THIẾT KẾ VÀ CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TỦY XƯƠNG LÊN MÀNG

Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
1
1.1. Công nghệ vật liệu trong y sinh học: [1], [7], [8], [21], [29]





Hình 1: Tai nhân tạo, một trong những thành tựu của công nghệ vật liệu
Công nghệ vật liệu là một trong những lónh vực tiềm năng vì các cơ
quan cấy ghép lấy từ cơ thể người cho thường được cung cấp rất hạn chế.
Mỗi năm có khoảng 19.000 ca cấy ghép được thực hiện tại Mỹ và khoảng
56.000 bệnh nhân tại đất nước này cần được ghép cơ quan, thậm chí có
trường hợp một người phải chờ đợi tới 13 năm. Các ca mổ này thường rất khó
khăn và tốn kém, đòi hỏi bệnh nhân phải trải qua một chế độ nghiêm ngặt vì
hệ miễn dòch bò suy giảm. Đây là thử thách lớn trong điều trò bằng phẫu thuật
cấy ghép.
Cho đến nay, một số sản phẩm vật liệu được đưa ra thò trường, vật
liệu thay thế da, xương và sụn.
Vật liệu sinh học trong nuôi cấy mô được sử dụng để hỗ trợ, hướng
dẫn các tế bào trong các cấu trúc 2 và 3 chiều chuyên biệt. Chúng được biết
đến với thuật ngữ ECM (Extracellular matrix), ECM có cấu trúc khung bao
gồm các proteins, carbohydrates và các phân tử tín hiệu. Giàn giáo lí tưởng
làm bằng các vật liệu sinh học mang đến cho các tế bào những tín hiệu cần
thiết cho sự phát triển, biệt hóa và tương tác với nhau tạo nên các cấu trúc
mong muốn. Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng phân hủy chậm tạo thành
các hợp chất không độc hại trong khi mô mới được hình thành và xác nhập
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
2
với mô của người bệnh. Hơn thế nữa, vật liệu sinh học cần phải an toàn, dễ
sử dụng với giá cả hợp lí.

Những vật liệu sinh học đầu tiên được sử dụng trong giải phẫu thường
được nghiên cứu sao cho không độc, không gây đáp ứng miễn dòch và tự
phân hủy. Ngày nay, các nghiên cứu thường tập trung vào sự phát triển của
vật liệu sinh học với những đặc tính mới như: khả năng phân hủy có thể điều
chỉnh, khả năng hỗ trợ cho tương tác tế bào. Trong đó, quan tâm nhất là sự
sát nhập của các phân tử tín hiệu sinh học với vật liệu sinh học.





Hinh 2: Hình ảnh của một khuôn tái sinh da điển hình có cấu trúc lỗ
xốp dưới kính hiển vi điện tử quét. Cấu trúc này cho phép tế bào len lỏi bên
trong.
Vật liệu sinh học có thể được làm bằng các chất tổng hợp (lactide,
glycolide, ceramics), dạng tự nhiên (collagen, các polysaccharide tự nhiên)
hay những vật liệu bán tổng hợp (poly-4-hydroxybutyrate, axit polylactic và
polyglycolic hay là sự kết hợp của các thành phần trên để tạo ra các loại vật
liệu dùng trong thử nghiệm lâm sàng và trong nghiên cứu. Một số thành tựu
điển hình của công nghệ vật liệu có thể kể đến như:
Các polymer tổng hợp có khả năng phân hủy được (VD: Chất dẻo
chòu nhiệt). Sự tạo thành của chúng có thể biến đổi bỡi nhiệt độ (từ nhiệt độ
phòng đến nhiệt độ của cơ thể) [7].
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
3
¾ Những vật liệu hỗn hợp làm từ polylactide-co-glycolide
hứa hẹn nhiều tiềm năng cho vật liệu thay thế xương [7].
¾ Các hydrogel tổng hợp được biến đổi ở một vài đoạn
peptide giúp cho các tế bào có thể đònh cư vào gel. Bởi tính thấm tốt cho chất
dinh dưỡng và khí, tính tương hợp sinh học và một số đặc điểm khác.

