Đánh giá di truyền một số dòng, giống thuốc lá (nicotiana spp ) nhập nội và mới chọn tạo của việt nam bằng chỉ thị phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
----------------

------------------

NGUYỄN THỊ THU

ĐÁNH GIÁ DI TRUYỀN MỘT SỐ DÒNG, GIỐNG
THUỐC LÁ (Nicotiana spp.) NHẬP NỘI VÀ MỚI CHỌN
TẠO CỦA VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 60.42.80
Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

HÀ NỘI – 2012


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, kết quả và số liệu nghiên cứu trình bày trong luận
văn là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ trong việc thực hiện luận văn này đã
được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn
gốc.
Tác giả

Nguyễn Thị Thu

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

i


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Phương Thảo đã
tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài, cũng như
trong suốt quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo Viện sau đại học, Khoa Công
nghệ sinh học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học thực
vật (trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội) đã có nhiều ý kiến đóng góp quý
báu giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Tào Ngọc Tuấn - Viện Kinh
tế Kỹ thuật Thuốc lá, KS Ngô Hải Anh và KS Nguyễn Thị Thùy Linh đã giúp
đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm đề tài.
Tôi cùng xin chân thành cảm ơn tới các bạn bè, gia đình và người thân
đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và
hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.

Hà Nội, ngày 16 tháng 04 năm 2012

Nguyễn Thị Thu

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

ii

MỤC LỤC
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục chữ viết tắt

v

Danh mục bảng

vii

Danh mục hình

viii

1

MỞ ĐẦU

1

1.1

Tính cấp thiết của đề tài

1

1.2

Mục đích và yêu cầu

3

1.3

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3

2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5

2.1

Giới thiệu chung về cây thuốc lá

5

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại thực vật

5

2.1.2. Đặc điểm thực vật học của loài Nicotiana tabacum L.

7

2.1.3

Đa dạng nguồn gen thuốc lá

9

2.1.4

Giá trị của cây thuốc lá

2.2

Tình hình nghiên cứu, chọn tạo giống thuốc lá trên Thế giới và Việt

10

Nam

11

2.2.1

Tình hình nghiên cứu, chọn tạo giống thuốc lá trên Thế giới

11

2.2.2

Tình hình nghiên cứu và chọn tạo giống thuốc lá ở Việt Nam

12

2.3

Virus TMV gây hại thuốc lá và các nghiên cứu về tính kháng
bệnh TMV ở thuốc lá

15

2.3.1

Giới thiệu về Virus khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus- TMV)

15

2.3.2

Giới thiệu chung về gen R và thuyết gen đối gen

21

2.3.3

Giới thiệu gen N và cơ sở phân tử của tính kháng TMV dựa trên
gen N ở cây thuốc lá

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

27
iii


2.4

Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng
nguồn gen cây thuốc lá

32

3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

34

3.1

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

34

3.2

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

34

4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

42

4.1

PHÁT HIỆN NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH TMV Ở CÂY
THUỐC LÁ

42

4.2

Nhân dòng và xác định trình tự

48

4.2.1

Trình tự nhân dòng sản phẩm cặp mồi NBS 182

50

4.2.2

Trình tự nhân dòng sản phẩm cặp mồi NBS 226

55

4.3

Kết quả phân tích đa dạng di truyền

59

5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

67

5.1

Kết luận

67

5.2

Kiến nghị

67

TÀI LIỆU THAM KHẢO

68

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TMV

Tobacco mosaic virus : Virus khám lá thuốc lá

CMV

Cucumber mosaic virus : Virus khám dưa chuột

DNA

Deoxyribonucleic Acid

cs

Cộng sự

AvrPto

Avirulence Pto

TSWV

Tomato Spotted Wilt Virus: Virus héo đốm cà chua

RNA

Ribonucleic Acid

ISSR

Inter-Simple Sequence Repeats

kDal

kiloDalton

bp

Bazơ pairs

kb

kilo base

MP

Movement protein

CP

coat protein: protein vỏ

CC

coiled-coil

NB

Nucleotide binding

TIR

Toll - Interleukin-1 Receptor

LRR

leucine-rich repeat

NBS

Nucleotide-binding site

CNL

coiled-coil / nucoleotide-binding site/leucine-rich repeat

TNL

Toll-interleukin-1 receptor/ nucoleotide-binding
site/leucine-rich repeat

ATP

Adenosine triphosphate

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

v


HR

hypersensitive response

PVX

Potato virus X

RT-PCR

Real time polymeraa

SHR

Systemic hypersensitive response

SAR

Systemic acquired resistance: hệ thống kháng tập nhiễm

RAPD

Random amplified polymorphic: đa hình các
đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên

SSR

Simple Sequence Repeats: trình tự lặp lại đơn giản

CTAB

Cetyltrimethyl ammonium bromide

PCR

Polymerase Chain Reaction

PIC

polymorphism information content

SMC

Simple matching coefficient

UPGMA

Unwaited Pair Group Method using Arithmetic Averages

RGHs

Resistance gene homologs

RGAs

Resistance gene analog

BLAST

Basic local alignment search tool

NCBI

National Center for Biotechnology Information

ORF

Open reading frame

R

Resistance

BLAST

Basic local alignment seach tool

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

vi


DANH MỤC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

3.1

Danh sách các mẫu dòng, giống thuốc lá thu thập

34

3.2

Thành phần phản ứng PCR

36

3.3

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

37

3.4

Danh sách các mồi NBS để xác định gen N ở thuốc lá

37

3.5

Thành phần phản ứng PCR

38

3.6

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

38

3.7

Danh sách mồi ISSR

39

3.8

Thành phần phản ứng nhân dòng

40

4.1

Kết quả nhân PCR sử dụng 8 cặp mồi trên 20 giống thuốc lá
nghiên cứu

48

4.2

Sản phẩm thu được từ các mồi ISSR

59

4.3

Số lượng vạch băng, hàm lượng thông tin đa hình, khả năng phân
tích của các mồi ISSR trên 20 mẫu thuốc lá thí nghiệm

