NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH CÁC GEN GÂY BỆNH CỦA HELICOBACTER PYLORI TỪ MẪU SINH THIẾT DẠ DÀY

HỌC VIỆN QUÂN Y
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU SINH Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ

HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Đề tài:
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH
CÁC GEN GÂY BỆNH CỦA HELICOBACTER PYLORI
TỪ MẪU SINH THIẾT DẠ DÀY

Nhóm SV NCKH:
1. Hoàng Ngọc Cường

DH38A

2. Trương Hữu Hoàng

DH38A

3. Hoàng Thị Minh

DH38A

4.Hoàng Văn Tú

DH38A

5.Nguyễn Đông Hưng

DH38A

Hà Nội – 2008

1


HỌC VIỆN QUÂN Y
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU SINH Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ

HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Đề tài:
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH
CÁC GEN GÂY BỆNH CỦA HELICOBACTER PYLORI
TỪ MẪU SINH THIẾT DẠ DÀY

Nhóm SV NCKH:
1. Hoàng Ngọc Cường

DH38A

2. Trương Hữu Hoàng

DH38A

3. Hoàng Thị Minh

DH38A

4.Hoàng Văn Tú

DH38A

5.Nguyễn Đông Hưng

DH38A

Hà Nội – 2008

2


ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn H.pylori được phát hiện đầu tiên bởi Marshall và Warren nǎm
1982 từ mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày người. Nhiều nghiên cứu tiếp theo đã
cho thấy vi khuẩn này đóng vai trò quan trọng và là nguyên nhân chính trong
bệnh sinh của viêm loét dạ dày - tá tràng và ung thư dạ dày. Các nghiên cứu về
dịch tễ học cho thấy khoảng một nửa dân số thế giới đang bị nhiễm vi khuẩn này
(Trích biên bản hội thảo quốc tế về nhiễm trùng H.pylori ở Dublin, Ireland,
7/1992).
Hầu hết những người nhiễm Helicobacter pylori đều không có triệu chứng,
và chỉ có một tỉ lệ nhỏ những bệnh nhân nhiễm phát triển thành bệnh loét dạ
dày (PUD - peptic ulcer diseases), một số ít hơn tiến triển thành ung thư dạ dày
(Rudi et al., 2000; Nomura et al 1994). Điều này có thể do một vài chủng H.
pylori mang nhiều độc tố hơn các chủng khác (Tovey et al., 2006). Sự biến đổi
của biểu hiện lâm sàng có liên quan đến một vài yếu tố như yếu tố độc lực của
chủng, yếu tố miễn dịch của cơ thể chủ và những ảnh hưởng của môi trường,
hoặc là sự kết hợp của các yếu tố trên. (Atherton et al., 1997). Một vài gen độc
lực có lẽ giữ vai trò trong sự phát sinh bệnh, cagA gene (chiếm khoảng 68% các
chủng) và vacA gene (hầu như có mặt trong tất cả các chủng) được tìm thấy có
mối liên quan nhiều với mức độ của bệnh (Yamazaki et al., 2005). Sự tác động

của 2 yếu tố độc lực chính này trên tế bào biểu mô dạ dày làm sáng tỏ hệ thống
phức tạp của sự tương tác tế bào được kích hoạt bởi vi khuẩn này (Moss ad Sood
2003). Những bệnh nhân viêm tá tràng, loét tá tràng, và loét dạ dày hầu hết
nhiễm chủng mang gen cagA - vacA, giả thuyết chúng giữ một vai trò quan
trọng trong phát sinh bệnh (Censini et al., 1996). Vì vậy việc phát hiện những
chủng mang gen cagA - vacA có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác dự phòng
và điều trị các bệnh lý dạ dày.
Hiện nay, việc ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán và phát
hiện gene độc lực của Helicobacter pylori đã khá phổ biến trên thế giới, tuy
nhiên tại Việt Nam việc ứng dụng công nghệ này chưa nhiều và các công trình
3


mới chỉ dừng lại ở việc phát hiện các gene độc lực bằng các phản ứng riêng lẻ
mà không phát hiện được những chủng mang nhiều gene độc lực cùng một lúc,
điều này gây tốn kém và không đáp ứng được nhu cầu điều trị.Vì vậy chúng tôi
tiến hành nghiên cứu “Ứng dụng kĩ thuật PCR chẩn đoán các gen gây bệnh
của H.pylori từ mẫu bệnh phẩm sinh thiết dạ dày” với các mục tiêu sau:
-Xây dựng qui trình tách chiết DNA tổng số của H.pylori từ mảnh sinh
thiết dạ dày.
-Xây dựng qui trình kĩ thuật Multiplex-PCR xác định các gen gây bệnh của
H.pylori.
-Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kĩ thuật PCR xác định gen gây bệnh
của H.pylori.
-Ứng dụng kĩ thuật PCR xác định kiểu gen của H.pylori gây bệnh trên bệnh
nhân bị bệnh lý dạ dày tá tràng(ung thư, loét dạ dày)

4

Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. TÌNH HÌNH NHIỄM HELYCOBACTER PYLORI TRÊN THẾ GIỚI
VÀ TRONG NƢỚC.

1. 1. Tình hình nhiễm H. Pylori
Mặc dù nhiễm trùng H. pylori mới được phát hiện cách đây không lâu sau
những công bố của Marshall và Warren những nghiên cứu tiếp theo về dịch tễ
học đã làm mọi người kinh ngạc khi “ hầu như nửa dân số thế giới bị nhiễm H.
pylori ”( hội thảo quốc tế về nhiễm trùng H.pylori,Dublin,Ireland,1992). Các
nghiên cứu cho thấy H. pylori phân bố khắp các khu vực, quốc gia trên thế giới
nhưng mức độ lưu hành H. pylori giữa các vùng, các quốc gia khác nhau phụ
thuộc nhiều yếu tố trong đó tình trạng kinh tế xã hội là yếu tố quan trọng nhất.
Nhìn chung tỉ lệ nhiễm H. pylori ở các nước phát triển thấp hơn so với các nước
đang phát triển, nhưng ở cả hai nhóm nước đều có sự gia tăng về mức độ lưu
hành theo tuổi
* Ở các nƣớc phát triển:
Các nghiên cứu dịch tễ học ở các nước phát triển cho thấy tỉ lệ nhiễm
H. pylori khoảng 20% ở độ tuổi dưới 40 và 50% ở độ tuổi từ 60 trở lên. Tỉ lệ
huyết thanh dương tính với H. pylori thấp hơn 10% ở các trẻ dưới 10 tuổi,
nhưng tỉ lệ nhiễm trùng gia tăng theo tuổi hàng năm ở trẻ em khoảng 0,5%5


