Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của vibrio cholerae phân lập tại tỉnh trà vinh
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (7.94 MB, 196 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
NGUYỄN THỊ ĐẤU
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ
TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA
VIBRIO CHOLERAE
PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
NGUYỄN THỊ ĐẤU
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ
TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA
VIBRIO CHOLERAE
PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã ngành: 6242 0107
Hướng dẫn khoa học
PGS.TS. HỒ THỊ VIỆT THU
2015
LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ,
Ban Giám hiệu Trường Đại học Trà Vinh, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu
và Phát triển Công nghệ Sinh học, Phòng Đào tạo, Phòng Quản lý Khoa
học, Phòng Quản lý Sau Đại học thuộc Trường và Viện đã tạo điều kiện
tốt thực hiện nghiên cứu khoa học và các học phần của nghiên cứu sinh.
Xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hồ Thị Việt Thu, PGS.TS. Trần
Nhân Dũng đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi có thể hoàn thành luận án.
Do mới nhận hướng dẫn trong thời gian 2 năm sau của luận án nên
PGS.TS Hồ Thị Việt Thu đã gặp nhiều khó khăn, và cũng trong thời gian
này tôi cũng chưa định hướng đúng đắn cho nghiên cứu, nhưng PGS.TS
Hồ Thị Việt Thu rất tận tình giúp đỡ, tìm hướng đi cho phù hợp với
nghiên cứu trong thực tế để tôi có thể hoàn thành luận án này.
Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Trà Vinh đã
tạo điều kiện cho chúng tôi tham gia lấy mẫu tại các cơ sở giết mổ trong
địa bàn Tỉnh.
Chân thành cảm ơn các anh chị em Bộ môn Vi sinh Khoa Nông
nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ; Trường Đại học
Y Dược Cần Thơ; Khoa xét nghiệm bệnh viện Đa khoa Trung ương Cần
Thơ; Khoa Nông nghiệp Thuỷ sản Trường Đại học Trà Vinh đã tạo điều
kiện, giúp đỡ tôi hoàn thành nghiên cứu đề tài này.
Chân thành cảm ơn gia đình và đồng nghiệp đã tạo điều kiện và
động viên tôi hoàn thành nghiên cứu này.
Xin chân thành cảm ơn!
NGUYỄN THỊ ĐẤU
i
TÓM TẮT
Vibrio cholerae là một loại vi khuẩn Gram âm có hình dấu phẩy với
những chủng không gây bệnh và gây bệnh. Chủng gây bệnh lây lan mạnh nhất
từ năm 1816 đến năm 1923 thuộc V. cholerae O1 type sinh học cổ điển. Những
năm sau đó, chủng vi khuẩn khác thuộc type sinh học El Tor gây ra những trận
đại dịch kéo dài trong thập niên 1970s, chủng gây bệnh mới nhất được xác định
vào năm 1992 thuộc type sinh học O139, chủng này cùng với chủng thuộc type
sinh học O1 được xem là nguyên nhân của những vụ dịch xảy ra gần đây. Hiện
nay, tuy có nhiều kháng sinh có thể điều trị được bệnh, nhưng hiệu quả kháng
sinh có phần hạn chế do tình hình đa kháng thuốc gia tăng trong quần thể vi
khuẩn này (CDC, 2005). Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu
đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của V. cholerae phân lập tại tỉnh Trà
Vinh” được thực hiện với mục đích cung cấp thông tin cần thiết trong chiến
lược sử dụng kháng sinh phù hợp nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm hiện
tượng kháng thuốc và giảm chi phí trong điều trị bệnh.
Nghiên cứu được thực hiện qua việc phân lập vi khuẩn Vibrio spp. từ
160 mẫu nghêu, 150 mẫu nước (50 mẫu nước biển, 50 mẫu nước sông, 50
mẫu nước ao nuôi tôm), 100 mẫu huyết heo và 40 mẫu phân bệnh nhân tiêu
chảy thu thập tại bệnh viện đa khoa tỉnh Trà Vinh từ tháng 4 năm 2012 đến
tháng 4 năm 2014. Kỹ thuật PCR và các test sinh hoá (theo tiêu chuẩn
ISO/TS 21872-1:2007) được sử dụng để định danh mức loài của vi khuẩn
Vibrio, phản ứng ngưng kết được sử dụng để định type huyết thanh V.
cholerae. Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 25 chủng vi khuẩn thuộc
Vibrio spp. bao gồm 6 chủng V. cholerae (24%) (3 chủng từ nghêu, 2 chủng từ
mẫu huyết heo và 1 chủng từ mẫu nước sông), 8 chủng thuộc loài V.
paraheamolyticus (32%), 4 chủng thuộc loài V. vulnificus (16%), 5 chủng
thuộc loài V. fluvialis (20%) và 2 chủng thuộc loài V. alginolyticus (8%). Kết
quả định type huyết thanh học 6 chủng V. cholerae đều thuộc type O1, với
50% (3/6) dương tính với Inaba, 50% (3/6) dương tính Ogawa. Không có
chủng nào thuộc type O139.
Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về trình tự nucleotide của gene 16S
rRNA của 6 chủng V. cholerae phân lập được với chủng MS6 (Thái Lan),
O395 (Ấn Độ), M66-62 (Indonesia), LMA 3894-4 (Brazil) và N16961 (Ấn
Độ). Kết quả cho thấy 1 chủng trong 6 chủng này 100% tương đồng với 56
chủng; 99% tương đồng với 32 chủng và 99% tương đồng với 12 chủng gần.
Riêng đối với 2 chủng mang gene kháng kháng sinh trong nghiên cứu này có
trình tự nucleotide tương đồng 97% với 10 chủng; 96% với 01 chủng và 94%
với 02 chủng.
ii
Tính kháng kháng sinh đối với 8 loại (streptomycin, norfloxacine,
ampicillin,
tetracycline,
azithromycin,
amoxillin/clavulanic
acid,
trimethotrime/sulfamethazol và vancomycin) của 6 chủng Vibrio cholerae
được xác định bằng phương pháp Kirby-Bauer (CLSI, 2010), kết quả cho
thấy có 50% (3/6) chủng kháng streptomycin, 33% (2/6) chủng kháng
tetracycline và trimethoprim-sulfamethoxazole. Với kỹ thuật PCR cho thấy
có 2 chủng trong tổng số 6 chủng kiểm tra chứa gene kháng kháng sinh
tetA (gene mã hóa cho yếu tố kháng tetracycline), chưa phát hiện gene
kháng kháng sinh blaSHV, aac(3)-IV và dhfrI mã hoá yếu tố cho nhóm
kháng sinh β-lactam, aminoglycosid, trimethoprim tương ứng.