4.4
4.5

62

Các chỉ thị ISSR cho các vị trí băng đặc trưng trên các dòng,
giống thuốc lá thu thập

63

Hệ số tương đồng di truyền 20 mẫu giống thuốc lá nghiên cứu

65

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

vii


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

2.1a

Hình thái phân tử virus TMV .

17

2.1b

Cấu trúc phân tử virus TMV.

17

2.2

Sơ đồ cấu trúc genome của TMV

18

2.3

Tổ chức bộ gen chính và 2 phân tử phụ genome của TMV

19

2.4

Triệu chứng bệnh khảm lá thuốc lá do virus TMV gây ra

20

2.5

Đặc điểm cấu trúc, vị trí hoạt động và ví dụ của 5 lớp gen kháng R

24

2.6

Tóm tắt đột biến mất đoạn gen N và kiểu hình của chúng.

30

2.7

Dự đoán cấu trúc chính của sản phẩm gen N và TMV 126 kDa
replicase protein;

4.1

Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS173 trên 20 mẫu
giống nghiên cứu

4.2

45

Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS374 trên 20 mẫu
giống nghiên cứu

4.8

44

Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS359 trên 20 mẫu
giống nghiên cứu

4.7

44

Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS329 trên 20 mẫu
giống nghiên cứu

4.6

43

Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS182 trên 20 mẫu
giống nghiên cứu

4.5

43

Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS267 trên 20 mẫu
giống nghiên cứu

4.4

42

Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS226 trên 20 mẫu
giống nghiên cứu

4.3

31

45

Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS271 trên 20 mẫu
giống nghiên cứu

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

46

viii


4.9

Biến nạp của sản phẩm nhân dòng bằng cặp mồi NBS 182

49

4.10

Biến nạp của sản phẩm nhân dòng bằng cặp mồi NBS 226

49

4.11

Kiểm tra khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp.

50

4.12

Xác định trình tự được nhân lên từ cặp mồi NBS182 trên giống
BS2

4.13

Kết quả BLAST trình tự nhân lên từ cặp mồi NBS182 trên
giống BS2

4.14

54

Xác định trình tự được nhân lên từ cặp mồi NBS226 trên giống
BS2

4.15

53

57

Kết quả BLAST trình tự nhân lên từ cặp mồi NBS226 trên
giống BS2

57

4.16

Sản phẩm PCR nhân các mồi ISSR

60

4.17

Quan hệ di truyền giữa các mẫu dòng, giống thuốc lá dựa trên chỉ
thị ISSR

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

64

ix


1. MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày quan
trọng ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam, cây thuốc lá đã được sử
dụng và trồng trọt khá lâu đời. Trong những năm qua, cây thuốc lá là một
trong những cây trồng có giá trị và chiếm cơ cấu quan trọng trong nông
nghiệp ở những vùng trồng phù hợp, cho hiệu quả kinh tế cao, giúp nông
dân xóa đói giảm nghèo, từ đó phát triển kinh tế tại những vùng dân tộc ít
người, kinh tế khó khăn, vùng sâu, vùng xa như Cao Bằng, Bắc Kạn, Lạng
Sơn, Gia Lai, Đắc Lắc...
Thuốc lá được nhập trồng lâu đời vào Việt Nam. Nhiều giống đã không
còn rõ nguồn gốc và được xem như là các giống địa phương. Trong những
năm gần đây, Việt Nam đã chú trọng hơn đến công tác phát triển giống mới.
Các giống thuốc lá thuần hoặc lai được nhập nội, sau đó các vật liệu này được
tiếp tục chọn lọc qua nhiều năm (đối với giống thuần chủng) để chọn ra
những dòng ưu tú, thích nghi với điều kiện sinh thái và trồng trọt trong nước
hoặc được tách dòng từ con lai F1. Việc sử dụng các dòng thuần nhập nội để
lai chéo cũng đã được khai thác và tạo ra một số tổ hợp lai triển vọng sau quá
trình chọn lọc.
Một điều đáng chú ý là công tác chọn tạo giống thuốc lá ở Việt Nam
được thực hiện bởi Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá, thuộc Tổng công ty
Thuốc lá Việt Nam và chủ yếu sử dụng phương pháp lai tạo và chọn lọc
truyền thống như nêu trên. Gần đây, một số nhà nghiên cứu có đề xuất và

triển khai ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để tạo ra các giống thuốc lá kháng
sâu bệnh (Phạm Thị Hạnh, 2007; Phạm Thị Vân, 2008, 2009; Trần Thị Thanh
Hảo, 2009; Vũ Thị Bản, 2007), tuy nhiên các kết quả mới dừng lại trong
phòng thí nghiệm.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

