Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào

Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
1
PHẦN I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT
CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO
1. ðặc ñiểm tế bào ñộng vật
1.1 Sự ñiều hòa trao ñổi chất
Quá trình trao đổi chất của cơ thể được tập trung chủ yếu ở trong từng tế bào. Sự
chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn tại của cơ
thể sống.
Ở tế bào động vật, ngoài tác động của hoạt động enzyme, hệ dịch quanh tế bào, chúng
còn bị tác động rất mạnh bởi hệ thần kinh. Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ phong phú
từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá trình trao đổi chất
ở tế bào. Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế bào có liên quan rất chặt chẽ đến sự điều
khiển của hệ thần kinh. Do đó, việc trao đổi chất của tế bào động vật ở cơ thể sống là hết sức
phức tạp.
Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo
các đặc điểm của một tế bào độc lập, giống như quá trình trao đổi chất ở tế bào vi sinh vật.
Khi đó, tế bào động vật trở thành một thực thể độc lập không tuân theo các qui luật của mô
và qui luật của cơ thể đa bào.
Việc nuôi cấy tế bào động vật được thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp
enzyme và điều khiển các hoạt động của enzyme. Sự hoạt động của enzyme cũng như quá
trình tổng hợp enzyme sẽ quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những
sản phẩm trao đổi chất của tế bào cũng như khả năng phân chia tế bào.
Hai vấn đề mang tính chất quyết định trong việc điều khiển quá trình tổng hợp và hoạt
động của tế bào:
Bản chất tự nhiên – nguồn gốc – của tế bào giúp định hướng sản phẩm cuối.
Yếu tố môi trường quyết định tính trạng riêng biệt của tế bào giúp tính trạng
đó được biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy.
Mọi tác động của môi trường đến tế bào nuôi cấy in vitro đều là những tác động trực
tiếp, xảy ra rất nhanh và rất mãnh liệt; do đó khi tiến hành kỹ thuật nuôi cấy in vitro cần tạo
ra sự hài hòa trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế bào được nuôi cấy.

1.2 Tính chất cơ học yếu
Tế bào động vật không có thành tế bào, chúng chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào.
Màng tế bào như một thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với tế bào trong mô. Các tế
bào động vật trong mô liên kết với nhau qua gian bào. Sự liên kết các tế bào trong mô này
thường ở những vị trí đặc biệt. Trong những điểm kết nối chứa đầy các phân tử protein có tên
khoa học là glycoprotein. Các protein này kết nối với sợi actin trong tế bào chất.
Kích thước tế bào động vật thường rất lớn, trung bình khoảng 10µm, lại không có
vách tế bào nên có tính chất cơ học yếu. Do đó, nên khi thiết kế các thiết bị lên men hay trong
quá trình vận hành nuôi cấy cần phải sử dụng máy mắc hay cánh khuấy có tốc độ rất thấp để
tránh sự phá vỡ tế bào.

Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
2
1.3 Khả năng phân chia và tốc ñộ tăng trưởng chậm
Ở động vật, một chu trình tế bào thường kéo dài khoảng 20 – 70 giờ. Thời gian phân
chia của tế bào có liên quan đến sự đấu tranh sinh tồn và sự bảo toàn tính di truyền của một
loài; do đó nó mang tính chất loài.
Các yếu tố môi trường bên ngoài thường tác động gián tiếp đến tế bào động vật. Sự
phát triển của tế bào trong các mô của động vật thường xảy ra một cách hài hòa giữa các mô
trong toàn bộ cơ thể, giúp tạo ra hình thái riêng biệt cho từng loài và từng cá thể. Nếu trong
một điều kiện nào đó, một loại tế bào trong cơ thể đa bào lại tăng số lượng một cách bất
thường, cơ thể sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý.
Ngoài khả năng tăng chậm về số lượng tế bào, sự phát triển của tế bào động vật xảy ra
cũng rất chậm, gây khó khăn cho việc nuôi cấy tế bào động vật in vitro.

1.4 Nhân ñôi trong quá trình phát triển cần giá ñỡ
Trong cơ thể người và động vật tồn tại hai loại tế bào:
Loại tế bào tự do: tế bào máu, tế bào sinh dục.
Loại tế bào ở dạng liên kết trong các mô.

Tế bào máu là loại tế bào hoàn toàn tự do, tồn tại trong hệ tuần hoàn. Nhờ trạng thái
tự do này mà tế bào máu có chức năng rất riêng biệt.
Tế bào sinh dục thuộc loại tế bào bán tự do. Có nghĩa chỉ tồn tại tự do ở trạng thái
sinh lý nhất định.
Các tế bào còn lại tồn tại trong mô, chúng chỉ có thể tăng số lượng và phát triển trên
một giá đỡ nào đó.
1.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao ñổi chất của tế bào
Các nhà khoa học gọi cơ chế này là cơ chế kìm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (feed
back). Thực ra, bất kỳ tế bào sinh vật nào đều cũng biểu hiện cơ chế này. Điểm khác biệt của
tế bào động vật là ở chỗ quá trình tổng hợp thừa ít xảy ra và hiện tượng các sản phẩm trao đổi
chất từ trong tế bào thoát ra khỏi tế bào thường rất chậm.

1.6 Khả năng tiếp nhận gen lạ
Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật được xem như một loại tế bào trần tự nhiên.
Chúng được bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do đó, trong trường hợp chúng tồn tại ở trạng thái
tự do, khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ (thông tin di truyền từ virus…) hoặc khi cho
những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau (nhân khác nhau) ở gần nhau, sẽ xảy
ra hiện tượng trao đổi vật chất di truyền. Hiện tượng này tạo ra các tế bào lai (hybridoma).
Hiện tượng lai này có ý nghĩa rất lớn trong việc tạo ra dòng lai mới.

