Tài liệu Luận văn tốt nghiệp "Sử dụng các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua" pdf

Luận văn tốt nghiệp

Sử dụng các dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens phòng
trừ vi khuẩn Ralstonia
solanacearum gây bệnh héo xanh
trên cây cà chua

.
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
1
Chương 1
GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề
Cà chua là một trong số những cây rau màu quan trọng, được phân bố rộng
rãi ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên việc gieo trồng cà chua vẫn gặp nhiều
khó khăn, trở ngại. Một trong những nguyên nhân làm hạn chế sự phát triển sản
xuất và làm giảm năng xuất cà chua đó là sâu và bệnh hại. Trong đó đáng chú ý
hơn cả là bệnh héo rũ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra. Đây là loại vi
khuẩn có khả năng gây hại trên 200 loài cây cỏ, đặc biệt gây hại nặng trên cây họ
cà như cà chua, cà tím, khoai tây, thuốc lá và các cây khác họ như đậu phụng,
gừng, chuối, chúng có khả năng sống rất lâu trong đất và lây lan rất nhanh, di
chuyển từ nơi nay sang nơi khác. Cây chết hàng loạt khi lá vẫn còn xanh giống như
bò cắt ngang gốc. Ước tính thiệt hại cho sản xuất cây trồng hàng năm do vi khuẩn
Ralstonia solanacearum gây ra là 15-95%(Emil Q.Javier, 1994).
Để khắc phục tình trạng này, các biện pháp phòng trừ tác nhân gây bệnh
bằng phương pháp sinh học được nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu. Đây là
một trong những phương pháp phòng chống có hiệu quả nhất hiện nay ở khả năng

phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum, giúp cây cà chua sinh trưởng và phát
triển tốt hơn, làm cho tác nhân gây bệnh không kháng thuốc, an toàn với môi
trường sinh thái cho kết quả nhanh và chính xác rất phù hợp với xu hướng nông
nghiệp an toàn hiện nay và đang được rất nhiều nước trên thế giới áp dụng.
Việc nghiên cứu các loại vi khuẩn đối kháng như : Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, để chống lại vi khuẩn Ralstonia
solanacearum là một vấn đề hết sức cần thiết hiện nay. Vì vậy, nghiên cứu về tính
đa dạng của các cá thể trong quần thể vi khuẩn gây bệnh và sự lưu hành của chúng
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
2
ở các vùng sản xuất là rất cần thiết, nó làm cơ sở khoa học cho các giải pháp phòng
chống và chọn tạo giống kháng bệnh sau này.
Xuất phát từ thực tiễn trên và để đánh giá khả năng phòng trừ của các dòng
vi khuẩn Pseudomonas fluorescens. Chúng tôi thực hiện đề tài:
“Sử dụng các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phòng trừ vi
khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua”.

1.2 Mục đích – yêu cầu

Đánh giá khả năng phòng trừ của các dòng vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên
cây cà chua.

1.3 Giới hạn đề tài
Đề tài được thực hiện trong tháng có nhiều mưa, đất trồng bò nhiễm nhiều
loại bệnh. Cây cà chua là loại cây dễ mẫn cảm với nhiều loại bệnh.

1.4 Đối tượng nghiên cứu

Các dòng vi khuẩn đối kháng thuộc nhóm Pseudomonas fluorescens
Dòng vi khuẩn gây bệnh Ralstonia solanacearum
Cây trồng: cà chua

1.5 Nội dung nghiên cứu
Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens
với các dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
trên đóa petri trong
phòng thí nghiệm.
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
3
Đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà chua trong điều kiện nhà
lưới.
Đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà chua ngoài đồng ruộng.

Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
4
Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lòch sử nghiên cứu bệnh
Vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
là vi khuẩn gây bệnh mạch dẫn gây hại
trên 200 loài cây cỏ. Halted đã nghiên cứu bệnh này vào năm 1892, năm 1896
E.F.Smith nghiên cứu, mô tả, đònh tên Pseudomonas solanacearum. Những năm sau
đó, bệnh héo rũ được nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu, nghiên cứu một cách
toàn diện như Kelman 1953, Hayward 1964, Cook and Baker 1983, Yabuuchi 1992,
1995(Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998).
Bệnh héo rũ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua có tên là:
Southern wilt (theo cách gọi của người Hoa Kỳ), Bacterial wilt (theo cách gọi của
người Anh), ở Việt Nam gọi là bệnh héo xanh, héo rũ.