1


Từ hiện trạng công tác nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá ở Việt Nam
có thể thấy các tồn tại sau:
+ Nguồn gen thuốc lá khá phong phú, tuy nhiên có nguồn gốc từ nhiều
nguồn khác nhau và hiện hầu như không rõ nguồn gốc. Việc đánh giá nguồn
gen hiện chủ yếu dựa trên lịch sử giống (nếu biết), kiểu hình và thông qua các
đánh giá trên đồng ruộng. Các phân tích di truyền ở mức phân tử hoàn toàn
chưa được tiến hành.
+ Công tác chọn tạo giống mới tuy đã bắt đầu tiếp cận công nghệ
hiện đại (chuyển gen) song chưa thấy sử dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử để
hỗ trợ quá trình tạo giống trong khi đây là kỹ thuật được áp dụng phổ biến
và hiệu quả để rút ngắn quá trình chọn tạo giống của bất cứ cây trồng nào
nói chung (Zhang, 2008; Piteekan, 2009; Liu, 2008; Sarala, 2008;
Denduangboripant, 2010).
Từ thực tiễn sản xuất thuốc lá hiện nay cho thấy ngoài nhu cầu có các
giống thuốc lá có năng suất, phẩm chất tốt thì nhu cầu về giống có tính kháng
virus là vô cùng cần thiết. Các thiệt hại do virus được công bố bởi Nguyễn
Văn Chín và Nguyễn Ngọc Bích (2008) như sau: Tại các vùng trồng thuốc lá
các tỉnh phía Bắc, các bệnh khảm lá do virus do khảm lá thuốc (TMV) và
virus khảm dưa chuột ( CMV) gây ra có tỷ lệ nhiễm trung bình từ 15-20%, có
khi lên đến 100% như tại xã Lâu Thượng- Thái Nguyên, gây ra thiệt hại cho
nông dân khoảng 10- 15 tỷ đồng/năm. Tại các vùng trồng phía Nam, theo

thống kê của phòng Đầu tư- phát triển thuộc Công ty cổ phần Hòa Việt và
phân Viện Kinh tế- Kỹ thuật Thuốc lá, thiệt hại về kinh tế chỉ riêng vùng Tây
Ninh trong 3 năm 2001- 2004 do các bệnh virus gây ra ước tính là 40-50 tỷ
đồng. Những công trình nghiên cứu gần đây về tính kháng TMV cho thấy ở
thuốc lá có tồn tại gen kháng N, có khả năng kháng hữu hiệu với TMV. Gene
N đã trở thành mô hình khi nghiên cứu gene kháng của cây trồng từ năm 1938
(Holmes, 1938). Cho đến nay, nhiều protein được mã hóa từ gene N đã được
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

2


nghiên cứu khá chi tiết và chứng minh được vai trò của từng vùng mã hóa
protein trong quá trình kháng bệnh.
Để góp phần khắc phục những tồn tại trên, đề tài này được tiến hành
nhằm ứng dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền ở mức
phân tử nguồn gen thuốc lá tại Việt Nam, đồng thời bước đầu nghiên cứu phát
hiện nguồn gen N kháng bệnh TMV. Các kết quả của đề tài sẽ đặt nền móng
cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống thuốc lá với các đặc
tính mong muốn.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Phân tích được đa dạng nguồn gen ở mức phân tử và xác định được
nguồn gen kháng bệnh virus TMV từ các dòng, giống thuốc lá nhập nội và
chọn tạo trong nước làm cơ sở cho phát triển giống mới bằng phương pháp
truyền thống kết hợp chỉ thị phân tử.
1.2.2. Yêu cầu
- Thu thập nguồn gen cây thuốc lá hiện đang lưu giữ và sử dụng ở Việt
Nam, tập trung vào các dòng, giống triển vọng về năng suất, chất lượng và
kiểu hình kháng bệnh hại.

- Phát hiện được nguồn gen kháng virus TMV từ các nguồn gen thu
thập bằng chỉ thị phân tử.
- Phân tích được mối quan hệ di truyền của các dòng/giống thu thập
bằng chỉ thị ISSR.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Các thông tin về đa dạng di truyền và nguồn gen kháng virus TMV ở
mức phân tử là những dẫn liệu quan trọng, lần đầu tiên được nghiên cứu trên
các dòng, giống nhập nội và chọn tạo tại Việt Nam. Các thông tin này sẽ là
những cơ sở dữ liệu cần thiết để sử dụng trong các chương trình chọn tạo
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

3


giống mới có định hướng, trên cơ sở kết hợp phương pháp chọn tạo truyền
thống và có sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (Marker assisted selection).
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả về nguồn gen kháng virus và mối quan hệ di truyền ở mức
phân tử của đề tài là cơ sở giới thiệu các tổ hợp lai với định hướng kháng
bệnh và tạo được ưu thế lai cao, góp phần rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu
quả chọn tạo giống thuốc lá ở Việt Nam.