1.7 Khả năng bảo quản trong ñiều kiện nhân tạo
Tế bào động vật cần phải được bảo quản trong những điều kiện hết sức đặc biệt mới
có thể giữ được những đặc tính riêng của nó.
Người ta thường sử dụng nitrogen lỏng hoặc bơm những chất phụ gia vào các dòng tế
bào động vật và bảo quản chúng ở nhiệt độ - 70
o
C. Bằng biện pháp này, tế bào động vật vẫn
duy trì được đặc tính của chúng trong thời gian rất dài. Khi sử dụng, tế bào động vật được
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
3

tiến hành giải đông và được hoạt hóa để phục hồi lại khả năng tăn trưởng và phân chia như
trước khi đem bảo quản.
Ngoài ra, tế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện môi trường, rất nhạy cảm
với kim loại. Trong quá trình phát triển trong môi trường nhân tạo, chúng rất cần huyết thanh,
hormone.

2. Tế bào mầm (Stem Cell)
Trong cơ thể động vật có một loại tế bào luôn luôn sẵn sàng bù đắp những mất mát,
tổn thương bất kỳ nào đó của cơ thể: sự tạo máu, liền cơ, xương, da, mọc tóc,… nhưng trước
đây người ta không chú ý đến tiềm năng và vai trò của tế bào này.
Tế bào mầm là những tế bào có khả năng phân chia ở những giai đoạn không xác định
trong quá trình nuôi cấy và có thể biệt hóa tạo ra những tế bào chuyên biệt.
Định nghĩa tương đối về tế bào mầm như sau: tế bào mầm là những tế bào có khả
năng cho sự tái tạo kéo dài vô hạn, và vì vậy, có thể giúp tạo ra ít nhất là một kiểu tế bào hậu
duệ có khả năng biệt hóa cao.
Thông thường còn có một loại tế bào trung gian giữa tế bào mầm và tế bào đã biệt hóa
(tế bào đích):

Một số ñặc ñiểm sinh học của tế bào mầm
2. 1 ðặc ñiểm chức năng
Luôn phân chia để tạo ra tế bào mới.
Là nguồn gốc của sự gia tăng số lượng tế bào trong cơ thể.
Có khả năng tạo nhiều kiểu tế bào đích khác nhau.
Có cơ chế điều hòa gen đặc biệt.
Dễ dàng thích nghi.

2.2 ðặc ñiểm tiến hóa
Các nhà khoa học cho rằng tế bào mầm là nguồn gốc của sự tiến hóa, tuy nhiên người
ta vẫn chưa xác định được thời điểm xuất hiện của các tế bào mầm trong các tổ chức sinh học,
cũng như những yếu tố điều khiển sự khác biệt đó.

2.3 Hai phương thức tái tạo và biệt hóa của tế bào mầm.
Sự tái tạo trực tiếp xảy ra bằng cách phân chia bất đối xứng: một tế bào gốc ra hai tế
bào con, trong hai tế bào con đó sẽ có một tế bào gốc và một tế bào tiền biệt hóa, và
chỉ có tế bào tiền biệt hóa mới tiếp tục phân chia hoặc biệt hóa tiếp theo.
Cơ chế điều hòa mức độ cao:
o Tế bào mầm tạo ra hai tế bào con đều có khả năng tiền biệt hóa như nhau.
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
4
o Các tế bào tiền biệt hóa đều có khả năng biệt khóa theo các con đường khác
nhau và ở nhiều giai đoạn khác nhau.


3. Sinh học của tế bào ñộng vật trong quá trình nuôi cấy.
3.1 Môi trường nuôi cấy
Trạng thái của tế bào động vật trong quá trình nuôi cấy tương tự như một kiểu chức
năng sinh lý thường xuyên tồn tại trong cơ thể động vật. Trong quá trình nuôi cấy, khi có sự
biến đổi điều kiện môi trường thì đặc tính của tế bào sẽ thay đổi theo. Những tế bào không
tăng sinh bình thường in vivo (trong cơ thể) có thể tăng sinh trong in vitro; hơn nữa trong
điều kiện in vivo, những tương tác giữa tế bào với tế bào và giữa tế bào với chất gian bào
giảm xuống vì chúng đồng dạng với nhau và không có được một cấu trúc 3 chiều, đồng thời,
hormone và các chất dinh dưỡng cung cấp dễ bị biến đổi. Lý do này khiến các nhà khoa học
tập trung nghiên cứu xây dựng một môi trường phù hợp cho sự tăng trưởng, chuyển động đến
vị trí cơ chất, tăng sinh của những tế bào không chuyên biệt hơn là môi trường cần thiết cho
sự biểu hiện các chứ năng khác nhau của tế bào. Việc sử dụng môi trường thích hơp, cung
cấp dưỡng chất, hormone và cơ chất là những vấn đề cơ bản cho sự biểu hiện những chức
năng chuyên biệt của tế bào. Trước khi duy trì những điều kiện chuyên biệt như vậy, cần phải
kiểm tra trong những trường hợp có thể xảy ra khi tiến hành nuôi cấy sơ khởi cũng như nuôi
cấy dòng tế bào sau đó.

3.2 Khởi ñầu việc nuôi cấy (nuôi cấy sơ khởi)
Việc nuôi cấy được bắt đầu tiến hành khi tế bào được tách ra từ mô bằng phương
pháp cơ học hay bằng phương pháp xử lý enzyme, và có thể tăng trưởng trong môi trường
thích hợp. Cho dù tế bào được tách ra bằng bất kỳ phương pháp vào thì đây vẫn là giai đoạn
chọn lọc đầu tiên của quá trình nuôi cấy để cuối cùng có thể thu các dòng tế bào tương đối
đồng dạng.
Bảng 1: Những yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của dòng tế bào
Giai ñoạn
Yếu tố ảnh hưởng lên sự chọn lọc
Mẫu cấy sơ
khởi

Tách tế bào
bằng enzyme
Cô lập
Tách tế bào
bằng phương
pháp cơ học

Tách tế bào
bằng enzyme.
Nuôi cấy sơ
khởi
Tăng trưởng
nhanh

Bám vào cơ chất
và tăng kích
thước.
Cấy chuyền

Nhạy cảm với trepsin
Sự hạn chế dưỡng chất, hormone, cơ
chất.

ðược nhân lên
như một dòng

Tốc độ tăng trưởng tương đối của
các tế bào khác nhau.

Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
5
tế bào
Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên sự
vượt trội của các kiểu hình bình
thường hay kiểu hình biến đổi.
Sự hạn chế dưỡng chất, hormone và
cơ chất.
Lão suy, biến
ñổi gen

Các tế bào thường chết.
Các tế bào biến đổi tăng trưởng
mạnh.


Trong giai đoạn nuôi cấy sơ khởi (primary culture) (giai đoạn từ khi tế bào được tách
ra khỏi mô và được nuôi cấy in vitro), sự chọn lọc dựa vào đặc tính của tế bào như tế bào có
thể được tách ra khỏi mẫu cấy ban đầu một cách dễ dàng. Đối với những tế bào phân tán, chỉ

có những tế bào nào còn sống sau khi tách rời khỏi nhau và bám vào cơ chất thành một lớp
mỏng hoặc tồn tại được trong dịch huyền phù thì sẽ trở thành đối tượng cơ bản của quá trình
nuôi cấy sơ khởi.
Nếu giai đoạn nuôi cấy sơ khởi kéo dài được hơn vài giờ đồng hồ thì bước chọn lọc
tiếp theo sẽ xảy ra. Những tế bào có khả năng tăng sinh sẽ tăng lên, một vài loại tế bào sẽ
sống nhưng không tăng sinh, một số khác sẽ không sống được trong điều kiện nuôi cấy này.
Vì lý do này, sự phân bố của các loai tế bào sẽ tiếp tục thay đổi cho đến khi bề mặt của cơ
chất hoàn toàn được bao phủ bởi tế bào (trong trường hợp tế bào nuôi cấy tạo thành từng lớp
đơn). Khi đó, tỷ lệ tế bào nhạy cảm với mật độ tới hạn sẽ từ từ giảm xuống, còn tỷ lệ những
tế bào không nhạy cảm với mật độ tới hạn sẽ tăng lên. Việc giữa cho mật độ tế bào thấp, ví
dụ như cấy chuyền thường xuyên, sẽ giúp duy trì kiểu hình bình thường của tế bào trong quá
trình nuôi cấy như trường hợp nguyên bào sợi của chuột, và những tế bào biến đổi tự phát có
khuynh hướng tăng trưởng mạnh khi mật độ tế bào cao (Tadaro và Green, 1963; Brouty –
Boyé và cộng sự, 1979)
Một vài khía cạnh của các chức năng chuyên biệt của tế bào có thể có biểu hiện mạnh
hơn trong giai đoạn nuôi cấy sơ khởi, đặc biệt là khi tất cả các bề mặt của cơ chất đều được tế
bào bám vào và các tế bào tạo ra môi quan hệ gần với nhau. Tế bào thu được trong giai đoạn
này được gọi là tế bào sơ khởi (primary cell). Các tế bào sơ khởi không đồng nhất với nhau
do chúng là các thế hệ con cháu của nhiều loại tế bào ban đầu khác nhau. Ở giai đoạn này, tế
bào nuôi cấy có hình thái gần giống với mô cha mẹ nhất.

3.3 Sự phát triển của dòng tế bào
Sau lần cấy chuyền đầu tiên các tế bào sơ khởi được thu nhận ổn định và trở thành
dòng tế bào (cell line), lúc này tế bào có thể được nhân lên và cấy chuyền vài lần. Qua mỗi
lần cấy chuyền, những tế bào có khả năng tăng sinh cao nhất sẽ dần dần chiếm ưu thế và
những tế bào không tăng sinh hoặc tăng sinh chậm sẽ bị phân tán. Đây là điểm nổi bật nhất
sau lần cấy chuyền đầu tiên khi có sự khác nhau về khả năng tăng sinh cùng với khả năng
biến đổi để chịu đựng được những tác động của trypsin và sự cấy chuyền tế bào.
Mặc dù vẫn có sự chọn lọc và sự tiến triển về hình thái, nhưng lần cấy chuyền thứ ba
trở nên ổn định hơn, điển hình là tế bào có khả năng tăng sinh nhanh chóng và mạnh mẽ.

Những tế bào này thường có nguồn gốc từ trung mô, xuất phát từ những mô liên kết với
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
6
nguyên bào sợi và các yếu tố mạch. Hiện tượng được biết đến là sự tăng trưởng mạnh của
nguyên bào sợi và trở thành những dòng tế bào hữu dụng ví dụ như W138 – nguyên bào sợi
của phôi phổi người, BHK21 – nguyên bào sợi của thận chuột đồng con và có lẽ nổi bật hơn
hết là tế bào L – nguyên bào sợi dưới dạng da được xử lý với methylcholanthrene. Đó là một
trong những thách thức chủ yếu của lĩnh vực nuôi cấy mô từ khi lĩnh vực này mới được khởi
đầu: làm cách nào để ngăn cản sự tăng trưởng quá mức của những tế bào yếu hoặc sự tăng
trưởng quá chậm của những tế bào như tế bào nhu mô gan hoặc những tế bào biểu bì hóa
sừng. Nguyên nhân là do điều kiện môi trường không phù hợp và vấn đề đáng chú ý hiện nay
là xây dựng được môi trường và chọn lọc được cơ chất thích hợp để có thể duy trì được nhiều
dòng tế bào chuyên biệt.