So sánh trình tự nucleotide gene tetA của chủng T1 và T3 so với chủng
hoang dại (N16961) cho thấy có hiện tượng thêm hoặc mất từ 1- 3 nucleotide
trên 10 vị trí codon của gene tetA của chủng T1 và trên 6 vị trí codon của
chủng T3.
Kết quả thử nghiệm trên thỏ chứng minh chỉ số bám dính vi khuẩn V.
cholerae T1 và T3 vào niêm mạc ruột đối với thỏ không uống vaccine phòng
bệnh tả tại thời điểm 9 giờ sau khi cho uống vi khuẩn là 55,7±13,9 và
59,3±4,2 cao hơn đối với thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả (12,4±0,6 và
7,41±1,9). Tại thời điểm 16 giờ sau khi cho uống vi khuẩn, không có hiện
tượng vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột trên tất cả thỏ được thí nghiệm.
Thí nghiệm cho thấy chủng phân lập có tính kháng nguyên giống với kháng
nguyên của vi khuẩn sử dụng làm vaccine phòng bệnh tả (moORCVAX) đang
được sử dụng trong nước.
Từ khoá: Vibrio, V. cholerae, đề kháng kháng sinh
iii
STUDY ON GENETIC CHARACTERISTICS AND ANTIBIOTICS
RESISTANCE OF VIBRIO CHOLERAE ISOLATES IN TRA VINH
ABSTRACT
Vibrio cholerae is a "comma" shaped Gram-negative bacteria, some of
which are pathogenic and some of which are not. The pathogenic strains
which caused the most pandemic cholera from 1816 to 1293 are the Vibrio
choleraes classical biotype O1. Later, other strains belong to biotype El Tor
which was active in the seventh of 20th century. The latest pathogenic biotype
O139 was discovered in 1992, this strain and strain O1 have been considered
to be the pathogenic agents of recent cholera outbreaks. Although, there are
antibiotics which can cure the disease now, but it is limited in therapy because
of V. choleraes are resistant to multiple drugs (Ingole et al., 1994). Hence, we
carried out “the study on genitical characteristic and antibiotic resistance of
Vibrio cholerae isolated in Tra Vinh province” with purpose of providing
essential information for appropriate antibotic using in order to reduce
mortality, decrease antibiotic resistance and cost of treatment.
The study was conducted by isolation of Vibrio spp from 160 clams,
150 water samples (50 samples of sea water, 50 samples of estuarine water,
and 50 samples of shrimp pond water), 100 samples of pig blood and 40
diarrheic stool samples collected from general hospital of Tra Vinh province
during April 2012 to April 2014. Polymerase chain reaction and biochemical
tests (standard ISO/TS 21872-1:2007) were used to indentificate Vibrio into
species, and agglutination test was used for characterization of Vibrio
cholerae serotype. The results showed that there were 25 Vibrio spp. isolates
including 6 strains of Vibrio cholerae (24%) (3 isolates were from clams, 2
isolates from pig blood samples and 1 from estuary water), 8 strains of Vibrio
paraheamolyticus (32%), 4 strains of Vibrio vulnificus (16%), 5 strains of
Vibrio fluvialis (20%) and 2 strains of Vibrio alginolyticus (8%). The
serotyping results showed that all of 6 Vibrio cholerae belong to biotype O1,
with 50% (3/6) positive to Inaba, and 50% (3/6) positive to Ogawa. No strain
belongs to biotype O139.
Nucleotide sequence comparison of gene16S rRNA of 6 Vibrio
cholerae strains with that of MS6 strain (Thailand), O395 strain (India),
M66-62 strain (Indonesia), LMA 3894-4 strain (Brazil) and N16961 strain
(India). The results showed that one out of 6 strains were 100% homogeneous
with 56 strains, 99% homogeneous with 32 strains and 99% homogeneous
with 12 close strains. Separately, 2 strains (T1 and T3) containing antibiotic
iv
resistance gene were 97% homogeneous with 10 strains, 96% homogeneous
with 01 strain and 94% homogeneous with 02 strains.
Antibiotic resistance to 8 antibiotics (streptomycin, norfloxacine,
ampicillin,
tetracycline,
azithromycin,
amoxillin/clavulanic
acid,
trimethotrime/sulfamethazol and vancomycin) of 6 Vibrio cholerae strains
was tested by Kirby-Bauer method (CLSI, 2010). The results showed that
there 50% (3/6) of isolates which was resistant to streptomycin, 33% (2/6)
was resistant to tetracycline and trimethoprim-sulfamethoxazole. Two out
of 6 strains had antibitotic resistance gene (gene tetA) encoding for
tetracycline resistant factor. Gene blaSHV, gene aac(3)-IV and gene dhfrI
which encode for β-lactam, aminoglycosid, trimethoprim resistant factors
were not detected.
Nucleotide sequence comparison of gene tetA of T1 và T3 with that of
wild strain (N16961) showed that there were 1- 3 nucleotide more or less in
10 codon positions of gene tetA in T1 strain and 6 codon positions in T3
strain. Results of experiments on rabbits demonstrated that adhesion
indexes of V. cholerae T1 and T3 strains in the intestinal mucosa of
rabbits which were not orally used cholera vaccine after 9 hours of oral
administration of these bacteria were 55,7±13,9 and 59,3±4,2,
respectively. These indexes were higher than those of rabbits with cholera
vaccination were 12,4±0,6 and 1,9±7,41, respectively. After 16 hours of
bacteria administration, there was no bacterial adhesion in the intestinal
mucosa of all the rabbits. It showed that T1 and T3 strains shared the
same antigens with bacteria used to produce cholera vaccine (MicroVAX)
which is available in Vietnam.
Keyword: Vibrio, V. cholerae , antibiotic resistance
v
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam kết luận án: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng
thuốc của Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh” này được hoàn
thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu
này chưa từng được sử dụng hoặc công bố cho một luận án nào khác.
Tác giả luận án
Nguyễn Thị Đấu
vi
MỤC LỤC
TT
1.1
1.2
1.2.1
1.2.2
1.3
1.4
1.5
1.6
2.1
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.4
2.2.5
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.4
2.4.1
2.4.2
2.4.3
2.5
2.6
2.6.1
2.6.2
2.6.3
2.6.4
2.6.5
2.6.6
2.7
TÓM TẮT ……………………………………………………..
ABSTRACT …………………………………………………...
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ………………………………….
Tính cấp thiết của đề tài ……………………………………….
Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu …………………………….
Mục tiêu nghiên cứu …………………………………………..
Nhiệm vụ nghiên cứu ……………………………………….....
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ………………………….....
Thời gian và địa điểm nghiên cứu ………………………….....
Những đóng góp của luận án ………………………………….
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án …………..
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU …………………...
Lịch sử bệnh do vi khuẩn tả …………………………………...
Tổng quan về Vibrio. ………………………………………….
Đặc điểm các loài thuộc giống Vibrio.........................................