1,0%. Ở người lớn tỉ lệ nhiễm trùng gia tăng theo tuổi hàng năm thấp hơn ở trẻ
em, từ 0,3%-0,5% [Bruce E và CS, 1997; Graham và CS, 1991] nhưng lại có
bước nhảy về mức độ lưu hành cao sau tuổi. Đó chính là tỉ lệ nhiễm ở thời thơ
ấu của họ, thời điểm mà tình trạng kinh tế xã hội của các nước phương Tây còn
thấp [Graham DY và CS,1991;Marshall BJ và CS,1984].
* Ở các nƣớc đang phát triển:
Tỉ lệ nhiễm HP ở các nước đang phát triển cao hơn hẳn các nước phát triển. Trẻ
bị nhiễm từ rất sớm, tỉ lệ 50% ở trẻ dưới 5 tuổi và tăng lên đến 70%-90% ở

người trưởng thành. Tỉ lệ nhiễm mới của ở trẻ hàng năm là 10% ở lứa tuổi từ 2
đến 8 [Marshall BJ và CS,1984; Mergaud F và CS, 1989]. Tuy nhiên tỉ lệ nhiễm
không giống nhau trong các nước đang phát triển:
Huyết thanh dương tính với H. pylori ở Algeri là 43% ở trẻ em và đạt tới 92%
ở người lớn độ tuổi 40 đến 49 [Pradip K.Bardhan, 1997]. Ở Nam Phi tỉ lệ H.
pylori dương tính là trên 50% ở độ tuổi dưới 10 và 94% ngay ở độ tuổi 30 [
Pradip K.Bardhan, 1997]. Ngay trong cùng một quốc gia mà tỉ lệ H. pylori
dương tính cũng khác nhau giữa các khu vực và các đối tượng: ở Chile số liệu
giữa các vùng ở người lớn là 43%-92%, ở trẻ em là 6%-100% trên các đối tượng
khác nhau [Guillmermo F và CS, 1997]. Ở Bangladesh cho thấy H. pylori dương
tính 61% ở trẻ 1-3 tháng tuổi, giảm xuống 33% ở trẻ 10-15 tháng và lại tăng lên
đến 84% ở trẻ 5-8 tuổi [Sarker SA và CS, 1997]. Như vậy dịch tễ học H. pylori
bị chi phối bởi nhiều yếu tố.
Tháng 06/1994 chi nhánh quốc tế của nhóm nghiên cứu về ung thư của
WHO định nghĩa H. pylori là tác nhân gây ung thư ở người. Khoảng 50% dân số
thế giới được đánh giá nhiễm H. pylori. Tỉ lệ lưu hành H. pylori trong huyết
thanh nói chung tăng theo tuổi: 5-27% ở thời thơ ấu và >70% ở người >50 tuổi.
Ước tính khoảng 8-10% dân số thế giới bị loét dạ dày tá tràng (LDDTT),
trong đó LDD chiếm khoảng một phần tư. Ở các nước châu Âu, tỷ lệ LDDTT
khoảng 5-10% dân số.
Ở Mỹ có khoảng 4-10% dân số bị LDDTT.
Viêm loét dạ dày-tá tràng (DD-TT) là bệnh lý phổ biến. Tại Mỹ, tỉ lệ mắc
6


bệnh tính trong suốt cuộc đời, khoảng 12% ở nam giới và 10% ở nữ giới. Bệnh
có tỉ lệ tử vong thấp, nhưng gây đau đớn và tốn kém cho bệnh nhân.
Ước tính có khoảng 5-10% dân số trên thế giới bị bệnh đau dạ dày. Riêng
bên Mỹ có đến 25 triệu người bị bịnh, số đàn ông và đàn bà bịnh ngang nhau. Ở
Việt Nam tỉ lệ này là 7%. Tuy nhiên, điểm quan trọng nhất mà y học ngày nay

mới phát hiện ra đó là có đến hơn 70% số dân có nguy cơ bị nhiễm chứng bệnh
này và nguyên nhân chính đã được xác định là vi trùng Helicobacter Pylori.
1.2 Tình hình bệnh lý dạ dày do Helicobacter Pylori trong nƣớc.
Việt Nam cũng nằm trong khu vực có tỉ lệ nhiễm H.pylori cao nhưng chưa
có một nghiên cứu dịch tễ học qui mô nào mô tả bức tranh đầy đủ về nhiễm
trùng H.pylori ở Việt Nam. Theo kết quả xét nghiệm huyết thanh học, Phùng
Đắc Cam, tỉ lệ lưu hành kháng thể kháng H.pylori ở nhóm người có bệnh dạ dày
- tá tràng là 98,2%, ở nhóm khỏe mạnh là 77,4%. Tỉ lệ nhiễm mới ở cả 2 nhóm
là 6,5-7,3% (13).
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Khánh Trạch trên 528 người ở Thanh
Hóa, Hà Nội, Nha Trang thấy tỉ lệ nhiễm H.pylori (xác nhận bằng phương pháp
ELISA) ở người khỏe mạnh trong cộng đồng là 75%; trong đó, nam chiếm
76,4%; nữ 74,7%.
2. HÌNH THỂ VÀ CẤU TRÚC GENOME CỦA