3.4 Sự phát triển của những dòng tế bào liên tục
Hầu hết các dòng tế bào đều có thể sinh sản theo một kiểu không đổi trong một số thế
hệ giới hạn, ngoài ra chúng có thể chết hoặc chuyển thành dòng tế bào liên tục (continuous
cell line). Đó là một số dòng tế bào có khả năng thích ưng với môi trường nuôi cấy, giữa
được khả năng phân chia tốt và có thể cấy chuyền vĩnh viễn. Khả năng dòng tế bào tăng
trưởng liên tục có lẽ phản ánh sự thay đổi kiểu di truyền cho phép sự chọn lọc xảy ra sau đó.
Nguyên bào sợi của người có tính ưu thế, có số lượng bội thể không bị thay đổi trong suốt
thời gian sống của chúng và không tạo thành dòng tế bào liên tục, trong khi đó các nguyên
bào sợi của chuột và các tế bào được tách ra từ các khối u của người và động vật thường bị
thay đồi số lượng bội thể trong quá trình nuôi cấy và trở thành dòng tế bào liên tục với tần số
cao. Những biến đổi trong quá trình nuôi cấy làm tăng sự biến đổi dòng tế bào thành dòng tế
bào liên tục được gọi là “sự biến đổi in vitro” và có thể tự xảy ra hoặc do sự cảm ứng của hóa
chất và virus.
Các dòng tế bào liên tục thường có số lượng bội thể thay đổi và số bội thể ở giữa mức
nhị bội và tứ bội. Cũng chưa rõ ràng hoặc những tế bào có khả năng trở thành các dòng tế bào
liên tục hiện diện sẵn trong mô nuôi cấy với số lượng rất nhỏ hoặc sau đó những tế bào này

được tạo ra do sự biến đổi của một hay nhiều tế bào. Lý do thứ hai có khả năng xảy ra cao
hơn, do các dòng tế bào liên tục thường xuất hiện rất trễ trong quá trình nuôi cấy, sau giai
đoạn tăng trưởng mạnh của các tế bào có trước. Tuy nhiên, khả năng còn lại có thể là do có
một quần thể tế bào thứ cấp có khuynh hướng biến đổi không giống với các tế bào còn lại.
Thuật ngữ “biến đổi” (transformation) được sử dụng cho quá trình hình thành dòng tế
bào liên tục bởi vì các tế bào nuôi cấy phải trải qua những sự biến đổi về hình thái và vận
động. Sự hình thành dòng tế bào liên tục thường diễn ra cùng với sự gia tăng phát sinh các
khối u. Một số dòng tế bào liên tục hình thành cùng những biến đổi theo các hướng không tốt
như giảm nhu cầu về huyết thanh, giảm mật độ giới hạn của sự tăng trưởng, tăng trưởng trong
môi trường bán lỏng, và bộ nhiễm sắc thể có số lượng bội thể biến đổi… Những thay đổi về
hình thái và bản chất tương tự có thể quan sát thấy ở các tế bào biến đổi do sự cảm ứng của
hóa chất hoặc virus.
Nhiều tế bào bình thường không thể biến đổi thành dòng tế bào liên tục. Nguyên bào
sợi của người có số lượng nhiễm sắc thể ổn định trong suốt đời sống cảu nó và khi gặp một
biến đổi lớn nào đó thì sẽ ngừng phân chia, mặc dù vẫn có thể tiếp tục sống thêm 18 tháng.
Tế bào thần kinh đệm của người và nguyên bào sợi của gà con cũng có đặc điểm tương tự
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
7
như vậy. Mặt khác, tế bào biểu bì sẽ từ từ tăng thêm thời gian sống nếu như kỹ thuật nuôi cấy
được cải tiến và còn có thể tăng khả năng tăng trưởng liên tục. Điều này có lẽ liên quan đến
khả năng tự đổi mới của mô in vitro. Việc nuôi cấy liên tục các nguyên bào bạch huyết cũng
được tiến hành, mặc dù trong trường hợp này có thể sử dụng virus Epstein Barr để cảm ứng
sự biến đổi.
Có thể điều kiện mở đường cho sự phát triển của một dòng tế bào liên tục là sự thay
đổi kiểu gen vốn có của tế bào, vì vậy không có gì ngạc nhiên khi kiểu gen trong dòng tế bào
liên tục khôn ổn định.

Bảng 2: Những ñặc tính của dòng tế bào giới hạn và dòng tế bào liên tục
Dòng tế bào giới hạn Dòng tế bào liên tục
Thuận

lợi
Kiểu gen và kiểu hình điển hình gần
với loại in vivo.
Thường có số bội thể ổn định.
Tăng trưởng nhanh.
Thời gian sống không bị hạn chế.
Dễ nhân dòng.
Có thể nhân lên trong dịch huyền phù.
Tế bào chắc.
Đòi hỏi môi trường đơn giản.
Đòi hỏi lượng huyết thanh thấp.
Bất lợi
Thời gian sống bị hạn chế
Tăng trưởng chậm.
Hiệu quả bám trên cơ chất thấp.
Kiểu gen không ổn định.
Biến đổi.
Thường là có số bội thể không bình thường.


3.5 Sự phản phân hóa
Sự phản phân hóa bao hàm ý nghĩa là những tế bào đã phân hóa bị mất đi tính chuyên
biệt in vitro, nhưng cũng chưa rõ là:
• Có thể những tế bào chưa phân hóa (trong cùng một dòng với những tế bào đã phân
hóa) tăng trưởng mạnh.
• Hoặc do sự vắng mặt của các chất cảm ứng thích hợp (hormone, sự tương tác qua lại
của tế bào hoặc chất gian bào) gây ra sự mất khả năng thích nghi.
Trong thực tế, cả hai nguyên nhân cùng có thể xảy ra. Sự tăng sinh liên tục có thể do
các tế bào chưa phân hóa không gặp được sự cảm ứng phù hợp của điều kiện môi trường để
phân hóa.