Phân loại vi khuẩn V. cholerae …………………………...
Đặc điểm hình dạng của V. cholerae ………………………….
Đặc điểm sinh thái của V. cholerae ……………………………….
Sức đề kháng của V. cholerae ……………………………………..
Tình hình dịch tễ học của bệnh tả do V. cholerae ……………..
Tình hình dịch tễ do V. cholerae ở các nước trên thế giới ….
Tình hình dịch tễ do V. cholerae ở Việt Nam ……………….
Nguồn truyền nhiễm và các phương thức truyền lây của V.
cholerae……………………………………………………….
Đặc điểm di truyền của V. cholerae …………………………..
Độc lực của V. cholerae ....................................................
Đặc tính di truyền về độc lực của V. cholerae ……………….
Các yếu tố về độc lực …………………………………………
Cơ chế gây bệnh của V. cholerae ……………………………..
Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn …………………….
Khái niệm ……………………………………………………..
Cơ chế kháng kháng sinh ……………………………………..
Sự kháng kháng sinh do V. cholerae ở các nước trên thế giới
Sự kháng kháng sinh của V. cholerae ở Việt Nam ....................
Cơ chế kháng kháng sinh của V. cholerae …………………….
Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn đối với tetracycline ……….
Tính miễn dịch đối với vaccine phòng bệnh tả trên người…….
vii
Trang
ii
vi
1
1
3
3
3
3
4
4
4
5
5
6
7
9
11
11
15
15
15
20
22
25
26
27
29
31
33
33
33
35
37
39
41
45
2.7.1
2.7.2
3.1
3.2
3.2.1
3.2.2
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.1.5.
4.1.6
4.1.7
4.2
4.3
4.4
4.4.1
4.4.2
4.4.3
4.4.4
4.4.5
4.4.6
4.5
4.5.1
4.5.2
Nguyên lý sử dụng vaccine …………………………………..
Cơ chế hoạt động của vaccine ……………………….
CHƯƠNG III: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………….
Nội dung nghiên cứu ………………………………………..
Phương tiện và phương pháp nghiên cứu ……………………
Phương tiện nghiên cứu………………………………………
Phương pháp nghiên cứu……………………………………….
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………...
Kết quả phân lập và định danh Vibrio spp. ……………………
Kết quả phân lập Vibrio spp. ...............................................…..
Kết quả định danh Vibrio spp. bằng phản ứng sinh hóa ...........
Kết quả định danh Vibrio spp. bằng máy định danh tự động ….
Kết quả định danh Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR …………..
Tỉ lệ phát hiện Vibrio spp. trên các loại mẫu phân lập ………
Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên nghêu ở huyện Cầu Ngang và
Duyên Hải……………………………………………………...
Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên huyết heo tại một số huyện …….
Kết quả định type huyết thanh học …………………………….
Kết quả tính tương đồng giữa các loài thuộc Vibrio trên
Genbank bằng công cụ BLAST ……………………………….
Sự kháng kháng sinh của V. cholerae ……………………..
Kết quả khảo sát sự kháng kháng sinh của V. cholerae bằng
phương pháp Kirby Bauer (CLSI, 2010) ……………………..
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ……………………………….
Sự hiện diện một số gene kháng kháng sinh ở vi khuẩn phân
lập ……………………………………………………………..
Kết quả giải trình tự các đoạn gen kháng kháng sinh………
So sánh trình tự nucleotid của chủng V. cholerae T1, T3 với
chủng V. cholerae hoang dại N16961………………………..
Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene
kháng kháng sinh tetA…………………………………………
Thử nghiệm độc lực chủng V. cholerae và đánh giá đáp ứng
miễn dịch trên thỏ..................................................…...
Kết quả đánh giá chủng V. cholerae không uống vaccine
phòng bệnh tả ......................................................... …………..
Kết quả đánh giá tính đáp ứng miễn dịch trên thỏ đã uống
vaccine phòng bệnh tả ................................................................
viii
45
46
47
47
47
47
49
66
66
66
67
69
70
71
74
75
76
77
84
84
87
89
90
92
96
100
100
103
5.1
5.2
1a
1b
2a
2b
3
4
5a
5b
6a
6b
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
107
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận ……………………………………………………….
107
Đề nghị ………………………………………………………..
107
Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án..
108
TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………….. 109 -123
PHỤ LỤC
Sắc phổ chuỗi trình tự chủng Ng3 (F11) …………................... 124-125
NCBI Blast V.cholerae (F11) ………………………………… 126-130
131
Sắc phổ chuỗi trình tự chủng N8 (F17) ……………………….
NCBI Blast V.cholerae N8 (F17) …………………………….. 132-136
137-141
NCBI Blast V.cholerae O3.2 (F13) …………………………
142-146
NCBI Blast V.cholerae O1.2 (F14) …………………………
Sắc phổ chuỗi trình tự 16S rRNA chủng O9.1 (F15)
147
148-152
NCBI Blast V.paraheamolyticus O9.1 (F15) …………………
153
Sắc phổ chuỗi trình tự gen kháng KS TetA chủng T1………...
NCBI Blast gene kháng kháng sinh T1………………………. 154-157
NCBI Blast gene kháng kháng sinh T3………………………. 158-159
160-161
Sự tương đồng về trình tự Nucleotide của các chủng V.
cholerae phân lập và các chủng V. cholerae trên Genbank.......
162
Tổng hợp kết quả thử kháng sinh đồ đối với V. cholerae……..
Chủng V. cholerae kháng thuốc chủ yếu từ năm 2003 – 2009 ở 163-165
một số nước trên thế giới ……………………………………..
166
Các acid amin trình tự chủng T1……………………………….
167
Các acid amin trình tự chủng T3 ………………………………
168
Các acid amin chủng hoang dại N16961………………………
Kết quả xử lý thống kê ………………………………………... 169-174
175-178
Thành phần môi trường, hoá chất dùng trong thí nghiệm…….
179
Hệ thống định danh trực khuẩn Gram âm (IDS 14 GNR)……
179
Vaccine tả dùng trong thí nghiệm …………………………….
25 chủng
Kết quả các phản ứng sinh hoá …………………….................
ix
DANH SÁCH BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
2.1
Tổng hợp sự phân bố tác nhân gây bệnh trên thế giới ................
20
2.2
Tổng hợp nhóm type huyết thanh gây bệnh ở Việt Nam ……....
21
2.3
Tình hình nhiễm V. cholerae trên các loại thức ăn......................
24
2.4
Tổng hợp về độ tuổi và giới tính mắc bệnh do V. cholerae ……
25
2.5
Cơ chế kháng kháng sinh của V. cholerae ……………………..
41
3.1
Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae ……….
54
3.2
Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR dựa trên
gen 16S rDNA…………………………………………………..