HELICOBACTER

PYLORI.
2.1. Phân loại và danh pháp:
Helicobacter pylori ban đầu gọi là Campylobacter like organism do chúng
có hình thái giống một nhóm tác nhân gây bệnh đường ruột khác đã biết là
Campylobacter. Sau đó Goodwin và cộng sự đã đề nghị xếp nó vào một giống
mới là giống Helicobacter. Tháng 6 năm 1989, tạp chí quốc tế về hệ thống học vi
khuẩn đã chấp nhận giống vi khuẩn mới là Helicobacter, từ đó Campylorbacter
pylori được gọi là Helicobacter pylori. Hiện nay theo hệ thống học vi khuẩn,
giống Helicobacter là một giống thuộc phân lớp epsilon, trong ngành
proteobacteria. Sau khi phát hiện về H.pylori người ta còn phát hiện ra 21 loài
thuộc giống Helicobacter cư ngụ trên các động vật khác và khả năng còn phát
7

hiện ra nhiều vi khuẩn khác nữa thuộc nhóm này.
2.2. Hình thể và cấu trúc:
Helicobacter Pylori có hình cong, xoắn nhẹ, gram âm, đường kính 0,3-1,0
µm, dài 1,5-5 µm, trên tiêu bản nhuộm có hình chữ S, dấu ~,dấu ?, hình cánh
cung. . . . trên các nuôi cấy lâu ngày.
Bề mặt vi khuẩn nhẵn, vỏ mỏng, có 4 - 6 roi, đầu mút hình củ hành. Nhờ
có roi, vi khuẩn có thể di chuyển được trong lớp chất nhày của niêm mạc dạ dày.
Vi khuẩn có hệ thống men phân giải ure và hệ thống các enzym gồm urease,
oxidase, catalase, phosphatase kiềm, γ glutamyl, transferase, ANDase … trong
đó men urease có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của vi khuẩn.
Men urease có hệ thống gen gồm có C, D, A, B, I, F, G, H; trong đó gen
A, B là gen cấu trúc; còn gen F, G, H là gen hoạt tính giữ vai trò hoạt động của
men. Men urease giữ vai trò thủy phân urea để tạo ra NH3 và CO2, tạo ra vi môi
trường kiềm bảo vệ cho H.pylori khỏi bị tác dụng của acid dạ dày. Men urease
làm tổn thương các tế bào niêm mạc dạ dày do các ion H+ sinh ra nhờ cân bằng
với NH3 và nước khuếch tán vào thành dạ dày làm tổn thương niêm mạc.
H.pylori sản xuất ra protein bề mặt có tính chất hóa ứng động đối với bạch cầu
đơn nhân và đa nhân.

(Một số hình ảnh H. Pylori)
Kích cỡ toàn bộ gen (genom) của Helycobacter Pylori nằm trong khoảng
1,6-1,73 Mb. chức năng của hơn 60 gen khác nhau trong bản đồ gen của HP đã
được xác định, một số gen liên quan đến gây bệnh được đặc biệt quan tâm là
8


CagA và VagA.
- Gen VagA mã hóa cho độc tố VagA ( vacuolating toxin A) gây tổn
thương tế bào niêm mạc và hình thành nên những không bào ( hốc) trong tế

bào. Gen này có ở tất cả các chủng Helycobacter Pylori nhưng vagA chỉ xuất
hiện khoảng 40%-50% số chủng lưu hành [Bruce E.Dunn và CS, 1997;
Zhongming Ge và Diane E.Taylor, 1999]. Độc tố này được hoạt hóa ở độ pH
thấp và có tính bền vững với acid và pepsin. Gen vacA (gen mã hóa cho độc
tố VacA) không có một vị trí cố định trên bộ gen nhưng luôn nằm cách xa
tiểu đảo sinh bệnh và thay đổi tùy thuộc từng chủng H.pylori. Phần giữa của
gen (m - middle) có hai alen m1 và m2, và vùng tín hiệu (s - signal) cũng
được phân loại thành các alen s1, bao gồm s1a, s1b và s2. Những thay đổi
khác nhau của gen này rất quan trọng đối với khả năng bài tiết độc tố gây
rỗng hoạt động của vi khuẩn, trong đó kiểu gen s1/m1 có khả năng bài tiết
độc tố mức độ cao, kiểu gen s1/m2 bài tiết độc tố ở mức độ vừa phải, trong
khi đó kiểu gen s2/m2 thì không có khả năng bài tiết độc tố, không thấy
chủng nào có kiểu gen s2/m1. Những nghiên cứu gần đây cũng thấy rằng,
chủng có chứa gen vacA s1a có mối liên quan lớn hơn với việc thâm nhiễm
bạch cầu hạt và tế bào lympho ở niêm mạc hang vị hơn những chủng có chứa
kiểu gen s1b hoặc s2. Chủng chứa gen vacA m1 có mối liên quan lớn hơn
trong tổn thương biểu mô dạ dày hơn chủng có gen m2. Bệnh loét hành tá
tràng thường thấy ở những bệnh nhân chứa chủng có kiểu gen s1a hơn là ở
những bệnh nhân có chưa chủng s1b và s2.
- Gen cagA mã hóa cho một loại protein liên quan đến độc tính mang
tên cagA ( cytotoxin-associated gen A ), gen này cũng có mặt ở hầu hết các
chủng phân lập được nhưng chỉ biểu hiện ở 50%-70% các chủng lâm sàng
[Leen-Jan van Doorn và CS, 2001]. Những chủng có biểu hiện đồng thời cả
cagA và vagA thường gây ra những tổn thương nặng ở niêm mạc cả invitro
và invivo, có vai trò gây bệnh rõ rệt, những chủng này được gọi là “ chủng
độc ” và được xếp vào type I, phân biệt với type II ( không có cagA và vagA
) ít có khả năng gây bệnh hơn [Helena Enroth và Lars Engstrand, 2001;
9

Zhongming Ge và Diane E.Taylor, 1999]. Người ta gọi là CagA vì độc tố này
có tính kháng nguyên rất mạnh và cơ thể người bệnh nhiễm chủng H.pylori
sản xuất Cag A sẽ nhanh chóng xuất hiện kháng thể kháng Cag A. Gen Cag A
thường có trên những chủng vi khuẩn bài tiết độc tố gây rỗng tế bào. Mặc dù
gen Vac A, gen sản xuất ra độc tố gây rỗng, không phải là một phần trong
tiểu đảo sinh bệnh (PAI) nhưng người ta thấy độc tố gây rỗng (Vac A) sẽ
không được H.pylori bài tiết nếu không có sự hiện diện của PAI. Trên thực
nghiệm khi người ta vô hiệu hóa gen Cag A và thấy trong khi phần còn lại
của PAI vẫn nguyên vẹn thì vi khuẩn vẫn có khả năng bài tiết độc tố gây
rỗng.
- Gen iceA mới được phát hiện gần đây, chức năng chưa hoàn toàn sáng tỏ
chỉ quan sát thấy, nhưng điều đặc biệt là sự biểu hiện của nó chỉ quan sát thấy
khi H. pylori tiếp xúc với tế bào niêm mạc của người [Leen-Jan van Doorn
và CS, 2001].
Ngoài ra còn một số gen quan trọng của H. pylori cùng với chức năng của
chúng như:
abcdABCD : tham gia vào hoạt tính của eanzym urease
babA/B

