2.3.2. Hợp chất DQE-2 (chất mới)

95

3.2.3.3. Hợp chất DQE-3

101

3.2.3.4. Hợp chất DQE-4

103

3.2.3.5. Hợp chất DQE-5

103

3.2.3.6. Hợp chất DQE-6

103

3.2.3.7. Hợp chất DQE-7

108

3.2.3.8. Hợp chất DQE-8

10

3.2.4. Hoạt tính sinh học của hợp chất tramecubin A (DQE-1)

111

Kết luận

116

Danh mục công trình công bố

118

Tài liệu tham khảo

119

Phụ lục

133

vii

DANH SÁCH BẢNG

Trang
Bảng 3.1. Các hợp chất phân lập từ quả thể nấm đa niên lỗ đen

55

Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-1

63

Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-2

69

Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H-NMR của chất NDM-3

70

Bảng 3.5: Số liệu phổ 1H-NMR của chất NDM-4

72

Bảng 3.6: Số liệu phổ NMR của chất NDM-5

73

Bảng 3.7: Số liệu phổ NMR của chất NDM-6

75

Bảng 3.8: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-7

77

Bảng 3.9: Số liệu phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất NDM-8

79

Bảng 3.10: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-9

81

Bảng 3.11: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-11

84

Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất nigrofomin A và

85

nigrofomin B
Bảng 3.13: Các hợp chất phân lập từ quả thể nấm vân chi

87

Bảng 3.14: Số liệu phổ NMR của hợp chất DQE-1

93

Bảng 3.15: Bảng dữ liệu phổ NMR của chất DQE-2

99

Bảng 3.16: Bảng dữ liệu phổ NMR của chất DQE-3

102

Bảng 3.17: Bảng dữ liệu phổ NMR của chất DQE-6

104

Bảng 3.18: Số liệu phổ NMR của hợp chất DQE-7

106

Bảng 3.19: Số liệu phổ NMR của hợp chất DQE-8

109

Bảng 3.20: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào 3 dòng ung thư của hợp chất

111

tramecubin A
Bảng 3.21: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật của hợp chất tramecubin A

112


viii

DANH SÁCH HÌNH

Trang
Hình 1.1. Ảnh nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus)

26

Hình 1.2. Ảnh nấm vân chi (Trametes cubensis)