Chủng V. cholerae sử dụng so sánh và phân tích di truyền……
56
59
4.1
Tiêu chuẩn đánh giá sự nhạy cảm đối với kháng sinh của vi khuẩn
đường ruột ……………………………………………………..
Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR xác định
gene kháng kháng sinh …………………………………………
Các chủng vi khuẩn kháng KS sử dụng để so sánh với trình tự
các chủng V. cholerae………………………………………….
Tổng hợp đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn…..
4.2
Kết quả thử sinh hoá các loài thuộc Vibrio spp…………
67
4.3
Tỉ lệ dương tính của các loài thuộc Vibrio spp…………..
69
4.4
Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên các loại mẫu ……………………
72
4.5
Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. theo chủng ………………….
73
4.6
Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên nghêu tại 2 huyện……………….
74
4.7
Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên huyết heo tại một số huyện ……..
75
4.8
Kết quả xác định type huyết thanh học ………………………..
76
4.9
Bảng trình tự nucleotide V. cholerae_Ng3-TraVinhVN-2014…
78
4.10
Bảng trình tự nucleotide V. cholerae_N8-TraVinhVN-2014….
79
4.11
Mức tương đồng của V. cholerae (F11) với các chủng V.
cholerae khác trên Genbank bằng công cụ BLAST……………
Sự nhạy cảm và kháng kháng sinh của V. cholerae ………...
81
3.3
3.4
3.5
3.6
4.12
x
57
61
62
66
84
4.13
Sự đa kháng kháng sinh của V. cholerae ……………...........
86
4.14
88
4.15
Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh
đối với V. cholerae ……………………………………………
Bảng trình tự nucleotide Gene_DKKS_T1_TraVinhVN_2014...
4.16
Bảng trình tự nucleotide Gene_DKKS_T3_TraVinhVN_2014...
91
4.17
So sánh vị trí các acid amin của chủng V. cholerae hoang dại
N16961 với chủng V. cholerae T1 ……………………...........
So sánh vị trí các acid amin của chủng V. cholerae hoang dại
N16961 với chủng V. cholerae T3 …………………………….
Mức độ tương đồng đoạn gen kháng kháng sinh của V.
cholerae (T1 và T3) ……………………………………….......
Lượng dịch lỏng (FA) thu từ ruột non của thỏ không uống
vaccine ………………………………………………………...
Số lượng V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non thỏ
không uống vaccine …………………………………………..
Lượng dịch lỏng (FA) thu từ ruột non của thỏ đã uống vaccine
94
4.18
4.19
4.20
4.21
4.22
4.23
Số lượng V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non thỏ đã
uống vaccine ………………………………………………...
xi
90
95
97
100
102
103
104
DANH SÁCH HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
2.1
Phân loại type huyết thanh V. cholerae ………………………….
10
2.2
Cấu tạo vi khuẩn V. cholerae ……………………………….........
11
2.3
Sinh thái vi khuẩn V. cholerae ………………………………......
15
2.4
Các giai đoạn đại dịch tả ..............................................................
19
2.5
Sự lan rộng của các đại dịch tả từ năm năm 1961 đến 1971.........
19
2.6
Thời gian mắc bệnh do V. cholerae trong năm …………………..
24
2.7
Nhiễm sắc thể 1 và nhiễm sắc thể 2 của V. cholerae …………….
26
2.8
Sự hình thành chủng V. cholerae có độc tố ………………….......
28
2.9
Sự chuyển giao gene theo chiều ngang …………………………
28
2.10
Trình tự di truyền của V. cholerae ……………………………....
29
2.11
Vi khuẩn đột biến roi …………………………………………….
30
2.12
Cơ chế tạo độc tố ở ruột của V. cholerae …………………….......
32
2.13
Sự di truyền Plasmid từ vi khuẩn sang vi khuẩn ………………...
37
2.14
Cấu trúc của các dẫn xuất của tetracycline ………………………
42
2.15
Cơ chế kháng tetracycline của vi khuẩn …………………………
43
2.16
Cơ chế tác động của kháng sinh ....................................................
44
2.17
Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn .........................................
45
3.1
Thỏ thí nghiệm …………………………………………………...
49
3.2
Quy trình phân lập và định danh Vibrio spp. …………………….
53
3.3
Thử nghiệm sự ngưng kết với kháng huyết thanh của V. cholerae
55
xii
3.4
Thỏ được gây mê ………………………………………………...
64
3.5
Dịch thu từ niêm mạc ruột non thỏ ………………………………
64
3.6
Pha loãng mẫu theo dãy thập phân ………………………………
65
4.1
Khuẩn lạc trên môi trường TCBS ………………………………..
66
4.2
Test sinh hoá ……………………………………………………..
68
4.3
Nồng độ muối từ 0% - 10% ……………………………………...
68
4.4
Vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử ………………………….......
69
4.5
Sản phẩm khuếch đại đoạn gen 16S-27F và 1492R …………….
70
4.6
Cây biễu diễn mối quan hệ di truyền dựa trên 16srDNA của các Vibrio
spp. phân lập và một số chủng tham khảo…………………………
80
4.7
Kết quả thực hiện kháng sinh đồ …………………………………
85
4.8
Tỷ lệ nhạy cảm và kháng kháng sinh đối với V. cholerae ……….
86
4.9
Sản phẩm khuếch đại đoạn gen tetAF và testAR …………………
89
4.10
So sánh các vị trí nucleotid được chèn vào và mất đi ……………
93
4.11
Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene kháng
kháng sinh tetA………………………………………………………….
98
4.12
Biểu đồ dịch lỏng sau khi tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ………
100
4.13
Biểu đồ V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non thỏ..........
102
4.14
Biểu đồ lượng dịch lỏng sau khi tiêm vi khuẩn vào ruột non
thỏ………………………………………………………………..
Biểu đồ V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non ………..