: mã hóa cho điểm bám trung gian của

H. pylori với té bào niêm mạc dạ dày
ureA/B

: gen cấu trúc của urease

GyrA

: kháng ciprofloxacin

..........
(Nguồn : Leen-Jan van Doom, 2001 ; Zhongming Ge, 1999).
Các nghiên cứu về sinh học phân tử đã cho thấy trật tự gen của H.pylori
thay đổi rất đa dạng giữa các chủng, mỗi một chủng ký sinh trên dạ dày người
lại mang một đặc điểm khác nhau, thậm chí cùng một chủng trước và sau điều
trị đã thấy xuất hiện một số thay đổi trong DNA của nhiễm sắc thể hoặc của
plasmid hoặc cả hai [Brown LM, 2000; Helena Enroth và CS,1999] tính đa
dạng trong chuỗi gen của các chủng H. pylori do có những vùng trong đó mang
đặc tính đột biến và tái tổ hợp cao [Ge Wang và CS, 1999]. Điều này giúp H.
10


pylori thích nghi cao với môi trường, đồng thời cũng giải thích khả năng kháng
lại kháng sinh nhanh chóng của chúng trong quá trình đièu trị và tạo ra một số
khác biệt trong các kỹ thuật chẩn đoán kháng thể.
Người ta dựa vào các gen Cag A, Vac A để chia ra các typ H.pylori
như sau:
-

Typ I là H.pylori có cả gen Cag A, Vac A sản xuất ra protein Cag A và

protein Vac A có độc tính là typ có liên quan nhiều với tổn thương nặng nề ở
dạ dày.
-

Typ II là H.pylori không có cả gen Cag A, Vac A nên không sản xuất ra

protein Cag A và protein Vac A có độc tính.
- Typ III là H.pylori không có gen Cag A, nhưng có gen Vac A.
-

Typ IV là H.pylori không có gen Vac A nhưng có gen Cag A
Ngoài độc tố tế bào, H.pylori còn có thể tác động đến quá trình hình

thành và bài tiết các thành phần của dịch vị. H.pylori hoạt hóa các bạch cầu
đa nhân đã bộc lộ HLADR và các thụ cảm thể interleukin 2 trên bề mặt tế
bào và sản xuất ra các superoxid, interleukin 1, yếu tố hoại tử u α. H.pylori
sản xuất ra protease làm phân hủy các glycoprotein- lipid của lớp chất nhày
dẫn đến làm giảm độ nhày và độ quánh của lớp chất nhày; do đó mặc dù vi
khuẩn làm tăng tổng hợp và bài tiết chất nhày nhưng chất lượng chất nhày dạ
dày giảm, khả năng bảo vệ niêm mạc của chất nhày cũng giảm. H.pylori
cũng sản xuất một chất bám dính làm vi khuẩn dễ bám vào bề mặt niêm mạc
hơn tạo điều kiện cho vi khuẩn cư trú và phát triển.
2.3. Vị trí cƣ trú của H.pylori
Vi khuẩn H.pylori ở trong môi trường của acid của dịch vị làm lỏng lớp
chất nhày che phủ niêm mạc dạ dày; tạo ra môi trường riêng thích hợp cho
vi khuẩn tồn tại và phát triển. Ở niêm mạc dạ dày, H.pylori thường cư trú ở
khe giữa các tế bào biểu mô ở phần sâu nhất của lớp chất nhày. Đôi khi,
người ta cũng thấy H.pylori ở trong tế bào. Ngoài niêm mạc dạ dày, H.pylori
còn có thể cư trú ở niêm mạc tá tràng, niêm mạc thực quản khi có dị sản
niêm mạc dạ dày. Một số nghiên cứu nhận thấy H.pylori tồn tại được ở môi
11


trường quanh bào tương tế bào với pH thích hợp từ 4-8; tuy nhiên trong
khoảng pH từ 4- 6 thì vi khuẩn H.pylori chỉ có thể tồn tại chứ không phân
chia được
2.4. Nuôi cấy
H. pylori thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, chúng thường được nuôi trong điều
kiện có 5% O2 , 10%CO2, 85%N2, Nhiệt độ 35-370C và độ ẩm cao. Phần lớn các

môi trường nuôi H. pylori đều sử dụng máu ngựa hoặc máu cừu tươi, môi
trường chọn lọc có nhiều kháng sinh như vancomycin, trimethoprim và
amphotericin B để ức chế tạp nhiễm(Fred M. Sutton và CS). Sau 3-5 ngày nuôi
cấy (có thể đến 14 ngày) có thể nhận thấy các khuẩn lạc tròn, bóng, màu xám
trong, đường kính 0,5-1mm, không tan máu hoặc tan máu anpha. Trên tiêu bản
nhuộm Gram, hình thể đa số là hình cong, mức độ xoắn không điển hình như
trên tiêu bản trực tiếp từ mảnh sinh thiết, có cả trực khuẩn. Sau 7 ngày nuôi cấy,
có thể thấy các thể hình cầu.
2.5. Đƣờng lây,nguồn lây.
Nguồn truyền nhiễm của H. pylori chủ yếu là người, một số tác giả đề cập
đến cừu và khỉ rhesus cũng có thể là nguồn truyền nhiễm(Dore MP và CS,Hazel
M. Mitchell 2001), nhưng việc phân lập được H. pylori là không phổ biến. Mặc
dù phân bố của H.pylori là khắp thế giới nhưng đường lây của chúng vẫn chưa
hiểu được một cách đầy đủ. Đường lây truyền chủ yếu là từ người sang người
qua đường tiêu hoá. Phương thức lây được đề cập nhiều nhất là đường phânmiệng, đương miệng-miệng và đường dạ dày miệng(hay còn gọi là đường chất
nôn-miệng) , nhưng đường nào là quan trọng thì vẫn còn nhiều tranh luận.
3. VAI TRÒ CỦA H.PYLORI VỚI BỆNH LÝ VIÊM LOÉT DẠ DÀY VÀ
LOÉT HÀNH TÁ TRÀNG.
3.1. Vai trò của H.pylori với bệnh lí viêm dạ dày và loét hành tá tràng.
Viêm dạ dày là tình trạng viêm ở niêm mạc dạ dày. Dựa vào triệu chứng
viêm dạ dày, chia thành hai loại chính là viêm dạ dày cấp và mạn tính.