27

Hình 3.1: Phổ ESI-MS của hợp chất NDM-1

56

Hình 3.2: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất NDM-1

57

Hình 3.3: Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất NDM-1

57

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của hợp chất NDM-1

58

Hình 3.5: Phổ HSQC của hợp chất NDM-1

59

Hình 3.6: Sự tương tác xa HMBC (H→C) trong hợp chất NDM-1

60

Hình 3.7: Phổ HMBC của hợp chất NDM-1

60

Hình 3.8: Phổ NOESY của hợp chất NDM-1

61

Hình 3.9: Sự tương tác xa (H↔H) trong phổ NOESY của chất NDM-1

61

Hình 3.10: Cấu trúc X-ray của hợp chất NDM-1

62

Hình 3.11: Phổ ESI-MS của hợp chất NDM-2

64

Hình 3.12: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất NDM-2

65

Hình 3.13: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất NDM-2

66

Hình 3.14: Phổ 1H-NMR của chất NDM-2

66

Hình 3.15: Phổ HMBC của NDM-2

67

Hình 3.16: Phổ NOESY của NDM-2

68

Hình 3.17: Sự tương tác xa (H↔H) trong phổ NOESY của NDM-2

69

Hình 3.18: Tương tác xa HMBC (H  C) trong hợp chất NDM-5

73

Hình 3.19: Tương tác xa HMBC (H  C) trong hợp chất madolin A

77

Hình 3.20. Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất DQE-1

87

Hình 3.21. Phổ khối lượng HR-ESI-MS của hơp chất DQE-1

88

Hình 3.22: Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DQE-1

89


ix
Hình 3.23: Phổ 1H-NMR của hợp chất DQE-1

89

Hình 3.24: Phổ 1H-NMR của hợp chất DQE-1

90

Hình 3.25: Phổ HMBC của chất DQE-1

91

Hình 3.26: Phổ COSY của chất DQE-1

92

Hình 3.27: Phổ NOESY của chất DQE-1

92

Hình 3.28: Sự tương tác H→C trong phổ HMBC, H→H trong phổ COSY

93

của chất DQE-1
Hình 3.29: Phổ khối lượng ESI-MS của DQE-2

95

Hình 3.30: Phổ khối lượng HR-ESI-MS của DQE-2

95

Hình 3.31: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất DQE-2

96

Hình 3.32: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất DQE-2

97

Hình 3.33: Phố 1H-NMR của hợp chất DQE-2

97

Hình 3.34: Phổ HMBC của DQE-2

98

Hình 3.35: Phổ NOESY của DQE-2

99

Hình 3.36: Sự tương tác xa HMBC( H→C)của DQE-2

99

Hình 3.37: Sự tương tác H→C trong phổ HMBC của hợp chất DQE-6

104

Hình 3.38: Tương tác xa HMBC (H  C) của hợp chất DQE-7

106

Hình 3.39: Tương tác xa HMBC (H  C) của hợp chất DQE-8

109


x

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Trang
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất (NDM) -1, -2, -3, -4, -8 và -9

35

Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất (NDM) -7, -8, -9, -10, -11

36

Sơ đồ 2.3. Sơ đồ chiết quả thể nấm Trametes cubensis

45

Sơ đồ 2.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất (DQE) -2, -6, -7, -8

46

Sơ đồ 2.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất (DQE) -3, -4, -5

47


xi

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

CC: Column Chromatography (Sắc kí cột)
FC: Flash Chromatography (Sắc ký cột nhanh)
TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng)

HPLC: High Performance Liquid Chromatography(Sắc ký lỏng cao áp)
IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)
MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng)
EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối va chạm electron)
ESI-MS: Electron Spray Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng phun mù electron)
HR-ESI-MS: High Relution-Electron Spray Impact Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng
phân giải cao phun mù electron)
1

H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton)
13

C-NMR: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13-

cacbon)
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer.
HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation
HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation
NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
s: singlet
br s: singlet tù
t: triplet
d: dublet
dd: dublet của duplet
dt: doublet của triplet
m: multiplet

xii
TMS: Tetramethylsilan
DMSO: DiMethylSulfoxide
Đ.n.c.: Điểm nóng chảy.
EC50: Giá trị 50% các tế bào hoặc gốc tự do bị chết hoặc được tạo ra bởi DPPH được
trung hòa.


1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thời tiết thuận lợi nên là một
trong những quốc gia có sự đa dạng sinh học cao so với các quốc gia khác trên thế giới
với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao và 3000 loài động vật có xương sống đã được mô
tả. Số loài nấm trên lãnh thổ Việt Nam ước lượng gấp 6 lần số loài thực vật bậc cao,
khoảng 80.000 loài trong đó có 2500 loài nấm đã được định danh, nấm lớn chiếm 1400
loài thuộc 120 chi. Nấm đảm (Basidiomycota) chiếm ưu thế với hơn 90% tổng số loài,
nấm nang (Ascomycota) chiếm 8%; nấm nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5%; nấm nội cộng
sinh (Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5% đã được ghi nhận. Nấm dược liệu ở Việt Nam
có khoảng hơn 700 loài trong đó có rất nhiều các loài dược liệu quý như Linh chi
(Ganoderma), nấm Vân chi (Trametes), đông trùng hạ thảo (Cordycep)…[6, 31, 32].
Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đã cho thấy nấm lớn là nguồn
tài nguyên vô tận ẩn chứa các hợp chất có tác dụng dược liệu (polysaccarit, polysaccaritprotein..) dùng để điều trị bệnh [47]. Ở Việt Nam có ít nhất 651 loài thuộc 182 chi có
chứa các hợp chất polysaccarit có tác dụng dược liệu [81], chúng hầu hết là các glucan
với nhiều kiểu liên kết glucosit khác nhau, những hợp chất này có khả năng chống ung
thư, diệt virut HIV hay hỗ trợ cho hệ miễn dịch của cơ thể con người [14, 16]. Ngoài
những hợp chất có khối lượng lớn, những hợp chất chuyển hoá thứ cấp có khối lượng nhỏ
như triterpenoit, flavonoit,…được phân lập từ nấm lớn, nhiều hợp chất đã được ghi nhận
có khả năng kháng ung thư, kháng khối u, kháng virut hay kháng khuẩn, kháng nấm
[126].

