Nghiên cứu, tuyển chọn vi khuẩn đối kháng chống ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây trồng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LÊ THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
ĐỐI KHÁNG CHỐNG Ralstonia solanacearum
GÂY BỆNH HÉO XANH CÂY TRỒNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------

LÊ THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
ĐỐI KHÁNG CHỐNG Ralstonia solanacearum
GÂY BỆNH HÉO XANH CÂY TRỒNG
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62420107
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Lê Như Kiểu
2. PGS. TS. Lại Thúy Hiền

Hà Nội - 2015

ii


LỜI CÁM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Tiến sĩ. Lê Như Kiểu và PGS. TS. Lại
Thúy Hiền là những người thày đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài Luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn:
- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tổ chức
khoá đào tạo tiến sỹ này, giúp tôi có điều kiện học tập và nghiên cứu để nâng cao
trình độ chuyên môn.
- Phòng Đào tạo sau Đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh vật, Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành Luận án.
- Ban lãnh đạo Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, tập thể cán bộ Bộ môn Vi sinh
vật và các phòng liên quan.
- Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia
đình, bạn bè đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
hiện Luận án này.
Hà Nội, ngày 20 tháng 07 năm 2015
Tác giả

Lê Thị Thanh Thủy

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
- Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với
các cộng sự khác.
- Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố
trên các tập san và tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của
các đồng tác giả.
- Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.
Tác giả luận án

Lê Thị Thanh Thủy

iv


MỤC LỤC
TT

NỘI DUNG

TRANG

MỞ ĐẦU

12

1.

Tính cấp thiết của luận án

12

2.

Mục tiêu của luận án

13

3.

Nội dung nghiên cứu của luận án

14

4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

14

5.

Đối tượng, phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu

14

6.

Những đóng góp mới của luận án

14

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

15

1.1.

Tình hình trồng ớt, lạc ở Việt Nam và trên thế giới

15

1.1.1.

Tình hình trồng ớt và lạc ở Việt Nam

15

1.1.2.

Tình hình trồng ớt và lạc trên thế giới

16

1.2.

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum

17

1.2.1.

Đặc điểm phân loại vi khuẩn R. solanacearum

17

1.2.2.

Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn R. solanacearum

19

1.2.3.

Các hình thức xâm nhập của R. solanacearum vào cây chủ

21

1.2.4.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến phát triển của vi khuẩn R.

22

solanacearum
1.3.

Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh do vi khuẩn ở Việt

23

Nam và trên thế giới
1.3.1.

Bệnh héo xanh do vi khuẩn

23

1.3.2.

Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn ở Việt Nam

26

1.3.3.

Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn trên Thế giới

29

1.4.

Vi sinh vật đối kháng và cơ chế đối kháng

30

1.4.1.

Vi sinh vật đối kháng

30

1.4.1.1.

Vai trò của vi khuẩn đối kháng

31

1.4.1.2.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quan hệ đối kháng giữa các vi sinh

32

vật
1.4.2.

Cơ chế đối kháng của vi sinh vật
1

33


1.4.2.1.

Cơ chế do kháng sinh

33

1.4.2.2

Cơ chế do siderophore

35

1.4.2.3.

Cơ chế tăng cường sức đề kháng của cây (kích kháng)

36

1.5.

Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng

38

1.5.1.

Nghiên cứu vi sinh vật đối kháng ở Việt Nam

38

1.5.2.

Nghiên cứu vi sinh vật đối kháng trên thế giới

40

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

45

NGHIÊN CỨU
2.1.

Vật liệu nghiên cứu

45

2.2.

Phương pháp nghiên cứu

46

2.2.1.

Khảo sát tình hình bệnh héo xanh cây ớt và lạc ở miền

46

Bắc và miền Trung Việt Nam
2.2.1.1.

Đánh giá tình hình bệnh héo xanh cây lạc ở miền Bắc và

46

miền Trung Việt Nam
2.2.1.2.

Phân lập vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh trên

46

cây ớt và lạc
2.2.2.

Nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với R. solanacearum

49

2.2.2.1.

Phân lập và tuyển chọn VKĐK R. solanacearum

49

2.2.2.2.

Đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn đối

50

kháng
2.2.2.3.

Phân loại vi khuẩn đối kháng

52

2.2.2.4.

Đánh giá an toàn sinh học (trên chuột bạch)

54

2.2.2.5.

Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh héo xanh cây ớt và lạc

55

(trong nhà lưới) của các chủng vi khuẩn đối kháng
2.2.2.6.

Tách và xác định Iturin A

56

2.2.2.7.

Tách và xác định Phenazine

56

2.2.3.

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh HX

57

2.2.3.1.

Nghiên cứu sự tương tác của chủng B. subtilis ĐKB1 và P.

57

fluorescens ĐKP1 trên cùng môi trường
2.2.3.2.

Xác định các điều kiện nhân sinh khối phù hợp của 2 chủng
B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1
2

57


2.2.3.3.

Nghiên cứu tạo chất mang

59

2.2.3.4.

Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh HX

59

2.2.4.

Đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây ớt và

60

lạc ngoài đồng ruộng
2.2.4.1.

Đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây ớt và

60

lạc ở điều kiện thí nghiệm ngoài đồng ruộng
2.2.4.2.

Đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây ớt và

61

lạc ở mô hình ngoài đồng ruộng
2.2.5.

3.1.

Phương pháp xử lý số liệu

62

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

63

Khảo sát tình hình bệnh héo xanh cây ớt và lạc do R.

63

solanacearum ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam
3.1.1

Bệnh héo xanh cây ớt ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam

63

3.1.2.

Bệnh héo xanh cây lạc ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam

63

3.1.3

Phân lập vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh HX cây ớt và

65

lạc
3.1.3.1.

Phân lập vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh cây ớt

66

3.1.3.2.

Phân lập vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh HX cây lạc

68

3.1.3.3.

Đánh giá sự khác nhau giữa 02 chủng LH3 (gây bệnh HX trên

71

lạc) và YH3 (gây bệnh HX trên ớt) bằng phân nhóm biovar
3.1.3.4.

Hình thái và kích thước khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum

72

3.2.

Nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với R. solanacearum

73

3.2.1.

Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn đối kháng

73

3.2.1.1.

Phân lập, lựa chọn các chủng vi khuẩn kháng vi khuẩn gây

74

bệnh héo xanh cây ớt
3.2.1.2.

Phân lập, lựa chọn các chủng vi khuẩn kháng vi khuẩn gây

79

bệnh héo xanh cây lạc
3.2.1.3.