Hydrogel là vật liệu tiềm năng cho các ứng dụng về công nghệ mô.
¾ Sự quang polymer hóa có thể tạo ra các khung có tính
linh động cao.
¾ Một số polymer như poly-4-hydroxybutyrate với tính
linh động cao và khả năng phân hủy sinh học được kiểm soát đã mở ra những
khả năng mới cho việc thiết kế các vật liệu sinh học.
¾ Các polymer kết hợp với protein được sản xuất dựa trên
sự phát triển của kỹ thuật gen và công nghệ vật liệu có khả năng phân hủy
sinh học và tính tương hợp sinh học cao. Sự kết hợp của các amino acid nhân
tạo có thể mang đến cho vật liệu những đặc tính rõ ràng.
1.2. Vật liệu sinh học thay thế da:
1.2.1. Giới thiệu: [1], [2], [7], [23], [24]
Da người là cơ quan phức tạp với nhiều chức năng:
¾ Điều nhiệt.
¾ Bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi sinh từ bên
ngoài.
¾ Giữ ẩm.
¾ Bảo vệ cơ học và làm lành vết thương.
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
4
Trong suốt hơn 30 năm qua, đã có nhiều nỗ lực để phát triển các sản
phẩm giống như da cho một vài trường hợp nguy kòch. Những sản phẩm này
không những đã đáp ứng được những yêu cầu nêu trên mà còn mang nhiều
đặc điểm có lợi khác như:
¾ Tạo những đáp ứng tăng sinh từ vết thương mà không
gây ra viêm hay loại thải.
¾ Bền và đàn hồi để có chức năng bình thường và tạo vẻ
bên ngoài.
¾ Có sắc tố giống với da thật.
¾ Thích hợp cho những ca nguy cấp và dễ dàng sử dụng.

Da nhân tạo có thể được ứng dụng trong điều trò bỏng, loét, giải
phẫu thẩm mó, khoảng 150.000 bệnh nhân hằng năm ở miền tây Châu u
cần được điều trò bằng da nhân tạo, nhưng con số này vẫn ít hơn số người bò
loét. Đây là một tổn thương không thể lành trong 6 tuần và duy trì trong
nhiều năm, gây tốn kém trong điều trò. Một số bệnh gây ra loét như tiểu
đường hay bệnh tónh mạch, số người mắc bệnh tăng lên theo tuổi và do lối
sống. Riêng ở Đức, có khoảng 2-3 triệu người bò loét, chi phí điều trò lên đến
hơn một tỉ euro.
Những mảnh da tổng hợp thường được sử dụng phổ biến trong điều trò
những tổn thương nêu trên. So với các kó thuật truyền thống như sử dụng da
người chết là vật thay thế, mảnh ghép tổng hợp có thuận lợi lớn là không phụ
thuộc vào nguồn da của người cho.



Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
5





Hình 3: Ảnh minh họa sự gắn kết của tế bào lên vật liệu
Có hai thành phần chính của da nhân tạo: khuôn, có thể làm bằng
collagen, axit hyaluronic, những polymer phân hủy sinh học bán tổng hợp
khác và những tế bào da khác nhau như keratin, fibroblast, melanin... Một số
sản phẩm đầu tiên trên thò trường để điều trò các vết bỏng sâu là: Epicel
(Enzyme Biosurgery, USA), Integra (Integra life sciences, USA), và
Transcyte (Smith & Nephew, UK). Tuy nhiên ngày nay đã có nhiều các sản
phẩm dùng để điều trò loét như: Apligraf (Organogenesis, USA), Dermagraft

(Advanced Tissue Sciences)…







Hình 4: Sự phối hợp của vật liệu, tế bào và các chất tăng trưởng trong
việc tạo thành cơ quan nhân tạo.
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
6
Các sản phẩm da nhân tạo cũng được sử dụng trong các thử nghiệm
invitro như thử nghiệm độc tố, dược lí học và thẩm mó…
1.2.2. Tiêu chuẩn cho vật liệu phủ vết thương: [1]
1.2.2.1. Tính thấm ướt nền vết thương và sự bám dính:
¾ Làm ướt bề mặt vết thương.
¾ Thích ứng với bề mặt vết thương.
¾ Bám dính hóa học với nền vết thương. Tránh sự tăng
sinh của lớp hạt.
¾ Bám dính ở tất cả các vùng. Nếu không sẽ hình thành
các túi không khí nhỏ giúp cho vi khuẩn sinh sôi.
¾ Năng lượng bề mặt của mảnh ghép và nền vết thương
nhỏ hơn giao diện của không khí và nền vết thương. Nền vết thương được
làm ướt, túi không khí được thải ra.
1.2.2.2. Sự tạo lỗ của mảnh ghép:
Mảnh ghép phải thấm được và ẩm. Nhưng độ ẩm lớn sẽ phá hủy giao
diện của vết thương và mảnh ghép. Độ ẩm nhỏ thì dòch tiết bên dưới mảnh
ghép sẽ nâng nó lên khỏi tấm nền vết thương. Lượng nước tối ưu: 5
mg/cm

2
/h.
Có khả năng tạo ra các lỗ giúp cho tế bào fibroblast phân chia và di
trú bên trong vật liệu. Bởi vì các tế bào biểu bì, trung mô trong vết thương có
đường kính 10 µm nên các lỗ phù hợp với trật tự này sẽ tạo thuận lợi cho
fibroblast đi vào bên trong vật ghép.
Sự di trú của tế bào phụ thuộc vào:
¾ Kích thước lỗ
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
7
¾ Bề dày mảnh ghép
Lỗ có đường kính nhỏ hơn 10 µm làm cho các tế bào fibroblast, biểu
bì không di chuyển xuyên qua lỗ, ta phải phân hủy khuôn giúp tế bào đi vào
bên trong vật liệu.
Vật liệu nếu dày sẽ làm chất dinh dưỡng từ nền vết thương đến mảnh
ghép bò hạn chế. Mảnh ghép mỏng dễ đứt gãy còn mảnh ghép dày sẽ cứng và
không dính với vết thương.
Khoảng cách giới hạn để duy trì chất dinh dưỡng tới tế bào đang di trú
được qui đònh bằng biểu thức không thứ nguyên bắt nguồn từ công thức
Thiele và được biến đổi bởi Wagner và Weisz:
R* L
2