Nấm dược liệu ở Việt Nam phong phú, nhiều loài là thuốc quý trong y học cổ
truyền, là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá cho khoa học và thực tiễn nhưng chưa được
các nhà khoa học nghiên cứu nhiều, chỉ chủ yếu nghiên cứu về sự đa dạng sinh học [2, 3,
4, 6, 8, 9].
Hợp chất thiên nhiên đang tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong chương trình tìm
kiếm thuốc mới của ngành công nghiệp dược và những ngành nghiên cứu khác. Một lý


2
do quan trọng trong việc sử dụng các sản phẩm thiên nhiên như nguồn các hợp chất có
vai trò là những chất lý tưởng vì chúng có cấu trúc rất đa dạng phong phú và hoạt tính rất
thú vị. Hơn nũa, các hợp chất có hoạt tính sinh học được tìm thấy từ thiên nhiên có thể
dùng trực tiếp trong y học, nhiều hợp chất khác được dùng như chất dẫn đường hoặc
phân tử hiên đại (mẫu) trong lĩnh vực tổng hợp và bán tổng hợp thuốc. Ngày nay, các hợp
chất thiên nhiên và dẫn xuất của chúng chiếm 50% lượng thuốc điều trị lâm sàng. Trong
đó các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật bậc cao chiếm 25%. Theo các
nghiên cứu gần đây của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khoảng 80% dân số thế giới lựa
chọn các bài thuốc y học cổ truyền nhằm chăm sóc sức khoẻ.
Chúng tôi nhận thấy việc nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học của các
loài nấm dược liệu rất cần thiết, giúp cho chúng ta hiểu hơn về giá trị dược học cũng như
kinh tế và tầm quan trọng của nguồn nấm dược liệu ở nước ta. Chính vì vậy mà chúng tôi
chọn đề tài “Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ quả thể nấm đa niên lỗ
đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) và nấm vân chi (Trametes cubensis
(Mont.) Sacc.) ở vùng Bắc Trung Bộ” nhằm nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên bằng
cách sử dụng các kỹ thuật hiện đại nhằm phân tích, phân lập và xác định cấu trúc hiện
đại. Đồng thời, thử nghiệm hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thư và hoạt tính kháng
khuẩn, kháng nấm của các hợp chất này.
2. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes
melanoporus (Mont.) Murrill) và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.)

được thu hái ở vùng Bắc Trung Bộ Việt Nam.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Chiết hỗn hợp các chất từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus)
và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis);
- Sử dụng các phương pháp sắc ký để phân lập các hợp chất từ dịch chiết của hai
loại nấm trên;
- Xác định cấu trúc của những hợp chất phân lập được;
- Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được.


3
4. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về được rửa sạch, sấy khô ở 400C. Việc
xử lý tiếp các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu
được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm.
- Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: sử dụng các
phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích và điều chế, sắc ký cột
nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích và điều chế trên các pha đảo, pha silica gel.
- Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học các hợp chất được
phân lập được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử ngoại (UV),
phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù
electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân
một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1H-NMR,
13

C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC.
- Cấu hình tương đối của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp

phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY và phương pháp nhiễu xạ tia X (X-Ray).