2.2 Mức độ phổ biến và gây hại của
Ralstonia solanacearum

Ngày nay, Ralstonia solanacearum được ghi nhận là vi khuẩn gây hại ở hầu
hết các châu lục, phổ biến là ở các nước như Angola, Trung quốc, Bangladesh, n
Độ, Indonesia, Srilanka, Đông n Ethiopia, Lybia, Kenya, Malaysia, Nigieria,
Philippin, Nam Phi, Đài Loan, Thái Lan, Uganda, Hoa Kỳ, Việt Nam, Zambia
(Subrhmagam, 1994).
Ở Việt Nam, bệnh héo xanh cà chua do vi khuẩn Ralstonia solanacearum
gây ra là một trong những bệnh gây hại rất phổ biến làm chết héo hàng loạt cây cà
chua trên đồng ruộng, gây tổn thất lớn ở các vùng trồng cà chua trong nước, nhất là
ở vùng đồng bằng sông Hồng. Bệnh được ghi nhận trên cà chua, khoai tây, cà tím,
thuốc lá, đậu phụng, gừng, ớt. Qua một số kết quả nghiên cứu công bố gần đây cho
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
5
thấy ở nước ta vi khuẩn gây bệnh héo xanh thuộc division Châu Á (Lê Lương Tề,
2002), race1, biovar 3 và 4 (Nguyễn Thò Yến, 2002).
Ở Hoa Kỳ, vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
được phát hiện trên khoai tây,
thuốc lá ở Florida được xác đònh bằng phương pháp PCR là biovar 1 (Prakash,
2002).
Ở Indonesia, bệnh được phát hiện đầu tiên trên đậu phụng vào năm 1905, ở
vung Cirebon. Về sau bệnh được ghi nhận trên nhiều loại cây trồng khác như cà
chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, chuối. Kết quả nghiên cứu bệnh héo xanh trên đậu
phụng giữa AARD và ACIAR vào năm 1985 cho rằng đây là bệnh chính trên đậu
phụng ở Indonesia, sự thiệt hại do bệnh gây ra có thể từ 15-90% năng suất (Wright,

1991).
Ở Đài Loan bệnh được gây hại trên cà chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, cà tím,
đậu phụng, dâu tây, tía tô, thầu dầu, mè, củ cải, rau dền và một số cây trồng khác.
Trên nhiều loại cây trồng sự thiệt hại do bệnh gây ra có thể từ 5-100% năng suất.
Các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum chủ yếu thuộc race1 (Yung-An Lee,
2001).
Ở Ai Cập, bệnh héo xanh vi khuẩn do Ralstonia solanacearum được ghi nhận
là gây hại nặng nhất trên cà chua và a ti sô trong những năm gần đây, sự thiệt hại
gây ra trên a ti sô từ 5-20% năng suất (Aly, 2000).

2.3 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum có dạng hình gậy, hai đầu hơi tròn, có một
lông roi ở một đầu, kích thướt 0,5-1,5µ
,
nhuộm gram âm là loài vi sinh vật tồn tại ở
trong đất thường xuyên gây ra các bệnh chết héo (héo rũ, héo xanh) trên nhiều loại
cây trồng như lạc, khoai tây, cà chua, ớt, thuốc lá phổ biến rộng ở hầu hết khắp các
vùng, gây tác hại lớn cho sản xuất. Chúng lan truyền theo nước tưới, xâm nhập vào
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
6
cây qua các vết thương và di chuyển vào trong bó mạch. Bệnh thường xảy ra vào
lúc cây đang tăng trưởng.
Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ tương đối cao, đất ẩm, xâm nhập qua vết
thương, sinh sản ở các bó mạch, kí chủ và di chuyển ở các bó mạch từ thân đến lá,
sinh độc tố làm cây héo, chết.
Phá bó mạch làm tắt ngẽn sự vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng, bệnh
hại nhiều trên đất cát pha, đất thòt bệnh nhẹ hơn. Trên những ruộng trồng luân canh
với cây lúa nước bệnh nhẹ.

Vi khuẩn thích hợp ở nhiệt độ 30-37
0
C, nhiệt độ tối thiểu là 10
0
C, tối đa
41
0
C, nhiệt độ gây chết là 52
0
C, mẫn cảm được môi trường khô.

