Kỹ thuật thụ phấn và nuôi cấy phôi invitro

Kỹ thuật thụ phấn và nuôi cấy
phôi invitro
Giảng viên: Nguyễn Thị Lý Anh
Sinh viên :Nguyễn Ngọc Hoà
Hoàng Thị Lê
Hoàng Khánh Hà
Đinh Thị Phương
Nguyễn Phương Thảo
Phạm Thị Hân


Nội dung

I. Các khái niệm

II. Kỹ thuật thụ phấn invitro

III. Nuôi cấy phôi invitro (cứu phôi)

IV. Ví dụ về thụ phấn invitro và cứu phôi


I. Các khái niệm

Thụ phấn

Thụ tinh

Phôi


Thụ phấn invitro

Nuôi cấy phôi (cứu phôi)



Thụ phấn (pollination) là sự tiếp nhận
các hạt phấn từ bao phấn tới núm nhụy
để thực hiện thụ tinh ở hoa.
Ở thực vật có hai phương thức thụ
phấn là thụ phấn chéo và tự thụ phấn



Thụ tinh (fertilization): Ở thực vật thụ tinh
là sự kết hợp của hai giao tử đực và cái
(tinh trùng và noãn) thành hợp tử (phôi,
bào tử hoặc hạt) là đặc trưng cơ bản của
sinh sản hữu tính, sinh sản lưỡng tính.
Ở thực vật hạt kín có phương thức thụ
tinh kép.



Phôi là một nhóm tế bào có khả năng phát
triển tạo thành cơ thể hoàn chỉnh là pha
phát triển trung gian giữa hợp tử hay tế bào
soma và bào tử thể.

Có hai loại phôi: phôi hữu tính & phôi vô

tính ( phôi soma)



Phôi hữu tính : là phôi trong hạt được tạo ra
do thụ tinh giữa tế bào trứng và giao tử đực
(do lai hoặc tự thụ) còn gọi phôi hợp tử.

Phôi soma: là phôi được phát sinh từ tế bào
sinh dưỡng 2n chỉ của bố hoặc mẹ và tế
bào ấy có cấu trúc như một phôi gọi là phôi
vô tính ( phôi soma).



Thụ phấn invitro là thực hiện quá trình thụ
phấn trong ống nghiệm không phụ thuộc
vào cơ thể mẹ.

Nuôi cấy phôi (cứu phôi) là sự tách rời và
nuôi cấy invitro phôi hợp tử đã thành thục
hoặc chưa thành thục thành cây hoàn
chỉnh.


II. Kỹ thuật thụ phấn invitro

Mục đích

Điều kiện có thể thụ phấn in vitro


Các bước tiến hành

Các phương pháp thụ phấn in vitro


II.1. Mục đích phải tiến hành kỹ thuật
này

Để khắc phục sự bất hợp trước khi thụ
tinh.

Thụ phấn, thụ tinh ở điều kiện in vitro tạo
ra cơ hội sản xuất các phôi lai giữa các
loài thực vật không thể lai bằng các
phương pháp gây giống cây trồng truyền
thống.


II.2. Điều kiện có thể thụ phấn in vitro

Điều kiện cơ bản là phải nuôi cấy thành
công bầu quả hay noãn phân lập (noãn
trần) của cây mẹ.

Chủ động điều khiển quá trình nảy mầm
của hạt phấn cây bố trong môi trường
nuôi cấy vô trùng.

Tiến hành thụ phấn để sự thụ tinh diễn

ra và nuôi cấy hợp tử phát triển thành
phôi lai trên môi trường dinh dưỡng vô
trùng.


II.3. Các bước tiến hành

Lấy nụ của hoa mẹ ở thời điểm trước khi nở
hoa 2 ngày, khử trùng, tách lấy bầu quả hay
lá noãn nuôi cấy invitro.

Lấy nụ hoa của cây bố vào ngày nở hoa,
khử trùng, tách lấy bao phấn và để trong
điều kiện vô trùng đến khi chúng tung phấn.

Lấy hạt phấn rắc trực tiếp lên mặt cắt của
bầu quả hay lá noãn để thụ phấn in vitro.

Khi noãn thụ tinh, chúng hình thành hợp tử
và tạo phôi. Các phôi lai in vitro thường bỏ
qua giai đoạn ngủ, nghỉ và mọc thành cây in
vitro


II.4. Các phương pháp thụ phấn in vitro
II.4.1. Thụ phấn bằng phương pháp cắt ngắn vòi nhụy



Là phương pháp dễ và hiệu quả. Núm nhụy

và 1 phần hoặc toàn bộ vòi nhụy của hoa
được cắt ngắn, sau đó hạt phấn của cây bố
được thụ trực tiếp lên vòi nhụy đã cắt ngắn
và kết quả là có rất nhiều ống phấn đã kéo
dài được tới bầu nhụy.