103
4.15
xiii
104
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ tắt
Chữ viết đầy đủ
Nghĩa tiếng Việt
APW
Alkaline peptone water
Nước peptone kiềm
ASPW
Alkaline saline peptone water
Nước peptone muối kiềm
ADH
Arginine Dihydrolase
CFU
Colony forming unit
Đơn vị hình thành khuẩn lạc
CTX
Cholerae toxin
Độc tố bệnh tả
CTXΦ
Cholerae toxin XΦ
Thực khuẩn thể của Vibrio cholerae
mang gen có độc tố tả
CTXP
Cholerae toxin pili
Độc tố bệnh tả (pili)
CTXA
Cholera toxin gene A
Gen mã hoá độc tố tả trên tiểu đơn vị A
CTXB
Cholera toxin gene B
Gen mã hoá độc tố tả trên tiểu đơn vị B
CLSI
Clinical and Laboratory Standard
Institute
Viện tiêu chuẩn phòng thí nghiệm và
lâm sàng
CDC
Centers for Disease Control
Trung tâm kiểm soát dịch bệnh
cAMP
Cycle Adenosin monophosphat
DNA
Deoxyribo nucleic acid
Phân tử acid nucleic mang thông tin di
truyền
FA
Fluid accumulation
Tích tụ chất lỏng
IgG
Immunoglobulin G
Kháng thể dịch thể lớp IgG
IgA
Immunoglobulin A
Kháng thể dịch thể lớp IgA
IVI
The International Vaccine Institute Viện Vaccine Quốc tế
KN
Kháng nguyên
LDC
Lysin decarboxylase
MDR
Multidrug resistance
MHA
Mueller Hinton agar
MIC
Minimum Inhibitory
Concentration
Nồng độ ức chế tối thiểu
NA
Nutrient agar
Thạch dinh dưỡng
NAG
Non-agglutinable
Không ngưng kết
NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate hydrogen
Đa đề kháng
xiv
NIHE
National Institute of Hygiene and
Epidemiology
Viện Vệ sinh và Dịch tễ Quốc gia
ORF
Open Reading Frame
Khung đọc mở
PAD
Phenyl Alanin Deaminase
PCR
Polymerase chain reaction
PAD
Phenyl Alanin Deaminase
RND
Resistance-nodulation-division
RITARD
Removable intestinal tie-adult
rabbit diarrhoea
Cột – tháo đoạn ruột trên thỏ tiêu chảy
TCPA
Toxin co-regulated pilus gene
Gen quy định mã hóa độc tố pili
ToxR
ToxR
Gen quy định mã hóa Protein màng
TCP
Toxin coregulated pili
Gen mã hoá độc tố pili
TCBS
Thiosunfat-Citrat-Bile-Sacaroza
Thạch muối mật – đường
TSI
Triple sugar iron agar
Thạch sắt và 3 loại đường
VcAM
VcAM
Gen VcAM quy định đa đề kháng KS
VPI
Vibrio pathogenicity Island
Vùng quy định tính gây bệnh của
Vibrios
SXT
Sulfamethoxazole–trimethoprim
Gen SXT quy định đa đề kháng kháng
sinh tương ứng
SNA
Saline Nutrient agar
Thạch dinh dưỡng – muối
WHO
World Health Organization
Tổ chức Y tế Thế giới
Phản ứng chuỗi Polymerase
xv
Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Vibrio cholerae là vi khuẩn Gram âm, tác nhân của bệnh dịch tả trên
người, gây tiêu chảy cấp tính và mất nước, dịch bệnh xảy ra với các hình thức
dịch địa phương và đại dịch. Thế giới đã trải qua 7 đại dịch dịch tả, từ năm 1816
đến năm 1923 đã có 6 vụ đại dịch xảy ra, những đại dịch này đều bắt đầu từ Ấn
Ðộ và đều do V. cholerae O1 type sinh học cổ điển gây ra. Đại dịch thứ 7 khác
với 6 đại dịch trước, đại dịch này do V. cholerae type sinh học El Tor gây ra và
có nguồn gốc từ đảo Celebes của Indonesia năm 1961. Đại dịch này kéo dài nhất
và có phạm vi rộng hơn 6 đại dịch trước đó, đến nay còn nhiều nước thông báo
những đợt bùng phát dịch tả cũng do nguyên nhân này gây ra (Hayes, 2005).
Ở Việt Nam, bệnh tả là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra
tiêu chảy hơn một thế kỷ nay, với 2.000.000 trường hợp được báo cáo trong năm
1850. Năm 1885, một đợt bùng phát dịch tả với tỉ lệ tử vong lên đến 50% và đến
năm 1910-1930 có 5.000 đến 30.000 trường hợp bệnh tả đã được báo cáo hàng
năm (Nguyen, 1962).
Trong những năm gần đây, Việt Nam đã xảy ra 3 đợt dịch tiêu chảy cấp
nguy hiểm ở 18 tỉnh, thành thuộc cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. Năm 2009 - 2010,
dịch tả lại xuất hiện tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam (Nguyen et al., 2012).
Đồng bằng sông Cửu Long, tính đến 19/8/2010 đã có 4 địa phương
gồm: Bến Tre, Tiền Giang, thành phố Cần Thơ và An Giang xuất hiện bệnh
nhân mắc bệnh tiêu chảy do vi khuẩn V. cholerae (Nguyễn Hoàng Vũ, 2011).
Tỉnh Trà Vinh có vị trí địa lý với nhiều nguy cơ tiềm ẩn bệnh dịch tả vì có bờ
biển kéo dài khoảng 65 km và trên địa bàn Trà Vinh có hệ thống sông chính
với tổng chiều dài 578 km, trong đó có các sông lớn là sông Hậu, sông Cổ
Chiên và sông Măng Thít, vì thế rất dễ cho việc lưu hành vi khuẩn tả từ sông
Cổ Chiên giáp với tỉnh Bến Tre, nơi đã từng xảy ra dịch bệnh vào năm 2010.
Biển Duyên Hải và Cầu Ngang thuộc tỉnh Trà Vinh là vùng chuyên nuôi
trồng thủy sản, trong đó phổ biến nhất là nghêu và tôm. Đã có nhiều nghiên
cứu chứng minh thức ăn hải sản là nguồn lưu trữ vi khuẩn gây bệnh tả được
xác định là V. cholerae. Vi khuẩn này có cấu trúc gene của chủng thuộc type
sinh học El tor, nhưng lại mang gene độc lực của type sinh học cổ điển, khiến
nó tăng độc lực và gây bệnh với triệu chứng lâm sàng nặng hơn, người khỏe
mang trùng và thời gian mang trùng dài hơn, khả năng tồn tại lâu hơn trong môi
trường (Boyd et al., 2008).
1
Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy triệu chứng chính của
bệnh tả trên người là do độc tố của vi khuẩn V. cholerae gây ra. Vi khuẩn có
mặt ở các môi trường nước biển và nguồn nước bị ô nhiễm (Nguyen Binh
Minh et al., 2002).
Có nhiều loại kháng sinh sử dụng điều trị bệnh tả đang đề kháng với vi
khuẩn này, trong đó có V. cholerae, đây là vấn đề phức tạp trong điều trị bệnh
và là mối quan tâm đối với sức khỏe cộng đồng. Nhiễm sắc thể được chứng
minh là yếu tố di truyền về gene kháng kháng sinh của vi khuẩn. Việc thu
nhận và lây truyền của các gene kháng kháng sinh là do các yếu tố di truyền
như plasmid, integrons và transposons (Ghosh et al., 2011). Một trong những
yếu tố di truyền được tích hợp và sao chép trên nhiễm sắc thể và được truyền
gene kháng kháng sinh giữa các vi khuẩn cùng loài trong môi trường (Burrus
et al., 2004).