2.4 Sự phân chia vi khuẩn Ralstonia solanacearum theo đặc tính gây hại
2.4.1 Race
Dựa trên phạm vi ký chủ được chia làm 4 race (Martin và French, 1997)
+ Race 1: Tấn công trên nhiều vùng đòa lý, loại cây trồng khác nhau. Đặc
biệt trên các cây như khoai tây, cà chua, cà tím, ớt, thuốc lá, đậu phụng. Vi khuẩn
Ralstonia solanacearum thuộc race 1 thường gây hại ở những vùng có nhiệt độ ấm
áp và gây hại nặng ở vùng nhiệt đới.
+ Race 2: Chủ yếu tấn công trên các cây thuộc họ chuối như chuối tam bội,
chuối lá, chuối sợi.
+ Race 3: Chủ yếu tấn công trên khoai tây. Khác với race 1, race 3 thường
gây hại ở những vùng có nhiệt độ thấp hơn và những vùng có vó độ cao.
+ Race 4: Được ghi nhận tấn công trên cây dâu tằm (mulberry) ở Trung
Quốc.
Sự phân chia các race thường rất phức tạp do phụ thuộc vào thầnh phần cây
ký chủ và phạm vi phân bố của chúng. Theo Martin và French (1997), race 1 lưu
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
7

tồn nhiều năm trong đất, ngược lại race 3 thường có xu hướng giảm sau vài năm
nếu không có khoai tây dại làm ký chủ.

2.4.2 Biovar
Dựa vào đặc tính sinh lý, sinh hoá khác nhau của các mẫu phân lập, 5
biovar có thể nhận dạng dựa vào khả năng sử dụng và oxi hoá 3 disaccharides
(cellobiose, lactose, maltose) và 3 rượu 6 cacbon (dulcitol, mannitol, sorbitol).
Biovar 2 thường bao gồm race 3, biovar 5 gồm race 4 và biovar 1, 3, 5 gồm race 1.

2.5 Triệu chứng gây hại của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Triệu chứng thường biểu hiện ngay sau khi bệnh xâm nhập vào cây. Ở cây
bò bệnh ban ngày lá mất màu nhẵn bóng, tái xanh, héo cụp xuống, ở giai đoạn cây
con thường biểu hiện trên toàn cây còn ở giai đoạn cây trưởng thành triệu chứng
thường biểu hiện ở lá ngọn trước. Ở 1-2 ngày đầu cây có thể phục hồi lại được vào
lúc trời mát hoặc về đêm, nhưng sau 2-3 ngày lá héo không thể hồi phục lại được
nữa và toàn cây bò héo rũ rồi chết. Cắt ngang đoạn thân cây gần mặt đất ta thấy bó
mạch bò hoá nâu, trong điều kiện ẩm độ cao thân cây bò bệnh dần dần thối mềm, ấn
mạnh gần miệng cắt có thể thấy dòch nhờn vi khuẩn tiết ra màu trắng sữa. Rễ có
màu nâu đen và thối.

2.6 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh
Thời gian vi khuẩn lưu tồn trong đất phụ thuộc nhiều yếu tố như ẩm độ,
nhiệt độ, hoá lý đất. Bên cạnh đó còn phụ thuộc vào race gây bệnh, race 1 thường
lưu tồn lâu trong đất trái lại race 3 thường giảm sau vài năm do khả năng thích ứng
thấp hơn. Vi khuẩn có thể lưu tồn trong đất từ 5-6 năm, trong cơ thể ký chủ thực vật
hoặc trong hạt giống có thể sống tới 7 tháng, còn nếu bám dính trên bề mặt hạt chỉ
tồn tại 2-7 ngày (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998).
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com

8
Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua rễ, vết thương cơ giới, thân non, lỗ hở tự
nhiên, do côn trùng, khi vào bên trong chúng sinh sản rất nhanh làm bít các lỗ mạch
đồng thời tiết ra độc tố làm các bó mạch bò hoá nâu, đen và gây ra hiện tượng héo
do cây bò thiếu nước. Dưới những điều kiện thuận lợi vi khuẩn có thể di chuyển
xuyên qua lớp vỏ và đi ra bên ngoài môi trường đất, đó cũng là sự tương tác giữa
đất và rễ, rễ bò nhiễm vi khuẩn từ đất và ngược lại vi khuẩn từ trong cây đi ra môi
trường đất (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Vi khuẩn lan truyền chủ yếu bằng nguồn nước, đất như bám dính vào giầy
dép, dụng cụ canh tác (Martin và French, 1997).
Bệnh héo xanh vi khuẩn phát sinh phát triển phụ thuộc vào đièu kiện đất đai
như trên các chân đất cao bệnh thường nặng hơn các chân đất thấp, đất được luân
canh với lúa nước làm giảm tỉ lệ bệnh đáng kể (Đỗ Tấn Dũng, 2001).
Thời vụ trồng cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát sinh phát
triển bệnh, thời vụ trồng có mưa nhiều, ẩm độ cao làm gia tăng sự phát sinh phát
triển bệnh.
Mật độ trồng cao tỉ lệ bệnh thường cao do chúng tạo một vùng khí hậu thuận
lợi cho sự phát sinh phát triển bệnh.
Vì nước là nguồn lây lan chủ yếu của bệnh, do đó phương pháp tưới là một
trong những yếu tố gia tăng tỉ lệ gây hại của bệnh.