Khả năng kiểm soát bệnh héo xanh cây ớt và lạc trong nhà

84

lưới của hai chủng vi khuẩn ĐKB1 và ĐKP1
3.2.2.

Hoạt tính sinh học các chủng VKĐK tuyển chọn

3

89


3.2.3.

Phân loại vi khuẩn đối kháng

91

3.2.3.1

Sử dụng kit API 50 CHB và API 20 NE

91

3.2.3.2

Sử dụng phương pháp sinh học phân tử

93

3.2.4.

Đánh giá an toàn sinh học của vi khuẩn đối kháng

94

3.2.4.1.

Xác định độc tính của vi khuẩn đối kháng bằng danh mục an

95

toàn sinh học của vi sinh vật
3.2.4.2.

Xác định độc tính của vi khuẩn đối kháng trên chuột bạch

95

3.2.5

Xác định loại kháng sinh do các chủng vi khuẩn tuyển

98

chọn sinh ra
3.2.5.1.

Xác định phenazine bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

100

(TLC) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
3.2.5.2.

Xác định Iturin A bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu cao áp

104

(UPLC/MS/MS)
3.3.

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh HX

106

3.3.1.

Phối hợp các chủng vi khuẩn đối kháng

106

3.3.1.1.

Đánh giá khả năng tồn tại cùng nhau trên môi trường của 2

106

chủng B.subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1
3.3.1.2.

Đánh giá khả năng ức chế R. solanacearum của tổ hợp 2

107

chủng B.subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1
3.3.2.

Xác định điều kiện nhân sinh khối phù hợp của 2

109

chủng B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1
3.3.2.1.

Nghiên cứu lựa chọn môi trường nhân sinh khối

109

3.3.2.2.

Xác định pH ban đầu thích hợp

110

3.3.2.3.

Xác định nhiệt độ phù hợp

111

3.3.2.4.

Xác định lượng không khí cung cấp thích hợp

112

3.3.2.5.

Xác định tốc độ khuấy phù hợp

113

3.3.2.6.

Xác định tỷ lệ giống cấp 2 phù hợp cho nhân sinh khối

114

3.3.2.7.

Xác định thời gian nhân sinh khối phù hợp

115

3.3.2.8.

Hoạt tính đối kháng của 2 chủng vi khuẩn sau nhân sinh khối

117

3.3.3.

Nghiên cứu tạo chất mang

118

3.3.4

Sản xuất chế phẩm vi sinh HX phòng chống bệnh héo
4

122


xanh cây ớt và lạc
3.3.4.1.

Xây dựng Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh HX phòng

122

chống bệnh héo xanh cây lạc và ớt
3.3.4.2.

Đánh giá hoạt lực đối kháng R. solanacearum của chế phẩm

125

HX
3.4.

Hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây ớt và lạc

127

3.4.1.

Trên cây ớt và lạc ở thí nghiệm ngoài đồng ruộng

127

3.4.1.1.

Trên cây ớt

127

3.4.1.2.

Trên cây lạc

128

3.4.2.

Trên cây ớt và lạc ở mô hình ngoài đồng ruộng

131

3.4.2.1.

Trên mô hình cây ớt

131

3.4.2.2.

Trên mô hình cây lạc

133

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

137

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA

138

TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO

139

PHỤ LỤC

5


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
TT

CHỮ VIẾT TẮT

1
2

3
4
5

CAS
CFU
ESI
HXVK
HPLC

6
7

IAA
ISR

8
9

KK
NCBI

10 NN&PTNT
11 PCA
12 PGPB
13 PGPR

14 PDA
15 RFLP
16 TLC

17
18
19
20

VKĐK
VSV
VKHX
SAR

21 WHO

TIÊNG ANH

TIẾNG VIỆT

Chrome Azurol S
Colony-forming unit
Electrospray ionization
Bacterial wilt disease
High Pressure Liquid
Chromatography
Indole-3-acetic acid
Induced Systemic
Resistance

Đơn vị hình thành khuẩn lạc
Ion hóa tia điện
Bệnh héo xanh do vi khuẩn
Sắc ký lỏng cao áp

Tính kháng hệ thống
Không khí
Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh
học Quốc gia

National Center for
Biotechnology
Information
Phenazine -1carboxylic acid
Plant GrowthPromoting Bacteria
Plant Growth
Promoting
Rhizobacteria
Photo Diode Array
Restriction fragment
length polymorphism
Thin layer
chromatography

Systemic Acquired
Resistance
World Health
Organization
6

Nông nghiệp và phát triển nông thôn
Axit Phenazine -1- carboxylic
Vi khuẩn kích thích sinh trưởng
thực vật

Vi khuẩn khu trú trong vùng rễ
kích thích sinh trưởng cây trồng
Khoảng bước sóng từ 190- 800
nm
Đa hình chiều dài đoạn cắt giới
hạn
Sắc ký lớp mỏng
Vi khuẩn đối kháng
Vi sinh vật
Vi khuẩn gây bệnh héo xanh
Tính kháng hệ thống có điều kiện
Tổ chức Y tế thế giới


DANH MỤC BẢNG
TT
Bảng.1.1:
Bảng 2.1:
Bảng 3.1:
Bảng 3.2:
Bảng 3.3:
Bảng 3.4:
Bảng 3.5:
Bảng 3.6:
Bảng 3.7:
Bảng 3.8:
Bảng 3.9:

Bảng 3.10:

Bảng 3.11:
Bảng 3.12:
Bảng 3.13:
Bảng 3.14:
Bảng 3.15:
Bảng 3.16:

NỘI DUNG
TRANG
Các race quan trọng nhất, cây ký chủ, phân bố địa lý của
18
R. solanacearum
Phân nhóm vi khuẩn R. solanacearum thành các biovar
48
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn R.
66
solanacearum phân lập từ cây ớt
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn R.
68
solanacearum phân lập từ cây lạc
75
Khả năng ức chế vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh
héo xanh cây ớt của các chủng vi khuẩn phân lập
Một số đặc điểm sinh học của chủng ĐKB1 phân lập
77
78
Khả năng cạnh tranh của chủng ĐKB1 với chủng vi
khuẩn R. solanacearum YH3 gây bệnh héo xanh cây ớt
79
Khả năng ức chế vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh

héo xanh cây lạc của các chủng vi khuẩn phân lập
Một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn ĐKP1
82
Khả năng cạnh tranh của vi khuẩn đối kháng ĐKP1 và
83
chủng vi khuẩn R. solanacearum LH3
Hiệu quả kiểm soát bệnh héo xanh cây ớt (giống ớt cay
85
LN57) trong nhà lưới của hai chủng vi khuẩn ĐKB1 và
ĐKP1
87
Hiệu quả kiểm soát bệnh héo xanh cây lạc (giống lạc
L14) trong nhà lưới của hai chủng vi khuẩn ĐKB1 và
ĐKP1
Đánh giá hoạt tính sinh học các chủng vi khuẩn kháng vi
89
khuẩn gây bệnh héo xanh lạc và ớt
Khả năng sử dụng nguồn cacbon với chủng ĐKB1 theo
92
kít chuẩn API 50CHB
Kết quả thử kít API 20 NE với chủng ĐKP1
93
Phân định độ an toàn sinh học của các chủng vi khuẩn
95
đối kháng
Đánh giá khả năng gây độc tính cấp của các chủng vi
96
khuẩn nghiên cứu trên chuột bạch, thí nghiệm sau 24 giờ
Đánh giá khả năng gây độc bán trường diễn của các
97

chủng vi khuẩn nghiên cứu trên chuột bạch, thí nghiệm
7


Bảng 3.17:
Bảng 3.18:
Bảng 3.19:
Bảng 3.20:

Bảng 3.21:
Bảng 3.22:
Bảng 3.23:
Bảng 3.24:
Bảng 3.25:
Bảng 3.26:
Bảng 3.27:
Bảng 3.28:
Bảng 3.29:
Bảng 3.30:
Bảng 3.31:
Bảng 3.32:

Bảng 3.33:
Bảng 3.34:
Bảng 3.35:

sau 30 ngày
Kết quả theo dõi trọng lượng chuột thí nghiệm sau 30
ngày
Kết quả thay đổi trọng lượng của chuột thí nghiệm

Khả năng tồn tại của chủng B. subtilis ĐKB1 và P.
fluorescens ĐKP1 trong điều kiện hỗn hợp và đơn lẻ
Hoạt tính đối kháng R. solanacearum của chủng B.
subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 trong điều kiện
hỗn hợp và đơn lẻ
Ảnh hưởng của các môi trường dinh dưỡng đến sinh
trưởng của 2 chủng vi khuẩn
Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của các
chủng vi khuẩn
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của các chủngvi
khuẩn sau 48h nuôi
Ảnh hưởng của lượng không khí đến sinh trưởng của các
chủng vi khuẩn sau 48h nuôi
Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến sinh trưởng của các
chủngvi khuẩn sau 48h nuôi
Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp 2 bổ sung đến chất lượng
sinh khối vi khuẩn
Thời gian nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn
Hoạt lực đối kháng R. solanacearum của 2 chủng vi
khuẩn trước và sau nhân sinh khối
Điều kiện phù hợp trong nhân sinh khối chủng B. subtilis
ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1
Thành phần lý, hoá học của than bùn (tại Sơn La)
Mật độ tế bào chủng B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens
ĐKP1 trong chất mang dạng bột sau 30 ngày nhiễm
Hoạt lực đối kháng R. solanacearum của B. subtilis
ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 trong chất mang dạng
bột sau 30 ngày nhiễm
Khả năng tồn tại của 2 chủng vi khuẩn B. subtilis ĐKB1
và P. fluorescens ĐKP1 trong chất mang

Khả năng tồn tại của B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens
ĐKP1 trong chế phẩm HX sau thời gian bảo quản
Hoạt lực đối kháng R. solanacearum của chế phẩm vi
8

97
98
107
108

109
110
111
112
114
115
116
117
118
119
119
120

121
125
126


Bảng 3.36:

Bảng 3.37:

Bảng 3.38:

Bảng 3.39:

Bảng 3.40:

Bảng 3.41:

Bảng 3.42:

Bảng 3.43:

Bảng 3.44:

Bảng 3.45:

Bảng 3.46:

sinh HX sau 6 tháng bảo quản
Hiệu quả kiểm soát bệnh héo xanh do vi khuẩn hại ớt
của chế phẩm vi sinh HX xã Tráng Việt, Mê Linh, Hà
Nội, vụ Hè Thu 2013)
Hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX tới sinh trưởng và
phát triển của cây ớt (giống ớt ngọt Mỹ)(tại xã Tráng
Việt, Mê Linh, Vĩnh Phúc, vụ Hè Thu 2013)
Hiệu quả kiểm soát bệnh héo xanh do vi khuẩn của chế
phẩm vi sinh HX trên cây lạc (xã Hòa Nam, Ứng Hòa,
Hà Nội, vụ Hè Thu 2013)

Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh HX đến các yếu tố cấu
thành năng suất lạc (xã Hòa Nam, Ứng Hòa, Hà Nội, Vụ
Hè Thu 2013)
Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh HX đến sinh trưởng,
phát triển và năng suất lạc (xã Hòa Nam, Ứng Hòa, Hà
Nội, Vụ Hè Thu 2013)
Hiệu quả kiểm soát bệnh héo xanh cây ớt (giống ớt cay
Hàn Quốc) của chế phẩm vi sinh HX (xã Tiền Phong, Mê
Linh, Hà Nội, vụ Đông Xuân 2014)
Hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX đến sinh trưởng và
phát triển của cây ớt (giống ớt cay Hàn Quốc)(tại Tiền
Phong, Mê Linh, Vĩnh Phúc, vụ Đông Xuân, 2014)
Hiệu quả kinh tế của chế phẩm vi sinh HX trong mô hình
ớt (xã Tiền Phong, Mê Linh, Hà Nội, vụ Đông Xuân
2014)
Hiệu quả kiểm soát bệnh héo xanh cây lạc - giống L14
của chế phẩm vi sinh HX (Tĩnh Gia, Thanh Hóa, vụ
Đông Xuân, 2014)
Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh HX đến sinh trưởng,
phát triển và năng suất lạc- giống L14 tại Tĩnh Gia,
Thanh Hóa, vụ Đông Xuân, 2014
Hiệu quả kinh tế của mô hình lạc khi bón chế phẩm vi
sinh HX tại Thanh Hóa, vụ Đông Xuân 2014

9

127

127

129

130

131

131

132

133

134

134

135


DANH MỤC HÌNH
TT
Hình 1.1:
Hình 1.2:
Hình 1.3:

Hình 3.1:
Hình 3.2:
Hình 3.3:
Hình 3.4:
Hình 3.5:

Hình 3.6:
Hình 3.7:
Hình 3.8:
Hình 3.9:
Hình 3.10:
Hình 3.11:
Hình 3.12:
Hình 3.13:
Hình 3.14:
Hình 3.15:
Hình 3.16:
Hình 3.17:

NỘI DUNG
Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum Pss4, nuôi cấy
trên môi trường TTC
Cây lạc bị chết do bệnh héo xanh vi khuẩn (mẫu bệnh héo xanh
lạc thu thập tại Tĩnh Gia, Thanh Hóa)
A: Cây ớt bị chết do bệnh héo xanh vi khuẩn; B. Dịch vi khuẩn
R. solanacearum màu trắng sữa thôi ra từ thân cây bị bệnh
HXVK (Nguồn: Viện TNNH)
Bệnh héo xanh cây lạc (Nghi Lộc, Nghệ An, tháng 3-2014)
Lây bệnh héo xanh vi khuẩn nhân tạo trên cây lạc
Hình ảnh thử phản ứng siêu nhạy trên lá thuốc lá
Sự chuyển hoá 6 môi trường biovar của chủng vi khuẩn LH3
(biovar 3)
Sự không chuyển hoá 6 môi trường biovar của chủng vi khuẩn
YH3 (biovar 1)
Tế bào của chủng vi khuẩn LH3 gây bệnh HX điển hình, chụp
dưới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại x 25.00 lần

Ảnh khuẩn lạc (A) và tế bào (B) chủng ĐKB1(độ phóng đại x
25,000)
Ảnh khuẩn lạc (A) và tế bào (B) chủng ĐKP1 (độ phóng đại x
25,000)
Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn đối kháng phân
lập được
Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn kháng R.
solanacearum
Minh hoạ thí nghiệm đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh HX cây
ớt trong nhà lưới của các chủng vi khuẩn ĐKB1 và ĐKP1
Minh hoạ thí nghiệm đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh HX cây
lạc trong nhà lưới của các chủng vi khuẩn ĐKB1 và ĐKP1
Khả năng sinh siderophore của các chủng B. subtilis ĐKB1 và
P. fluorescens ĐKP1
Vị trí phân loại của chủng ĐKB1 và các loài có quan hệ họ
hàng gần
Vị trí phân loại của chủng ĐKP1 và các loài có quan hệ họ
hàng gần
Hoạt lực đối kháng vi khuẩn R. solanacearum gây héo xanh
lạc và ớt của chủng B. subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1
Ảnh chụp TLC mẫu phenazine dịch lên men (1) và phenazine

10

TRANG
17
26
26

64

70
70
72
72
73
76
82
83
84
85
88
90
93
94
99
101


Hình 3.18:
Hình 3.19:
Hình 3.20:
Hình 3.21:
Hình 3.22:

Hình 3.23:
Hình 3.24:
Hình 3.25:

Hình 3.26:
Hình 3.27:

Hình 3.28:
Hình 3.29:
Hình 3.30:
Hình 3.31:

Hình 3.32:

Hình 3.33:
Hình 3.34:

chuẩn (2)
Hình ảnh peak của phenazine thu được từ dịch lên men (mẫu
T1) trên sắc ký đồ HPLC
Hình ảnh peak của phenazine chuẩn (Mẫu T2) trên HPLC
Phổ tử ngoại của mẫu phenazine từ dịch lên men chủng P.
fluorescens ĐKP1 (Mẫu T1)
Phổ tử ngoại của mẫu phenazine chuẩn (Mẫu T2)
(A) Vùng ức chế của dịch nuôi cấy ĐKP1; (B) Vùng ức chế
của phenazine từ bản gen TLC đối với vi khuẩn R.
solanacearm gây bệnh héo xanh lạc
Hình ảnh peak của Iturin A từ dịch lên men chủng B. subtilis
ĐKB1 trên UPLC
Hình ảnh peak của iturin A chuẩn trên UPLC
(A,B) Vùng ức chế của dịch lên men ĐKB1; (B,C,D) Vùng ức
chế của Iturin tách chiết từ dịch lên men vi khuẩn đối với vi
khuẩn R. solanacearm gây bệnh héo xanh ớt và (E) dung môi
tách chiết Iturin
Nuôi cấy vạch 2 chủng vi khuẩn B.subtilis ĐKB1 và P.
fluorescens ĐKP1 trên cùng môi trường dinh dưỡng

Hoạt tính đối kháng R. solanacearum 2 chủng vi khuẩn
B.subtilis ĐKB1 và P. fluorescens ĐKP1 trong chất mang sau
30 ngày nhiễm, trong điều kiện hỗn hợp chủng vi khuẩn (A) và
đơn chủng vi khuẩn (B)
Minh họa quá trình sản xuất chế phẩm vi sinh HX phòng chống
bệnh héo xanh cây lạc và ớt
Sơ đồ Qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh HX phòng chống
bệnh héo cây lạc và ớt
Hoạt lực đối kháng R. solanacearum của chế phẩm vi sinh HX
sau 6 tháng bảo quản
Thí nghiệm đánh giá hiệu quả chế phẩm vi sinh HX trên ớt
ngoài đồng ruộng (xã Tráng Việt, Mê Linh, Vĩnh Phúc, vụ Hè
Thu 2013)
Thí nghiệm đánh giá hiệu quả chế phẩm vi sinh HX trên lạc
ngoài đồng ruộng (xã Hòa Nam, Ứng Hòa, Hà Nội, Vụ Hè Thu
2013)
Mô hình đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây
ớt tại xã Tiền Phong, Mê Linh, vụ Đông Xuân, 2014
Mô hình đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây
lạc tại Tĩnh Gia, Thanh Hóa, vụ Đông Xuân, 2014