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

4


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây thuốc lá

2.1.1. Nguồn gốc, phân loại thực vật
2.1.1.1. Nguồn gốc
Cây thuốc lá hoang dại đã có cách đây khoảng 4.000 năm, trùng với
văn minh của người da đỏ vùng Trung và Nam Mỹ. Lịch sử chính thức của
việc sản xuất thuốc lá được đánh dấu vào ngày 12/10/1492 do chuyến thám
hiểm tìm ra châu Mỹ của Christopher Columbus, ông đã phát hiện thấy người
bản xứ ở quần đảo Antil vừa nhảy múa, vừa hút một loại lá cuộn tròn gọi là
Tabaccos.
Hàng ngàn năm trước Công nguyên, người da đỏ đã trồng thuốc lá
trên vùng đất mênh mông ở Nam Mỹ, Trung Mỹ, quần đảo Antil và một
số nơi khác.
Thuốc lá được đưa vào châu Âu khoảng năm 1496-1498 do Roman
Pano (nhà truyền đạo Tây Ban Nha) sau khi đi châu Mỹ về. Năm 1556, Andre
Teve cũng lấy hạt thuốc lá từ Brazil đem về trồng ở Tây Ban Nha, Bồ Đào
Nha. Jean Nicot, Đại sứ Pháp ở Lisbon đã dâng lên nữ hoàng Pháp Featerina
Mechssi những cây thuốc lá đầu tiên. Theo ông thuốc lá có thể xua đuổi bệnh
đau đầu, bằng cách cho người bệnh ngửi bột thuốc.
Thuốc lá được trồng ở Nga vào năm 1697 do Petro Valeski sau cuộc
viếng thăm Anh và một số quốc gia khác đem về. Vua Sulemam cho trồng
thuốc lá ở Bungari vào khoảng năm 1687.
Tại Đức từ năm 1640 đã có nhà máy sản xuất thuốc lá điếu ở
Nordeburg và vào năm 1788 đã có xưởng sản xuất xì gà tại Hamburg.
Tại các nước châu Á, Thái Bình Dương, thuốc lá được trồng vào thế
kỷ 18. Ngành kỹ thuật trồng trọt, công nghệ sinh học đã phát triển rất
nhanh chóng để sản xuất đa dạng các loại nguyên liệu thuốc lá đáp ứng
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

5

cho công nghiệp chế biến, nhu cầu thị hiếu đa dạng về thuốc điếu và đặc
biệt để xuất khẩu.
Trong thời gian dài, thuốc lá được gọi rất nhiều tên như La Herba
Sanena (cây làm thuốc), Herba Panacea (cây thuốc trị mọi bệnh), L’Herbe
etrange (cây làm thuốc dị thường), L’Herbe d’Ambassadeur (cây kỷ niệm tên
Đại sứ ở Lisbon). Sau đó các tên mất dần chỉ còn lại tên gọi Nicotiana để kỷ
niệm tên Jean Nicot, người có công truyền bá trồng thuốc lá ở châu Âu. Ngày
nay nhiều nước có tên gọi thuốc lá giống nhau là Tabacco (Anh, Mỹ), Tabak
(Đức, Nga), Trutrun (Thổ Nhĩ Kỳ, Bungari), ...Còn tên khoa học của cây
thuốc lá vàng là Nicotiana Tabacum L.
Thuốc lá được trồng rộng rãi ở các điều kiện tự nhiên khác nhau, tiêu
chí khác hẳn thời nguyên thủy. Phạm vi phân bố vùng trồng từ 40 vĩ độ Nam
đến 60 vĩ độ Bắc, nhưng tập trung nhiều ở vĩ độ Bắc.
Sau chiến tranh thế giới thứ 2, các quốc gia giành được độc lập đã quan
tâm phát triển ngành công nghiệp thuốc lá như Trung Quốc, Indonesia, Triều
Tiên, Ấn Độ, Philippines, Ai Cập, Pakistan, Việt Nam...( Lê Đình Thụy và
Phạm Kiến Nghiệp, 1996).
2.1.1.2. Phân loại thực vật học
Cây thuốc lá có tên khoa học là Nicotiana sp., thuộc:
Ngành Hạt kín (ngành Ngọc lan):

Angiospermatophyta

Lớp Hai lá mầm:

Dicotyledoneae

Phân lớp Cúc:

Asteridae

Bộ Hoa mõm sói:

Solanales

Họ Cà:

Solanaceae

Chi :

Nicotiana

Loài:

Nicotiana spp.

( Hoàng Thị Sản, 1999).

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

6


Căn cứ vào hình thái, màu sắc của hoa người ta phân chia thành 4 loài
chính:
- Loài Nicotiana tabacum L.: có hoa màu hồng hay đỏ tươi. Đây là loại
phổ biến nhất chiếm 90% diện tích thuốc lá trên thế giới.
- Loài Nicotiana rustica L.: có hoa màu vàng, chiếm 10% diện tích
thuốc lá trên thế giới.

- Loài Nicotiana petunioide L.: có hoa màu trắng, phớt hồng hay tím.
Thường chỉ có trong vườn thực vật phục vụ nguồn dự trữ gen cho lai tạo, ít
được dùng trong sản xuất.
- Loài Nicotiana polidiede L. : có hoa màu trắng. Loài này cũng ít
được dùng trong sản xuất, chủ yếu chỉ có trong vườn thực vật học của một
số quốc gia.
Như vậy, hầu hết thuốc lá trồng mang tính thương mại ngày nay đều
thuộc loài Nicotiana tabacum.L.
Goodspeed (1954) đã phân chia Nicotiana thành 3 chi phụ, 14 nhóm và
65 loài. Trong số 65 loài này thì có 45 loài thuộc bản địa Bắc và Nam Mỹ, 15
loài thuộc bản địa Úc. Smith (1979) đã tổng hợp sự phân loại đối với chi
Nicotiana như sau:
Chi phụ Rustica:

Có 3 nhóm với 9 loài

Chi phụ Tabacum:

Có 2 nhóm với 6 loài

Chi phụ Petunioides:

Có 9 nhóm với 50 loài

2.1.2. Đặc điểm thực vật học của loài Nicotiana tabacum L.
Để phân biệt các dạng và các giống thuốc lá trồng với nhau, người ta sử
dụng một số đặc điểm hình thái chính sau:
Dạng tán cây:
Tùy thuộc vào mức độ phát triển của lá ở các vị trí trên thân cây, người
ta nhận thấy tán cây có 3 dạng chính là hình trụ, hình elíp và hình tháp.