Nhược điểm: số lượng hạt trong 1 quả ít.
Có thể do ống phấn gặp khó khăn trong khi
đâm xuyên qua vách bầu.


II.4.2. Thụ phấn bằng phương pháp
ghép vòi nhụy



Hạt phấn cần thụ được “gửi” trên 1 núm nhụy
thích hợp và nảy mầm, 1 ngày sau vòi nhụy và
1/3 bầu của hoa chứa hạt phấn được cắt và ghép
lên 3/4 bầu nhụy của hoa cây mẹ cần thụ phấn.

Theo Vantuyl và cộng sự(1991) thì một ngày sau
khi “gửi” hạt phấn vòi nhụy được cắt ngắn cách
trên bầu 1-2mm và được gắn lên bầu nhụy của
hoa cây mẹ. Bầu và vòi nhụy ngoài đồng ruộng
được kết hợp với nhau = ống nối còn trong invitro
chỉ cần sử dụng agar để cố định là đủ.


II.4.3. Thụ phấn cho giá noãn


Bầu được cắt theo chiều dọc thành nhiều
miếng vào ngày núm nhụy tiết ra dịch nhầy
hoặc 1-2 ngày sau đó. Mỗi 1 miếng sẽ chứa 1
giá noãn và 1 hàng noãn, có thể để lại hoặc
không để lại vách bầu. Một lượng lớn hạt
phấn cần thụ được đặt theo giá noãn. Để kích
thích hạt phấn nảy mầm và đâm xuyên vào
noãn có thể đặt vào môi trường nuôi cấy 1
hay 2 vòi nhụy.



Có thể nuôi cấy ngoài sáng hay trong tối.
Noãn nảy mầm sau 5-7 tuần thụ phấn và
tiếp tục được thụ phấn

Thụ phấn bên trong bầu (intraovarian
pollionation): cả vòi nhụy hoặc 1 phần
của nó có thể được tách ra và hạt phấn
hoặc được đặt trên bề mặt vết cắt bầu
quả hoặc chuyển qua lỗ trên thành vòi
nhụy đến bầu quả


III. Kỹ thuật cứu phôi

Mục đích


Nuôi cấy phôi hữu tính

Các yếu tố ảnh hưởng

Ứng dụng


III.1. Mục đích

Khắc phục sự bất hợp sau thụ tinh.

Khắc phục sự bất hợp giữa nội nhũ và
phôi khi lai xa.

Tạo cây đơn bội (lúa mì x ngô, lúa mỳ x
yến mạch dẫn đến sự loại bỏ một bộ
nhiễm sắc thể).

Ngăn ngừa sự thui chột phôi ở những loại
quả hạch chín (đào, mận, mơ…).

Phá ngủ nghỉ, rút ngắn chu kỳ tạo giống…


III.2. Nuôi cấy phôi hữu tính

Sự phát sinh phôi hữu tính:
-Xảy ra quá trình thụ tinh giữa hạt phấn và
noãn hình thành hợp tử

-Hợp tử trải qua quá trình nguyên phân liên
tiếp tạo thành phôi

Nuôi cấy phôi hữu tính gồm
-Tách phôi
-Nuôi cấy phôi để tạo cây.


III.2.1. Tách phôi

Phôi hữu tính được hình thành trong môi
trường vô trùng của noãn và mô bầu hoa.
-Ở một số loài phôi có kích thước lớn,
thuận tiện cho quá trình tách phôi (cây họ
đậu), nhưng một số loài hoa khó tách phôi
(hoa lan_hạt có kích thước nhỏ, vỏ hạt tiêu
giảm và thiếu nội nhũ)
-Ở thực vật hoa dạng chùm, mô non
thường xếp ở đỉnh của chùm hoa



Trong quá trình thu nhận phôi cần hạn chế
sự tổn thương của dây treo phôi. Dây treo
phôi có kích thước nhỏ và cấu trúc mỏng
manh nên khó tách nó nguyên vẹn cùng với
phôi để đưa vào nuôi cấy. Không có dây
treo phôi làm giảm đáng kể tỉ lệ hình thành
cây con từ nuôi cấy phôi non

III.2.2. Thành phần môi trường nuôi
cấy
Sau khi tách từ hạt phôi được nuôi
cấy trong môi trường chứa:

Muối khoáng

Chất điều hoà sinh trưởng

Nguồn carbon

Aminoaxit và thành phần hữu cơ phức
hợp