12


Vi khuẩn H.pylori có thể gây viêm dạ dày ruột cấp tính rồi dẫn đến viêm
dạ dày mạn tính. Tuy nhiên, tổn thương viêm dạ dày cấp do H.pylori thường
thoảng qua và khó phát hiện.
Viêm dạ dày mạn tính hiện nay sử dụng phương pháp phân loại của
Strickland và Mackay chia thành:

Viêm dạ dày mạn tính typ A là bệnh ít phổ biến có đặc trưng viêm chủ yếu
ở vùng thân và đáy dạ dày, vùng hang vị ít khi gặp. Bệnh gây ra do thiếu yếu
tố nội tại của dạ dày, dẫn đến giảm hấp thu vitamin B12, giảm tiết acid, liên
quan đến bệnh thiếu máu ác tính. Viêm dạ dày typ A ít liên quan với nhiễm
H.pylori.
Viêm dạ dày mạn tính typ B là hình thái phổ biến của bệnh viêm dạ dày
mạn tính. Bệnh hay gặp ở người trẻ. Tổn thương chủ yếu ở vùng hang vị. Tỷ
lệ nhiễm bệnh tăng dần theo tuổi có thể đạt 78% ở người trên 50 tuổi và hầu
hết 100% người trên 70 tuổi. Đa số các nghiên cứu đều thấy có mối liên quan
chặt chẽ giữa nhiễm H.pylori với viêm dạ dày mạn tính typ B. Tỷ lệ nhiễm
H.pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày từ 44 - 92% tùy tác giả và nơi nghiên cứu.
Cơ chế tổn thương do H.pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày mạn tính:
- Men urease của H.pylori thủy phân ure tạo thành amoni clorid (NH4Cl);
là một chất độc với tế bào niêm mạc; nó ức chế hiện tượng thức báo. Các
men catalase, lipase, glycoproteinase có thể phân hủy chất nhày, làm
H.pylori xâm nhập sâu hơn và bộc lộ các thụ cảm thể để H.pylori có thể
bám chặt vào tế bào niêm mạc dẫn đến phá hủy tế bào.
- H.pylori tiết ra các độc tố tế bào làm hủy tế bào niêm mạc như Cag A, và
Vac A.
-

Phản ứng miễn dịch của tế bào niêm mạc do thâm nhiễm tế bào viêm sản
xuất ra các độc tố trung gian làm tổn thương tế bào niêm mạc dạ dày.

3.2.

Vai trò của H.pylori trong loét hành tá tràng

Loét hành tá tràng là một bệnh phổ biến, đa nguyên nhân. Người ta thấy có 10%
dân số châu Âu bị loét hành tá tràng. Ở Việt Nam, theo một số thống kê tỉ lệ loét

13


hành tá tràng từ 10 - 15%. Nguyên nhân chủ yếu gây loét hành tá tràng được giả
thuyết là do tăng tiết acid, do dùng thuốc chống viêm không steroid và do nhiễm
H.pylori. Tỉ lệ loét hành tá tràng có nhiễm H.pylori có thể từ 90 - 100% tùy theo
thống kê.
Cơ chế loét hành tá tràng trong nhiễm H.pylori, được giả thuyết như sau:
Do H.pylori kích thích tế bào viền làm tăng tiết acid. Niêm mạc hang
vị dạ dày có tế bào G có nhiệm vụ tiết gastrin. Đây là một chất kích thích tiết
acid. Niêm mạc hang vị cũng có tế bào D có vai trò sản xuất somatostatin. Chất
này có tác dụng ức chế tiết gastrin và giảm sản xuất acid. Khi nhiễm H.pylori,
các độc tố cytokin và chất phản ứng viêm kích thích làm tế bào D giảm tiết
somatostatin dẫn đến phản ứng tăng tiết gastrin máu và tăng tiết acid. Lượng
acid xuống tá tràng tăng gây dị sản niêm mạc dạ dày tại hành tá tràng. Vùng dị
sản này phát triển dẫn đến tăng tiết chất nhày; tạo điều kiện cho vi khuẩn
H.pylori có thể cư trú và phát triển. Vi khuẩn H.pylori cũng kích thích gây phản
ứng viêm tại chỗ như làm thoái hóa, hoại tử rụng, trợt, long. Nhiễm H.pylori
mạn tính và tăng tiết acid quá mức làm các vết trợt hợp lại tổn thương sâu thêm,
cuối cùng dẫn đến loét hành tá tràng.
3.3.

Vai trò của H.pylori trong loét dạ dày

Loét dạ dày là một bệnh phổ biến, tuy tỉ lệ mắc bệnh thấp hơn loét hành tá tràng.
Bệnh hay gặp ở lứa tuổi trên 60, muộn hơn loét hành tá tràng khoảng 10 năm.
Nam hay gặp hơn nữ. Tổn thương loét dạ dày cũng xuyên qua niêm mạc đến lớp
hạ niêm mạc và thường có viêm dạ dày rộng bao quanh ổ loét. Loét dạ dày mặc
dù có liên quan với tăng tiết acid và pepsin nhưng tốc độ tiết acid thường giảm
so với người không loét; có khoảng 10 - 20% bệnh nhân loét dạ dày kết hợp với

loét hành tá tràng. Bệnh loét dạ dày xảy ra được giải thuyết là do sức đề kháng
niêm mạc dạ dày giảm hoặc tổn thương trực tiếp niêm mạc dạ dày. Nguyên nhân
loét dạ dày thường được cho là do nhiễm H.pylori, dùng thuốc chống viêm
không steroid (NSAID), rượu, acid, kiềm, stress, dịch tá tràng trào ngược.
Tỷ lệ nhiễm H.pylori ở bệnh nhân loét dạ dày khoảng 70,7 - 90% tùy từng tác
giả và nơi nghiên cứu, thấp hơn ở loét hành tá tràng. Ổ loét có thể ở mọi vùng
14