2.7 Biện pháp phòng trừ
2.7.1 Biện pháp hoá học
Hiện nay, vẫn chưa có loại thuốc nào đặc hiệu để phòng trừ bệnh héo xanh
trên cây cà chua, tuy nhiên biện pháp hoá học vẫn được xem là cần thiết hiện nay,
nhưng xét về lâu dài biện pháp hoá học ngày càng thể hiện các mặt trái của nó như
làm cho tác nhân gây bệnh trở nên kháng thuốc, đặc biệt là gây ô nhiễm môi
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com

9
trường và sức khỏe con người một cách nghiêm trọng. Dùng formol, Mocap 10G,
Furadan 3H, vôi, CuSO
4
xử lý đất. Dùng thuốc: Kasuran, Rovral, Dithan.

2.7.2 Biện pháp sinh học
Khi sử dụng thuốc hoá học để bảo vệ thực vật thì thuốc sẽ tạo thành một lớp
mỏng trên bề mặt lá, quả, thân cây, mặt đất, mặt nước và một lớp chất lắng gọi là
dư lượng ban đầu của thuốc vì vậy biện pháp sinh học trong công tác bảo vệ thực
vật ngày càng chú ý khai thác và vò trí của biện pháp nay ngày càng được nâng
cao. Việc bảo vệ môi trường sống, môi trường sản xuất cũng như tiến hành nông
nghiệp sạch thì biện pháp này càng có ý nghóa hơn.
Sử dụng một số vi khuẩn đối kháng như Bacillus sudtilis, Pseudomonas
fluorescens để xử lí hạt trước khi gieo, nhúng rể cây con trước khi trồng hoặc đưa vi
sinh vật đối kháng vào vùng rễ sau trồng nhằm ức chế, cạnh tranh và tiêu diệt vi
khuẩn Ralstonia solanacearum (Đỗ Tấn Dũng, 2001).
Sử dụng chế phẩm V
58
có chứa vi sinh vật đối kháng trên ruộng trồng cà
chua ở Tiền Phong - Mê Linh - Vónh Phúc, kết quả thu được có công thức sử dùng
V
58
tỉ lệ chết giảm còn 25% so với đối chứng 80% (Lê Như Kiểu, 2001).
Ngoài ra, chúng ta cần phải làm đất vườn ươm sạch bệnh, cày bừa kỹ, bón
đạm vừa phải, phân chuồng phải ủ hoai, luân canh với cây lúa nước và dùng thuốc
một cách hợp lý.

2.8 Phòng trừ sinh học bệnh cây
2.8.1 Khái niệm phòng trừ sinh học bệnh cây

Theo Cook và Baker (1983), phòng trừ sinh học bệnh cây (PTSHBC) là
thông qua việc sử dụng một hoặc nhiều sinh vật (ngoại trừ con người) để khống
chế mầm bệnh hay làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một tác nhân gây hại
nào đó. Đến năm 1988, Cook đã đưa ra một khái niệm rộng hơn về phòng trừ sinh
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
10
học. Theo ông PTSHBC là việc sử dụng sinh vật, gen và các sản phẩm của gen để
điều khiển tác nhân gây bệnh. Các cách điều khiển tác nhân gây bệnh có thể là:
(i) duy trì mật số nguồn bệnh ở mức thấp dưới ngưỡng kinh tế, (ii) làm chậm hoặc
loại trừ tiến trình xâm nhiễm của bệnh, (iii) kích hoạt và tạo điều kiện phát huy hệ
thống tự vệ của cây.