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

7


- Dạng hình trụ: Khi lá ở các tầng dưới, giữa cây và tầng trên của cây
thuốc lá có khích thước tương đương nhau.
- Dạng elíp: Khi lá ở vị trí giữa cây có kích thước lớn nhất và giảm dần
về phía gốc và ngọn.
- Dạng hình tháp: Khi lá ở vị trí thấp nhất có kích thước lớn nhất và lên
cao kích thước giảm dần.
Đặc điểm lá:
- Lá là bộ phận cho thu hoạch. Hình dạng và kích cỡ lá thay đổi rất lớn.
Lá có cuống hoặc không cuống, có tai lá hoặc không.
- Lá thuốc đơn, mọc cách và xoắn với công thức diệp tự phổ biến là 2/5
hoặc 3/8. Số lá trên cây thay đổi tùy giống. Thông thường số lá trên thân cây
chính trung bình từ 20- 35 lá.
- Góc đóng lá: Tùy thuộc vào góc độ được tạo bởi lá và thân chính mà
tạo ra 3 thế đứng của lá: thế đứng, thế ngang, thế rủ.
- Hình dạng lá: Một số dạng chính gồm các hình trái tim, oval, elíp,
mũi mác.
- Hình dạng đuôi lá: các dạng chính có mũi nhọn, mũi tù và mũi tròn.
- Mặt cắt ngang lá: Có các dạng bán nguyệt, dạng chữ M, dạng chữ V
và dạng phẳng.
- Hàm lượng Nicotin ở lá từ 0,8- 4%, hàm lượng đường tổng số từ 923%.
Đặc điểm hoa:
- Hình dạng hoa tự: Tùy thuộc vào sự phân bố của hoa trong chùm hoa,
ta có các dạng tròn, elíp, hình thoi, hình tháp ngược.
- Hình dạng hoa: Có các dạng chao đèn, hình chuông và hình cai ly.

- Màu sắc hoa: Cánh hoa màu trắng- hồng sẫm, tràng hoa gầy và màu đỏ.
Đặc điểm hạt: Rất nhỏ, trọng lượng từ 0,05- 0,09gram/1000 hạt.
(Trần Đăng Kiên, 2011; Lê Đình Thụy và Phạm Kiến Nghiệp, 1996).
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

8


2.1.3. Đa dạng nguồn gen thuốc lá
Cây thuốc lá trồng ngày nay là thể nhị bội kép khác loài (2n= 4x= 48)
được bắt nguồn từ tổ tiên của thể lưỡng bội N. sylvestris và N.
tomentosiformis (Lim, 2000; Fulne ek, 2002; Skalická, 2005). Nghiên cứu
của Fulne ek và cs (2002) đã xác định và mô tả hai họ riêng biệt của DNA
ribosome 5S (rDNA) ở N. tabacum, một họ có chiều dài trung bình 431bp và
họ khác có chiều dài 646bp. Trong các loài lưỡng bội, N. sylvestris và N.
tomentosiformis, có độ dài 5S rDNA tương ứng là 431 bp và 644 bp. Các
trình tự khoảng cách không mã hóa của chuỗi ngắn ở N. tabacum có trình tự
tương đồng cao với trình tự 5S rDNA của N. sylvestris, trong khi đó chuỗi dài
hơn có tương đồng cao với trình tự 5S rDNA của N. tomentosiformis. Điều
này cho thấy rằng hai họ 5S rDNA trong thuốc lá có nguồn gốc từ các tổ tiên
lưỡng bội.
Hiện nay, cây thuốc lá (N.Tabacum.L) được gieo trồng thương mại trên
khắp thế giới. Ở nước Nga và một số nước châu Âu người ta trồng loài
N.rustica chủ yếu cho tiêu dùng tại chỗ. Một số loài hoang dại như N.alata,
N.sylvertris được trồng làm cây cảnh.
Cây thuốc lá có tính di truyền phong phú, tính thích ứng rộng rãi và
dưới sự tác động trực tiếp của con người, ngày nay thuốc lá có nhiều đặc
trưng phẩm chất, ngoại hình khác nhau. Có thể kể đến loại thuốc lá vàng sấy
có hương vị độc đáo là Virginia ( Hoa Kỳ, Zimbabwe...), thuốc lá Orientalđặc sản vùng Địa Trung Hải, xì gà nổi tiếng Cuba và Sumatra (Indonesia).
Ngoài ra cây thuốc lá còn được coi là cây mô hình để tiến hành nghiên

cứu sinh học cơ bản về chức năng, vai trò cũng như cơ chế hoạt động của gen
hay protein, các con đường trao đổi chất, tổng hợp các chất sơ cấp và thứ cấp
ở động vật hay tương tác thực vật với các vi sinh vật gây bệnh...Bên cạnh đó
với khả năng dễ tái sinh và chấp nhận các gen ngoại lai, nên cây thuốc lá cũng
được sử dụng là mô hình thử nghiệm và phát triển những nghiên cứu ứng
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