của dạ dày như: hang vị, bờ cong nhỏ, bờ cong lớn dạ dày. Sau khi dùng thuốc
điều trị diệt H.pylori, những bệnh nhân loét dạ dày có nhiễm H.pylori thường
liền sẹo. Nhiễm H.pylori hình như làm cho loét dạ dày dễ tái phát hơn, người ta
nhận thấy nếu còn H.pylori ở dạ dày, tỉ lệ loét dạ dày tái phát có thể tới 50%
trong khi ở nhóm không có H.pylori tỉ lệ loét tái phát chỉ có 8,5%.
* Cơ chế loét dạ dày do H.pylori
Có nhiều cơ chế giải thích loét dạ dày do H.pylori, tuy nhiên các tác giả đều
thống nhất cho rằng H.pylori làm thay đổi cấu trúc chất nhày nhờ men urease, từ
đó dẫn đến thoái hóa niêm mạc rồi đến loét dạ dày. Theo Sidebotham R.H và
Baron J.H thì H.pylori sản xuất men urease làm biến các cấu trúc hình cầu của
chất nhày thành các cấu trúc hình phiến. Từ đó làm biến thể chất nhày, phá hỏng
hàng rào niêm mạc tạo điều kiện để hình thành ổ loét. Còn theo Capper thì
H.pylori làm tăng khuyếch tán ion H+ vào lớp niêm mạc dạ dày kết hợp với
giảm sản xuất và bài tiết chất nhày dẫn đến thoái hóa niêm mạc và hình thành
loét. Những yếu tố bổ sung, ủng hộ cơ chế loét dạ dày do H.pylori còn là loét dạ
dày thường có viêm dạ dày kết hợp, mà tổn thương viêm dạ dày thì có liên quan
chặt chẽ với nhiễm H.pylori.
4. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH LÝ DẠ DÀY DO
HELYCOBACTER PYLORI HIỆN NAY
Hiện nay người ta chia ra 2 nhóm phương pháp chẩn đoán là nhóm phương
pháp không xâm phạm (như:test thở với C phóng xạ,phương pháp huyết

thanh,xét nghiệm nước bọt,. . .) và nhóm phương pháp xâm phạm(như: phương
pháp tế bào học,phương pháp mô bệnh học, urease test, phương pháp PCR,
phương pháp nuôi cấy, . . .).
4.1. Các phƣơng pháp không xâm phạm:
4.1.1. Test thở CO2 phóng xạ :
Đây là một test không có hại. Được coi là phương pháp tốt nhất để theo
dõi và diệt trừ H.pylori. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp là khá cao
(95-100%). Nguyên tắc của phương pháp là cho bệnh nhân uống một dung dịch
ure phóng xạ. Nếu có H. Pylori, urese do vi khuẩn sản xuất ra sẽ phân tích ure
15


phóng xạ thành CO2 để giải phóng ra CO2 phóng xạ trong vòng 1 giờ. Các mẫu
khí thở ra có thể thấy C13_C14 bằng một máy đếm nhấp nháy.

Test cho kết quả nhanh chóng(10-40 phút) và phản ánh trung thực quá
trình điều trị.Tuy nhiên trở ngại chính của phương pháp này là phải có dụng cụ
để đo nồng độ ¹³CO2 trong khí thở ra do vậy hiện nay no vẫn chỉ được áp dụng
tại một số trung tâm chẩn đoán.
4.1.2. Các test huyết thanh :
Cơ sở của test này là việc phát hiện ra các kháng thể trong huyết thanh của
bệnh nhân bị nhiễm H. pylori.Kháng thể tăng cao ở người bị nhiễm H. pylori và
giảm rõ khi H.Pylori được diệt trừ và tăng lại nếu như bị tái nhiễm.Hiện nay đây
vẫn được coi là loại xét nghiệm phù hợp nhất cho các nghiên cứu dịch tễ học.
hiện nay, có các xét nghiệm huyết thanh học thong dụng chẩn đoán H.pylori
gồm có: ELISA, Immunoblot, và xét nghiêm huyết thanh với máu toàn phần.
Trong đó, ELISA cho kết quả tốt nhất. Những test này vẫn chưa phổ biến và
thường cho kết quả sai ở giai đoạn cửa sổ
4.2. Các phƣơng pháp xâm phạm:
Các phương pháp này thường phải dùng nội soi để sinh thiết hoặc là qua mổ dạ

dày.

16


4.2.1. Khảo sát tế bào học:
Đây là phương pháp cho kết quả nhanh chóng, được thực hiện bằng cách
chải quét hoặc ấn mẫu sinh thiết lên lam kính rồi cố định bằng cồn hoặc để khô
tự nhiên sau đó được nhuộm:
+

Hoặc bạc Warrthin starry,hoặc nhuộm huỳnh quang acridine orange: vi

khuẩn hiện lên rõ nét, rất dễ nhận thấy. Song phương pháp này tốn kém và đòi
kỹ thuật cao.
+

Nhuộm Giemsa là một phương pháp nhanh và rẻ tiền để phát hiện sự có

mặt của H. poylori.
Phương pháp này nhanh chóng, đơn giản và dễ thực hiện ở các tuyến có nội
soi nhưng kết quả phụ thuộc vào kinh nghiệm người đọc.
4.2.2.Phƣơng pháp mô bệnh học:
Là một trong những phương pháp được áp dung nhiều nhất trong nhóm các
phương pháp xâm phạm chẩn đoan H.pylori.Nhuộm HE và Giemsa được chấp
nhận vì rẻ tiền và dễ thực hiện.Tuy nhiên phương pháp này cho độ nhạy thấp,tuỳ
kinh nghiệm của người đọc bệnh phẩm.
4.2.3. Cấy tổ chức sinh thiết:
Đây là một phương pháp chuẩn để tham khảo và để khảo sát kháng sinh đồ,
tuy có khó khăn nhưng là phương pháp đặc hiệu nhất (95-98%).