- Thăm dò các hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thư và hoạt tính kháng khuẩn,
kháng nấm.
5. Những đóng góp mới của luận án
Đây là công trình nghiên cứu về thành phần hoá học và cả về hoạt tính sinh học
của một số chất phân lập được từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus)
và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) lần đầu tiên ở Việt Nam.
* Từ dịch chiết quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) đã phân
lập và xác định cấu trúc 11 hợp chất:
-

04 hợp chất secquiterpenoit: nigrofomin A, nigrofomin B, madolin A và

dehydrovomifoliol. Nigrofomin A và nigrofomin B là các hợp chất mới;
-

02 hợp chất steroit: ergosterol và ergosterol peroxit;

-

03 hợp chất phenolic: trans-p-hydroxycoumaric, metyl ferulat và (2-hydroxy-

phenyl) axetat;


4
-

01 hợp chất lacton: γ-(4-metyphenyl)-γ-metyl-γ-butyrolacton;

-

01 hợp chất axit benzoic;

Các hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ loài nấm này.
* Xác định được các thông số cấu trúc tinh thể của hợp chất nigrofomin A. Các số
liệu về tinh thể học của hợp chất này hiện được lưu trữ tại Trung tâm dữ liệu Cambridge.
* Hai hợp chất nigrofomin A và nigrofomin B đều có khả năng gây độc các dòng
tế bào bệnh bạch cầu cấp tính (Jurkat), ung thư biểu bì vòm họng ở người (NPCTW01), ung thư phổi (NCI-H661).
* Từ dịch chiết quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) phân lập được 8 hợp
chất:
-

04 hợp chất triterpenoit: tramecubin A, tramecubin B, axit eburicoic, 3β-

hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic. Tramecubin A và tramecubin B là các hợp chất
mới;
-

02 hợp chất steroit: ergosterol, ergosterol peroxit;

-

02 hợp chất coumarin: oospolacton và oospoglycol;

Các hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ loài nấm này.
* Hợp chất mới tramecubin A và tramecubin B tiến hành thử hoạt tính khả năng
gây độc tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu), ung thư biểu mô liên kết (RD);
hoạt tính kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn Gr (-) (ATCC 25922), vi khuẩn Gr (+)
(ATCC 25923); hoạt tính kháng nấm với chủng nấm sợi (439, M42), nấm men (ATCC
7754, SH 20) với các kết quả âm tính.

Kết quả thử sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập gợi mở khả
năng ứng dụng là nguồn nguyên liệu cho thực phẩm chức năng.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án bao gồm 119 trang với 19 bảng số liệu, 36 hình và 5 sơ đồ với 124 tài liệu
tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (28 trang), phương
pháp và thực nghiệm (24 trang), kết quả và thảo luận (61 trang), kết luận (2 trang), danh
mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (13 trang). Ngoài ra còn có phần phụ
lục gồm 110 phổ của một số hợp chất chọn lọc.


5
Chương 1
TỔNG QUAN

1.1. Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn
1.1.1. Giới thiệu về nấm lớn
Trong hàng ngàn năm qua, nấm được con người biết đến, sử dụng như một nhóm
sinh vật quan trọng và phong phú trong lĩnh vực dược học, thực phẩm. Hiện nay, giới
nấm chủ yếu gồm bốn ngành rộng, Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, và
Basidiomycota, các chi thuộc giới nấm được tìm thấy đóng vai trò là một trong những
nguồn đa dạng sinh học rộng bao gồm cả trên mặt đất và dưới nước, góp phần đặc biệt
quan trọng trong sự hình thành hệ sinh thái học của hành tinh chúng ta.
Số loài nấm trên lãnh thổ Việt Nam ước lượng gấp 6 lần số loài thực vật bậc cao,
khoảng 80.000 loài trong đó có 2500 loài nấm đã được định danh, nấm lớn chiếm 1400
loài thuộc 120 chi. Nấm đảm (Basidiomycota) chiếm ưu thế với hơn 90% tổng số loài,
nấm nang (Ascomycota) chiếm 8%; nấm nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5%; nấm nội cộng
sinh (Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5% đã được ghi nhận [7, 45, 31, 32].
Theo thống kê của Trịnh Tam Kiệt, số loài nấm lớn Việt Nam là khoảng 22.000 loài
trong đó khoảng 1.000 loài là nấm mục gỗ, 700 loài có giá trị làm thuốc. Từ xa xưa,
người phương Đông đã biết dùng nhiều loài nấm để làm thuốc bổ, tăng cường thể lực,