9


dụng như biểu hiện các protein tái tổ hợp có giá trị như các vaccine hoặc dược
liệu, làm nguồn nhiên liệu sinh học thay thế,.... Là cây trồng đầu tiên được
biển đổi gen vào năm 1983 (Hoekema và cs, 1983).
2.1.4. Giá trị của cây thuốc lá
Cây thuốc lá đã thu hút nhiều lao động nông nghiệp (trồng trọt, thu hái,
sơ chế…), tăng thu nhập cho người lao động, làm phong phú thêm cơ cấu
luân canh, góp phần cải tạo đất trồng trọt, phân bố lại dân cư . Theo số liệu
thống kê của Hội thuốc lá Zimbabwe, diện tích thuốc lá của nước này chỉ
chiếm 3% diện tích đất nông nghiệp nhưng đã đóng góp 38% tổng sản phẩm
nông nghiệp xuất khẩu và đem lai 30% tổng số ngoại tệ xuất khẩu cho đất
nước trong đó 98% thuốc lá được xuất khẩu với giá trị trên 500 triệu
USD/năm. Trung Quốc lá quốc gia có sản lượng thuốc lá nguyên liệu và
thuốc lá điếu đứng đầu thế giới. Chỉ tính riêng tỉnh Vân Nam, doanh thu về
thuốc lá đạt tới trên 13 tỷ USD/năm với lợi nhuận khoảng 1,5 tỷ USD và nộp
vào ngân sách nhà nước khoảng 3 tỷ USD tương đương khoảng 72% doanh
thu thuế toàn tỉnh. Tại Việt Nam, năm 2008 nộp ngân sách trên 7.500 tỷ đồng
(tăng 20%) và xuất khẩu đạt trên 90 triệu USD (tăng 30%) (Bản tin Tổng
công ty thuốc lá Việt Nam số 4).
Sản phẩm chính của cây thuốc lá là lá thuốc lá, ngoài ra thuốc lá còn
được sử dụng vào một số mục đích khác, theo Lê Đình Thụy và Phạm Kiến

Nghiệp (1996):
- Trồng thuốc lá Nicotiana rustica L. có hàm lượng nicotin rất cao (45%) để sản xuất Sulfat Nicotin sử dụng trong phòng trừ sâu bệnh trên đồng
ruộng.
- Từ thân và lá của cây thuốc lá chiết xuất sclareol và 13- epi sclareol
có tác dụng phòng trừ được bệnh rỉ sắt trong cây họ đậu.
- Chiết xuất dầu từ hạt thuốc lá (35-40% dầu) để sử dụng trong công
nghiệp.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

10


- Sản xuất nước hoa từ thuốc lá, axit nicotinic, acid citric lấy từ cây
thuốc lá cao gấp 2-3 lần ở chanh, cam, sử dụng trong công nghiệp thực phẩm.
- Về mặt nghiên cứu, cấy thuốc lá được coi là đối tượng nghiên cứu
sinh học, nuôi cây mô, chuyển gen...
2.2. Tình hình nghiên cứu, chọn tạo giống thuốc lá trên Thế giới và Việt
Nam.
2.2.1 Tình hình nghiên cứu, chọn tạo giống thuốc lá trên Thế giới
Trên thế giới, ở các nước có diện tích trồng thuốc lá lớn như Trung
Quốc, Mỹ, Zimbabwe, Brasil công tác lai tạo giống thuốc lá được quan tâm,
hàng năm có hàng chục giống được giới thiệu để khảo nghiệm. Ở Mỹ hàng
trăm giống được lai tạo với những đặc tính giống khác nhau như: Coker 176,
Coker 48, Coker 319, Coker 371Gold, King 326, CU263, K149, K346, K394,
K399, K730, NC27NF, RG8, RG13, RG17, RG22, RG81, Speight G-28,
Speight G-70, Speight G-80, Speight G-108 , Speight G- 111, Speight G-117,
Speight G-126…, đồng thời từ các cơ sở nghiên cứu thuốc lá ở Mỹ cũng tiến
hành lai tạo để tạo ra các giống lai( F1) như: RGH4, NC71, NC55, NC 72,
NC79, NC82, NC95, NC100, NC297, NC606, NC729, RGH61, RGH12,
PVH03, PVH09… Các giống lai đều có khả năng kháng bệnh vius TMV,

PVY. Những giống PVH03, PVH09, RGH51 là những giống thuốc lai mới
được trồng từ năm 2000. Đến năm 2001, các giống thuốc lá lai mới như
NC297, NC606, Speight H20 được trồng. Với sự ra đời của hàng loạt giống
lai nên diện tích trồng giống K326, K346, RG8 ngày càng thu hẹp. Năm 1999,
diện tích trồng giống K326 chỉ chiếm 31%, giống K346 là 16%, diện tích
trồng 2 giống lai NC71, NC72 là 32%. Những năm gần đây các giống lai
được trồng với diện tích ngày càng nhiều và chiếm tới 50% diện tích trồng
thuốc lá.
- Tại Zibabwe, các giống thuốc lá vàng được Viện nghiên cứu thuốc lá
Kutsaga lai tạo đã đưa vào phục vụ sản xuất như: White Gold, SCR,
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