-Phương pháp này gây chảy máu dạ dày, và có thể lây nhiễm chéo.
17


-Vi khuẩn chỉ có thể phân lập từ những mảnh sinh thiết dạ dày, song không
bao giờ từ dịch vị.
-Cấy phải lâu tới 7 ngày trong môi trường ưa khí.
-Nếu dùng thuốc kháng H2 trước 1 ngày,gây tê nhiều trước khi nội soi thì cho
kết quả không chính xác.
4.2.4. Test usease nhanh :
Đây l một loại test nhanh, đơn giản và rẻ tiền, có độ nhạy và độ đặc hiệu tốt.
Nó dựa trên nguyên lý H. pylori sản xuất ra nhiều urease có hoạt tính rất cao để
phân huỷ ure . Một trong những test đó là CLO test (Campylobacter Like
organism test), đặt một mảnh sinh thiết tổ chức trong một test môi trường có ure,
một chỉ thị pH(độ phenol) và một tác nhân kìm vi khuẩn.
Nếu có H. P, urease của vi khuẩn sẽ thuỷ phân, ure và amoniac được sản
xuất ra nó làm cho pH của dung dịch trở thành kiềm và làm đổi màu của dung
dịch từ vàng chuyển sang đỏ trong 20 phút đến 30 phút.
Thử nghiệm urease tốt nhất được đọc trong 24h đầu,ngoài thời gian đó, độ
đặc hiệu sẽ giảm vì xuất hiện hoạt tính urease của tổ chức mô và vi khuẩn bội
nhiễm khác. Khi số lượng vi khuẩn ít có thể xuất hiện âm tính giả.
4.2.5. Kỹ thuật sinh học phân tử
Vào những năm cuối của thế kỷ XX, sinh học đã có sự phát triển nhảy vọt
nhờ sự ra đời của nhiều phương pháp khuếch đại
in vitro có chọn lọc, trong đó thành tựu nổi bật nhất phải kể đến phản ứng chuỗi
trùng hợp (PCR). Phương pháp này hoàn toàn mới trong việc phân tích ADN do
Kary Mullis và cộng sự phát minh.
* Cơ sở lý thuyết của PCR
Phân tử ADN là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một
chuỗi nucleotit. Mỗi nucleotit gồm một gốc phosphate, đường deroxyribose và

một trong 4 bazơ (adenine, cytozine, guanine, thymine). Hai mạch kết hợp với
nhau nhờ liên kết hydro hình thành giữa các bazơ bổ sung nằm trên hai mạch
đơn. A bổ sung với T, G bổ sung với C. Mỗi mạch đơn là một trình tự có định
hướng với một đầu là 5' phosphate, đầu kia là đầu 3' OH (hướng quy ước là 5'18


3'). Hướng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau, gọi chúng là hai
mạch đơn song song.

Hình 1. Cấu trúc hoá học hai mạch đơn phân tử ADN
Sau khi cấu trúc của ADN được phát hiện người ta đi sâu nghiên cứu
bản chất của quá trình sao chép và tìm hiểu những thành phần tham gia. Dựa vào
nguyên lý của sự kết cặp bổ sung giữa các bazơ nitơ trên phân tử ADN, dựa trên
cơ sở của sự hiểu biết về cơ chế sinh hoá học của phản ứng sao chép ADN đã
cho phép thiết lập PCR in vitro. Có thể coi các bước của PCR là một quy trình
phản ứng lặp lại trong tự nhiên, sử dụng những enzym tồn tại trong tự nhiên để
tổng hợp ADN in vitro.
* Nguyên tắc của PCR
PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn ADN đặc thù nhờ hai
đoạn mồi oligonucleotit (primer) tương hợp với hai đầu 3' ở cả hai sợi của đoạn
ADN đích (target sequence) với sự tham gia của ADN polymeraza. Đoạn mồi sẽ
liên kết bổ sung với đoạn ADN đích ở đầu 3'.
* Thành phần phản ứng của PCR:
- ADN khuôn.
- Đoạn mồi (primer).
19


- dNTPs ( dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
- Taq ADN polymeraza.

- Đệm thích hợp.
Phản ứng PCR tiếp tục theo chu kỳ 3 bước:
-Bước 1: Giai đoạn biến tính DNA (denaturation). Trong dung dịch hỗn
hợp đầy đủ các thành phần phản phản ứng PCR bao gồm các thành phần cần
thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ 940C – 950C
trong vòng 30 giây đến 1 phút. Kết quả là 2 chuỗi đơn tách rời nhau.
-Bước 2: Giai đoạn bắt mồi (anealing). Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn
Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động
trong khoảng 400C – 700C tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng, kéo dài từ 30
giây đến 60 giây.
-Bước 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp (extension). Nhiệt độ được tăng lên
đến 720C giúp cho enzyme DNA polymerase tổng hợp tốt nhất, thời gian tuỳ
thuộc vào độ dài của đoạn DNA cần khuếch đại. Thường kéo dài từ 30 giây đến
vài phút.
Một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần
sẽ làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số
nhân, sau 30 chu kỳ kết quả thu được sẽ là 106 lần so với ban đầu.

20


Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành trên 20 bệnh nhân có bệnh lý dạ dày tá tràng. Được
chia làm 3 nhóm:
Nhóm I : bệnh nhân bị viêm dạ dày mạn tính
Nhóm II : bệnh nhân bị loét dạ dày
Nhóm III : bệnh nhân bị ung thư dạ dày
Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: các bệnh nhân có bệnh lý dạ dày tá tràng có
sinh thiết dạ dày.