phòng chống bệnh tật như các loài nấm sau: Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis),
phục linh, vân chi, linh chi, nấm hương… Những loài nấm này được sử dụng rộng rãi,
với nhiều bài thuốc dân gian khác nhau nhằm điều trị nhiều loại bệnh. Trong những
phương thuốc này, hai loài nấm C.sinesis, Ganoderma lucidum được xếp vào loại thuốc
quan trọng [7, 31, 35, 90].
Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây cho thấy rằng lớp nấm nang, nấm sinh sản vô tính
và nấm đảm là những loài nấm có khả năng sản sinh ra các sản phẩm chuyển hóa bậc hai
có hoạt tính sinh học, quen thuộc nhất là từ các loài nấm thuộc các chi Aspergillus,
Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Phoma, Alternaria, Acremonium, và Stachybotrys,
Ganoderma, Lactarius và Aureobasidium [111].


6
Số lượng các nghiên cứu được đầu tư công nghệ phân lập, phân loại nấm ngày
càng nhiều, ngày càng hiện đại. Do đó, từ những năm 1990 đến nay, nhiều mẫu nấm lớn
trên thế giới đã được tìm thấy, đặc biệt là nấm ký sinh côn trùng và nấm biển được chú ý
như nguồn nguyên liệu mới, đa dạng có hiệu quả tốt nhằm cung cấp cho ngành dược liệu.
Nấm lớn dược liệu có số lượng rất lớn, có sự đa dạng sinh học phong phú [15, 72].
1.1.2. Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn
Trong lịch sử nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm lớn, hợp chất chuyển
hoá bậc hai được phân lập đầu tiên là từ nấm lớn là axit mycophenolic từ P.glaucoma
được công bố bởi Gosio. Đến năm 1929, nhà bác học Alexander Fleming công bố hợp
chất penicillin được phân lập từ nấm mốc Penicillium notatum, có khả năng kháng khuẩn
hiệu quả được sử dụng rộng rãi trong chiến tranh thế giới lần thứ II. Đây là sự phát hiện
vĩ đại, cho thấy con đường mới, quan trọng mở ra con đường mới cho việc tìm ra các loại
thuốc trong y học hiện đại.
Năm 1940, các chất chuyển hoá bậc hai từ nấm lớn mới thật sự được sự chú ý đặc
biệt [125]. Từ đó đến nay, các nhà khoa học phân lập được khoảng hơn 8.600 hợp chất
chuyển hoá bậc hai có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ các loài nấm lớn [111].
1.1.2.1. Kháng khuẩn và kháng nấm

Qua nghiên cứu của các nhà khoa học trong thời gian gần đây thì có hơn 75% các
loài nấm lớn trên thế giới thể hiện khả năng kháng khuẩn [92]. Những hoạt tính này
không chỉ liên quan đến các hợp chất chuyển hoá có khối lượng nhỏ mà còn liên quan
đến những hợp chất có khối lượng lớn như polysaccarit…
Nấm lớn, đặc biệt là họ Polyporaceae, Ganodermaceae có lịch sử lâu dài trong
việc sử dụng làm thuốc, chẳng hạn như Fomes fomentarius sử dụng làm thuốc cầm máu,
băng bó vết thương ở thế kỷ 18, 19 [8, 81]. Cho đến nay, nhiều nghiên cứu công bố cho
thấy khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất phân lập từ các loài nấm lớn,
chẳng hạn từ Ganoderma lucidum, Ganoderma resinoceum, Ganoderma pfeifferi thể hiện
khả năng kháng khuẩn dòng Baccillus subtilis. Hợp chất ganomycin A (1) và ganomycin
B (2) phân lập từ nấm Ganoderma pfeifferi có khả năng kháng nhiều dòng vi khuẩn như
dòng Gram (+): B. subtilis, S. aureus, Micrococcus flavus [71].