Có một sự khác biệt quan trọng giữa phản phân hóa, mất khả năng thích nghi và sự
chọn lọc.
• Sự phản phân hóa được cho là bản chất chuyên biệt của các tế bào đã phân hóa bị mất
đi và không thể đảo ngược được, ví dụ như tế bào gan sẽ mất enzyme của nó
(arginase, aminotransferase,…), không thể dự trữ glycogen hoặc tạo ra protein huyết
thanh, và những đặc tính này không thể được cảm ứng trở lại một khi đã bị mất đi.
• Sự mất khả năng thích nghi là sự tổng hợp các sản phẩm chuyên biệt hoặc một chức
năng chuyên biệt dưới sự điều hòa của những hormone (hormone: tương tác giữa tế
bào với tế bào, tương tác giữa tế bào và chất gian bào,…) có thể được tái cảm ứng khi
điều kiện nuôi cấy thích hợp; ví dụ như cảm ứng enzyme tyrosine aminotransferase
trong gan chuột bình thường đòi hỏi phải có hormone (insulin, hydrocortisone) và sự
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
8
tương tác chính xác của các chất cơ bản, khi điều kiện nuôi cấy thích hợp các chức
năng của tế bào đã phân hóa có thể được biểu hiện ở một số dòng tế bào khác.
• Sự phản phân hóa là sự mất đi chức năng chuyên biệt được xem như là một sự giải
thích không hoàn toàn chính xác.
Để điều kiện cảm ứng chính xác có hiệu lực, cần phải có được những tế bào thích hợp.
Trong những thí nghiệm nuôi cấy tế bào gan trước đây, sự biểu hiện các đặc tính của tế bào
gan không xảy ra, phần nào là do sự tăng trưởng quá mức của các nguyên bào sợi của mô liên
kết hoặc nội mô của mạch máu hoặc các thể xoang. Bằng cách sử dụng kỹ thuật tách tế bào
và điều kiện nuôi cấy thích hợp các tế bào gan có thể được chọn lọc một cách phù hợp hơn.
Tương tự, các tế bào biểu bì có thể tăng trưởng nhờ sử dụng phương pháp lớp nuôi hoặc môi
trường chọn lọc phù hợp.

4. Nuôi cấy tế bào ñộng vật
4.1 ðiều kiện nuôi cấy
4.1.1 Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy
4.1.1.1 Thiết bị
Tủ ấm thường, tủ ấm CO

2
.
Tủ lạnh và tủ đông.
Tủ sất đối lưu.
Bể điều nhiệt.
Kính hiển vi thường.
Kính hiển vi soi ngược.
Ống hút tự động, ống hút Pateur.
Máy khuấy từ.
Máy đo mật độ quang.
Bơm chân không.
Máy ly tâm thường, máy ly tâm lạnh.
Nồi hấp vô trùng môi trường nuôi cấy.
pH kế.
Cân phân tích
Máy cất nước hai lần
Tủ cấy vô trùng

4.1.1.2 Dụng cụ
Hộp plastic nuôi cấy loại giếng
Bình nuôi cấy
Đĩa petri plastic
Hộp plastic nuôi cấy hình chữ nhật
Bình nuôi cấy bằng thủy tinh
Ống nghiệm có nắp đậy
Ống làm lạnh + hộp đựng.
Dụng cụ thủy tinh để pha môi trường.
Màng lọc đã khử trùng.

4.1.2 Môi trường nuôi cấy

Từ khi khám phá ra các tế bào từ các mô có thể nuôi cấy in vitro, các nhà khoa học cố
gắng tìm ra những môi trường xác định từ môi trường cơ bản đơn giản của Eagle (1955; 1959)
để duy trì sự tăng trưởng liên tục của tế bào. Đó là những môi trường có thành phần phức tạp
hơn như môi trường 199 của Morgan, môi trường CMRL 1066 của Parker. Mặc dù hầu hết
các môi trường hiện nay đã được xác định thành phần nhưng chúng vẫn cần phải bổ sung 5 –
20% huyết thanh. Người ta muốn không lệ thuộc vào huyết thanh trong quá trình nuôi cấy tế
bào nên đã xây dựng những môi trường phức tạp hơn để thay thế cho huyết thanh như trong
môi trường NCTC 109, Waymouth’s MB, Ham’s F12, Birch & Pirt, MCDB.
Một phương pháp để tạo ra môi trường mới là bắt đầu từ một môi trường giàu chất
dinh dưỡng như môi trường Ham’s F12 hoặc môi trường 199 có bổ sung huyết thanh với
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
9
nồng độ cao (20%), cố gắng từ từ giảm nồng độ huyết thanh bằng cách tăng nồng độ các chất
đã có trong môi trường và thêm vào những chất mới. Đây là một phương pháp khó, nhưng
kết quả là tạo ra được những mội trường khác nhau để nuôi cấy tế bào cơ của người và các
loại tế bào khác mà không cần huyết thanh hoặc chỉ cần đến huyết thanh với nồng độ thấp.

Bảng 3: Môi trường cơ bản ñơn giản của Eagle’MEM (1956, 1959)
Thành phần Nồng ñộ (mg/l) Thành phần Nồng ñộ (mg/l)
Muối vô cơ Amino acid
CaCl
2
200 L – arginine.HCl 126
KCl 400 L – cystine 24
MgSO
4
.7H
2
O 200 L – glutamine 292
NaCl 6800 L – histidine.HCl.H

2
O 42
NaHCO
3
2200 L – isoleucine 52
Na
2
HPO
4
.H
2
O 140 l – leucine 52
Vitamin
L – lysine.HCl 73,1
D – panthothenate
calcium
1 L – methionine 15
Choline chloride 1 L – phenylalanine 33
Acid folic 1 L – threonine 48
I – inositol 2 L – tryptophan 10
Nicotiamide 1 L – tyrosine 36
Pyridoxal.HCl 1 L – valine 47
Riboflavine 0,1
Các thành phần khác
Thiamine.HCl 1 D – glucose 1000
Đỏ phenol 10

Bảng 3: Môi trường Waymouth’s MB17,50 752/1
Thành phần Nồng ñộ (mg/l)
Thành phần Nồng ñộ (mg/l)

Muối vô cơ Amino acid
CaCl
2
.2H
2
O 120 L – arginine.HCl 75
KCl 150 L – aspartic acid 60
KH
2
PO
4
80 L – cystein 61
MgCl
2
.6H
2
O 240 L – cystine 15
MgSO
4
.7H
2
O 200 L – glutamic acid 150
NaCl 6000 L – glutamine 350
NaHCO
3
2240 Glycine 50
Na
2
HPO
4

.7H
2
O 566 L – histidine 123
Vitamin
L – isoleucine 25
L – ascorbic acid 17,5 L – leucine 50
Biotin 0,02 L – lysine.HCl 240
D – panthothenate calcium 1 L – methionine 50
Choline chloride 250 L – phenylalanine 50
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
10
Acid folic 0,4 L – proline 50
I – Inositol 1 L – threonine 75
Nicotiamide 1 L – tryptophan 40
Riboflavine 1 L – tyrosine 40
Thiamine.HCl 10 L – valine 65
Vitamin B12 0,2
Các thành phần khác
Pyroxine.HCl 1 D – Glucose 5000
Đỏ phenol 10
Glutathione 15 Hypoxanthine 25