11

101
102
102
103
103

104

104
105

106
108

122
123
126
128

129

132
136


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Bệnh hại cây trồng đã gây thiệt hại đáng kể trong sản xuất và bảo quản nông
sản. Trong đó, phải kể đến bệnh héo xanh (Bacterial wilt disease) do vi khuẩn
Ralstonia solanacearum (HXVK) gây ra. Vi khuẩn R. solanacearum tồn tại lâu
trong đất, tàn dư thực vật và được thông báo gây hại nhiều loại cây thuộc họ cà và
đậu ở nhiều nơi trên thế giới từ những năm 80 của thế kỷ XIX. Nguyên nhân gây
bệnh được nhà bác học người Mỹ E.F.Smith xác định năm 1896, ở đâu có trồng các
loại cây họ cà và đậu (cà chua, khoai tây, ớt, lạc, đậu tương,…) là thấy sự có mặt
của bệnh héo xanh do vi khuẩn R. solanacearum gây ra. Ngoài ra nó còn ký sinh
trên 200 loài thực vật khác như chuối, thuốc lá, bí, dưa chuột,.... Đây là bệnh phổ
biến, nguy hiểm và phân bố rộng khắp trên thế giới, đặc biệt ở vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới [78, 93, 115]. Bệnh héo xanh do vi khuẩn được coi là một trong năm loại

bệnh cây trồng thuộc đối tượng quan tâm nhất của chương trình phòng trừ sâu bệnh
tổng hợp của FAO (1992) và chịu sự kiểm soát chặt chẽ của kiểm dịch Quốc tế, nhất
là các nước thuộc cộng đồng châu Âu, châu Mỹ [31; 34].
Trước tình hình đó, đã có nhiều nghiên cứu về canh tác và chọn giống cây
trồng, cũng như áp dụng biện pháp kiểm soát sinh học bằng cách sử dụng các chế
phẩm vi sinh, phân hữu cơ vi sinh chứa các chủng vi sinh vật đối kháng có khả năng
ức chế và làm giảm tính độc của R. solanacearum. Tuy nhiên, các biện pháp vẫn
còn hạn chế là: khả năng giảm tỉ lệ bệnh còn thấp, thời gian bảo quản chế phẩm
ngắn, hiệu quả chưa cao nên chưa đáp ứng nhu cầu của thực tiễn,...v...v...
Hơn nữa, với bản chất biến đổi tính độc liên tục (do các chủng R.
solanacearum độc luôn bị ảnh hưởng bởi hóa chất bảo vệ thực vật, tác động của môi
trường,..v…v…) cũng như sự đa dạng của vi khuẩn R. solanacearum trên toàn thế
giới, nên các biện pháp phòng trừ bệnh này ngày càng trở nên phức tạp và khó khăn
hơn. Bệnh héo xanh do vi khuẩn ở Việt Nam cũng xuất hiện ở mọi lúc, mọi nơi,
xâm nhiễm và gây bệnh trên nhiều loại cây trồng, có nơi có lúc bệnh hại nặng tới
mức gây chết 90% cây trồng [10].
12


Trong khi đó, việc sử dụng thuốc hóa học để hạn chế vi khuẩn R.
solanacearum không những hiệu quả rất thấp mà còn gây ảnh hưởng xấu tới môi
trường sinh thái, chất lượng sản phẩm và sức khỏe cộng đồng. Do đó, việc thường
xuyên phân lập các chủng R. solanacearum mới, có tính độc cao từ ngoài đồng
ruộng là rất cần thiết, vì những chủng này sẽ là đối tượng cho việc phân lập, tuyển
chọn các chủng vi sinh vật (VSV) vừa có khả năng đối kháng cao với chúng vừa
cạnh tranh tốt với các VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng để sản xuất chế phẩm vi sinh
phòng trừ bệnh HXVK, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, giảm
thiệt hại kinh tế cho người nông dân và xã hội là việc làm có ý nghĩa khoa học và
thực tiễn cao.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài luận án: “Nghiên

cứu, tuyển chọn vi khuẩn đối kháng chống Ralstonia solanacearum gây bệnh héo
xanh cây trồng”. Trong số các cây trồng quan trọng trong nông nghiệp của Việt
Nam thì cây lạc và ớt có giá trị dinh dưỡng rất cao, mang lại lợi ích kinh tế rất lớn
cho xuất khẩu và phục vụ tiêu dùng trong nước. Tuy nhiên, hai loại cây này thường
bị bệnh HXVK ở mức độ cao, có những vùng chuyên canh lạc và ớt bị bệnh héo
xanh tới 30-40%, có nơi không thể trồng được 2 loại cây này nữa, vì mầm bệnh tiềm
tàng trong đất rất lớn và rất lâu. Trước tình hình thực tế trên, luận án sẽ đi sâu
nghiên cứu bệnh HXVK ở cây lạc, ớt và phân lập, tuyển chọn vi khuẩn đối kháng
(VKĐK) cũng như xác định cơ chế kháng vi khuẩn R. solanacearum của các chủng
VKĐK tuyển chọn để sản xuất chế phẩm vi sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh héo
xanh lạc và ớt.
2. Mục tiêu của luận án
Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn đối kháng có khả năng kháng cao với vi
khuẩn R. solanacearum để sản xuất chế phẩm vi sinh ứng dụng trong phòng trừ
bệnh héo xanh cây ớt và lạc. Xác định được cơ chế kháng vi khuẩn R. solanacearum
của các chủng VKĐK tuyển chọn.
13


3. Nội dung nghiên cứu của luận án
3.1. Khảo sát tình hình bệnh héo xanh cây ớt và lạc ở miền Bắc và miền Trung Việt
Nam; Phân lập vi khuẩn R.solanacearum.
3.2. Nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với R. solanacearum
3.3. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh HX
3.4. Đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh HX trên cây ớt và lạc
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Góp phần làm sáng tỏ mức độ đa dạng sinh học của quần thể vi khuẩn R.
solanacearum gây bệnh héo xanh cây trồng. Bổ sung một số chủng VKĐK với R.
solanacearum vào bộ sưu tập giống VSV nông nghiệp Việt Nam. Cung cấp những
luận cứ và cơ sở khoa học về hướng ứng dụng VSV đối kháng trong phòng chống

bệnh héo xanh cây trồng nói chung, cây ớt và lạc nói riêng. Sản xuất và ứng dụng
chế phẩm vi sinh (HX) trong phòng chống bệnh héo xanh cây ớt và lạc có hiệu quả
cao, thân thiện với môi trường.
5. Đối tượng, phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Đối tượng: Vi khuẩn R. solanacearum, VKĐK, cây ớt, cây lạc.
- Phạm vi: Những vùng trồng lạc và ớt bị bệnh héo xanh ở miền Bắc Việt
Nam; bệnh héo xanh vi khuẩn; chế phẩm vi sinh phòng bệnh héo xanh.
- Địa điểm: Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hóa
học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Viện Vệ sinh dịch tễ Trung
ương, Thành phố Hà Nội, tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa.
- Thời gian: 2010 – 2014.
6. Những đóng góp mới của luận án
- Phân lập, tuyển chọn mới được 2 chủng vi khuẩn B. subtilis ĐKB1 và P.
fluorescens ĐKP1, ức chế mạnh vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh.
- Xác định được một số cơ chế chính kháng R. solanacearum là do 2 chủng
VKĐK sinh kháng sinh Phenazine, Iturin A và siderophore tiêu diệt hoặc làm giảm
tính độc của R. solanacearum trên cây ớt và lạc.
- Sản xuất được chế phẩm vi sinh HX chứa 2 chủng VKĐK trên nền chất
mang là: than bùn + 5% rỉ đường + 1% bột vỏ tôm cua có khả năng hạn chế 89,82%
bệnh héo xanh cây ớt và 89,39% bệnh héo xanh cây lạc trên đồng ruộng.
14