7
OH
HO

R
COOH

(1) Ganomycin A (R=OH)
(2) Ganomycin B (R=H)

Hợp chất isocoumarin có tên oospolacton (3) được phân lập từ quả thể nấm
Gleophyllum sepiarium thể hiện khả năng kháng chủng nấm Alternaria với giá trị MIC ở
12,5-25 µg/mL [74].
OH

O

O

(3) Oospolacton

Nhóm hợp chất khác có khả năng kháng nấm nữa đó là những hợp chất polyketit
chẳng hạn như axit merulinic A, B và C (4-6) được phân lập từ quả thể nấm Merulius
tremellosus và Phlebia radiata [28].

(4) Axit merulinic A (R1=OH, R2=H)
(5) Axit merulinic B (R1=H, R2=OH)
(6) Axit merulinic C (R1=H, R2=H)

Hợp chất axit mirulinic thể hiện khả năng kháng nấm với giá trị MIC trong khoảng
0,4-10 µg/mL, chống lại các chủng nấm Arthrobacter citreus, B. subtilis,
Corynobacterium insidiosum, Micrococcus roseus và Sarcina lutea. Hợp chất 5 và 6 thể
hiện khả năng kháng chủng nấm Micrococcus phlei, trong khi hợp chất 4 không có khả
năng này. Ngoài ra, hợp chất 5 còn có khả năng kháng các chủng nấm S. aureus và
Proteus vulgaris.


8
Nấm Merulius tremellosus không sản sinh hợp chất 5 nhưng tạo ra hợp chất
secquiterpenoit merulidial (7), có khả năng kháng nấm cao hơn hợp chất 5 [28]. Hoạt tính
sinh học của hợp chất 7 do trong phân tử sự có mặt của hai nhóm andehit [78].
OH
H

OHC
CHO

(7) Merulidial

Khả năng kháng khuẩn của các hợp chất secquiterpen phải kể đến
desoxyhypnophilin (8), hypnophilin (9), 6,7-epoxy-4(15)-hirsuten-5-ol (10) và 6,7epoxy-4(15)-hirsuten-1,5-diol (11) với kiểu khung hirsutan được phân lập từ quả thể nấm
Lentinus crinitus [10].
H

O

O
H
R

(8) Desoxyhypnophilin (R=H)

(10) 6,7-epoxy-4(15)-hirsuten-5-ol (R=H)

(9) Hypnophilin (R=OH)

(11) 6,7-epoxy-4(15)-hirsuten-1,5-diol (R=OH)

Trong đó, hợp chất 8 và 9 thể hiện khả năng kháng chủng khuẩn Gram (+)
Bacillus cereus và các chủng Aspergillus niger, Aspergillus flavus và Mucor rouxii. Khả
năng kháng khuẩn của những hợp chất 8 và 9 do hệ thống không bảo hoà trong phân tử
tạo nên. Sự thay thế nhóm cacbonyl trong hợp chất 8 bằng nhóm hidroxyl làm cho hợp
chất 10 mất khả năng kháng khuẩn. Hợp chất 9 còn được phân lập từ quả thể nấm
Pleurotellus hypnophilus cùng với pleurotellol (12), axit pleurotellic (13) [49].
H

O

O
H
R

(12) Pleurotellol (R=CH2OH)
(13) Axit pleurotellic (R=COOH)


9
Ngoài khả năng kháng khuẩn, kháng nấm thì hợp chất 9 và 12 còn có khả năng
kìm hãm sự phát triển của thực vật [59].
Hai hợp chất hirsutan khác có tên axit hirsutic (14) và axit complicatic (15) được
phân lập từ Stereum compliatum [64], hợp chất (15) thể hiện khả năng kháng khuẩn dòng
S. aureus [60].
H

O

O

COOH

H

(14) Axit hirsutic

(15) Axit complicatic

Khả năng kháng nấm của hợp chất secquiterpen β-D-xylosit có tên là aleurodiscal

(16) đã được phân lập từ quả thể nấm Aleurodiscus mirabilis. Hợp chất (16) có khả năng
chống lại một số chủng nấm ký sinh, đặc biệt là Mucor miehei [50].