2.8.2 Lựa chọn tác nhân phòng trừ sinh học
Chiến lược PTSHBC có thể chia thành hai loại (1) chiến lược dựa trên
nguyên tắc cơ bản về sinh thái học hay còn gọi là phòng trừ sinh học cổ điển
(Hokkaness và Lynch, 1995) hay phòng trừ sinh học chỉ xử lý một lần (Cook, 1993),
(2) chiến lược sử dụng vi sinh vật như là một loại thuốc sinh học và việc xử lý có
những điểm gần giống như xử lý thuốc hoá học nhằm mục đích kiểm soát bệnh
trong một khoảng thời gian giới hạn. Chiến lược này còn được gọi là phòng trừ sinh
học tăng dần (Hokkaness và Lynch, 1995). Sự khác nhau về chiến lược phòng trừ
ảnh hưởng đến sự lựa chọn và phương pháp sàng lọc tác nhân phòng trừ sinh học.
Đối với chiến lược PTSHBC tăng dần, người ta chú ý đến nguồn gốc của vi
sinh vật đối kháng. Tuy nhiên những hiểu biết về khía cạnh này là điều cần thiết
cho việc đánh giá rủi ro và là một trong những yêu cầu cần thiết cho quá trình đăng
ký thương mại hoá sản phẩm (Lumsden và Lewis, 1989).
Có một số phương pháp sàng lọc tác nhân phòng trừ sinh học dựa trên hoạt
tính của men thủy phân của vi sinh vật đối kháng, tương tác giữa vi sinh vật gây

bệnh và vi sinh vật đối kháng, phương pháp có liên quan đến cây kí chủ.

2.8.3 Vi khuẩn - một tác nhân phòng trừ sinh học:
Nhiều công trình nghiên cứu về các tác nhân phòng trừ sinh học đã công bố
từ dầu thế kỷ 20 trong đó có vi khuẩn. Đang là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
11
biến nhất là Pseudomonas spp., kế đến là Bacillus spp. và Streptomyces (Burr và
ctv, 1978, Weller và Cook, 1983).
Những nghiên cứu về vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn trên thân lá cây đã dẫn
đến việc chia chúng thành ba loại: loại có hại cho cây, loại trung tính và loại có ích
cho cây. nh hưởng có ích của nhóm vi khuẩn này là do chúng sản sinh ra chất kích
thích tăng trưởng cây, các chất ức chế hoặc làm suy yếu tác nhân gây bệnh hoặc cả
hai (Baker, 1988). Cơ chế ban đầu ức chế tác nhân gây bệnh là tiết ra các chất
kháng sinh (Fravell, 1988). Tuy nhiên những yếu tố khác như việc tiết ra chất
sidrophores, HCN, sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng có vai trò quan trọng trong việc
ức chế tác nhân gây bệnh (Cook và Baker, 1983).
Trong số các loài Pseudomonas spp., Pseudomonas fluorescens được chú ý
và tăng cường nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại nấm
bệnh lưu tồn trong đất, loài vi khuẩn này có khả năng kích thích sự phát triển cây
trồng. Bằng cách xử lý hạt có hay không có chất mang hoạt chủng vào đất cùng với
giá thể làm thức ăn nền, đã làm giảm mức trầm trọng cũa bệnh, làm gia tăng sự
phát triển và tăng năng suất cây trồng. Với thuận lợi là có nhiều cơ chế tác dụng
như: đònh cư, chiếm chỗ, loại trừ mầm bệnh ra khỏi vùng thích hợp, tiết chất kháng
sinh (Pyrrolnitrin, pyoluteorin) ngoại ký sinh, cạnh tranh dinh dưỡng (hợp chất sắt),
gia tăng sức đề kháng cho cây, Pseudomonas rất có triển vọng sử dụng trên lãnh
vực thương mại.
Biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh cây là điều khiển môi trường, cây

trồng và sinh vật đối kháng một cách thích hợp, để tạo nên một thế cân bằng sinh
học cần thiết, giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống dưới ngưỡng gây hại. Nhờ
đó, bệnh của cây trồng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ, không gây ảnh hưởng quan
trọng về mặt kinh tế.
Biện pháp sinh học không có mục đích tiêu diệt toàn bộ mầm bệnh, và cũng
không có khả năng này (Phạm Văn Kim, 1999).
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
12