4.1.2.1 Các yếu tố vật lý tác ñộng ñến môi trường.
a. pH: hầu hết các dòng tế bào tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,4. Độ pH tối thích đối với
mỗi dòng tế bào sẽ khác nhau. Một số dòng tế bào như nguyên bào sợi tăng trưởng tốt nhất ở
pH 7,4 – 7,7 và những dòng tế bào biến đổi sẽ tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,2 – 7,4 (Eagle,
1973). Theo Eisinger và cộng sự (1979), tế bào biểu bì có thể sống ở pH 5,5. Sự thay đổi pH
môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến sức sống và khả năng tăng sinh của tế bào.
Đánh giá pH môi trường thông qua đỏ phenol thường mang tính chủ quan, do đó cần

phải làm một thang chuẩn mới với muối cân bằng (Balanced Salt Solution – BBS) và đỏ
phenol với nồng độ chính xác.

b. ðệm: môi trường nuôi cấy cần phải có dung dịch đệm trong hai trường hợp:
♣ Khi mở đĩa nuôi cấy tế bào, CO
2
khí quyển sẽ làm tăng pH.
♣ Lượng CO
2
và acid lactic được sinh ra quá mức từ các dòng tế bào biến đổi (khi mật
độ tế bào cao) làm pH môi trường giảm.
Dung dịch đệm bổ sung vào môi trường giúp ổn định độ pH trong những trường hợp
sau:
♠ Một số dòng tế bào đòi hỏi phải có CO
2
dạng khí, đặc biệt là khi mật độ tế bào thấp.
Dung dịch đệm ngăn cản sự thất thoát CO
2
và từ môi trường nuôi cấy.
♠ Khi không đậy chặt nắp bình nuôi cấy (nắp bình được cuốn bằng giấy nhôm) hoặc sử
dụng những bình nuôi cấy mà CO
2
có thể xuyên qua nắp bình vào môi trường nuôi
cấy thì dung dịch đệm sẽ thúc đẩy sự giải phóng CO
2
.
♠ Dung dịch đệm
thường được sử dụng hơn các dung dịch đệm khác, mặc dù khả
năng đệm tương đối yếu ở pH sinh lý, bởi vì nó ít độc với mẫu nuôi cấy, giá thành
thấp và thành phần khoáng thích hợp với thành phần môi trường. HEPES (Hydroxy –

Ethyl – Piperazine – Ethane – Sulfonic Acid) có tác dụng đệm mạnh hơn ở pH 7,2 –
7,6 và nó thường được sử dụng vớ nồng độ 10 hoặc 20mM. Khi HEPES được sử dụng
với CO
2
ngoại sinh thì nồng độ của HEPES phải tăng lên gấp 2 lần so với đệm
thông thường.


c. Áp suất thẩm thấu
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
11
Hầu hết các tế bào nuôi cấy đều có thể chịu được biên độ áp suất thẩm thấu tương đối
rộng. Áp suất thẩm thấu thích hợp cho sự tăng trưởng của tế bào những loài động vật khác
nhau sẽ khác nhau. Trong trường hợp nuôi cấy tế bào trong môi trường nhược trương thì nên
nuôi trong đĩa petri để cho có sự thoát bớt hơi nước trong quá trình nuôi.
Việc đo áp suất thẩm thấu rất cần thiết trong quá trình pha môi trường để tránh không
xảy ra sai sót trong lúc cân hóa chất và pha loãng.

d. Nhiệt ñộ
Ngoại trừ những ảnh hưởng trực tiếp lên sự tăng trưởng của tế bào, nhiệt độ còn ảnh
hưởng đến pH của môi trường: nhiệt độ thấp sẽ làm tăng sự hòa tan CO
2
vào môi trường, do
sự thay đổi khả năng ion hóa và pK
2
của dung dịch đệm.

e. ðộ nhớt của môi trường
Độ nhớt của môi trường chủ yếu bị ảnh hưởng bởi thành phần của huyết thanh, và
trong hầu hết các trường hợp, sự thay đổi độ nhớt môi trường sẽ ảnh hưởng trên sự tăng

trưởng của tế bào. Nếu huyền phù tế bào bị lay động khi được khuấy hoặc khi tế bào tách
khỏi nhau sau khi được trypsin hóa mà có tế bào bị tổn thương thì số lượng tế bị tổn thương
sẽ giảm xuống khi tăng độ nhớt môi trường với carboxy methyl cellulose hoặc polyvinyl
pyrrolidone.

f. Sức căng bề mặt và sự tạo bọt
Sức căng bề mặt của môi trường có thể được lợi dụng để cho mẫu cấy sơ khởi bám
vào bề mặt cơ chất nhưng hiếm khi thực hiện được. Trong huyền phù tế bào, nếu 5% CO
2

trong không khí được sục vào môi trường có huyết thanh thì có thể sẽ tạo ra bọt. Silicon được
bổ sung vào môi trường để chống tạo bọt do làm giảm sức căng bề mặt.
Tốc độ biến tính protein có thể tăng lên, và mức độ nhiễm cũng gia tăng nếu như bọt
khí chạm vào cổ bình nuôi cấy.

4.1.2.2 Thành phần môi trường
a. Dung dịch muối cân bằng
Dung dịch muối cân bằng (Balanced Salt Solution – BBS) là một hỗn hợp muôi vô cơ,
trong đó thường có bicarbonate sodium và glucose, mặc dù khi sử dụng người ta thường bò
bớt bicarbonate và glucose. Đệm HEPES (5 – 20mM) có thể được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy nếu cần thiết và NaCl với một lượng tương đương có thể được bỏ đi để duy trì áp
suất thẩm thấu chính xác của môi trường.
BBS được sử dụng như một dung dịch pha loãng những môi trường phức tạp, môi
trường dùng để rửa mẫu, môi trường phân chia hoặc dùng trong những mục đích khác nhau
và không cần đến một môi trường nhược trương không nhất thiết phải có đầy đủ các khoáng
chất.
Sự chọn lựa dung dịch muối cân bằng phụ thuộc vào:
♥ Áp lực CO
2
.