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình trồng ớt, lạc ở Việt Nam và trên Thế giới
1.1.1. Tình hình trồng ớt và lạc ở Việt Nam
* Cây ớt: Ở Việt Nam, ớt cay được trồng ở nhiều tỉnh thành trong cả nước,
phổ biến nhất là Hải Dương, Hải Phòng, các tỉnh miền Trung, thành phố Hồ Chí
Minh. Riêng tỉnh Quảng Trị hàng năm trồng tới 100.000 ha ớt cay để xuất khẩu.
Quảng Bình cũng là một trong những tỉnh có diện tích trồng ớt lớn, mỗi năm trồng

khoảng 125.000 ha. Năm 2011, Thái Bình có diện tích trồng ớt 1.200 ha, năm 2012
đã tăng lên 1.500 ha. Một số tỉnh miền Trung có nơi trồng tới 15.000-20.000 ha ớt
đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn trồng lúa và có thể đạt 400 triệu đồng/ha/năm. Ớt
ngọt được trồng ở Vĩnh Phúc khoảng 200 ha. Từ 41 ha (vụ Đông 2011-2012), đến
nay, diện tích trồng ớt của huyện Yên Định, Thanh Hóa đã mở rộng lên 215 ha, thu
hút hàng trăm hộ tham gia, cây ớt đã cho nguồn thu từ 40 đến 45 tỷ đồng/năm. Ở
Bình Định, huyện Phù Mỹ là địa phương có phong trào trồng ớt mạnh nhất, trong vụ
Đông Xuân 2012-2013 diện tích trồng ớt cũng tăng đột biến lên 800 ha, tăng hơn
200 ha so cùng kỳ năm trước [23].
* Cây lạc: Lạc là cây có dầu quan trọng trong số các loại cây có dầu đang
trồng trên thế giới, sản phẩm của lạc có nguồn protein cao làm thức ăn tốt cho người
và gia súc, làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến. Sản phẩm lạc là một mặt
hàng có kim ngạch xuất khẩu khá lớn. Hàng năm, Việt Nam xuất khẩu 100.000135.000 tấn lạc (đạt khoảng 65-120 triệu USD) [13, 24].
Năm 2012, diện tích trồng lạc của cả nước đạt 220.500 ha. Tới năm 2014, tổ
chức USDA (Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ) dự báo diện tích gieo trồng sẽ tăng lên
230.000 ha và sản lượng cũng tăng 7,8% ở mức 530.000 tấn. Điều kiện thời tiết
thuận lợi và những cải thiện về giống sẽ góp phần thúc đẩy năng suất và sản lượng
lạc. Năm 2015, sản lượng lạc được dự báo tăng lên 550.000 tấn cùng với sự mở
15


rộng về diện tích gieo trồng. Khu vực trồng lạc chủ yếu tập trung ở bờ biển Bắc
Trung Bộ, khu vực miền núi và trung du Bắc Bộ và Duyên Hải Nam Trung Bộ [23].
1.1.2. Tình hình trồng ớt và lạc trên Thế giới
* Cây ớt: Diện tích trồng ớt cay trên thế giới khoảng 1,7 triệu ha, tổng sản
lượng 11,25 triệu tấn, trong đó châu Á chiếm khoảng 1/3, tập trung ở Ấn Độ, Trung
Quốc, Hàn Quốc, Indonesia, Thổ Nhĩ Kỳ và Malaysia. Tính đến 2008, Trung Quốc
là nước sản xuất ớt lớn nhất thế giới, tiếp theo là Mexico.
Sản lượng ớt ở những nước như Ấn Độ, Trung Quốc, Pêru, Bănglađét,
Hungari và những nước khác đang tăng lên, với tốc độ tăng khoảng 5,2% mỗi năm,

sản lượng của Ấn Độ hàng năm chiếm từ 50 đến 60% tổng sản lượng toàn cầu. Sản
lượng của Trung Quốc và Pêru tăng nhanh, trong khi sản lượng của Hungari giảm.
Ấn Độ có diện tích trồng ớt năm 2005 là 737.000 ha, giảm xuống 654.000 ha năm
2006, nhưng tăng lên 737.000 ha năm 2007. Năm 2008, diện tích trồng là 805.000ha
và năm 2009 là 750.000 ha. Sản lượng ớt Ấn Độ năm 2005 đạt 1.185 triệu tấn, năm
2006 đạt 1.014 triệu tấn, năm 2007 tăng lên 1.242 triệu tấn, năm 2008 ở mức 1.297
triệu tấn và năm 2009 đạt 1.167 triệu tấn [64].
* Cây lạc: Cây lạc được trồng ở tất cả các châu lục với hơn 100 nước trên thế
giới, với tổng diện tích ít biến động ở các vụ trong năm. Năm 2009, diện tích trồng
lạc trên thế giới khoảng 23,95 triệu ha, năng suất trung bình đạt 15,2 tạ/ha và sản
lượng đạt 36,41 triệu tấn/năm.
Tuy nhiên, sự phân bố về diện tích, năng suất, sản lượng lại tập trung không
đều giữa các khu vực trồng lạc khác nhau trên thế giới. Sản xuất lạc phát triển mạnh
ở châu Á (chiếm 50% tổng diện tích toàn cầu và 64% tổng sản lượng lạc của thế
giới) và châu Phi (chiếm 46 % tổng diện tích toàn cầu và 28% tổng sản lượng của
thế giới). Những nước trồng lạc lớn trên thế giới là Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ,
Nigeria và Myama [64].
16