Thực phẩm và nước ô nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh là một mối đe
dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng, càng quan tâm hơn nữa là kháng sinh
được bổ sung vào thức ăn cho động vật đã góp phần vào việc kháng kháng
sinh khi điều trị bệnh trên người (Smith et al, 1999). Nhiều nghiên cứu về V.
cholerae được phân lập từ các nguồn nước sông và nước biển, trên các loại
mẫu thức ăn hải sản đều cho thấy vi khuẩn này có khả năng kháng lại hầu hết
các kháng sinh thường được sử dụng, điều này có thể khẳng định trong thực tế
việc kháng kháng sinh đang gia tăng cả trong lĩnh vực chăn nuôi trang trại và
y tế công cộng, đây cũng là vấn đề toàn cầu trong những thập kỷ gần đây do
sử dụng bừa bãi và lạm dụng kháng sinh trong các trang trại chăn nuôi và thực
phẩm làm thức ăn gia súc, gia cầm (Teuber, 2001; Bywater, 2004).
Với tính chất lây lan và nguy hiểm của bệnh dịch tả, đặc biệt là vùng
đồng bằng sông Cửu Long, nghiên cứu này được thực hiện nhằm góp phần xác
định tỉ lệ nhiễm của vi khuẩn V. cholerae và mức độ kháng kháng sinh của vi
khuẩn đang gia tăng cả trong môi trường và thức ăn từ hải sản, cùng với mục
tiêu xác định mối liên quan về đặc điểm di truyền gene kháng kháng sinh của
V. cholerae phân lập được từ môi trường nước và trên các loại mẫu có nguồn
gốc từ hải sản. Nghiên cứu đã tiến hành từ năm 2012 đến 2014 với nội dung:
“Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân
lập tại tỉnh Trà Vinh”, từ đó giúp cơ sở y tế có chiến lược sử dụng kháng sinh
đúng nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm chi phí trong điều trị bệnh, phù hợp
với điều kiện kinh tế trong khu vực.
2
1.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định tỉ lệ nhiễm và type huyết thanh học của các chủng V.
cholerae phân lập được.
- Xác định đặc tính kháng kháng sinh của các chủng V. cholerae.
- Xác định các kiểu đột biến gene gây kháng thuốc của các chủng
Vibrio cholerae và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch với V. cholerae ở thỏ đã
được chủng vaccine đang lưu hành trên thị trường.
- Định danh các chủng vi khuẩn phân lập và đánh giá quan hệ di truyền
giữa các chủng phân lập với các chủng đã công bố.
1.2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu
Phân lập, định danh các loài thuộc Vibrio spp., trên các loại mẫu
thức ăn từ hải sản (tôm, nghêu) ở huyện Duyên Hải và Cầu Ngang; mẫu
nước (sông, ao nuôi tôm, nước biển) tại thành phố Trà Vinh bắt nguồn từ
sông Cổ Chiên và nước ao nuôi tôm tại huyện Duyên Hải; mẫu huyết heo
từ các cơ sở giết mổ ở Thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, huyện
Duyên Hải, huyện Cầu Ngang, huyện Càng Long; mẫu phân lấy từ bệnh nhân
tiêu chảy tại bệnh viện Đa khoa Trà Vinh.
Các giống vi khuẩn thuộc Vibrio được kiểm tra độ dài DNA bằng kỹ
thuật PCR, dựa trên gene 16S rRNA, sau đó tìm sự tương đồng về trình tự
nucleotide với những chủng khác bằng công cụ BLAST.
Xác định sự kháng kháng sinh của các chủng V. cholerae dựa trên các
cặp mồi blaSHV (gene mã hoá kháng β-Lactam), aac(3)-IV (gene mã hoá kháng
aminogly-cosid), tetA (gene mã hoá tính kháng tetracycline), dhfrI (gene mã
hoá kháng trimethoprim); so sánh tính đột biến với các chủng V. cholerae
hoang dại.
Thử nghiệm trên thỏ nhằm khảo sát tính miễn dịch đối với vaccine hiện
hành và sự đột biến đối với vi khuẩn phân lập được.
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio trong
đó loài V. cholerae được nghiên cứu về sự đột biến và tính kháng kháng
sinh.
3
Phạm vi nghiên cứu:
5 loại mẫu thu thập từ 4 huyện, 1 thành phố thuộc tỉnh Trà Vinh: mẫu
nghêu (thu mua tại huyện Duyên Hải và Cầu Ngang), mẫu huyết heo (thu tại
cơ sở giết mổ ở thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, Duyên Hải, Cầu
Ngang và Càng Long), mẫu nước (nước ao nuôi tôm ở huyện Cầu Ngang và
Duyên Hải, nước biển ở huyện Duyên Hải, nước sông tại thành phố Trà Vinh
và sông Cổ Chiên), mẫu tôm (thu mua tại chợ huyện Duyên Hải); mẫu phân
bệnh nhân có triệu chứng tiêu chảy tại bệnh viện Đa khoa Trà Vinh.
1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu từ tháng 4/2012 – 4/2014, tại phòng thí nghiệm
sinh học phân tử thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học,
Đại học Cần Thơ; Bệnh viện Đa khoa Trung ương Cần Thơ; Bệnh viện trường
Đại học Y Dược Cần Thơ; Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, trường
Đại học Cần Thơ và Khoa Nông nghiệp – Thuỷ sản, trường Đại học Trà Vinh.
1.5 Những đóng góp của luận án
- Phân lập được 6 chủng V. cholerae và tỉ lệ nhiễm V. cholerae trên các
loại mẫu thức ăn từ hải sản như nghêu, tôm và mẫu nước từ môi trường nước
sông và nước ao nuôi tôm.
- Xác định được type huyết thanh học Ogawa và Inaba của các gốc V.
cholerae phân lập.
- Xác định được sự tương đồng về trình tự nucleotide của các chủng V.
cholerae phân lập được với trình tự nucleotide của những chủng V. cholerae ở
các nước thuộc vùng Đông Nam Á dựa vào đoạn 16SrDNA.
- Xác định được tính kháng kháng sinh của V. cholerae đối với kháng
sinh vancomycin, streptomycin, azithromycin, trimethoprim-sulfamethoxazol
và tetracycline.
- Xác định được sự đột biến gene kháng tetracycline của V. cholerae
phân lập được.
1.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
* Ý nghĩa khoa học: Định danh được 5 loài thuộc giống Vibrio hiện
đang phổ biến ở trong môi trường nước sông, thức ăn có nguồn gốc thủy sản
và có thể gây bệnh cho người. Kết quả của đề tài có thể sử dụng cho các
nghiên cứu tiếp theo.
* Ý nghĩa thực tiễn: Cung cấp số liệu về tỉ lệ nhiễm các loài thuộc
giống Vibrio và sự kháng kháng sinh của V. cholerae.