(16) Aleurodiscal

Một số hợp chất steroit được phân lập từ Ganoderma applanatum như: 5α-ergost7-en-3β-ol (17), 5α-ergost-7,22-dien-3β-ol (18), 5,8-epidioxy-5α,8α-ergost-6,22-dien-3βol (19), và một chất mới lanostanoit (20) cũng có khả năng chống lại chủng khuẩn Gram
(+) [88].

H

H

HO

H

H

HO

(17) 5α-ergost-7-en-3β-ol

(18) 5α-ergost-7,22-dien-3β-ol


10
COOH
HO
O
OH

O

O

O

H

O

HO

O

HO

(19) 5,8-epidioxy-5α,8α-ergost-6,22-dien-3β-ol

(20) Lanostanoit

Một số hợp chất triterpen với kiểu khung lanostan có tên axit polyporenic C (21),
axit 3α-axetyloxylanosta-8,24-dien-21-oic (22), axit pinicolic A (23), axit trametenolic B
(24) và axit fomitopsic (25) được phân lập từ Fomitopsis pinicola, những hợp chất này có
khả năng kháng khuẩn dòng B. subtilis nhưng chỉ thể hiện khi thử trên TLC với nồng
khối lượng từ 0,01-1 µg nhưng lại không thể hiện khả năng này khi thử trên bản agar với
nồng độ lên tới 50 µg/mL [42].
HOOC

OH

H
O

(21) Axit polyporenic C

(22) Axit 3α-axetyloxylanosta-8,24-dien-21-oic

HOOC

H
O

(23) Axit pinicolic A

(24) Axit trametenolic B

Các chi Agaricus, Favolaschia và Filoboletus chứa các hợp chất strobilurin A
(26), E (27), và F1 (28), 9-methoxystrobilurin A (29), oudemansin A (30), những hợp
chất thơm này thể hiện khả năng kháng nấm với giá trị MIC 0,1-1 µg/mL.


11

HOOC

OH O
H3COOC

H
O

(25) Axit fomitopsic

R2
R1

O

O

H3COOC

OCH3

O
O

(26) Strobilurin A (R1=H, R2=H)

H3COOC

OCH3

(27) Strobilurin E

(28) Strobilurin F1 (R1=OH, R2=H)
(29) 9-methoxystrobilurin A (R1=H, R2=OCH3)
OCH3

H3COOC

OCH3

(30) Oudemansin A

Những hợp chất strobilurin và oudemansin còn có khả năng ngăn cản sự phát triển
của nấm gây bệnh ở nồng độ rất thấp [59]. Những hợp chất này có khả năng tấn công vào
trung tâm oxi hoá ubiquinol của vi khuẩn xenluloze (BC1) [59]. Vì khả năng đặc biệt đó,
chúng trở thành những hợp chất dẫn đường để tổng hợp nên những dẫn xuất có hoạt tính
mạnh hơn và được sử dụng diệt nấm trong nông nghiệp [20].
Ngoài những hợp chất có cấu trúc phức tạp và khối lượng lớn có khả năng kháng
nấm và kháng khuẩn thì những hợp chất có cấu trúc hợp chất thơm đơn giản cũng có hoạt
tính đó, chẳng hạn như anisandehit (31), (4-metoxyphenyl)-1,2-propanediol (32) được
phân lập từ Pleurotus pulmonarius và Bjerkandera adusta, những hợp chất này thể hiện
khả năng kháng nấm yếu [22].