S=
D* C
0

Trong đó: R : tốc độ sử dụng chất dinh dưỡng tới hạn của tế bào.
L : khoảng cách hỗ trợ chất dinh dưỡng khuyếch tán.
D : sự khuyếch tán chất dinh dưỡng qua màng được

hydrate hoá.
C
0
: nồng độ chất dinh dưỡng tại nền vết thương.
S : số không thứ nguyên.
S=1 thì tử và mẫu cân bằng, sự sinh trûng mao quản xảy
ra, cung cấp cho tế bào cơ chất và oxi.
1.2.2.3. Độ bền của vật ghép:
Vật ghép có độ bền cao giúp cho thao tác không bò rách, phủ vết
thương trong toàn bộ chu trình lành hóa.

Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
8
1.2.2.4. Tốc độ phân hủy sinh học:
Quá trình phân hủy sinh học gây đáp ứng viêm tối thiểu đối với vật
chủ. Ta cần tính toán, cân bằng tốc độ phân hủy vật liệu với thời gian cần
cho tái sinh tế bào.
Nếu mảnh ghép phân hủy nhanh thì vết thương không được che phủ
hiệu quả.
Nếu mảnh ghép phân hủy chậm thì sẽ hình thành sẹo và phối hợp vật
liệu vào trong vết thương.
1.2.2.5. Tính kháng nguyên:
Vật liệu thay thế da có khả năng bò loại ra và làm viêm cục bộ nếu có
tính kháng nguyên.
1.2.2.6. Cấu trúc vó mô:
Nếu không có giàn giáo (scaffold), nguyên bào sợi sẽ xắp xếp
collagen ngẫu nhiên và hình thành sẹo.
1.2.3. Phân loại các loại màng sinh học dang dược sử dụng hiện nay: [1]
1.2.3.1. Vật ghép tự nhiên:
Chủ yếu là autograft (da tự thân) và allograft (da từ người khác).

Tác dụng của autograft và allograft:
¾ Giảm số lượng vi khuẩn trên bề mặt được làm ướt của
vết thương.
¾ Giảm sự mất dòch và protein.
¾ Giảm đau.
¾ Hạn chế sự co cứng của vết thương.
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
9
¾ Tăng sự tạo mạch mới.
Hạn chế:
¾ Thiếu autograft ở bệnh nhân phỏng nặng.
¾ Khó khăn trong dự trữ allograft, có tính kháng nguyên.
Xenograft từ heo, là vật liệu che phủ tạm thời, đòi hỏi tiệt trùng cao,
bệnh nhân bỏng phải được xóa bỏ miễn dòch, mảnh ghép cuối cùng bò đẩy ra
và thay thế bằng autograft.
Màng ối: màng phủ vết thương tự nhiên tạm thời nhưng tăng sự tạo
hạt của nền vết thương. Do đó mảnh ghép của da sống lâu hơn nhưng cũng
có nhiều sẹo hơn.
1.2.3.2. Vật ghép tổng hợp:
Mảnh ghép đơn lớp: thường sử dụng collagen do:
¾ Nguồn chiết tách lớn.
¾ Liên kết chéo của collagen làm tăng độ bền và sức căng nhưng
cũng có khuynh hướng làm cho sợi cứng & dòn.
¾ Bám dính tự nhiên với vết thương lúc ban đầu do kết hợp với
fibrin.
¾ Collagenase xuất hiện trong nền vết thương & vi khuẩn từ nền
vết thương có thể làm tuột miếng xốp collagen này.
Mảnh ghép đa lớp:
Màng 2 lớp: bên trong là collagen & chondroitin-6-sulfate và lớp bên
ngoài là silastic. Có tác dụng ngăn chặn sự co vết thương với kích thước lỗ tối

ưu là 50 µm. Lớp silastic dày 0,1 mm, có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn trong
khi vẫn duy trì dòng nước thích hợp qua màng, cung cấp độ cứng cần thiết để
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
10
khâu mảnh ghép vào đúng chỗ, ngăn chặn sự di chuyển mảnh ghép trong
quá trình lành hóa vết thương. Vật liệu trên bám dính với vết thương trong
vài phút và tạo mạch mới trong 3 - 5 ngày.