11


Kutsaga51, Kutsaga E1, Kutsaga 51E, Kutsaga Mammothe, Kutsaga110,
Kutsaga Mammothe10, Kutsaga RK1, Kutsaga 34.
- Tại Canada các giống thuốc lá được trồng là các giống Delgold,
Delfield, Delliot, Candel, Ac Cheng, Delhi 76.
- Tại Trung Quốc, trong thập kỷ 80, 90 thế kỷ 20 tại tỉnh Vân Nam
Trung Quốc (nơi chiếm 1/3 diện tích trồng thuốc lá của TQ) giống được trồng
chủ yếu là giống K326, Đại Kim Nguyên hoa đỏ và V2 (giống K326, V2
được nhập từ Mỹ). Sau đó Trung Quốc tiến hành công tác lai tạo giống một
cách mạnh mẽ, các giống mới được ra đời trong đó có hai giống đang trồng
rộng rãi là giống Vân Nam 85, Vân Nam 317. Hiện nay, tỉnh Vân Nam trồng
2 giống thuốc lá K326 và Vân Nam 85 là chủ yếu. Ngoài ra một số giống lai
cũng bắt đầu được đưa vào sản xuất. Các tỉnh khác như An Huy, Hà Nam
trồng chủ yếu là giống K326. Giống K326 với chất lượng lá nguyên liệu vượt
trội các giống khác nên Cục thuốc lá Trung Quốc đã đặt hàng trường Đại học
nông nghiệp Hà Nam nghiên cứu làm giãn bề mặt lá tầng trên (tăng diện tích

lá và mỏng lá) nhưng không làm thay đổi chất lượng lá sấy, vẫn đảm bảo đặc
tính hóa học, hương vị.
2.2.2. Tình hình nghiên cứu và chọn tạo giống thuốc lá ở Việt Nam
- Giai đoạn từ năm 1990 trở về trước
+ Trước năm 1990 tại phía Bắc Việt Nam, các giống thuốc lá vàng sấy
được trồng là những giống thuốc lá giống cũ có nguồn gốc Trung Quốc được
du nhập vào Việt Nam như Đại kim tinh, Trung hoa bài 1, Trung hoa bài 2,
Bắc Lưu, một số giống của địa phương như Cao Bằng 2, Cao Bằng 3, Ninh
Bình 1. Ở phía Nam chủ yếu trồng giống thuốc lá nâu Riogrand, giống thuốc
lá vàng sấy được trồng là giống Vĩnh Hảo. Các giống thuốc lá trên đều cho
năng suất thấp, chất lượng kém, đặc biệt là khả năng chống chịu sâu bệnh
kém. Trước tình hình các giống thuốc lá trên không đáp ứng được yêu cầu của
ngành thuốc lá, Hiệp hội Thuốc lá Việt Nam đã nhập một loạt các giống thuốc
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

12


lá vàng sấy từ nước ngoài như: Vir 131, Vir 137, Vir 297,Vir 315, Vir 23-5-3,
Vir 276 Krawat, Vir 3X, Vir 87, Vir 97, Vir 188, Vir 168…., các giống Coker
như: Coker391, Coker 48E, Coker 80F, Coker 213, Coker 251, Coker 347,
Coker 254, SPG28, SPG52, SPG58, SPG 67, SPG 70, SPG 104, Kasuga E1,
Kasuga 51E, Macneir 30, Macneir 37…để chọn lọc nhằm chọn ra giống thuốc
lá vàng sấy phù hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam và cho năng suất
chất lượng tốt đáp ứng cho ngành thuốc lá của Việt Nam ngày càng phát triển.
Song kết quả không chọn được giống nào phù hợp từ 59 giống nhập nội. Vì
vậy, trong những năm 80, 90 của thế kỷ trước, các nhà máy sản xuất thuốc lá
điếu thiếu nguyên liệu trầm trọng, việc nhập khẩu nguyên liệu từ nước ngoài
khó khăn, làm ảnh hưởng tới sự phát triển của ngành thuốc lá.
- Giai đoạn từ năm 1990 tới nay

+ Sau năm 1990 hàng loạt các giống thuốc lá vàng sấy hữu dục từ
Pháp, Mỹ, Trung Quốc được nhập vào Việt Nam như : Coker 319, Coker 347,
Coker 176 (nhập từ Pháp), Coker 176 (nhập từ Mỹ), K326 (nhập từ Pháp),
K326 (nhập từ Mỹ), K399, Macneir 373, RG 8, RG 11, RG 28, RG 13, RG
17, RG 81, K326B, K399, K346, K35, K394, K149, K110 (nhập từ Mỹ),
SP108, SP168, SP70, Cu263, NC27NF, NC37NF, Vân nam 80, Vân Nam 85
(nhập từ Trung Quốc)…
+ Tổng Công ty thuốc lá Việt Nam đã giao nhiệm vụ cho Viện KT –
KT Thuốc lá (Viện) lưu giữ nguồn giống trên và tiến hành đánh giá chọn lọc
tại các vùng sinh thái khác nhau trên toàn quốc. Kết quả sau nhiều năm chọn
lọc, đánh giá các giống nhập nội, Viện đã chọn ra hai giống thuốc C176,
K326 phù hợp với điều kiện khí hậu cả hai miền Nam và Bắc, có năng suất
đạt trên 1,8 tấn / ha và chất lượng thuốc lá nguyên liệu tốt, đáp ứng cho công
nghệ sản xuất thuốc lá điếu của các nhà máy thuốc lá. Sau khi được công
nhận giống, hai giống thuốc lá trên đã nhanh chóng được đưa vào sản xuất và
đã thay thế hoàn toàn các giống thuốc lá cũ như: Đại kim tinh, Trung hoa bài
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