2.8.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước:
2.8.4.1Nghiên cứu trong nước:
Lê Lương Tề, 2002 nghiên cứu “phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn cà
chua có hiệu quả kinh tế cao bằng biện pháp sử dụng rộng rãi các giống cà chua
kháng bệnh, có năng suất cao CLN-1462A và P.T4719A ở vùng đồng bằng sông
Hồng”. Đã đưa vào trồng đại trà ở các tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng và các tỉnh
phía Bắc nước ta.
Lê Như Kiểu, Nguyễn Ngọc Cường, Đào Thu Hằng, 2003 nghiên cứu “phát
hiện biovar 1 và 5 trong quần thể vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo
xanh cà chua”. Điều này cho thấy quần thể gây bệnh héo xanh cà chua ở Việt Nam
là rất đa dạng (có 5 biovar).
Phạm Minh Sang, 2003 nghiên cứu “Hiệu lực của vi khuẩn đối kháng và kích
thích sinh trưởng trong phòng trừ bệnh khô vằn do nấm Rhizoctonia solani” bước
đầu đã khống chế được bệnh khô vằn cho lúa và kích thích cây tăng trưởng mạnh
bằng VKĐK.
Nguyễn Trung Thành, 2004 cũng đã thành công trong việc nghiên cứu “Bước
đầu chọn lọc và đánh giá dòng VKĐK, phân lập từ đất để khống chế nấm
Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, và vi khuẩn Ralsronia solanacearum gây
bệnh trên cây cà chua”. Các dòng VKĐK có khả năng kháng với cả ba tác nhân

gây bệnh trong điều kiện In vitro và trong nhà lưới VKĐK đã khống chế được bệnh
do nấm
Sclerotium rolfsii
gây ra.
Phạm Mỹ Liên, 2004 nghiên cứu về vấn đề “Chọn lọc và đánh giá dòng vi
khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng với nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh trên
cây cà chua” cũng đã thành công trong quá trình nghiên cứu.

2.8.4.2 Nghiên cứu ngoài nước
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
13
Tại Đài Loan, bằng phương pháp PCR với cặp primer PS-IS đặc hiệu với vi
khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc race 1, kết quả phân tích cho thấy tất cả các
dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
thu thập trên cà chua, khoai tây, ớt, đậu phộng,
cà tím, thuốc lá, dâu tây, chuối và nhiều loại cây trồng khác đều thuộc race 1 (Yang
An Lee, 2001).
Phân tích trên 120 dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trên cà
chua, khoai tây, cà tím, ớt, chuối, gừng và nhiều loại cây trồng khác từ Châu ,
Mỹ, u, Phi và Châu Đại Dương cho thấy vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
thuộc
division Châu thường bao gồm biovar 3 và 4, division Châu Mỹ thường bao gồm
biovar 1 và 2.
Theo Rindran và Vidhiaekaran (1996) cho rằng những loại vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens được phân lập từ vùng rễ, có sắc tố phát huỳnh quang
vàng xanh cũng kìm hãm sự phát triển của nấm

Rhizoctonia solani
. Một trong
những dòng có hiệu quả nhất là PFAIR2, phân lập trên than bùn được dùng để xử
lý hạt, xử lý rể, rải vào đất và phun trên lá. Từng nghiệm thức riêng lẻ đã kiểm
soát bệnh có hiệu quả. Tuy nhiên, sự kết hợp của bốn cách dẫn đến hiệu quả phòng
trừ tốt nhất trong nhà lưới. Trên đồng ruộng, sử dụng PFAIR2 phòng trừ bệnh có
hiệu quả, gia tăng năng suất và có thể so sánh với các loại thuốc trừ nấm thông
dụng như carbendazim.



Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
14









Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và đòa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian

Đề tài được thực hiện từ ngày 5/6/2005 – 30/8/2005

3.1.2 Đòa điểm
- Nơi tiến hành nghiên cứu: Công ty Hai Mũi Tên Đỏ thuộc công ty giống
Đông Tây, xã Nhuận Đức, huyện Củ Chi, Thành Phố Hồ Chí Minh.
- Nơi phân lập và nuôi cấy: Phòng thực tập Bệnh cây – Bộ môn Bảo Vệ
Thực Vật – Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
15
- Nơi phân tích: Trung tâm phân tích thí nghiệm hoá sinh – Trường Đại học
Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.

3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối
kháng: 18, 73, 85, 123, 124, 187 và các dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
gây
bệnh: RST004, RST005, RST006, RST01, RSBog3, RSBog4. Hạt cà chua với tỷ lệ
nẩy mầm 90%.
Môi trường phân lập và nuôi cấy:
- PDA (potato, dextrose, agar)
- LB (tryptone, yeast extract, sodium chloride)
- WA (water, agar)
Vật liệu lây nhiễm: hạt giống cà chua (1628)
3.2.2 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên đóa
petri trong phòng thí nghiệm

Điều kiện tiến hành: thí nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm tại
Phòng Thực tập Bệnh cây – Bộ môn Bảo vệ Thục vật – Trường Đại học Nông Lâm
Tp. Hồ Chí Minh.