Hình 5: Màng 2 lớp
Màng giai đoạn 2: các tế bào đáy của da được tách, nuôi cấy và được
đưa vào trong khuôn bằng cách tiêm trực tiếp hay sử dụng lực li tâm. Tế bào
biểu bì nhanh chóng tăng sinh. Sự thay thế da chức năng đạt được ở heo sau
4 tuần, tốc độ nhiễm trùng thấp, bề mặt đồng nhất, mềm dẻo và trơn láng
tương tự da bình thường.
1.2.3.3. Các đặc tính lí tưởng của vật liệu thay thế da:
¾ Bám dính nhanh, bền lên bề mặt vết thương.
¾ Cấu trúc cho phép sự cố đònh, di chuyển, tăng sinh, tăng
trưởng của các tế bào mô mới.
¾ Không thấm các vi khuẩn ngoại sinh.
¾ Giảm sự mất nước, mất điện giải, protein.
¾ Không tạo kháng nguyên, không gây dò ứng.
¾ Có tính linh động, độ co giãn cao nhưng vẫn bảo vệ vết
thương.
¾ Không gây độc.
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
11

¾ Có thể tiệt trùng được.
¾ Có thể hạn chế sự nhiễm trùng bên dưới.
¾ Giảm thiểu sự tạo sẹo.
¾ Giúp bám nhanh vết thương.
¾ Có khả năng thấm, chứa các chất kháng khuẩn.
¾ Khả năng phục hồi chức năng da sau chữa trò.
¾ Dễ bảo quản và bảo quản được lâu.
¾ Giá thành rẻ.
1.2.4. Các loại màng trên thò trường: [16], [27]
1.2.4.1. Orcell:
Khuôn tế bào hai lớp, là sản phẩm vật liệu nuôi cấy mô nhằm mục
đích hàn gắn các vết thương như bỏng, loét da gót chân do tiểu đường.
Orcell là vật liệu hai lớp có mang tế bào mà cụ thể là các tế bào
keratin và fibroblast của người. Hai loại tế bào này được nuôi trong hai lớp
tách biệt làm bằng collagen bò loại1. Tế bào fibroblast được nuôi ở mặt trên
và bên trong các lỗ của vật liệu trong khi tế bào keratin thì được nuôi ở bề
mặt không có lỗ được phủ ở trên.
Orcell là vật liệu tương hợp sinh học có khả năng hấp thu tốt, tạo điều
kiện lí tưởng cho sự di trú của các tế bào khởi động cho quá trình tái tạo mô
da. Các tế bào trên cũng tiết ra các cytokine và các hormon tăng trưởng.
Orcell cũng cung cấp một cấu trúc mở. Cấu trúc này giúp các tế bào có thể di
cư vào và xuyên qua các lỗ. Các lỗ trên vật liệu cho phép tế bào fibroblast
có thể di chuyển và tạo lại da. Trước khi đưa tế bào lên, vật liệu được tạo
thành và sau đó được phủ lên một lớp gel mỏng làm bằng collagen.
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
12
Nhiều thử nghiệm đã được thực hiện trên Orcell để đảm bảo rằng
không có các phản ứng nguy hiểm xảy ra. Các tế bào cũng được thử nghiệm
để cho kết quả âm tính với virus người, retrovirus, vi khuẩn, nấm…
1.2.4.2. Dermagraft:

Hình 6: Màng Dermagraft
Dermagraft là một màng thay thế trung bì dẫn xuất nguyên bào sợi
người. Cấu tạo màng Dermagraft gồm nguyên bào sợi, chất nền ngoại bào và
một giàn đỡ có thể hấp thu sinh học. Các nguyên bào sợi nuôi cấy được đưa
vào giàn đỡ mạng lưới polyglactin có thể hấp thu sinh học. Các nguyên bào
sợi tăng sinh để lấp kín các kẽ hở của giàn đỡ này, sản xuất collagen trung
bì, các protein nền, các nhân tố tăng trưởng và cytokine của người.
1.2.4.3. Transcyte:





Hình 7: Màng Transcyte
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
13
Tế bào fibroblast được phát triển trên một mạng lưới, nơi chúng phân
chia và sản xuất ra các nhân tố tăng trưởng, collagen và các protein khác để
tạo thành da người có chức năng cụ thể.
1.2.4.4. Integra: [30]

Hình 8: Màng integra
Integra là một nền polymer collagen – glucoaminoglycan (CG) có khả
năng phân hủy sinh học, được phủ một lớp polysiloxane (silicone) mỏng.
Collagen loại 1 của bò và chondroitin-6-sulfate (một trong số các
glycoaminoglycan chính) được ủ chung với nhau, được làm lạnh khô và khâu
mạch.
Kích thước lỗ được xác đònh để tối đa sự tăng trưởng của tế bào và
mức độ khâu mạch cũng như thành phần GAG được thiết kế để kiểm soát tốc
độ phân hủy của chất nền.
Sau 2 – 3 tuần ghép, trung bì mới và mạch mới được hình thành.





Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
14
1.2.4.5. Apligraf: [25], [26]





Hình 9: Màng Apligraft
Được sử dụng bằng cách đưa các tế bào fibroblast lên trên vật liệu để
tạo lớp dưới. Khi tế bào fibroblast di chuyển xuyên qua collagen, lớp da được
thay đổi, sản xuất ra nhiều collagen hơn. Lúc này, các tế bào keratin được
đặt lên trên, tạo thành lớp biểu mô ở trên. Lớp biểu mô này tiếp xúc với
không khí, là lớp bên ngoài có chức năng bảo vệ của da.
1.2.4.6. EZ Derm: [3]

Hình 10: Màng EZ Derm
EZ Derm là một mảnh ghép da dò loại từ heo đã được biến đổi hóa
học để bảo quản.
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
15
Tất cả các yếu tố của trung bì từ trung bì heo gốc bò bất hoạt theo quy
trình hóa học, không giống như trung bì heo đông lạnh sẵn có. Tuy nhiên,
màng phủ này không kích thích làm lành vết bỏng.
1.2.4.7. Promogran:
Hình 11: Màng Promogran
Màng phủ collagen Promogran là màng kết hợp collagen động vật
(55%) với cellulose tái sinh được oxi hóa (oxidized regernerated cellulose –
ORC) (45%). Vai trò của cellulose là hấp thu. ORC/collagen hấp thu các
protease thừa từ bề mặt vết bỏng.
Màng phủ ORC/collagen tạo ra một môi trường collagen hấp dẫn tế
bào và kích thích tăng trưởng mô.
1.3. Nguyên liệu thiết kế màng phủ vết thương:
1.3.1. Chitosan: [1], [7], [17]

Hình 12: Cấu tạo hóa học của chitosan
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
16
Chitosan là một polysaccharide, poly[β-(1-4)-2-amino-2-deoxy-D-
glucopyranose], được tạo ra do quá trình deacetyl hóa chitin tự nhiên. Chitin
và chitosan được biết từ lâu, nhưng gần đây chitin và chiosan mới được chú ý
nghiên cứu và sử dụng. Sản lượng chitosan trên thế giới hiện nay khoảng
2000 tấn/năm, điều này cho thấy mức độ và nhu cầu sử dụng nó trên thực tế.
Trong hóa học, chitosan được điều chế từ chitin. Chitin có nhiều trong
tự nhiên nhất là trong vỏ các loài động vật giáp xác như tôm, cua…. Mẫu
chitin nhận được từ nguồn vỏ tôm, cua qua quá trình xử lí như sau: vỏ tôm,
cua được xay nhỏ, loại protein bằng NaOH 0,005N, loại muối phosphate
bằng HCl 1N, loại protein trong cấu trúc vỏ bằng NaOH 2N ở 100
o
C. Sau đó
rửa sạch, sấy khô thu được chitin. Chitin được xử lí 1 hoặc 2 giờ trong dung
dòch NaOH 47% ở 110
o
C (hoặc 60
o
C) trong môi trường có nitrogen, sau đó
rửa nước ở 80
o
C đến trung hòa. Sản phẩm thu được có độ deacetyl hóa
khoảng 80%. Việc xử lí kiềm và rửa trong nước được lặp lại nhiều lần để thu
được sản phẩm chitosan có độ deacetyl hóa cao hơn.
Chitosan và các dẫn xuất của chitosan được nghiên cứu và ứng dụng
trong nhiều lónh vực khác nhau:
¾ Trong lónh vực môi trường, chitosan được xem như vật
liệu mới có tác dụng làm sạch nước, khí thải công nghiệp, thu hồi kim loại

nặng, protein chống ô nhiễm môi trường.
¾ Trong nông nghiệp, chitosan dạng dung dòch được phủ
lên hạt giống, có tác dụng chống nấm mốc và kích thích nẩy mầm hạt giống
làm tăng năng suất vụ mùa. Người ta còn sử dụng chitosan làm nguyên liệu
chính để điều chế chế phẩm bảo quản hoa tươi, hoa quả đóng hộp, thòt,
trứng, làm chất điều hòa sinh trưởng cho cây, bảo quản thực phẩm, chế phẩm
phòng chống nấm bệnh thực vật….
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
17
¾ Trong mó phẩm, chitosan dùng làm keo xòt tóc, kem
dưỡng da, làm chất keo cảm quan trong công nghiệp in, làm vải côn, làm
tăng độ bền màu vải nhuộm trong công nghiệp dệt.
¾ Các kết quả nghiên cứu dược lý của chitosan cho thấy:
chitosan có tính tương hợp sinh học khá cao: không gây độc tính ở các mức
độ cấp, bán cấp, độc tính tại chỗ, hay toàn thân. Chúng cũng không gây ảnh
hưởng đối với trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan, các chức năng gan, thận,
cơ quan tạo máu, các chỉ tiêu sinh hóa của máu và nứơc tiểu trong các thử
nghiệm dài hạn… nghóa là chúng có tính an toàn sinh học cao.
¾ Về tác dụng chữa bệnh, chitosan có tác dụng kháng
khuẩn và nấm, có khả năng thúc đẩy sự lành hóa vết thương. Thế nên nó
được sử dụng làm thuốc và màng sinh học trong điều trò tổn thương bỏng.
Chitosan còn dùng làm giảm lượng cholesterol trong máu, làm chỉ khâu phẫu
thuật tự tiêu, làm kính áp tròng, làm thuốc cầm máu, kích thích hệ thống
miễn dòch và làm chất mang đưa thuốc đến vùng cần trò liệu như khối u trong
điều trò ung thư.
¾ Chitin và chitosan tỏ ra thích hợp để ứng dụng trong lónh
vực dược phẩm vì chúng có tính tương hợp sinh học, thoái biến sinh học và
an toàn sinh học. Chitosan có thể dùng làm các chất phụ gia, tá dược các
loại, chất tạo màng, tạo vỏ viên nang mềm và cứng, chất mang sinh học dẫn
thuốc….

Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
18
1.3.2. Collagen và gelatin: [3], [12], [19]

Hình 13: Cấu tạo hóa học của gelatin
Khoản ¼ protein trong cơ thể là collagen. Collagen là một protein cấu
trúc chính hình thành các sợi phân tử, tạo sự rắn chắc cho gân và các phiến
đàn hồi nâng đỡ da và các cơ quan bên trong. Xương và răng được tạo thành
do việc thêm các tinh thể khoáng vào collagen.
Nguyên bào sợi tạo collagen. Quá trình tổng hợp collagen là tiến trình
kết hợp các axit amin thành những chuỗi liên kết với nhau để thành các phân
tử tạo ra các tơ, chúng gắn bó với nhau thành sợi rồi thành các bó collagen.
Collagen gồm ba chuỗi kết hợp tạo cấu trúc xoắn ba chặt, mỗi chuỗi
có chiều dài hơn 1400 axit amin, chủ yếu gồm glycin (xấp xỉ 1/3 gốc axit
amin), prolin và hydroxyprolin (hơn ¼ gốc axit amin).
Collagen bò biến tính ở nhiệt độ cao. Khi xoắn ba này được tháo xoắn,
các chuỗi tách rời, được làm lạnh và hấp thu nước mạnh sẽ tạo thành gelatin.
Như vậy, gelatin được thu nhận khi thủy phân giới hạn sợi collagen không
hòa tan. Thành phần và trình tự axit amin của gelatin tương tự collagen.
Gelatin có hàm lượng glycin, prolin và hydroxyprolin cao. Cấu trúc xoắn ba
của tropocollagen được bảo tồn trong gelatin, vì vậy gelatin có thể giữ nước
để tạo thành gel.

Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
19

Hình 14: Thành phần axit amin của collagen và gelatin
Gelatin không tan trong nước lạnh nhưng dễ hòa tan trong nước ấm.
Khi thêm nước lạnh, những hạt gelatin trương phồng, tăng đến 5 – 10 lần
trọng lượng trong nước. Khi tăng nhiệt độ lên 40
o
C, những hạt gelatin này
hòa tan để tạo thành dung dòch. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hòa tan của
gelatin là nhiệt độ, nồng độ và kích thước hạt.
Collagen thể hiện tính kháng nguyên ở điều kiện sinh lí khi sử dụng
trong sinh y. Gelatin được sử dụng nhiều trong các ứng dụng sinh y, đặc biệt
ứng dụng làm màng phủ vết thương, nhờ một số ưu điểm: không có tính
kháng nguyên, hoạt hóa đại thực bào, hiệu quả cầm máu cao, có thể được
hấp thu hoàn toàn invivo.
1.3.3. Axit Hyaluronic: [13], [14]
Axit hyaluronic, hay còn gọi là hyaluronan (HA), là một trong số các
polysaccharide nhầy có trọng lượng phân tử cao tồn tại với số lượng lớn ở
huyết thanh, mào gà, da cá mập và sụn cá voi.
HA có cấu tạo của một glucoaminoglycan, gồm một mạch không phân
nhánh chứa các chuỗi β-(1,4)-glucoronic acid và β-(1,3)-N-
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
20
acetylglucosamine sắp xếp một cách tuần tự tạo thành một dimer, mỗi dimer
như vậy có khối lượng là 450 dalton. Một phân tử HA có khoảng từ 1000
dimer như vậy. Protein gắn với HA (HABP) liên kết với HA bằng nối H

+
,
mỗi vò trí gắn HABP chứa khoảng 10 đơn vò dimer, phân tử HA phải chứa tối
thiểu 20 đơn vò cho hai vò trí gắn.