♥ Mục đích sử dụng: tách các tế bào từ mô hoặc trải các tế bào thành lớp đơn.
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
12
♥ Sử dụng trong các huyền phù tế bào có các tế bào chỉ có thể tăng trưởng khi bám vào
cơ chất.
Hiện nay, HEPES là dung dịch có hiệu quả nhất ở pH 7,2 – 7,8 và TRICINE có hiệu
quả ở pH 7,4 – 7,8.

b. Các môi trường xác ñịnh
Được xây dựng bằng cách thay đổi các thành phần trong môi trường tối thiểu của
Eagle (MEM) (1959) - trong đó có chứa các amino acid cần thiết, vitamin và muối – thành
những môi trường phức tạp như môi trường 199, CMRL 1066, RPMI 1640 và F12. Những
môi trường phức tạp có chứa một lượng lớn các amino acid và các vitamin khác nhau và
thường được bổ sung với các chất biến dưỡng như các nucleoside và khoáng
Amino acid: các amino acid cần thiết là các amino acid không được không được tổng hợp
trong cơ thể nên cần bổ sung từ môi trường nuôi cấy. Nhu cầu về cysteine và tyrosine thay
đổi khác nhau tùy theo dòng tế bào. Nồng độ của amino acid thường hạn chế mật độ tối đa
của các tế bào và sự cân bằng amino acid sẽ ảnh hưởng đến sức sống và tốc độ tăng trưởng
của tế bào. Glutamine cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào và chỉ một dòng tế bào có thể sử
dụng được glutamate. Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy rằng glutamate được sử dụng
trong môi trường nuôi cấy tế bào như nguồn cung cấp năng lượng và carbon.

Vitamin: khi tăng thành phần môi trường lên (mục đích để giảm hàm lượng huyết thanh
xuống) thì danh sách các vitamin trong môi trường cũng phải tăng theo. Khi mật độ tế bào
trong môi trường nuôi cấy thấp (trong giai đoạn nhân dòng tế bào) thì cần phải tăng lượng
vitamin cho dù trong môi trường đã có sự hiện diện của huyết thanh. Sự hạn chết về vitamin
có ảnh hưởng rõ rệt trên sức sống và tốc độ tăng trưởng của tế bào hơn là trên mật độ tế bào.

Muối: các loại muối chủ yếu là là thành phần chính tạo ra áp suất của môi trường. Trong
huyền phù tế bào, lượng thường được giảm xuống để hạn chế sự kết cụm của tế bào. Nồng

độ được xác định bằng nồng độ CO2 ở dạng khí.

Glucose: được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cung cấp năng lượng. Glucose được
chuyển hóa chủ yếu bởi chu trình đường phân (glycoside) tạo ra acid lactic để đi qua chu
trình Krebs giải phóng CO2. Trong in vitro, chu trình Krebs hoạt động không trọn vẹn,
carbon trong acid lactic đa số từ glutamine, chỉ một phần nhỏ từ glucose. Điều này giải thích
cho nhu cầu glutamine và glutamate của tế bào nuôi cấy.

Dung dịch ñệm: khi torng môi trường có dung dịch muôi cân bằng thì khả năng đệm của
dung dịch đệm bị hạn chế, đó là do sự hiện diện của phospahte. Trong những môi trường đòi
hỏi cần phải có dun dịch đệm thì lượng phải tương đương với lượng CO2 ở dạng khí khi
bình nuôi cấy mở nắp.

Khoáng chất: cũng như một vài loại vitamin, hầu hết các khoáng chất cần thiết cho tế bào
được cung cấp bởi huyết thanh. Việc bổ sung các chất nay vào môi trường nói chung không
cần thiết làm, trừ khi có sự giảm lượng huyết thanh trong môi trường. Trong môi trường có
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
13
hàm lượng huyết thanh thấp hoặc hoàn toàn không có huyết thanh thì lúc đó cần phải bổ sung
sắt, đồng, kẽm, selenium và các nguyên tố dạng vết khác vào môi trường nuôi cấy.

Các chất hữu cơ khác: các hợp chất khác nhau như nucleoside, các chất trung gian của chu
trình Krebs, pyruvate và lipid cũng có mặt trong các môi trường nuôi cấy phức tạp. Những
hợp chất này cần thiết khi giảm lượng huyết thanh trong môi trường nuôi cấy. Các chất này
có vai trò trong nhân dòng và duy trì các dòng chuyên biệt.

c. Huyết thanh
Huyết thanh được sử dụng hầu hết trong các môi trường nuôi cấy mô là huyết thanh
bê, huyết thanh phôi bò, huyết thanh ngựa và huyết thanh người. Huyết thanh bê thường được
sử dụng nhiều nhất, kế đến là huyết thanh bò (tùy theo nhu cầu của dòng tế bào) và huyết

thanh người được sử dụng trong nuôi cấy một số dòng tế bào người.
Mặc dù hầu hết các dòng tế bào đều cần có huyết thanh trong môi trường nuôi cấy,
nhưng hiện nay người ta thấy cũng có những dòng tế bào có thể được duy trì và tăng sinh
trong môi trường không có huyết thanh. Các chủng tế bào liên tục (continuous cell) như L929
và tế bào Hela là những chủng đầu tiên được nuôi cấy và tăng trưởng trong môi trường không
có huyết thanh. Tuy nhiên, ở phòng thí nghiệm Ham và một số phòng thí nghiệm khác
(Carney) đã chứng minh rằng có thể giảm lượng huyết thanh hoặc bỏ hẳn mà không ảnh
hưởng đến tế bào nếu như các chất khoáng và hormone bổ sung vào môi trường thích hợp với
dòng tế bào được nghiên cứu.
Protein: mặc dù protein là thành phần chính trong huyết thanh nhưng vai trò của một
số loại protein vẫn còn chưa được chứng minh rõ ràng: một số loại protein có lẽ có vai trò
chuyên chở các chất khoáng, acid béo, hormone hoặc bản thân chúng cũng là hormone. Các
loại protein hữu dụng là albumin và globulin. Fibronectin (globulin không tan) điều khiển sự
kết hợp α 2-macroglobulin hạn chế hoạt động của trypsin. Fetuin trong huyết thanh bò làm
tăng tính bám của tế bào và transferrin liên kết với sắt làm giảm độc tính của sắt để phù hợp
với nhu cầu của tế bào. Có thể có những loại protein khác chưa biết được đặc tính cũng cần
thiết cho khả năng bám và tăng trưởng của tế bào.