1.2. Vi khuẩn Ralstonia solanacearum
1.2.1. Đặc điểm phân loại vi khuẩn R. solanacearum
Tế bào loài R. solanacearum có hình oval ngắn, gram âm, tròn ở hai đầu,
thường thấy ở dạng đơn, ghép đôi hoặc ghép 4, nhưng ít khi kết thành chuỗi, không
hình thành nội bào tử. Tuy có sự dao động đáng kể nhưng kích thước tế bào của
chúng khoảng 0,5 – 0,7 µm  1,5 - 2,0 µm, không có màng nhày (nonencapsulated). R. solanacearum dương tính với catalaza, oxidaza và làm giảm hàm
lượng nitrat, không thủy phân tinh bột và gelatin, bị ức chế trong môi trường thịt có
NaCl lớn hơn 2% [144]. Hầu như chúng luôn chuyển động, có một đến vài tiên mao
ở một cực của tế bào, bề mặt khuẩn lạc thường nhẵn, đôi khi gồ ghề, chảy hoặc
không chảy, màu trắng đục hoặc phớt hồng, hoặc trắng (hình 1.1). Cả chủng có tính

độc cao và tính độc thấp đều có các lông nhỏ ở rìa [111]. Vị trí phân loại của R.
solanacearum được sắp xếp theo NCBI (2005) như sau: Giới: Bacteria; Ngành:
Proteobacteria;

Lớp:

Betaproteobacteria;

Bộ:

Burkholderiales;

Họ:

Burkholderiaceae; Chi: Ralstonia; Loài: solanacearum.

Hình 1.1. Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum Pss4 ,
nuôi cấy trên môi trường TTC (nguồn: Viện Thổ nhưỡng nông hóa)
Các nhà khoa học đã chia R. solanacearum thành 5 race khác nhau, sự phân
chia các race thường rất phức tạp do phụ thuộc vào thành phần cây chủ và phạm vi
phân bố của chúng [39]. Race 1 là nhóm gây hại với phổ ký chủ rộng và phổ biến ở
các nước khu vực châu Mỹ, châu Phi, châu Á và Nam Mỹ. Race 2 chủ yếu gây bệnh
17


cho chuối và tập trung ở Trung tâm châu Mỹ và Đông Nam Á. Race 3 phân bố rộng
khắp trên thế giới và liên quan chủ yếu đến cây khoai tây. Race 4 gây hại trên cây
gừng ở Châu Á và Hawaii; Race 5 gây hại đến cây dâu tằm ở Trung Quốc [56, 93,
119]. Race 2 và 3 là các race quan trọng của R. solanacearum (bảng 1.1) và gây
bệnh trên nhiều loại cây trồng có giá trị cao trong nông nghiệp.

Dựa trên các đặc điểm sinh hoá, khả năng sử dụng và ôxy hóa một số
disaccharide (cellobiose, lactose và maltose) và rượu hexose (dulcitol, manitol và
sorbitol), He và cs. (1983) đã chia R. solanacearum thành 5 biovar khác nhau.
Biovar 1 và 2 thuộc loại dinh dưỡng kém linh hoạt so với biovar 3 và 4, giữa các
biovar khác nhau bởi các hình ảnh điện di đồ, các protein màng. Biovar 1 và 2 còn
khác biovar 3, 4 và 5 trên cơ sở phân tích các mẫu ADN và RFLP [79, 112].
Bảng 1.1: Các race quan trọng nhất, cây ký chủ và phân bố địa lý
của R. solanacearum
Race

Cây ký chủ

Phân bố địa lý

Biovar

1

Nhiều loại

Châu Á, Úc, Mỹ

1, 3 và 4

2

Chuối và các loài Muss sp.

Caribbean, Brazil,

1

Philippines
3

Khoai tây, cà chua, một số cây họ

Khắp thế giới trừ Mỹ

2

cà, Geranium và một số loài khác

và Canada

4

Gừng

Châu Á

3 và 4

5

Dâu tằm

Trung Quốc

5

(Nguồn: Denny và Hayward, 2001)[55].

Biovar 1 và 2 chiếm ưu thế ở châu Mỹ, biovar 3 ở châu Á. Ở Philippin thấy
có mặt cả 4 biovar, còn biovar 2 có phân bố địa lý rộng nhất, trong khi đó biovar 3
có đặc điểm dinh dưỡng linh hoạt hơn cả. Có một bằng chứng cho rằng R.
solanacearum là một loài cổ, chỉ có quan hệ xa với các loài thuộc chi Ralstonia.
18


Theo phân loại, R. solanacearum như là một nhóm thuộc Ralstonia đã được biết
trong nhiều năm dựa vào phân tích số liệu của những đặc điểm hình thái, lai ADN ADN hoặc ARN-ARN [57].
Dựa vào sự đa hình về chiều dài đoạn ADN được tạo ra bởi các enzym cắt
giới hạn (RFLP), Cook đã chia các biovar thành hơn 40 nhóm RFLP [52].
Trình tự nucleotide của R. solanacearum FQY-4 khoảng 3,715,422 bp, trong
đó tỉ lệ G+C trung bình là 66,8% [51].
Theo Fegan (2005), R. solanacearum được chia làm 4 phylotype, liên quan
đến 4 nhóm gen chính, mỗi nhóm lại liên quan đến khu vực địa lý xuất hiện.
Phylotype I gồm tất cả các chủng R. solanacearum thuộc biovar 3,4,5 được phân lập
từ châu Á. Phylotype II bao gồm các chủng thuộc biovar 1, 2 và 2T (là phân nhóm
dưới biovar 2, khu vực nhiệt đới), phân lập từ châu Mỹ; tất cả các chủng thuộc race 3
gây bệnh cho khoai tây và race 2 gây bệnh cho chuối. Phylotype III gồm các chủng
thuộc biovar 1 và 2T, từ châu Phi và các khu vực bán đảo xung quanh. Phylotype IV,
nhiều hỗn tạp, với biovar 1, 2 và 2T từ Indonesia, Australia và Nhật Bản, cũng như
loài R. syzygii và vi khuẩn gây bệnh máu (BDB) [65].
Tài liệu ngày 02 tháng 11 năm 2014 của Tổ chức phi lợi nhuận (Wikimedia
Foundation) đăng trên khẳng
định rằng: Vi khuẩn R. solanacearum là một loại vi khuẩn gây bệnh cây trồng quan
trọng nhất trên thế giới vì khả năng gây chết, tồn tại, phổ cây chủ, phân bố địa lý
rộng và gây thất thoát năng suất cây trồng của nó.