Vật liệu nghiên cứu:
- Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens:18, 73, 85, 123, 124.
- Các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum: RST004, RST005, RST006,
RST01, RSBog3, RSBog4.
Dụng cụ thí nghiệm:
Que trang vi khuẩn, pipet và đầu tiếp đã được vô trùng.
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
16
Môi trường sử dụng: PDA (200g Potato, 15g Agar, 20g Dextrose và 1 lít nước
cất).
Phương pháp tiến hành:
Lấy 100µl các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum tran đều trên môi
trường PDA đã chuẩn bò sẵn. Dùng pipet hút 20µl dòch vi khuẩn và tiến hành cấy
dòch vi khuẩn thành 5 điểm tương ứng với các dòng vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens đã chuẩn bò sẵn. Cuối cùng đem ủ ở nhiệt độ phòng (27-30
0
C), khoảng
24 giờ sau xem kết quả đối kháng của các dòng vi khuẩn.
Chỉ tiêu theo dõi:
Khả năng đối kháng của 5 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

3.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà
chua trong nhà lưới
Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhà lưới tại công ty Hai Mũi Tên
Đỏ.
Vật liệu nghiên cứu:
- Nguồn vi khuẩn kháng mạnh nhất và gây độc mạnh nhất được chọn lọc
trong phòng thí nghiệm.
- Hạt cà chua với tỉ lệ nảy mầm 90%.
- Đất.
- Chậu nhựa 7x12cm (đường kính x chiều cao).
- Khay xốp (60 lổ).
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
17
- Trang thiết bò thí nghiệm tại phòng thực tập Bệnh cây – Bộ môn Bảo Vệ
Thực Vật và tại trung tâm phân tích thí nghiệm Hoá Sinh trường Đại học Nông Lâm
Tp.Hồ Chí Minh.
Môi trường sử dụng: LB lỏng (tryptone, yeast extract, sodium chloride).
Phương pháp tiến hành: Lây nhiễm theo phương pháp của Phạm Đăng Minh
(2003) có cải tiến
- Sau khi khảo sát tính độc của các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum
trong phòng thí nghiệm, ta chọn ra các dòng gây độc cho cây cà chua và chọn ra
một dòng mạnh nhất. Tương tự, ta cũng chọn ra một dòng VKĐK mạnh nhất.
- Nguồn vi khuẩn: từ nguồn vi khuẩn trữ ở -80
0
C, nuôi cấy trên môi trường
LB lỏng khoảng 16 giờ, ly tâm thu vi khuẩn ở 3000 vòng/phút, hoà vi khuẩn vào
nước cất vô trùng.

- Hạt giống cà chua được rửa bằng cồn 70% trong 1 phút, NaOCl 2% trong 5
phút, sau đó rửa lại nhiều lần với nước cất vô trùng, ủ hạt trên giấy thấm được làm
ẩm bằng nước cất vô trùng đặt trong đóa petri, giữ ở nhiệt độ 27
0
C.
- Lấy hạt cà chua đã nẩy mầm khoảng 0,5 – 2mm ngâm trong dòch huyền
phù đã chuẩn bò ở trên, nồng độ 10
9
cfu/ml vi khuẩn đối kháng (khoảng 20 phút) đã
chuẩn bò sẵn, sau đó làm khô hạt trên giấy thấm đem gieo khay xốp đã chuẩn bò
sẵn đất (khay 60 lổ).
- Khi cây cà chua được 15 ngày tuổi đem trồng vào chậu đất đã có chủng
sẵn dung dòch vi khuẩn gây độc, với mật số vi khuẩn: 10
3
cfu/g đất, các cây cà chua
được chia thành 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 30 cây, với 3 lần lặp lại. Tiến
hành theo dõi trong vòng 20 ngày.
Chỉ tiêu theo dõi:
Chiều cao cây: đo từ hai lá mầm lên đến đầu ngọn lá, 5 ngày/lần.
Số lá: đếm toàn bộ số lá trên cây, 5 ngày/lần.
Các nghiệm thức:
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
18
NT1 (T
1
): không xử lý vi khuẩn gây bệnh và đối kháng.
NT2 (T
2

): chỉ xử lý vi khuẩn gây bệnh trong ly đất.
NT3 (T
3
): xử lý vi khuẩn đối kháng ở giai đoạn hạt nứt nanh và vi khuẩn gây
bệnh trong ly đất.
NT4 (T
4
): xử lý vi khuẩn đối kháng ở giai đoạn hạt nứt nanh, trước khi trồng
vào ly đất đã chủng sẵn vi khuẩn gây bệnh tiến hành nhúng cây cà chua vào dòch vi
khuẩn đối kháng đã chuẩn bò sẵn với mật số 10
9
cfu/ml, (khoảng 20 phút).