4
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Lịch sử bệnh do vi khuẩn tả (Vibrio cholerae)
Năm 1816 bệnh xuất hiện tại Châu Âu và Mỹ, đến đầu thế kỷ 20 đã có
6 đại dịch tả lan khắp thế giới. Tiếp đó, đến những năm 60 phạm vi gây bệnh
của vi khuẩn tả đã được khoanh vùng và cho đến những năm gần đây bệnh chủ
yếu xuất hiện ở Đông Nam Á. Năm 1961 type sinh học El Tor gây dịch tại
Philippines và tạo làn sóng thứ bảy. Từ đó trở đi type vi khuẩn này tiếp tục
gây những vụ dịch tại châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi và một phần Châu
Âu (Colwell, 2004).
Từ năm 1991, tỉ lệ mắc bệnh tả do vi khuẩn V. cholerae O1 đã xảy ra ở
Châu Mỹ La tinh (Levine, 1991; Ries et al., 1992), đến năm 1992 bệnh lại xuất
hiện và lây lan nhanh chóng bởi V. cholerae O139 trong khu vực Đông Nam
Châu Á (Shimada et al., 1993) và gần đây bệnh lại bùng phát ở châu Phi, do type
huyết thanh non-O1, non-O139, đây cũng là nguyên nhân quan trọng gây tiêu
chảy (Sharma et al., 1998). Các nghiên cứu về sự tiến hóa phân tử chủng V.
cholerae O1 ở Peru từ năm 1991-1995, Ấn Độ, và ở Thái Lan cho thấy rằng V.
cholerae O1 đã trải qua những thay đổi về di truyền ở mức tương đối cao. Những
thay đổi này rất quan trọng trong việc tìm hiểu về dịch tễ học và sự tiến hóa của
V. cholerae (Dalsgaard et al., 1999).
Khoảng thời gian từ 1969 đến 1974, type sinh học El Tor đã chiếm ưu
thế trong dịch tễ học bệnh tả. Năm 1991, type sinh học El Tor gây dịch tại
Peru (sau vụ dịch trước 100 năm tại nơi này) và nhanh chóng lây lan tại vùng
Trung và Nam Mỹ. Tính từ tháng 1/1991 đến tháng 9/1994 tổng số có
1.041.422 người bị bệnh, trong đó 9.642 người chết (tỉ lệ chết 0,9%). Riêng
năm 1993, 204.543 người bị bệnh và 2.362 người chết tại Bangladesh
(Faruque et al., 1998). Tháng 12 năm 1992 một vụ dịch lớn lại xảy ra ở nước
này, vi khuẩn gây bệnh được xác định là V. cholerae O139 Bengal. Về mặt di
truyền, O139 Bengal hình thành từ type sinh học El Tor nhưng cấu trúc kháng
nguyên của chúng cũng biến đổi. Tất cả ở mọi lứa tuổi trên người (kể cả trong
vùng đã có dịch) đều có thể bị nhiễm, vi khuẩn V. cholerae O139 đã gây bệnh
ít nhất 11 nước ở Đông Nam Á đến năm 2005 (Garg et al., 2003).
Tháng 4 năm 1997, dịch bùng phát trong cộng đồng 90 ngàn người tị
nạn Ruanđa ở Cộng Hòa Côngô. Chỉ trong 22 ngày đầu đã có 1521 người
chết, đa số các trường hợp chết đều do không được can thiệp kịp thời.
Tại Mỹ, dịch tả xuất hiện vào những năm 1800 sau đó được khống chế
do đảm bảo vệ sinh nguồn nước sinh hoạt. Tuy vậy, giao thông và du lịch đã
5
tạo điều kiện để bệnh xuất hiện lẻ tẻ. Đa số trường hợp do đi du lịch tại các
nước Mỹ La tinh, Châu Phi, Châu Á. Một số trường hợp nhiễm bệnh do ăn
thức ăn mang về từ các quốc gia còn lưu hành bệnh. Vi khuẩn tả có mặt trong
các vùng nước lợ, nước mặn ven biển. Một số người bị bệnh tại Mỹ do ăn
sống hay ăn tái sò từ vịnh Mêhico (Barnes, 2005).
Ở Việt Nam bệnh tả là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra
tiêu chảy từ những năm 1850. Năm 1885, một đợt bùng phát dịch tả lại xảy ra và
đến năm 1910-1930 bệnh tả đã được báo cáo hàng năm (Nguyen, 1962). Đến
năm 1964 V. cholerae O1 type sinh học El Tor lại gây bệnh ở miền Nam Việt
Nam. Trong lịch sử, phần lớn các đợt dịch bệnh tả đều xuất hiện ở các khu vực
ven biển miền Trung và Nam Việt Nam. V. cholerae O1 type sinh học El Tor
hiếm khi xuất hiện ở Bắc Việt Nam. Đến năm 1976, bệnh có xảy ra tại thành phố
Hải Phòng và tỉnh Quảng Ninh (Dalsgaard et al., 1999). Từ năm 2007 đến năm
2008 và năm 2010, một chủng vi khuẩn V. cholerae O139 được phân lập từ 7
mẫu nước và được đặt tên là V. cholerae O139. Tuy có sự lây lan nhanh chóng
của O139 trong khu vực Đông Nam Á nhưng ở Việt Nam, có rất ít thông tin
về bệnh tả do O139 gây ra (Dong Tu Nguyen, 2012).
2.2 Tổng quan về Vibrio
Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales, lớp
Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Đặc điểm chung các loài vi
khuẩn thuộc giống Vibrio: Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích
thước 0.3-0.5 x 1.4-2.6 μm. Chúng không hình thành bào tử và chuyển động
nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh; chung sống tự nhiên trong môi
trường biển (Morris et al., 1985).
Tất cả những loài thuộc Vibrio đều thích hợp ở điều kiện yếm khí
không bắt buộc (tùy nghi) và hầu hết là oxy hoá và lên men trong môi trường
O/F Glucose. Thiosulphate citrate bile salt agar TCBS là môi trường chọn lọc
của Vibrio. Dựa vào màu sắc của khuẩn lạc trên môi trường này, Vibrio spp.
được chia thành hai nhóm: nhóm có khả năng lên men đường sucrose có
khuẩn lạc màu vàng và nhóm không có khả năng lên men đường sucrose có
khuẩn lạc màu xanh lá cây trên môi trường TCBS (Morris et al., 1985).
Hầu hết các loài đều phát triển trong môi trường nước biển cơ bản, Na+
kích thích cho sự phát triển của Vibrio và nhiều loài có nhu cầu tuyệt đối,
chúng không phát triển trong môi trường không muối (NaCl), không sinh H2S.
Cơ bản chúng đều sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa
sông, liên quan đến các động vật biển, một số loài là tác nhân gây bệnh cho
người và động vật biển (Morris et al., 1985).