1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn R. solanacearum
R. solanacearum là vi khuẩn hiếu khí, không hình thành bào tử, có khả năng
tổng hợp poly-3-hydroxybutyrat (PHB) như là nguồn cacbon dự trữ, oxy là chất
nhận điện tử cuối cùng của chuỗi biến đổi thức ăn, trong vài trường hợp nitrat được
sử dụng như là chất nhận điện tử, một vài loại lại oxy hoá hợp chất vô cơ không bắt
buộc để sử dụng làm chất dinh dưỡng, chúng có thể oxy hoá H2 hoặc CO thành
nguồn năng lượng chính. Vì vậy, R. solanacearum có thể sinh trưởng trên nhiều loại
môi trường khác nhau, khi nuôi cấy R. solanacearum có thể dùng các loại môi
trường chứa cao nấm men, pepton, cazein, đường, glycerin trong điều kiện hiếu khí
19


và nhiệt độ 280C  20C. Trong dịch cây nghèo chất dinh dưỡng nhưng lại rất phù
hợp cho R. solanacearum phát triển, trong thân cây mật độ tế bào của chúng có thể
đạt 108-109CFU/g cây cà chua [85].
PHB là một loại PHA (polyhydroxyalkanoate) được sinh ra từ nhiều loại vi
khuẩn, trong điều kiện dư thừa cacbon và thiếu hụt dinh dưỡng dẫn đến tích lũy
cacbon và năng lượng trong tế bào [147]. 3 gen qui định các enzyme điều khiển 3
phản ứng quá trình sinh tổng hợp PHB là Acetoacetyl CoA reductase, - ketotiolase,
PHB polymerase [106].
R. solanacearum và một số vi khuẩn gram âm như Pseudomonas, Rhizobium,
Azotobacter, Agrobacterium…không sử dụng con đường đường phân thông thường
hay pentose- phosphate mà sử dụng con đường Entner- Doudoroff. Con đường
Entner- Doudoroff phân giải glucose thành pyruvate, ATP, ADH và ADPH [132].
Mặc dù không tạo ra sắc tố phát huỳnh quang, nhưng nó có thể tổng hợp sắc
tố mầu nâu khi khuếch tán trên môi trường thạch có chứa tyrozin. R. solanacearum
có thể khử nitrat thành nitrit, nhưng không thuỷ phân tinh bột, hoá lỏng yếu hoặc
không hoá lỏng gelatin. R. solanacearum có phản ứng khác nhau với chất kháng
sinh, các nòi của chúng có thể mẫn cảm với streptomyxin, chống chịu với penixilin,
viomyxin,...[79].

Năm 1963, Sequeira và William đã phát hiện cả 2 dạng độc và không độc của
R. solanacearum đều tổng hợp IAA dễ dàng ngay cả khi không có mặt tryptophan
trong môi trường nuôi cấy. Hơn nữa, một chủng R. solanacearum có tính độc đã
tổng hợp IAA từ nhân vòng của tryptophan chứ không phải từ các chuỗi thẳng. Như
vậy, chủng có dạng khuẩn lạc chảy lỏng và có tính độc này đã không tuân thủ trình
tự chuyển hoá Tryptophan --> Indol - Axetaldehit --> IAA như đã thấy ở hầu hết các
vi sinh vật (VSV) và thực vật bậc cao [138]. Trong khi đó, một đột biến có dạng
khuẩn lạc hình chai, không độc lại chuyển hoá cả nhân vòng và mạch thẳng của
tryptophan thành IAA [138, 140].
1.2.3. Các hình thức xâm nhập của R. solanacearum vào cây chủ
R. solanacearum có nhiều gen điều khiển 6 hệ thống tiết ra protein, trong đó
được nghiên cứu nhiều nhất là “Hệ thống tiết kiểu 3” (T3SS hoặc TTSS). Nhờ đó R.
20


solanacearum tiết ra những protein gọi là “T3Es” kích thích và thúc đẩy nhanh quá
trình xâm nhiễm của R. solanacearum vào tế bào cây chủ. T3SS được mã hóa bởi
các gen hrp [63, 87].
Vi khuẩn R. solanacearum được lưu tồn từ đất và nước, các dòng chảy là
nguồn phát tán chủ yếu vi khuẩn vào môi trường [62]. Nhờ khả năng tạo một quần
thể trong quản bào và mao mạch thân gỗ, R. solanacearum rất khác biệt với phần
lớn vi khuẩn gây thối lá, thối rữa và gây thối ở những chỗ vi khuẩn tấn công, trước
tiên là các mô mềm (nhu mô). Người ta thường thấy những hình thức xâm nhập của
R. solanacearum vào cây chủ có quan hệ mật thiết với các cơ thể đơn bào ăn rễ ở
trong đất (Meloidogyne. spp.), khi có sự tương tác giữa giun tròn với R.
solanacearum thì tốc độ xâm nhiễm của vi khuẩn vào thân cây chủ sẽ tăng, đồng
thời khả năng tồn tại cũng tăng [88].
Bệnh phát triển mạnh nhất khi R. solanacearum và giun tròn được nhiễm
đồng thời, tỉ lệ mắc bệnh cao khi giun tròn được nhiễm vào đất trước vi khuẩn.
Nhiễm R. solanacearum đơn lẻ thì mức độ bệnh sẽ giảm, điều này chứng minh rằng

giun tròn đã làm tổn thương bộ rễ của cây và qua đó vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào
bên trong mô mạch. Mức độ xâm nhiễm của vi khuẩn vào rễ nhờ đơn bào được biểu
thị qua chỉ số vết thương trên rễ, tuy nhiên những đơn bào cũng có thể làm thay đổi
trạng thái của mô, làm mô trở nên thuận lợi hơn cho sự quần tụ của vi khuẩn. Khi vi
khuẩn đã xâm nhập vào cây chủ, thì tại đó các enzyme pectinase, cellulase và
protease bắt đầu hoạt động, gây nên sự phá huỷ tế bào của cây [77].
Bên cạnh đó còn có các hình thức xâm nhập khác thông qua côn trùng như:
ong, kiến... hoặc các loại sâu gây hại khác ...v..v.. có mang R. solanacearum, chúng
chích vào cây, qua đó vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào cây chủ, hình thức này rất
phổ biến và lan truyền nhanh. Ngoài ra, còn do sự chăm sóc dẫn đến đứt rễ, sây sát
thân, dập lá cây, lúc này vi khuẩn tiềm tàng trong đất có cơ hội xâm nhập vào cây
chủ. Hơn nữa, R. solanacearum gây bệnh lan truyền từ cây này sang cây khác, hoặc
từ vùng này đến vùng khác là do: Di chuyển vật liệu trồng trọt và hạt giống cũng có
thể là vật mang mầm bệnh [11].
21