Hình 15: Cấu tạo hóa học của axit hyaluronic
HA chủ yếu do tế bào fibroblast và các tế bào liên kết mô tạo ra. HA
ở dòch khớp đi vào trong huyết tương thông qua hệ thống bạch huyết và
nhanh chóng rời khỏi máu bằng một cơ chế phụ thuộc receptor ở các tế bào
biểu mô của gan và bằng hoạt động của enzyme hyaluronidase.
HA được tìm thấy nhiều ở trạng thái liên kết với protein và
chondroitin sulfate ở khoảng không giữa các tế bào của mô liên kết như da
và nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc, ẩm độ của mô và
bảo vệ, chống lại sự xâm nhiễm của vi khuẩn. Khả năng giữ nước tuyệt vời
của HA cho phép nó có thể duy trì ẩm độ ở trong mắt, khớp nối và các mô
da.
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
21
Vì không bền ở dạng axit nên HA thường được chiết xuất và tinh chế
ở dạng muối natri. Natri hyaluronate có khả năng giữ nước cao và dung dòch
muối hyaluronate có độ nhớt cao.







Hình 16: Cấu tạo hóa học của muối hyaluronate
Trong lónh vực y dược, muối hyaluronate được sử dụng trong giải

phẫu bệnh đục nhân mắt, là thuốc chữa bệnh viêm khớp (dạng tiêm), giảm
thò lực…
ỨNG DỤNG:
HA-protein:
Khuôn xốp được tạo thành từ gelatin và hyaluronan bằng cách nhúng
hỗn hợp gelatin, hyaluronan vào hỗn hợp aceton:nước theo tỉ lệ 9:1 cùng với
một lượng nhỏ carbodiimide (EDC) để tạo liên kết chéo. Vật liệu xốp được
hình thành để phủ vết thương hoặc làm khuôn cho những ứng dụng nuôi cấy
mô. Khi được tẩm với sulfadiazine bạc, vật liệu trên có tác dụng làm lành
vết thương ở chuột [14].
Vật liệu được làm từ collagen và hyaluronan bằng cách kết hợp các
thành phần trên trong dung dòch axit acetic loãng. Sau đó tạo liên kết chéo
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
22
với glyoxal hay periodate-oxidized dialdehyde. Vật liệu này kháng được
collagenase và cho phép tế bào fibroblast phát triển [14].
Bên cạnh đó, vật liệu làm từ hydroxyapatite-collagen-hyaluronan
được tạo thành bằng cách thêm hydroxyapatite vào dung dòch hyaluronan.
Sau đó, trộn với các sợi collagen. Vật liệu sau cùng có 90% hydroxyapatite,
9,2% collagen và 0,8% hyaluronan có tính tương hợp sinh học cao, được sử
dụng để điều trò các tổn thương ở xương [14].
Hyaluronan-chitosan
Hỗn hợp hyaluronan và chitosan glutamate được tạo thành có độ nhớt
cao, có khả năng mang và thải gentamycin. Đây là sự kết hợp giữa khả năng
bám dính tốt của hyaluronan với hiệu quả xâm nhập mạnh mẽ của chitosan.
Phức hợp này được tạo thành ngay trong môi trường axit và bền vững với
một khoảng pH rộng. Hỗn hợp cũng cho thấy khả năng bám dính, tăng sinh
tế bào và làm lành vết thương [14].
1.3.4. EDC [1–ethyl–3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide]: [3]
Trong khi thiết kế màng phủ sinh học, các tác nhân khâu mạch có vai

trò làm giảm tốc độ phân hủy của vật cấy ghép do nó tạo thành các liên kết
chéo hóa học. Có nhiều tác nhân khâu mạch như :
¾ Tác nhân vật lí: nhiệt, bức xạ ion hóa.
¾ Tác nhân hóa học : formaldehyde, glutaraldehyde,
carbodiimide…
Tuy nhiên, tính độc của các tác nhân khâu mạch có ảnh hưởng rất lớn
trong việc phát triển các vật liệu sinh học. Glutaraldehyde là tác nhân khâu
mạch có hiệu quả, nhưng có tính độc cao khi thải vào cơ thể vật chủ sau
quá trình phân hủy sinh học thậm chí ở nồng độ 3 ppm.
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
23
Với tác nhân khâu mạch là 1–ethyl–3-(3-dimethylaminopropyl)
carbodiimide (EDC) được biết là không có tính độc và tương hợp sinh học
do EDC không hợp nhất vào trong cấu trúc xốp được khâu mạch, mà chỉ
biến đổi thành một dẫn xuất urea hòa tan trong nước. Tính độc của dẫn
xuất urea rất thấp so với EDC.
EDC là dẫn xuất tan trong nước của carbodiimide. Carbodiimide xúc
tác sự tạo thành liên kết amide giữa axit carboxylic và hoặc nhóm
phosphate và amine bằng cách hoạt hóa nhóm carboxyl hoặc nhóm
phosphate hình thành dẫn xuất O-urea.
EDC dễ bò mất hoạt tính trong môi trường nước nên thường sử dụng
dung môi hữu cơ để hòa tan.
Yêu cầu cần thiết của vật cấy ghép là cấu trúc lỗ bên trong xốp. Cấu
trúc lỗ có hai chức năng lâm sàng :
¾ Các kênh có lỗ là cổng vào cho sự di trú tế bào từ mô kề cận
vào chất thòt của vật ghép hay đối với sự thấm dòch từ mạch máu xuất huyết
gần kề.
¾ Các lỗ sẽ tương tác đặc trưng với tế bào đang xâm lấn hay
tương tác với các yếu tố đông máu khi máu chảy vào trong vật liệu (như
miếng xốp cầm máu).