Polypeptide: những huyết thanh có dạng đóng cục tự nhiên sẽ kích thích sự tăng sinh
của tế bào nhiều hơn là những huyết thanh ở dạng khác. Điều này xảy ra là do có sự phóng
thích ra một loại polypeptide từ tiểu cầu trong quá trình trong quá trình đóng cục của huyết
thannh. Polypeptide này được gọi là yếu tố tăng trưởng của tiểu cầu. Đây là một nhóm các
polypeptide gây ra hoạt động phân chia tế bào và có lẽ là yếu tố tăng trưởng chính trong
huyết thanh. Những yếu tố khác như yếu tố tăng trưởng trong nguyên bào sợi (fibroplast
growth factor FGF), yếu tố tăng trưởng biểu bì tế bào (epidermal growth factor EGF), yếu tố
tăng trưởng nội bì và hoạt động kích thích sự nhân dòng (Multiplication-Stimulating Activity
MSA) được cô lập từ mô hoặc tế bào phóng thích ra môi trường trong quá trình nuôi cấy với
các mức độ chuyên biệt khác nhau và có lẽ chúng có mặt với một lượng nhỏ trong huyết
thanh.

Hormone: hormone có những ảnh hưởng khác nhau trên tế bào và thường khó có thể
nhận ra được những tác động chính của chúng. Insulin kích thích sự hấp thu glucose và
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
14
amino acid và có lẽ khả năng kích thích sự phân chia tế bào của nó đã ảnh hưởng đến thuộc
tính này. Các hormone tăng trưởng có thể có mặt trong huyết thanh, đặc biệt là huyết thanh
bò và cùng với somatomedine ảnh hưởng lên sự phân bào. Hydrocortisone cũng có trong
huyết thanh với hàm lượng thay đổi, kích thích sự bám dính của tế bào; nhưng trong những
điều kiện nhất định (khi có mật độ tế bào cao) thì cản sự phân bào và có thể cám ứng biệt hóa
tế bào. Các thí nghiệm giàm hoặc bỏ hẳn huyết thanh trong môi trường nuôi cấy cho thấy các
hormone cần thiết cho việc nuôi cấy có thể cũng có mặt trong thành phần của huyết thanh nên
việc bổ sung huyết thanh vào môi trường nuôi cấy là cần thiết.

Các chất biến dưỡng và các dưỡng chất: trong huyết thanh cũng có amino acid,
glucose, ketoacid và một số các dưỡng chất, các chất biến dưỡng trung gian. Những chất này
quan trọng trong môi trường đơn giản nhưng ít quan trọng hơn trong các môi trường phức tạp,
đặc biệt là những môi trường có các chất bổ sung khác và các amino acid với nồng độ cao.

Khoáng chất: các nguyên tố dạng vết như sắt, đồng, kẽm có thể được cung cấp bởi
huyết thanh và chúng liên kết với các protein của huyết thanh.

Các yếu tố kìm hãm: huyết thanh có thể có chứa các cơ chất có tác dụng kìm hãm sự
tăng sinh của tế bào. Một số chất có thể được tạo ra trong quá trình chuẩn bị môi trường như
độc tố của các loại vi khuẩn nhiễm vào môi trường trước khi qua lọc vô trùng, các phân đoạn
của γ – globulin có thể chứa các loại kháng sinh gây trợ ngại cho việc nuôi cấy. Hơi nóng có
thể làm phân hủy một vài phức chất trong huyết thanh và làm giảm tính độc của
immunoglobulin mà không gây hại đến các yếu tố tăng trưởng là polypeptide, hơi nóng có
thể phân hủy một số chất dễ bị biến tính bởi nhiệt và thành phần của huyết thanh sẽ không
còn giống trước khi xử lý.

4.1.2.3 Ảnh hưởng cuả oxygen, carbon dioxide dạng khí và nhiệt ñộ trong quá trình
nuôi cấy.
a. Oxygen
Tùy theo mục đích sử dụng mà nhu cầu O
2
của mẫu cấy thay đổi: đó là sự khác nhau
giữa cơ quan và môi trường nuôi cấy. Trong khi O
2
không khí hoặc một lượng O
2
thấp hơn
nồng độ O
2
không khí phù hợp hơn với hầu hết các tế bào nuôi cấy thì có vài loại cơ quan, ví
dụ như phôi của các giai đoạn sau (phôi mới hình thành hoặc phôi trưởng thành) lại cần đến
95% O
2
ở dạng khí. Hầu hết các tế bào tách rời nhau cần lượng O
2
thấp hơn và sẽ tăng trưởng
tốt hơn khi lượng O
2
thấp hơn O
2
không khí. Sự có mặt selenium làm giảm bớt lượng O
2
hòa
tan trong môi trường. Vai trò của O
2
hòa tan ngày càng giữ vai trò quan trong và phải cung

cấp O
2
trong suốt giai đoạn nuôi mẫu. Độ sâu của môi trường có thể ảnh hưởng đến sự
khuếch tán của O
2
vào đến mẫu nuôi cấy, vì vậy người ta khuyên rằng nên đổ môi trường vào
bình nuôi cấy dày khoảng 2 – 5 mm (0,2 – 0,5 ml/cm
2
) trong bình nuôi cấy.

b. Carbon Dioxide (CO
2
)
CO
2
có vai trò phức tạp hơn O
2
vì có sự tương quan giữa mọi hoạt động của nó, ví dụ
CO
2
hòa tan, pH và nồng độ . Khó có thể xác định được tác dụng chính của nó. Áp lực