13


1, Trung hoa bài 2, Bắc Lưu, một số giống của địa phương như Cao Bằng 2,
Cao Bằng 3, Ninh Bình 1, Vĩnh Hảo. Giống C176 phát triển tốt, khả năng
kháng bệnh TMV, CMV khá cao, khả năng chịu hạn khá, cho năng suất cao
tại các vùng như Bắc Giang, Lộc Bình - Lạng Sơn, Bắc Kạn, Đà Nẵng, Khánh
Hòa, Ninh Thuận, Tây Ninh. Giống K326 phát triển tốt tại Cao Bằng, Lạng
Sơn, Bắc Giang, Thái Nguyên, các tỉnh Tây Nguyên và cho năng suất khá với
chất lượng thuốc lá nguyên liệu rất tốt về màu sắc, hương vị cũng như hàm
lượng nicotin….Tuy vậy, nhược điểm của giống K326 là mẫn cảm với bệnh
TMV, CMV, TSWV, thường bệnh đen thân nặng vào giai đoạn thu hoạch nên

ảnh hưởng tới năng suất. Vì vậy, trồng giống K326 cần phải trồng trên những
vùng được luân canh với lúa nước. Hơn nữa với với kỹ thuật trồng trọt ngày
càng tiến bộ nên phần nào hạn chế được sự phát triển của bệnh gây hại. Do
chất lượng bị hạn chế nên giống C176 ngày càng thu hẹp, giống K326 đang
được trồng nhiều hơn bởi sự vượt trội về chất lượng. Hiện nay, hai giống
K326 và C176 đang chiếm khoảng 50% diện tích trồng thuốc lá.
+ Từ năm 1997, Viện bắt đầu tiến hành công tác tạo chọn giống thuốc
lá trong nước với hai hướng chọn lọc các giống nhập nội, chọn tạo giống
thuần và giống lai. Một loạt các giống nhập nội, giống địa phương được sử
dụng làm nguồn vật liệu lai, song chỉ có các cặp lai giữa các giống mới được
nhập nội là mang lại hiệu quả. Trong một thời gian ngắn tập thể cán bộ
nghiên cứu khoa học của Viện đã lai tạo thành công các giống thuốc lá và
được công nhận giống quốc gia như giống C7-1, C9-1, VTL81, VTL5H,
GL…. Các giống mới có ưu thế về năng suất, khả năng kháng bệnh, chịu hạn
và chất lượng tương đương giống K326. Giống VTL5H, Gl… là những giống
cho năng suất cao và khả năng kháng bệnh CMV cao. Giống C7-1 cho năng
suất rất cao, chịu hạn và rét tốt, không ra hoa sớm trong điều kiện bất lợi ở
các tỉnh miền núi phía Bắc, khả năng kháng bệnh đen thân, héo rũ vi khuẩn
tương đối cao, kháng trung bình với bệnh TMV. Giống C9-1, VTL81, cho
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

14


năng suất cao, chất lượng tốt, kháng cao với bệnh héo rũ vi khuẩn, đốm lá vi
khuẩn, đen thân, ngoài đồng ruộng mức độ nhiễm bệnh TMV thấp hơn K326.
Giống VTL81 có sự nổi trội về chất lượng nguyên liệu ở hai chỉ tiêu hương
thơm và vị.
+ Các giống thuốc lá mới C7-1, C9-1, VTL5H đã nhanh chóng được
nông dân ở phía Bắc chấp nhận. Hiện nay ở phía Bắc, các giống thuốc lá mới

đã chiếm 50% diện tích và dần thay thế giống C176.
+ Ngoài ra, hướng chọn lọc giống kháng cũng đã tiến hành. Viện đã
chọn lọc được 2 dòng BS2, BS3 có khả năng kháng bệnh TMV cao, dòng
BS2 đã được công nhận là giống quốc gia vào năm 2011. Đồng thời Viện
cũng đã tiến hành công tác chọn giống khác bằng công nghệ sinh học, đặc biệt
là công nghệ biến đổi di truyền, tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh
khảm lá do TMV (Vũ Thị Bản, 2007). Hiện nay, Viện đang phối hợp cùng
Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam triển
khai đề tài nghiên cứu tạo giống thuốc lá kháng bệnh khảm lá và xoăn đọt
bằng kỹ thuật chuyển gen (Lê Quỳnh Liên và cs, 2010).
2.3. Virus TMV hại thuốc lá và các nghiên cứu về tính kháng bệnh TMV
ở thuốc lá
Như đã biết, nhiều loại tác nhân gây bệnh có thể tiếp xúc với cây nhưng
nhìn chung cây có thể kháng lại tốt với phần lớn tác nhân gây bệnh. Thậm chí
tác nhân có thể tấn công và gây bệnh thì cây vẫn có thể biểu hiện tính kháng
với các mức độ khác nhau. Cho tới nay, rất nhiều gen kháng R của cây đã
được xác định. Các gen kháng này có thể qui định tính kháng thông qua quan
hệ gen-đối-gen hoặc không. Sản phẩm của các gen này gọi là các protein R.
2.3.1. Giới thiệu về Virus khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus- TMV)
Virus khảm thuốc lá (TMV) đã được trung tâm nghiên cứu virus phát
hiện ra cách đây hơn một trăm năm. TMV cũng là virus đầu tiên được phát
hiện. Cuối thế kỷ 19, các nhà nghiên cứu phát hiện ra rằng một nhân tố truyền
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp…………………..

15