2. CÁC THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU
2.1 Các thiết bị nghiên cứu
Bảng 6. Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị

Hãng sản xuất

Máy PCR (GeneAmp PCR System 9700)

Applied BioSystems

Máy ly tâm lạnh (Biofuge Primo R)

Heraeus

Máy chụp ảnh Gel – Dolphil

Dolphin

Tủ lạnh (-)200 C, (-)800C

Nuaire

Lò vi sóng

Sanyo

Cân điện tử (Electronic balances)

Adam

Pippetman điều chỉnh được các loại

Gilson, Hamilton

Máy lắc, rung (Vortex)

OSI Rotolab

Máy lắc Gyromax 737R

Amerex Instruenzymet

Máy lắc và ủ nhiệt độ Eppendorf

Eppendorf

Bộ điện di ngang, nguồn

Labnet

Túyp PCR 0,2ml, Túyp 1,5ml
Đầu pippet không chứaDNA có đầu lọc khí

21


(A)

(B)

Hình 3. Máy nhân gene PCR (A), Máy lắc ủ nhiệt độ (B)
2.2.Các sinh phẩm hóa chất
. Lisis Buffer
. Lysozym
. Proteinkinase K
. Clorofom,Phenol,Isoamyl.
. Cồn 70,100.
. Dung dịch Owen.
. dNTPs
· Taq DNA Polymerase with Standard Taq Buffer (New England Biolabs,
USA)
· RNase-free nước; Ethanol 99%
· Các cặp Primers đặc hiệu H. pylori
· Agarose NA (Amersham Biosciences, USA)
· Đệm TBE 50x (Applied Biosystems)
· Ethidium Bromide 0. 5 µg/ml (Applied Biosystems)
· Gel loading 6X (Invitrogen)
· Thang DNA chuẩn 50, 100 bp
22


3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3. 1. Lấy mẫu bệnh phẩm
Các bệnh nhân mắc bệnh lý dạ dày tá tràng có chỉ định phẫu thuật sinh thiết một
mảnh niêm mạc (chủ yếu vùng hang môn vị). Được bảo quản và vân chuyển
ngay tới phòng thí nghiệm.
3. 2. Tách DNA từ mảnh sinh thiết :
Mảnh sinh thiết được lấy một mẫu nhỏ đem nghiền cùng với 500µ dung
dịch PBS bằng chày trong eppendorf 1,5ml. Sau đó hút lấy phần dung dịch đem

cất ở -20°C để dùng dần.
*. Tách DNA theo quy trình Clorofom :
-Lấy 1000µ dịch nghiền,cho thêm 500µ Lisis Buffer + 15µ Lysozyme .
-Votex, ủ 30 phút trên nước đá.
-Thêm 15µ Proteinkinase K,lắc kỹ.
-Ủ ở 56°C trong 3h
-Cho 100µ Clorofom, Phenol, isoamyl. (25:24:1)
-Ly tâm 13000vòng /10 phút.
-Hút phần nước nổi vào ống mới có 500µ cồn 100° và 25µ dung dịch Owen.
-Ủ ở -20°C trong 3h
-Ly tâm 13000vòng /10 phút.
-Bỏ phần nước nổi,giữ cặn.
- Cho thêm 1000µ cồn 70° lắc vài lần.
-Ly tâm 13000vòng /10phút.
-Hút bỏ nước nổi.
-Làm khô, cho thêm 50µ nước khử ion, giữ ở -4°C.

23


3. 3. Chuẩn bị thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng được tính toán và chuẩn bị trong bảng sau:
Bảng thành phần phản ứng PCR đa mồi
Thành phần

TT

Nồng độ

Thể tích (µl)

1.

Nước khử ion

2.

Đệm gồm MgCl2 (10X)

MgCl2: 1,5 mM

2. 5

3.

dNTPs

2,5 mM

2. 0

4.

Mồi VAI F, VAI R, Cag F,

10pmol/mồi

11. 85

3. 0µl

Cag R, VAG F, VAG R
5.

Buffer

6.

Taq DNA polymerase

0. 5µl mồi x6 =

2. 5
0. 75u

0. 15

(NEB)
cDNA của phản ứng PCR thứ nhất

3

Tổng số (µl)

25

3. 4. Phản ứng PCR
Phản ứng PCR tiến hành theo chu trình luân nhiệt sau khi tìm được nhiệt
độ gắn mồi phù hợp như sau: sau khi biến tính DNA ở nhiệt độ 940C trong 3
phút; thực hiện 35 chu kỳ mỗi chu kỳ gồm: 940C x 30 giây, 590C x 1 phút,

720C x 1 phút 30 giây; bước cuối cùng kéo dài ở nhiệt độ 720C trong 7 phút và
giữ ở 40C.
3. 5. Điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm DNA được điện di trên gel Agarose 1,2%.
Chuẩn bị gel Agarose:
+ Chuẩn bị Agarose 1,2% trong dung dịch đệm 1X TBE (1,2 gram + 100ml dd
1xTBE ).
+ Đun trong lò vi sóng cho Agarose tan hoàn toàn.
+ Dung dich Ethidium Bromide 10 mg/ml
+ Để nguội đến 600C, hòa tan 5 µl Ethidium Bromide 10 mg/ml (chất có khả
năng gắn xen giữa các base của phân tử DNA) lắc đều, đổ gel vào khay điện di
24


ngang đã được lắp lược.
+ Rút lược ra sau khi gel đã đông lại (khoảng 30 phút).
Quá trình điện di và kiểm tra sản phẩm PCR:
+ Gel được đặt nằm ngang trong buồng điện di có chứa dung dịch đệm (1xTBE)
đến mức phủ kín bề mặt thạch.
+Nạp bệnh 3 μl phẩm nhuộm trong đệm loading dye 1x (5μl) vào rãnh điện di.
+ Điện di thực hiện theo phương nằm ngang với dòng điện một chiều có hiệu
điện thế 110 Vôn, dòng 80 mA, trong thời gian khoảng 45 phút.
+ Quan sát và chụp ảnh bằng máy soi Gel-Dolphil.
3. 6. Phát hiện DNA của H. pylori và phân biệt genotype của H. pyori
Sản phẩm c-DNA của H. pylori được nhuộm bằng Ethidium Bromide.
Gel Agarose, soi bằng tia cực tím (UV) trên máy soi Dolphin. Sự tồn tại sản
phẩm tổng hợp c-DNA trong phản ứng PCR đúng kích thước mong đợi (so sánh
với thang chuẩn DNA) cho phép chẩn đoán tồn tại H. pylori trong mẫu bệnh
phẩm. Dựa vào kích thước khác nhau của các sản phẩm PCR được khuyếch đại
nhờ các primer đặc hiệu genotype của H. pylori cho phép phân biệt các genotype

của H. pylori.
3. 7. Phân tích và xử lý số liệu.
Số liệu nghiên cứu được tổng hợp, báo cáo và xử lý theo phương pháp thống kê
y học

25