3.2.4 Phương pháp đánh giá tính độc của vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
trên
cây cà chua trong điều kiện nhà lưới
Các phương pháp đánh giá giống như mục 3.2.3 nhưng chủng vi khuẩn gây
độc với mật số vi khuẩn: 10
10
cfu/g đất, tiến hành theo dõi trong 12 ngày sau trồng.
Chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ chết của cây cà chua (%)
3.2.5 Phương pháp đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens
với dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
trên cây cà
chua ngoài đồng ruộng.
Thí nghiệm được tiến hành ngoài đồng ruộng tại công ty Hai Mũi Tên Đỏ.

Vật liệu nghiên cứu:
- Nguồn VKĐK mạnh nhất được chọn lọc trong phòng thí nghiệm.
- Hạt cà chua với tỉ lệ nẩy mầm 90%.
- Đất được lên luống, phủ bạt và đục lổ đã chuẩn bò trước.
- Khay xốp (60 lổ).
Phương pháp tiến hành:
Khi cây được 15 ngày tuổi đem trồng ngoài đồng ruộng, các cây cà chua được
chia thành 2 nghiệm thức, sau trồng 3 ngày tưới dòch VKĐK. Tiến hành theo dõi trong
20 ngày sau trồng.
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
19
Chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ chết của cây cà chua (%)
Các nghiệm thức:
- NT1 (T
1
’
): các cây cà chua, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 20 cây. Không
chủng vi khuẩn đối kháng và gây bệnh.
- NT2 (T
2
’
): các cây cà chua, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 80 cây. Có
chủng vi khuẩn đối kháng.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
T
1
’
T
2
’

T
2
’
T
1
’
T
2
’

T
2
’
T
1
’
Ghi chú:
T

1
’
: đối chứng
T
2
’
: xử lý VKĐK
3.2.6 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm MSTATC.


Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
20











Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Mức đối kháng của các dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens
với các
dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
trên đóa petri
Trên đóa petri có chứa môi trường PDA dùng que tran vi khuẩn tran đều 6
dòng VKGB, sau đó tiến hành cấy thành 5 điểm đã đánh dấu trước tương ứng với 5
dòng VKĐK để xác đònh mức độ đối kháng của 5 dòng vi khuẩn. Kết quả được tình
bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1 Mức độ đối kháng của 5 dòng vi khuẩn trên đóa petri
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
21
DVKGB
DVKĐK
RST004 RST005 RST006 RST01 RSBog3 RSBog4
18 +++ +++ +++ +++ +++ ++
73 +++ ++ +++ +++ +++ +++
85 +++ +++ +++ +++ +++ +++
123 ++ + + ++ + +
124 ++ ++ + ++ + +
Chú thích:
(+++): kháng mạnh
(++): kháng trung bình
(+): kháng yếu
DVKGB: dòng vi khuẩn gây bệnh
DVKĐK: dòng vi khuẩn đối kháng
Các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum: RST004, RST005, RST006,

RST01, RSBog3, RSBog4.
Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens: 18, 73, 85, 123, 124.
Trong các dòng VKĐK
Pseudomonas fluorescen
có 5 dòng đều có khả năng
đối kháng với các dòng VKGB Ralstonia solanacearum, có 3 dòng đối kháng mạnh,
2 dòng còn lại có mức độ kháng từ trung bình đến yếu.
Như vậy, trong 5 dòng VKĐK có 3 dòng kháng mạnh, tiếp tục nghiên cứu 3
dòng này và chọn ra một dòng mạnh nhất.
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
22

Hình 4.1: Khả năng đối kháng của 5 dòng VKĐK đối với VKGB RSBog3


Hình 4.2: Khả năng đối kháng của 5 dòng VKĐK đối với VKGB RSBog4
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com
23

Hình 4.3: Khả năng đối kháng của 5 dòng VKĐK đối với VKGB RST01


Hình 4.4: Khả năng đối kháng của 5 dòng VKĐK đối với VKGB RST004
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Hồ Thanh Hoàng
Download» Agriviet.com

24

Hình 4.5: Khả năng đối kháng của 5 dòng VKĐK đối với VKGB RST005


Hình 4.6: Khả năng đối kháng của 5 dòng VKĐK đối với VKGB RST006