Các lỗ được tạo ra đầu tiên bằng đông tụ huyền phù loãng sợi
collagen và sau đó thăng hoa tinh thể nước đá bằng cách phơi bày huyền
phù với chân không ở nhiệt độ thấp. Cấu trúc lỗ cuối cùng là mô hình âm
tính của mạng lưới tinh thể nước đá, kích thước của lỗ giảm khi nhiệt độ
đông giảm.

Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
24
1.4. Tế bào mầm của tủy xương: [6], [33]

Hình 17: Tế bào mầm của tủy xương quan sát dưới kính hiển vi
Một quần thể tế bào trong tủy xương chòu trách nhiệm trong việc hình
thành tất cả các dạng tế bào máu khác nhau trong cơ thể là những tế bào
mầm của mô tạo máu (HSC: hepatopoietic stem cell). HSC đã được nhận
diện từ hơn 40 năm nay. Ngoài ra, một quần thể tế bào khác trong tủy xương
là quần thể tế bào nền của tủy xương (Bone marrow stromal cell). Những tế
bào nền trong tủy xương là một hỗn hợp các quần thể tế bào có thể sản sinh
ra xương, sụn, mỡ, mô liên kết dạng sợi và hệ thống mạng lưới hỗ trợ cho sự
hình thành những tế bào máu. Những tế bào mầm trung mô của tủy xương
(MSC: Mesenchymal stem cell) cũng có thể tạo ra những mô này và tạo
thành cùng một quần thể tế bào như những tế bào nền tủy xương. Gần đây,
một quần thể những nguyên bào đònh hướng biệt hóa thành những tế bào nội
mạc, một loại tế bào nằm lót trong mạch máu và được phân lập từ vòng tuần
hoàn máu, được nhận biết là có nguồn gốc từ tủy xương. Dù rằng những
nguyên bào nội mạc giống với những nguyên bào mạch, loại tế bào tạo thành
mạch máu trong quá trình phát triển của phôi, nhưng việc chúng có đại diện
cho một quần thể tế bào mầm của tủy xương ở cá thể trưởng thành thật hay
không vẫn còn là điều không chắc chắn. Do đó, tủy xương dường như có
Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng
25

chứa 3 quần thể tế bào mầm là: HSC, MSC và có thể là cả nguyên bào nội
mạc.
1.4.1. Tế bào mầm của mô tạo máu (HSC: Hematopoietic Stem Cell):
Tế bào máu là một trong những tế bào có khoảng thời gian sống ngắn
nhất trong tất cả các loại tế bào của cơ thể (ví dụ tế bào hồng cầu không
nhân chỉ sống được khoảng 120 ngày), cho nên cuộc sống của động vật phụ
thuộc vào khả năng bổ sung liên tục những tế bào hồng cầu và những tế bào
máu khác của cơ thể. Quá trình bổ sung này xảy ra chủ yếu ở tủy xương nơi
mà những HSC cư trú, phân chia và biệt hóa thành những loại tế bào máu.
Những HSC có khả năng tự làm mới và tạo ra tất cả các loại tế bào máu của
cơ thể. Điều này có nghóa là một HSC đơn có khả năng tái sinh ra một hệ tế
bào tạo máu hoàn chỉnh. Hơn nữa, chúng còn có khả năng tái sinh lại hệ
thống mô tạo máu của động vật. Cơ sở của kết luận này là một thử nghiệm
trên đối tượng chuột nhắt. Những con chuột này nhận liều phóng xạ gây tử
vong để phá hủy hoàn toàn hệ thống mô tạo máu của bản thân chúng. Sau
đó, những HSC được cấy ghép vào tủy xương của chúng và hệ thống mô tạo
máu của chúng được tái sinh trở lại.
Cả vòng đời của HSC lẫn vòng đời của các loại tế bào máu đều bắt
đầu từ tủy xương đến máu và quay trở lại tủy xương dưới ảnh hưởng của một
loạt những yếu tố được tiết ra để điều hòa sự tăng sinh, biệt hóa và di trú của
chúng.
Những HSC được chứng minh là những tế bào mầm tạo máu lần đầu
tiên trong một loạt thí nghiệm ở chuột và những tế bào mầm tạo máu tương
tự cũng được chứng minh là có hiện diện ở người.
Có hai loại HSC là HSC dài hạn (long-term HSC) và HSC ngắn hạn
(short-term HSC). Những HSC dài hạn tăng sinh trong suốt đời sống của sinh