6
Ngoài ra, nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng
oxidase và catalase dương tính, là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng
lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrit từ nitrat, và
nhất là nhạy với hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (O/129, 150
μg) là hợp chất giúp phân biệt vi khuẩn Vibrio và Aeromonas. Hơn nữa, các
chủng vi khuẩn thuộc Vibrio đều phát triển tốt ở môi trường có 3% NaCl, sinh
indole và có khả năng tạo axít từ mannitol (West et al., 1986).
Có ít nhất 12 loài thuộc Vibrio gây bệnh ở người (Janda et al., 1988).
Các loài vi khuẩn thuộc Vibrio có ý nghĩa trong y tế là V. cholerae, V.
parahaemolyticus, V. vulnificus, V. fluvialis và V. alginolyticus.
2.2.1 Đặc điểm các loài thuộc giống Vibrio
2.2.1.1 Vibrio cholerae
V. cholerae là những trực khuẩn ngắn, mảnh, kích thước khoảng 0,3 x
3µm. Mới phân lập từ bệnh phẩm, vi khuẩn hình cong như dấu phẩy, đặc biệt
di động rất nhanh, qua cấy truyền, hình dạng trở nên thẳng hơn.
Phẩy khuẩn tả mọc dễ dà ng trong môi trường nuôi cấy bình thường ở
phòng thí nghiệm, không đòi hỏi yếu tố tăng trưởng đặc biệt, nhưng nếu môi
trường có thêm 5-15mmol/l NaCl sẽ kích thích vi khuẩn mọc tốt hơn. Vi
khuẩn ưa môi trường kiềm pH 8-9,5, tồn tại ở nhiệt độ 16 – 420C, nhiệt độ tối
ưu 370C, kỵ khí tuỳ nghi. V. cholerae chết nhanh trong môi trường acid, dễ bị
diệt bởi các chất tẩy uế, đặc biệt nhạy cảm với sự khô hạn, chỉ tồn tại 10 phút
ở 550C. Tuy nhiên có thể sống được 4-7 ngày trên rau trái tươi để ở nơi mát
và ẩm (Đặng Chi Mai, 2006).
V. cholerae O1 là tác nhân chính gây bệnh tả (Morris et al., 1985), bệnh gây
ra các triệu chứng tiêu chảy mất nước và chất điện giải, nôn mửa và đau cơ
bắp. Khi tiêu chảy lượng nước mất theo khối lượng phân có thể 1 lít/h. Mức
độ bệnh bao gồm: nhiễm trùng không có triệu chứng (75%), bệnh nhẹ (18%),
bệnh vừa (5%), và bệnh nặng (2%). Tiêu chảy nặng có thể dẫn đến tử vong
trong vòng vài giờ, thời kỳ ủ bệnh của bệnh tả thường là 2 đến 3 ngày
(Gangarosa et al., 1974).
2.2.1.2 Vibrio parahaemolyticus
V. parahaemolyticus thuộc vi khuẩn Gram âm, có hình hơi cong ngắn,
di động và là vi khuẩn ưa mặn tồn tại trong nước biển và các động vật biển
như cá, tôm, sò, ốc ...Vi khuẩn mọc tốt ở môi trường kiềm và mặn, nhiệt độ
thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 370C. V. parahaemolyticus phát triển trên
môi trường TCBS có khuẩn lạc màu xanh, tròn, lồi, đường kính 2-3mm. Phản
7
ứng dương tính với oxidase, catalase, có khả năng lên men đường trong điều
kiện kị khí và hiếu khí. Tất cả các chủng đều có phản ứng decarboxylase;
dương tính với lysine và ornithine, không sinh ureaza nhưng sinh idole,
acetoin và gelatin, đều sử dụng đường glucose, D-mannitol, maltose,
L.arabinose, không lên men saccharose (Fujino et al., 1953).
V. parahaemolyticus dễ bị diệt ở 650C sau 10 phút, chúng không phát
triển được ở nhiệt độ dưới 150C. Vi khuẩn có 3 loại kháng nguyên: Kháng
nguyên thân 0 chịu nhiệt, được chia thành 12 type; kháng nguyên lông H;
kháng nguyên vỏ K không chịu nhiệt, được chia thành 59 type (Fujino et al.,
1953).
V. parahaemolyticus là nguyên nhân gây bệnh do thực phẩm có nguồn
gốc hải sản được xác định lần đầu tiên năm 1950 (Fujino et al., 1953). Các
biểu hiện lâm sàng thường gặp nhất là viêm dạ dày ruột, bệnh cũng gây tiêu
chảy cấp, mất nước, đau bụng, buồn nôn, thời gian ủ bệnh trung bình từ 24
đến 48 giờ, kéo dài trong 3 ngày, bệnh nhẹ đến trung bình và thường tự khỏi,
có một số trường hợp có thể nặng và phải nhập viện (Levine et al., 1993).
Nhiễm trùng có thể nặng ở những người có bệnh mãn tính như người bị bệnh
gan, bệnh tiểu đường, suy giảm hệ thống miễn dịch. Ở Mỹ từ năm 1988 đến
năm 1997, V. parahaemolyticus gây nhiễm trùng ở người có viêm dạ dày ruột
là (59%), nhiễm trùng vết thương (34%), nhiễm trùng huyết (5%), và 2% từ
các nhiễm trùng khác (Daniels et al., 2000).
2.2.1.3 Vibrio vulnificus
V. vulnificus là vi khuẩn gram âm, hình que, có tiêm mao ở một đầu, có
khả năng di động trong môi trường lỏng, chúng phát triển trên môi trường
TCBS có khuẩn lạc màu xanh. Phản ứng dương tính với oxidase, catalase,
ONPG, LDC, có khả năng lên men đường, đặc biệt chúng không phát triển
được trên 400C. Tất cả các chủng đều có phản ứng decarboxylase dương tính
với lysine và ornithine, không sinh ureaza, không tăng trưởng được trong môi
trường không có muối và bị ức chế trong môi trường từ 8-10% NaCl (Shyh và
Ching., 2003).
V. vulnificus hiện diện trong môi trường biển như cửa sông, ao nước lợ,
hoặc các khu vực ven biển, (Oliver et al., 2001). V. vulnificus gây nhiễm trùng
sau khi ăn hải sản, đặc biệt là hàu sống hoặc nấu chưa chín, các triệu chứng
lâm sàng như buồn nôn, tiêu chảy, đau bụng, và viêm da phồng rộp, sốc nhiễm
trùng, và có thể dẫn đến tử vong. Bệnh có nguy cơ cao đối với những người có
hệ miễn dịch kém, đặc biệt người mắc bệnh gan mãn tính dễ dàng mẫn cảm
với V. vulnificus (Janda et al., 1988).
8
